Структурированные участки нуклеиновых кислот - мишени для избирательного воздействия низкомолекулярных лигандов и олигонуклеотидов

Демченко, Юлия Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурированные участки нуклеиновых кислот - мишени для избирательного воздействия низкомолекулярных лигандов и олигонуклеотидов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурированные участки нуклеиновых кислот - мишени для избирательного воздействия низкомолекулярных лигандов и олигонуклеотидов"

На правах рукописи

Демченко Юлия Николаевна

Структурированные участки нуклеиновых кислот - мишени для избирательного воздействия низкомолекулярных лигандов и олигонуклеотидов

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2004

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научные руководители: д.б.н.

Зенкова Марина Аркадьевна Бросалина Елена Борисовна

к.х н

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор Дымшиц Григорий Моисеевич

к.х.н.

Малыгин Алексей Аркадьевич

Ведущая организация: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

по адресу: 630090, г. Новосибирск 90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Авторефераг разослан

Ученый секретарь диссертационного совела

Защита состоится 2004 г. в

часов

докюр химических наук

Федорова О. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важной задачей современной молекулярной биологии является создание методов регуляции биологических процессов в исследовательских и терапевтических целях. Одним из наиболее перспективных подходов к решению этой задачи является направленное воздействие на выбранные участки нуклеиновых кислот с помощью олигонуклеотидов и их производных, а также низкомолекулярных лигандов, способных распознавать определенные структуры молекул ДНК или РНК. Так как, в составе природных нуклеиновых кислот практически отсутствуют открытые участки, мишенями для связывания олигонуклеотидов служат некоторые элементы вторичной структуры ДНК- и РНК-молекул. Наиболее перспективными мишенями для регуляции функциональной активности нуклеиновых кислот с помощью олигонуклеотидов представляются шпилечные структуры.

Конформационные перестройки шпилечных участков часто лежат в основе природной регуляции биологических процессов, поэтому представляется актуальным изучение возможных конформационных состояний мишени, а также факторов, вызывающих ее структурную реорганизацию. Взаимодействие с олигонуклеотидами может вызвать изменение структуры мишени не только в области комплексообразования, но и, с большой вероятностью, будет инициировать перестройки в близлежащих областях нуклеиновой кислоты, что в свою очередь может привести к изменению их функциональной активности. В связи с этим, актуальной задачей является изучение влияния комплексообразования олигонуклеотидов с ДНК- или РНК-мишенью на ее структурную организацию и биологическую активность.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение функционально значимых шпилечных структур нуклеиновых кислот как потенциальных мишеней для связывания олигонуклеотидов и анализ изменений в структуре и биологической активности ДНК- и РНК-шпилек, происходящих при связывании с ними олигонуклеотидов. В ходе исследования решались следующие задачи:

— изучение возможных конформаций фрагмента ДНК, являющегося сайтом связывания регуляторного белка NssBF и входящего в состав U3 области длинных концевых повторов (LTR) ретротранспозона 1731 Drosophila melanogaster, a также факторов, влияющих на структурные перестройки этого фрагмента;

— исследование влияния комплексообразования олигонуклеотидов с ДНК на структурную организацию и биологическую активность близлежащих областей ДНК, не вовлеченных непосредственно в образование комплексов;

— выявление олигонуклеотидов, способных специфически связываться с областью а-сарциновой петли 23S рРНК М. tuberculosis.

Научная новизна и практическая ценность работы, Впервые проведено исследование структурной подвижности шпилечного ДНК-элемента, расположенного в U3 области LTR ретротранспозона 1731 Drosophila melanogasler, и обнаружены факторы, стабилизирующие определенные конформационные состояния этого ДНК-фрагмента. Выявлено влияние связывания олигонуклеотидов на структурную организацию и функционалАн^^^д||^Щ^ь(^1ж;тей ДНК, не

i ВИКЛИОТЕКА , I 1

I snuffi

вовлеченных непосредственно в образование комплексов. Охарактеризованы структурные изменения в молекуле ДНК, происходящие в результате связывания с ней олигонуклеотидов. Продемонстрировано, что связывание олигонукле-отидов изменяет биологическую активность участков ДНК вследствие стабилизации или дестабилизации несовершенных тройных комплексов, определяющих функциональную активность данного участка. В ходе данных исследований были выявлены некоторые закономерности, которые могут служить дополнительными критериями при создании соединений, способных стабилизировать определенные конформационные состояния нуклеиновых кислот и влиять на их биологическую активность. Проведено сравнение различных подходов, используемых для повышения специфичности связывания олигонуклеотидов с РНК-мишенью и идентифицирован олигонуклеотид, способный избирательно связываться с областью а-сарциновой петли 23S pPHK M tuberculosis, который может быть использован при создании терапевтических препаратов для подавления роста микобактерий.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации оп>бликовано 3 печатные работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: "French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression", (Новосибирск, 1995), "RNA as Therapeutic and Genomics Target" (Новосибирск, 2001) и "Targeting RNA* Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA Interference" (Новосибирск, 2003).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 123 страницах, содержит 29 рисунков и 2 таблицы. Библиография включает 209 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Структурная подвижность шпилечного ДНК-элемента, расположенного в U3 области LTR ретротранспозона 1731 Drosophila melanogaster

Использованный в работе фрагмент ДНК расположен в V3 области LTR ретротранспозона 1731 Drosophila melanogaster и относится к его промоторному участку. Данная последовательность является сайтом связывания двух транс -крипционных факторов - р] 1 и NssBF. Белок NssBF узнает только кодирующую цепь ДНК (Вс-участок) и не взаимодействует ни с комплементарной ему цепью (Впс), ни с РНК, с последовательностью, соответствующей Вс (рис. 1) В связи с этим, представлялось интересным изучить в виде каких структурных форм может существовать Вс-фрагмент и комплементарный ему фрагмент Впс.

1 10 20 30

5TATGTAATTTTGTATGAGAACATACATACATACACATGCA

Рис. 1. Последовательность фрагмента Вс. Выделены нуклеотиды, соответствующие сайтам связывания NssBF.

1.1. Исследование вторичной структуры фрагментов Вс и комплементарного ему Впс

В состав фрагмента Вс входит последовательность ТОТАТО и три комплементарных ей, частично перекрывающихся последовательности САТАСА, что делает возможным формирование нескольких альтернативных шпилечных структур. Эти предполагаемые шпильки могут содержать 4, 8 или 12 нуклеоти-дов в петле, соответственно.

Для определения структуры Вс-фрагмента была проведена его химическая модификация диэтилпирокарбонатом (маркирующим одноцепочечные пурины) и перманганатом калия (маркирующим одноцепочечные тимидины). Реакции проводили в отсутствие ионов магния. Данные по химической модификации ББРС и КМпО4 [5'-32Р]-меченого Вс после расщепления пиперидином свидетельствуют о том, что область О9-О13 Ве количественно защищена от модификации, и, следовательно, входит в состав дуплекса. Модификация оснований Аи - Ап усиливается по сравнению с контролем (модификация Вс-фрагмента ББРС в присутствии ББТА), что свидетельствует о наиболее вероятном нахождении их в петле шпильки. Схематическая картина модификации ББРС и КМ11О4 Вс-фрагмента, а также предположительные структуры Вс представлены на рис. 2. Среди нуклеотидов З'-области Вс только Аз (защищенный от модификации ББРС количественно) входит в состав стебля шпильки обеих структур. Частичная защита от модификации оснований Ах9, Т20, А2 Т24, А25 и А27 свидетельствует о том, что в условиях эксперимента Вс существует в виде двух равновесных структур, содержащих 6 пар оснований в стебле и 8 или 4 нуклеотида в петле шпильки, и основания А19, Т20, А21, Т24, А25 и А27 находятся в двуцепо-чечной области только в составе одной из этих структур.

А А* в Т* 20

ПЕРС- -»А д.

•С-С

•т—АФ

фА-Т»

10#Т-А»

I «С—С

ТАТСТААТТТТ-АТАСЛСАТОСА

у • | Г у

шпилька вида I

С А „

—►А А

—С

•т- —А*

#А- 20

10#Т- —А*

•С- —с

ТАТСГААТТТГ— кмп04

шпилька вида II

АТАСАТАСАСАТССА ••• • ; I I з'

Рис. 2. Равновесные структуры Вс, детектируемые в отсутствие М§ . Стрелками отмечены сайты модификации Вс-фрагмента КМ11О4 (черные) и ОЕРС (серые). Кружками отмечены основания Вс, защищенные от модификации ОЕРС (серые) и КМ1Ю4 (черные). Размер кружков соответствует степени защиты основания: большие - полная защита, маленькие - частичная защита.

Известно, что присутствие ионов двухвалентных металлов может стабилизировать вторичную структуру нуклеиновых кислот, поэтому представлялось интересным выяснить, влияет ли присутствие ионов магния на структуру Вс. Модификацию Вс-фрагмента DEPC и КМпС>4 проводили в присутствии 10 мМ MgQ2. Оказалось, что картины химической модификации Вс в отсутствие и в присутствии ]У^С12 достаточно схожи, и существенные отличия выявляются только в 5'- и З'-областях этих структур (рис. 3). В присутствии ионов магния основания Т2, Т24, А25 и А27 полностью защищены от химической модификации. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что в присутствии Mg2+ две равновесные формы, содержащие в петле шпильки 4 или 8 нуклеотидов, сохраняются, но если в отсутствие ионов магния -области Вс - одноцепочечные, то в присутствии Mg2+ они формируют дуплексы.

G -» А •G-

• Т-•А-

10#Т—

• G-

• т-

.Т

-*т

-с А

•А— •Т-1G-

тА Т 5'

T« 20

-С' -A«

"I*

-С* -А*

-А» -С 30 -А С А Т G С

А ,,

G А _

-»А А

•G- —С

•т- —А*

•А- —т. 20

10»Т- —А»

• G- —С

• т- —А»

•т

'Т *т

» А

• Д-

•т-

1G-

тА-Т-5'

-А# -С -А» -Т -АС 30 А С А Т G С

А„

Рис. 3. Равновесные структуры Вс, детектируемые в присутствии 10 мМ М§С12. Стрелками отмечены сайты модификации Вс-фрагмента КМп04 (черные) и БЕРС (серые). Кружками отмечены основания Вс, защищенные от модификации БЕРС (серые) и КМп04 (черные). Размер кружков соответствует степени защиты основания: большие - полная защита, маленькие — частичная защита.

шпилька вида III

шпилька вида IV

Так как транскрипционные факторы связываются только с Вс и не взаимодействуют с комплементарной цепью, возникает вопрос о функциональной важности существования нескольких структурных форм Вс. В связи с этим представлялось интересным изучить, обладает ли подобными характеристиками комплементарный фрагменту Вс фрагмент Впс, не участвующий в связывании регуляторных белков.

Для выяснения структуры Bnc-фрагмента были проведены эксперименты по его модификации перманганатом калия. Реакцию проводили в присутствии 10 мМ MgCl2. Показано, что наиболее сильно модифицируются основания 5'-участка Впс ТрТц, а также Т23, Т24, Т26, в то время как основания Т15, Ti9, Т2] и Т29 полностью защищены от модификации КМп04. На основании полученных

данных можно предположить существование только одной шпилечной структуры, содержащей в петле 4 нуклеотида (рис. 4). Таким образом, было пока-

N. с Т

С— А— •Т-30 А—

с-

А А-А

35 А

ТТ_

Ас-

А-

зано, что Вс-фрагмент в отсутствие ионов Mg2+ существует в виде двух равновесных шпилечных структур, содержащих 6 пар оснований в стебле и 4 или 8 нуклеотидов в петле. В присутствии ионов магния также сохраняется равновесие двух шпилечных структур, содержащих 4 или 8 нуклеотидов в петле, а неструктурированные ранее 3'- и 5'-концы Вс образуют несовершенный стебель, содержащий 4-х нуклео-тидное выпетливание. Фрагмент Впс, комплементарный Вс, существует только в виде одной шпильки с 4-мя нуклеотидами в петле. Учитывая тот факт, что транскрипционные факторы связываются только с кодирующей Вс-последовательностью, можно предположить, что обнаруженная структурная подвижность Вс-фрагмента может играть важную роль в регуляции процесса транскрипции.

1.2. Анализ структуры Вс с помощью макроциклов, созданных на основе акридина

1 ✓

т в

т •

А 20 Т»

-в

-А

-Т 151 "в -Т* А Т

СЮ

т*-

т <— А С5 в

Т<—

Т *— 5'

Рис. 4. Структура Впс, детектируемая в присутствии 10 мМ М§С12. Стрелками отмечены сайты модификации Впс-фрагмента КМПО4. Кружками отмечены основания Впс, защищенные от модификации КМп04.

кмл04

Данные о структуре Вс-фрагмента, полученные с помощью химической модификации, были подтверждены в рамках совместных исследований с Институтом физико-химической биологии им. Пьерра и Марии Кюри (Париж, Франция) А. Слама-Швок Slama-Schwok) с помощью исследования термической денатурации Вс-фрагмента и олигонуклеотидов, содержащих замены или делеции в последовательности Вс, а также экспериментов по измерению выхода флуоресценции бис-акридинового макроцикла при его связывании с этими олигонуклеотидами.

Ранее было показано, что макроциклы, синтезированные на основе акридина (рис. 5), связываются с одноцепочечными и двуцепочечными последовательностями нуклеиновых кислот с различной эффективностью (Slama-Schwok et э1., 1995). Бис-акридин обладает повышенным сродством к пурино-вым нуклеотидам, расположенным в петлях шпилек, а не в неструктурированных одноцепочечных участках нуклеиновых кислот.

Нами была исследована возможность применения бис-акридинового (Mel) и трис-акридинового макроциклов (Мс2) (рис. 5) в качестве фотоактиви-руемых реагентов, чувствительных ко вторичной структуре молекул ДНК.

Облучение комплексов фрагмента Вс с макроциклами УФ светом с последующей обработкой пиперидином приводит к расщеплению Вс-фрагмента по модифицированным основаниям, что позволяет определить позиционную направленность фотомодификации. Из рис. 6.А видно, что пиперидиновая обработка нативного Вс-фрагмента, а также Вс, облученного в отсутствие макроциклов, не приводит к появлению продуктов деградации ДНК, тогда как пиперидиновая обработка фотомодифицированной макроциклами мишени приводит к расщеплению Вс по положениям. На рис. 6.Б отмечены основания, по которым происходит расщепление фрагмента Вс. Видно, что фотомодификация протекает по остатку расположенному в петле шпильки Вс, по остатку входящему в состав пары оснований, замыкающей стебель шпильки, а также по остатку, расположенному вблизи выпетливания, существование которого было доказано с помощью химической модификации Вс-фрагмента в присутствии ионов Mg2+ (шпильки III и IV, рис. 3).

А) 1 2 3 4 5

Б)

G А

-»С-

тА-10т--»G-

тт т т

А А-Т-IG-ТА-Т-5'

-а —Т 20 -а -с -а

-а -с -а -Т -а

с зо

А с А T G с

А„

Рис. 6. Фотоиндуцируемая модификация Вс-фрагмента с помощью акридиновых макроциклов. А. Анализ продуктов пиперидин-зависимого расщепления [5'-32Р]-Вс, облученного в присутствии Мс1 и Мс2. Радиоавтограф 20% денатурирующего ПААГ. Дорожка 1 - А+в реакция; дорожка 2 - Вс в отсутствие Мс без облучения; дорожка 3 - Вс, облученный в отсутствие Мс; дорожка 4 - Вс, облученный в присутствии 5х10'5 М Мс1; дорожка 5 - Вс, облученный в присутствии 5х10'3 М Мс2. Б. Схематическое представление положений расщепления в молекуле Вс, появляющихся после облучения в присутствии макроциклов.

Такая картина пиперидин-зависимого расщепления может быть объяснена пространственной организацией молекулы ДНК-мишени и повышенной чувствительностью G-оснований к фотомодификации под воздействием акридиновых макроциклов.

Результаты, полученные А. Слама-Швок по измерению выхода флюоресценции бис-акридина при связывании его с Вс-фрагментом, свидетельствуют о том, что макроциклы в первую очередь связываются с основаниями, расположенными в петле шпильки, но при повышении соотношения Вс/Мс до 1/3 связывание происходит и с основаниями в выпетливании. Поскольку в данных экспериментах соотношение Вс/Мс составляло 1/10, можно предположить, что макроциклы также связываются с основаниями петли и с основанием А4 в области выпетливания. Шпилечные структуры с таким выпетливанием были выявлены с помощью химической модификации только в присутствии ионов Mg2+. Известно, что акридиновые макроциклы при связывании способны стабилизировать структуру ДНК (Slama-Schwok et al., 1997). Поэтому, несмотря на то, что фотомодификация проводилась в отсутствие ионов магния, можно предположить, что в этих условиях, наряду с преобладающими шпилечными структурами типа I и II (рис. 2), существуют и шпильки с более протяженным несовершенным стеблем типа III и IV (рис. 3), которые стабилизируются при связывании Mel и Мс2, что и объясняет одинаковую степень фотомодификации оснований

Таким образом, акридиновые макроциклы при облучении УФ-светом модифицируют гуанины, расположенные в области петли, выпетливания или в участках, непосредственно прилегающих к ним. Полученные результаты позволяют рассматривать такие макроциклы в качестве дополнительных инструментов для исследования вторичной структуры ДНК в растворе. Кроме того, такие макроциклы могут быть использованы как лиганды для стабилизации определенных структурных элементов нуклеиновых кислот и, следовательно, наряду с олигонуклеотидами, могут воздействовать на функциональную активность нуклеиновых кислот.

2. Влияние образования комплексов олигонуклеотидов со шпилечной ДНК-мишенью на структурную организацию и функционирование близлежащих

областей ДНК

При связывании шпилечной ДНК-мишени с олигонуклеотидами возможно образование структур, стабилизирующих шпильки: триплексов и "двойных шпилечных" структур. В работе (Brossalina et. al., 1993) в качестве мишени была использована 69-звенная шпилечная последовательность ДНК, содержащая элементы мини-экзонной последовательности РНК Leishmania amazonensis, и было охарактеризовано взаимодействие этой ДНК-мишени с различными олигонуклеотидами. В данной работе исследовалось влияние взаимодействия таких олигонуклеотидов с модельной 69-звенной шпилечной после-

довательностью ДНК на структурную организацию и функциональную активность близлежащих областей, не вовлеченных в образование комплексов.

Последовательности ДНК-мишеней и олигонуклеотидов, использованных в работе, представлены на рис. 7:

69Т

ТТСАСТСААТТСТТАА

« so Т г СИ--

СТАСТССТСТСТТ f fpfff т $>

сат g a gga ga gaagag ggatc с taggtagc

69Т

ттсастсааттсттаа

стастсстстстт

AGGATCCATCG

69Т

5IT

сат с а сг.а ca caa gag г. пат с ct а о ci та о с

• ••«•■••«■ А С>

3. устсстстстт о\Л ВашН1

ttgactgaattcttaa

41 SO Т }•

стастсстстсттстссст OL4

сат gaggagagaagagggätcctaggtagc зо ..er CCTCTCIIC тссст OL 5

стсстст стгт\'1ттт]т OL б

40 50 3'

gtactcctctctt

сат cagcagagaagagccatcctacgtagc

ш69Т

ttgaHtgaatiHttaa

■40 50 Т

стастсстстстт

сат с agg a ga gaag agg gatc ctag с та с с С 30 10 5'

Рис. 7. Последовательности ДНК-мишеней и олигонуклеотидов. Мишени 69Т, 51Т и т69Т имеют сайты связывания для всех олигонуклеотидов. OL4, OL7 и 5'-область OL2, OL3 формируют Уотсон-Криковские пары, в то время как OLI, OL5 и 3'-область OL2 (и OL3) являются третьей цепью в триплексе. Точками отмечены связи Хугстиновского типа. Измененные основания в т69Т заключены в рамку.

69Т - мишень (69-мер), представляющая собой шпилечную структуру со стеблем длиной 13 п.о. OL1 образует тройной комплекс с 10-звенной Ру-Ри последовательностью стебля ШПИЛЬКИ 69-мера. OL2 сконструирован таким образом, что его 5'-область образует дуплекс с прилежащим к шпильке 69-мера 6-звенным олигопуриновым "якорным" участком (область 12-17 нуклотидов 69Т), а З'-концевой участок способен, образуя тетра-Т петлю, связываться с пред формированным дуплексом и стеблем шпильки 69Т с образованием трехцепочеч-ной структуры, состоящей из 16 триплетов. Таким образом, формируется так называемая "двойная шпилечная" структура. OL3 отличается от OL2 тем, что содержит не тетра-, а гекса-Т петлю. OL4 и OL5 соответствуют 5'- и 3'- участ-

кам OL2 и при взаимодействии с 69-мером образуют аналогичную "двойной шпилечной" структуру из двух отдельных олигонуклеотидов, не связанных тет-ра-Т мостиком. Последовательность OL7 выбрана таким образом, чтобы он мог образовывать дуплекс с одноцепочечной 5'-областью 69-мера, располагающейся в непосредственной близости от последовательности, участвующей в образовании "двойных шпилечных" структур, формируя функционально активный BamHI сайт. Под функциональной активностью BamHI сайта имеется в виду способность предформированного сайта рестрикции в составе комплекса 69Т-OL7 подвергаться расщеплению рестриктазой BamHI. 5IT - мишень, последовательность которой соответствует 1-51 нуклеотидам мишени 69Т и содержит места связывания всех семи олигонуклеотидов. т69Т - мишень 69Т, где C5S, Сл заменены на А,8, А65.

Образование комплексов 69T-OL1, 69T-OL2, OL4-69T-OL5 было подтверждено ранее с помощью методов задержки в геле, химической модификации DMS и с помощью измерения температур плавления комплексов (Brossalina et. ah, 1993).

2.1. Олигонуклеотиды модулируют расщепление комплекса 69T-OL7 рестриктазой BamHI

Были исследованы кинетические особенности расщепления комплекса 69T-OL7 рестриктазой BamHI в присутствии OL1 - OL5. Ожидалось, что образование триплекса между OL1 и стеблем шпильки 69-мера, который расположен достаточно далеко от предформированного BamHI сайта, не будет влиять на эффективность расщепления рестриктазой BamHI. Можно было также ожидать уменьшения эндонуклеазной активности в присутствии OL2, вызванного стерическими затруднениями из-за наличия рядом с BamHI сайтом "двойной шпилечной" структуры: триплекса и одноцепочечного участка петли. При этом перекрывания между местами связывания мишени с OL7 и OL2 не существует.

Зависимость глубины расщепления дуплекса 69T-OL7 по BamHI сайту от времени в отсутствие и в присутствии OL1 - OL5 приведена на рис. 8.

Видно, что добавление OL1 к дуплексу 69T-OL7 приводит к полному ингибированию расщепления BamHI сайта соответствующей рестриктазой. Добавление к реакционной смеси OL2 (также как и OL3) приводит к увеличению выхода продуктов расщепления. Аналогичный эффект наблюдался при использовании вместо OL2 смеси олигонуклеотидов OL5 и OL4. Очевидно, размер петли в олигонуклеотидах OL2 и OL3, участвующих в формировании "двойной шпилечной" структуры, также как и ее наличие (OL5+OL4), не влияют на функционирование BamHI сайта, находящегося в непосредственной близости от данной структуры. Добавление OL5 также вызывает существенное увеличение расщепления дуплекса 69T-OL7 эндонуклеазой BamHI. Следует заметить, что OL5 в отсутствие OL4 может образовывать состоящий из 10 триплетов комплекс со стеблем шпильки 69Т. Следовательно, комплекс 69T-OL5 должен структурно соответствовать комплексу, образованному OL1 со стеблем шпиль-

ки 69Т. 5'- концевой участок OL5 при этом остается несвязанным (рис. 7). Неожиданным оказался тот факт, что хотя OL1 и OL5 теоретически образуют с 69Т комплексы с одинаковой структурой, эффект их воздействия на расщепление рестриктазой ВатШ был строго противоположным: OL1 ингибировал процесс расщепления комплекса 69T-OL7, a OL5 вызывал резкое увеличение расщепления.

Рис. 8. Связывание олигонукле-отидов OL1 - OL6 с комплексом 69T-OL7 модулирует эффективность расщепления этого комплекса рестриктазой BamHI. [5'-32Р]-меченый 69-мер (5* К)"8 М) предынкубировали в течение 30 мин при 20°С в присутствии OL7 (3x10"5 М) и в присутствии или в отсутствие антисмысловых олигонуклеотидов (1x10'5 М). Расщепление комплекса 69T-OL7 рестриктазой ВатШ (0.3 е.аУмл) проводили в 50 мМ NaOAc, pH 6.0, 10 мМ MgCl2 в течение 20 мин, 60 мин и 120 мин при 20°С.

Из полученных данных следует, что связывание олигонуклеотидов (ОЬ1 - ОЬ5) либо влияет на связывание ОЬ7 с 69-мером, либо вызывает существенные структурные перестройки в комплексе 69Т-ОЬ7.

Были проанализированы комплексы этих олигонуклеотидов с 69-мером с помощью модификации БЕРС в условиях проведения расщепления дуплекса 69Т-ОЬ7 рестриктазой ВатШ. Картина электрофоретического разделения продуктов модификации БЕРС [5'-32Р]-меченого 69-мера в присутствии олигонуклеотидов ОЬ1 - ОЬ7 приведена на рис. 9. В результате образования комплекса 69Т-ОЬ7 в составе 69-мера от модификации БЕРС защищены А,, в5, в6 и А, (рис. 9, дор. 3). После добавления ОЫ, ОЬ2, ОЬ5 или ОЬ4+ОЬ5 эти основания оставались защищенными, что указывает на то, что в присутствии этих олигонуклеотидов дуплекс 69Т-ОЬ7 остается стабильным (рис. 9, дор. 4 -7).

Следовательно, разная эффективность расщепления не является результатом изменения стабильности комплекса 69Т-ОЬ7, которое могло бы быть вызвано добавлением олигонуклеотидов. Видимо, основной причиной, оказывающей влияние на эффективность рестрикции ВатШ, являются структурные перестройки в комплексе 69Т-ОЬ7, происходящие при его взаимодействии с оли-гонуклеотидами ОЬ1 - ОЬ5.

2.2. Комплекс 69T-OL7имеет в своем составе несовершенные

триплексы

Эксперименты по модификации 69-мера ББРС показали, что при добавлении ОЬ7 меняется реакционная способность некоторых пуриновых оснований в составе 69Т, не находящихся в месте связывания ОЬ7. В частности, наблюдалась повышенная реакционная способность А и в в области с 12 по 17 нуклеотид ("якорный" участок) (рис. 9, дор. 3).

Исходя из этих данных, можно предположить, что добавление ОЬ7 к 69Т приводит к образованию структуры, в которой "якорный" участок 69-мера находится в области выпетливания, а З'-область 69-мера взаимодействует с предформированным дуплексом 69Т-ОЬ7 (рис. 10). То, что перечисленные выше эффекты обусловлены участием З'-области 69Т, было показано с помощью мишени 51Т - укороченного с 3'-конца аналога мишени 69Т. Действительно, при добавлении к 51Т-мишени ОЬ7 не наблюдалось изменения картины модификации ББРС, что указывает на то, что 3'- конец 69Т взаимодействует с предформированным дуплексом.

При добавлении ОЬ1 к комплексу 69Т-ОЬ7 наблюдалось еще большее увеличение модификации

DEPC "якорного" участка 69-мера (рис. 9, дор. 4), тогда как в отсутствие OL7 таких изменений при связывании 69Т с OL1 не происходило. По-видимому, OL1, образующий триплекс со стеблем шпильки мишени, стабилизирует комплекс 69T-OL7. То есть, можно предположить, что З'-участок 69Т образует несовершенную триплексную структуру с олигопурин-олигопиримидиновой частью комплекса 69T-OL7, как это изображено на рис. 10. Стэкинг-взаимодействие с триплексом 69T-OL1 может стабилизировать несовершенный триплекс. В несовершенном триплексе предполагается участие оснований - Т52, Т6б З'-концевой области 69-мера. Образование таких структур может защищать BamHI сайт от расщепления. Действительно, как было показано выше, связывание OL1 приводит к ингибированию рестрикции комплекса 69Т-OL7.

ст

С Л

40 50

gtactcctc тстт"'

сат gaggagagaa

С а

x ал Т G G Т а л/г т

69Т

g g

г i

A- G i i

т- с а с

,Г АА

ГТ з

gatccatcg ¿ Т A t G V ЛСС

01-7

Рис. 10. Гипотетическая структура комплекса 69Т-ОЬ7. Точками отмечены связи Хуг-стиновского типа.

Исходя из гипотетической структуры комплекса 69T-OL7 (рис. 10), включающего в себя несовершенный триплекс, можно сделать следующие предположения.

Во-первых, OL1 - OL5 не должны влиять на эффективность расщепления дуплекса 51T-OL7. Действительно, удаление 18 нуклеотидов с З'-конца 69Т снимает полученные ранее эффекты, наблюдающиеся при связывании олиго-нуклеотидов. Из рис. 11 видно, что эффективность расщепления дуплекса 51Т-OL7 практически не зависит от присутствия OL1, OL2 или OL5. Это свидетельствует о том, что наличие области оснований 52-69 в 69-мере является существенным для обеспечения структурных перестроек, происходящих при образовании дуплекса 69Т-OL7, которые в свою очередь определяют влияние олигонуклеотидов OL1-OL5 на эффективность его расщепления рестрик-тазой BamHI.

Во-вторых, в предложенной структуре комплекса 69T-OL7 третья пиримидиновая цепь взаимодействует с лури-новой цепью дуплекса,

образуя Хугстиновские водородные связи. Стабильность такого триплекса зависит не только от нуклеотидной последовательности, но и от рН, так как триплеты C-G»C+ более стабильны при кислых рН. Зависимость структурной организации комплекса 69T-OL7 от рН была продемонстрирована с помощью OL2 содержащего 5-Me-Ci2-26, для которого ранее было показано, что он образует "двойную шпилечную" структуру при рН 7.0 в присутствии ионов магния (Brossalina et. al., 1993). Действительно, связывание 5-Me-C-OL2 с комплексом 69T-OL7 в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl (рН 7.0), 10 мМ MgCl2, никак не повлияло на эффективность расщепления рестриктазой ВатШ предформи-рованного дуплекса 69T-OL7. ЭТОТ факт служит еще одним доказательством того, что в основе изменения эффективности расщепления при связывании OL1 - OL5 с дуплексом 69T-OL7 при рН 6.0 лежит образование несовершенных триплексных структур.

В третьих, в соответствии со структурой, приведенной на рис. 10, последовательность участка 52-69 нуклеотидов 69Т является определяющей для ее формирования. Для доказательства роли конкретных нуклеотидов в составе 3'-области 69-мера, вовлеченных в образование несовершенного триплекса, была использована мишень т69Т, в которой были заменены на А58 и Аб5

(рис. 7). Анализ данных по эффективности расщепления комплекса m69T-OL7 рестриктазой ВатШ и модификации DEPC в отсутствие и в присутствии OL1 и OL2 показал, что полученные результаты идентичны результатам, полученным в случае использования в качестве мишени 51-мера. Следовательно, присутствие в 69-мере чрезвычайно важно для образования структуры, недоступной для расщепления рестриктазой ВатШ в присутствии OL1. Это служит дополнительным доказательством возможности существования структуры, приведенной на рис. 10.

Эта структура так же объясняет эффекты, наблюдаемые в присутствии OL2. В рамках предложенной модели образование комплекса с "двойной шпилечной" структурой 69T-OL2, в котором участвует "якорный" участок 69Т, приводит к пространственному разнесению вероятно, к разрушению несовершенных тройных комплексов, образованных З'-концом 69Т. Как следствие, ВатШ сайт, входящий в состав дуплекса 69T-OL7, должен характеризоваться большей доступностью. Действительно, добавление OL2 к комплексу 69T-OL7 приводит к повышению эффективности расщепления (рис. 8).

2.4. Основания 5*-области OL5взаимодействуют с 69Т

Предложенная модельная структура не объясняет эффекта влияния связывания OL5 на расщепление комплекса 69-OL7 рестриктазой ВатШ. ЭТОТ ОЛИ-гонуклеотид может образовывать с 69Т 10-звенную триплексную структуру, поэтому предположительный эффект комплексообразования должен был быть аналогичен действию OL1: стабилизация несовершенных триплексов и ингиби-рование расщепления по ВатШ сайту. Напротив, мы наблюдаем значительное увеличение эффективности гидролиза (рис. 8). Это может быть объяснено либо

влиянием электростатического отталкивания между различными участками 69-мера и 5'-несвязанного участка ОЬ5, либо взаимодействием этого участка ОЬ5 с "якорной" областью 69-мера и разрушением несовершенного триплекса, что кажется более вероятным.

Была осуществлена модификация 32Р-меченого ОЬ5 перманганатом калия. Оказалось, что связывание ОЬ5 с 69Т приводит к гипермодификации Т12 в составе ОЬ5. Обращает на себя внимание тот факт, что при модификации БЕРС 69-мера в присутствии ОЬ7 и ОЬ5 (рис. 9, дор. 6, стрелка) усиливается модификация А23 мишени 69Т, основания, которое должно входить в триплет Т| 2(ОЬ5)*А2з (69Т)-Т46(69Т). В присутствии 01.7 I 01.1 (или 01.2) такой повышенной модификации основания не происходило. Таким образом, ОЬ5, в отличие от ОЬ1 и ОЬ2, также формирующих триплекс со стеблем шпильки 69-мера, образует триплекс с особенной конформацией, в которой присутствует открытый триплет Т12(ОЬ5)*А23(69Т)-Т4б(69Т). Можно предположить, что это структурное изменение связано с напряжением, вызванным взаимодействием 5'-участка ОЬ5 с "якорной" областью 69Т.

Роль этого 5'-участка ОЬ5 была продемонстрирована с помощью ОЬ6 — модифицированного ОЬ5, в котором четыре С, не вовлеченные в образование триплекса со стеблем 69Т, были заменены на четыре Т (рис. 7). Было показано, что добавление олигонуклеотида ОЬ6 к комплексу 69Т-ОЬ7 приводит к инги-бированию его расщепления рестриктазой БашИ1 (рис. 8). Следовательно, ОЬ6 проявлял те же свойства, что и ОЫ, что подчеркивает определяющую роль остатков цитидина в 5'-участке ОЬ5 для дестабилизации несовершенного триплекса 69Т-ОЬ7, изображенного на рис. 10.

Таким образом, было показано, что при определенных условиях (10 мМ М^С12, рИ 6.0) не только Уотсон-Криковские, но и Хугстиновские водородные связи стабилизируют структуру ДНК-мишени: между двуцепочечным (включая предформированный БашИ1 сайт) и З'-одноцепочечным участками молекулы ДНК образуются несовершенные тройные Ру-Ри-Ру комплексы.

С помощью олигонуклеотидов с точечными заменами и делециями были охарактеризованы структурные изменения внутри молекулы ДНК-мишени, происходящие в результате связывания олигонуклеотидов. Были идентифицированы основания, участвующие в образовании несовершенных триплексов.

В данной работе показано, что, связываясь, олигонуклеотиды могут вызывать структурные перестройки мишени, приводящие к изменению эффективности расщепления предформированного БашИ1 сайта, удаленного от области связывания олигонуклеотидов. Было продемонстрировано, что такой эффект вызван образованием несовершенных триплексных структур, которые определяют функциональную активность ДНК (эффективность БашИ1 гидролиза) и стабилизируются или дестабилизируются в результате образования комплексов между ДНК-мишенью и олигонуклеотидами.

Показано, что олигонуклеотиды, которые предположительно образуют с мишенью комплексы с одинаковой структурой, могут влиять на эффективность расщепления дуплекса 69Т-ОЬ7 прямо противоположным образом. Таким

образом, при интерпретации полученных результатов необходимо принимать во внимание вероятность возникновения подобных неожиданных эффектов воздействия олигонуклеотидов.

3. Повышение специфичности связывания олигонуклеотидов при использовании в качестве мишени шпилечных структур РНК

3.1. Олигонуклеотиды способны специфично связываться с областью а-сарциновой петли 23SpPHK М. tuberculosis

Выбор в качестве мишени участков нуклеиновых кислот, частично занятых в образовании вторичной структуры, может помочь оптимизировать соотношение эффективности и специфичности воздействия олигонуклеотидов. Литературные данные свидетельствуют о том, что связывание олигонуклеотидов с областью а-сарциновой петли Е. coli приводит к подавлению роста этих бактерий (Good et.al., 1998). Но последовательность а-сарциновой петли относится к высококонсервативным последовательностям РНК, что затрудняет выбор олигонуклеотидов, специфично связывающихся с данной областью рРНК конкретного микроорганизма. Нами была осуществлена попытка выбора олигонуклеотидов, способных специфично связываться с областью а-сарциновой петли 23 S рРНК М. tuberculosis.

Взаимодействие антисмысловых олигонуклеотидов с областью а-сарциновой петли 23S рРНК изучали, используя в качестве модели 171-звенный фрагмент 23S рРНК М. tuberculosis (участок 2625-2795) (нумерация нуклеотид-ных остатков приведена по 23 S рРНК Е. coli), полученный реакцией транскрипции in vitro (рис. 12). В качестве контроля во всех экспериментах был использован аналогичный фрагмент 23S рРНК Е. coli, так как последовательности этих рРНК в области а-сарциновой петли различаются только в 3-х положениях из 27. Ранее было показано, что олигонуклеотид, комплементарный участку 26592672 23S рРНК Е. coli, эффективно связывается с этой рРНК в физиологических условиях (Petyuk et. al., 2004). Мы предположили, что олигонуклеотид, комплементарный гомологичному участку в 23S рРНК М. tuberculosis (ONI), также будет проявлять высокую эффективность взаимодействия со своей РНК-мишенью. Область связывания ON2 (2661-2674) сдвинута на 2 нуклеотида в сторону стебля шпильки, что может способствовать повышению избирательности связывания этого олигонуклеотида по сравнению с ON1. Участки связывания олигонуклеотидов ON3 (2657-2666) и ON4 (2667-2674) прилегают друг к другу. При гибридизации ON3 и ON4 с 23 S рРНК ожидалось образование тан-демного дуплекса, который, предположительно, должен обладать повышенной селективностью связывания по сравнению с полноразмерным дуплексом (ON1). При этом, нуклеотиды в ON2 и ON4, некомплементарные гомологичному участку 23S рРНК Е. coli, располагаются дальше от 5'-конца олигонуклеотидов (по сравнению с контрольным ON1), что также может способствовать повышению селективности их связывания.

Рис. 12. Вторичная структура 171-звенного фрагмента 23S рРНКМ tuberculosis. Область 23 S рРНК, к которой "адресованы" олигонуклеотиды ON I - ON4, выделена жирным шрифтом. Границы участков комплементарности олигонуклеотидов ON I- ON4 обозначены линиями. Обведены нуклеотиды, отличающиеся в 23 S рРНК М. tuberculosis и 23 S рРНК£ coli (GAC в М. tuberculosis и AGU в Е. coli). В рамки вынесена область сарциновой петли 23S рРНК и выделены сайты связывания

соответствующих олигонуклеотидов.

Взаимодействие олигонуклеотидов с равномерно мечеными фрагментами рРНК М. tuberculosis и Е. coli исследовали с помощью метода задержки в геле. рРНК (1x10"8 М) инкубировали с олигонуклеотидами, варьируя их концентрацию от 0.01 мкМ до 10 мкМ. Из зависимостей предельной степени связывания от концентрации олигонуклеотидов были определены значения термодинамических констант ассоциации КА(Табл. 1).

ON1 эффективно связывается как с 23 S рРНК М. tuberculosis, так и с 23 S рРНК Е. coli. Олигонуклеотид ON3 также связывается с обеими рРНК, но с низкой эффективностью. Напротив, ON2 и олигонуклеотиды ON3 и ON4, образующие тандемный дуплекс, эффективно связывались только с рРНК М. tuberculosis. Следует отметить, что эффективное связывание ON3 и ON4 наблюдалось только в случае их совместной гибридизации с 23 S рРНК, тогда как связывание ON4 с обеими рРНК не наблюдалось в условиях проведения эксперимента. Константы ассоциации олигонуклеотидов с рРНК существенно не изменялись при проведении реакции в присутствии ионов магния (10 мМ). 16

Для подтверждения того, что при одновременном взаимодействии ON3 и ON4 с рРНК происходит образование тандемного гетеродуплекса с участием обоих олигонуклеотидов, исследовали кинетику связывания [5'-32P]-ON3 в присутствии немеченого ON4 и [5'-32P]-ON4 в присутствии немеченого ON3. Оказалось, что в присутствии ON3 олигонуклеотид ON4 достаточно быстро гибри-дизуется с рРНКМ tuberculosis.

Таблица 1. Равновесные константы связывания олигонуклеотидов ONI - ON5 с 23 S рРНК М. tuberculosis и 23 S рРНК Е. coli._

Ка (М")и

Олигонуклеотиды Участок связывания 23 S рРНК М. tubérculos 23 S рРНК Е. coli

ON1 5'- GTCCCGGTCCTCTC 2659-2672 (7.7±0.3)х107 (7.0±0.4)хЮ6

ON2 5'- CCGTCCCGGTCCTC 2661-2674 (4.2±0.6)*Ю7 -

ON3 5'- GTCCTCTCGT 2657-2666 (7.9±0.8)х104 (8.3±0.5)х104

ON4 5'- CCGTCCCG 2667-2674 - -

ON3+ON4 2657-2674 (6.4±0.3)х106 -

]) Расчет равновесных констант связывания КА проводили с использованием программы DYNAFIT. Нумерация нуклеотидов приведена по 23 S рРНК Е. coli.

Таким образом, было продемонстрировано, что ON2 и ON3+ON4 действительно обладают повышенной специфичностью связывания с 23S рРНК М. tuberculosis по сравнению с контрольным ON1.

3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с 70S рибосомами М. smegmatis и Е. coli и влияние их связывания на функциональную активность рибосом

Олигонуклеотиды ONI, ON2 и (ON3+ON4), способные взаимодействовать с изолированными фрагментами 23 S рРНК, были использованы в экспериментах по определению эффективности их связывания с 70S рибосомами М. smegmatis и E. coli. Рибосомы выделяли из культуры М. smegmatis, так как последовательности 23 S рРНК в районе сс-сарциновой петли M. smegmatis и М. tuberculosis полностью совпадают. Кроме того, бактерии М. smegmatis обладают более высокой скоростью пролиферации по сравнению с М. tuberculosis и не патогенны для человека.

Связывание [5'-32Р]- меченых олигонуклеотидов с 70S рибосомами изучали с помощью фильтрования комплекса рибосомы через нитроцеллюлоз-ные фильтры. Данные, представленные на рис. 13, свидетельствуют о том, что ON2 избирательно связывается с рибосомами М. smegmatis, в то время как олигонуклеотиды ON1 и ON3 связываются с одинаковой эффективностью как с

рибосомами М. smegmatis, так и с рибосомами Е. coli. Оказалось, что ON4 не взаимодействует с рРНК в составе 70S рибосом ни самостоятельно, ни в присутствии ON3.

Тестом, подтверждающим, что олигонуклеотиды связываются с 70S рибосомами в области сс-сарциновой петли и блокируют биосинтез, является поли(Ц)-зависимый синтез дипептида Phe-Phe. В качестве контроля специфичности связывания был использован олигонуклеотид pTi6. Было обнаружено, что ON2 селективно подавляет формирование дипептида на рибосомах М. smegmatis, тогда как гибридизация ON1 с рибосомами приводила к снижению количества синтезированного дипептида на рибосомах обеих бактерий (Табл. 2).

Таблица 2. Ингибирование поли-зависимого синтеза дипептида Phe-Phe на 70S рибосомах М. smegmatis и Е. coli под действием олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды Степень ингибирования1'

70S рибосомы М. smegmatis 70S рибосомы Е. coli

ON1 30±5% 30±5%

ON2 25±5% 0%

рТ16 0% 0%

11 За 100% принято количество дипептида, синтезированного на рибосомах в отсутствие олигонуклеотида, что соответствует 0% подавления синтеза.

Следовательно, можно говорить о том, что подходы, используемые для повышения селективности связывания олигонуклеотидов на коротких модельных ДНК или РНК-мишенях, не всегда могут быть успешно применимы для природных РНК-мишеней, имеющих определенную вторичную структуру, стабилизирующуюся при связывании с клеточными белками. Наши исследования показали, что только ОШ, более протяженная область связывания которого расположена в участке, образующем дуплекс, а некомплементарные основания 18

находятся дальше от 5'-конца (по сравнению с контрольным ON1), можно рассматривать как потенциальный селективный ингибитор функции рибосом ми-кобактерий.

Выводы

1. Изучена структура 40-звенного функционально значимого элемента ДНК (Вс), входящего в состав Ш области длинных концевых повторов рет-ротранспозона ] 731 Drosophila melanogaster, с которым взаимодействует регу-ляторный белок NssBF.

- Показано, что в отсутствие ионов Mg2+ данный фрагмент ДНК (Вс) существует в виде двух равновесных шпилечных структур, содержащих 6 нуклеотид-ных пар в стебле и 4 или 8 нуклеотидов в петле. В присутствии ионов Mg2+ сохраняется равновесие двух шпилечных структур, содержащих 4 или 8 нуклеотидов в петле, а неструктурированные ранее 3' и 5'-концы Вс образуют несовершенный стебель, содержащий 4-звенную боковую петлю. Связывание акридиновых макроциклов с Вс в отсутствие ионов Mg2+ также приводит к стабилизации такой структуры.

- Фрагмент ДНК, комплементарный Вс (Впс), существует только в виде шпильки с четырьмя нуклеотидами в петле.

2. Исследовано связывание олигонуклеотидов с модельной 69-звенной шпилечной ДНК, содержащей элементы мини-экзонной последовательности РНК Leishmania. Выявлено влияние связывания олигонуклеотидов на структурную организацию и функциональную активность областей ДНК, не вовлеченных непосредственно в образование комплексов.

- Показано, что при определенных условиях (10 мМ MgCl2, pH 6.0) в присутствии олигонуклеотидов вторичная структура ДНК претерпевает изменения, которые определяются не только Уотсон-Криковскими, но и взаимодействиями Хугстиновского типа: происходит образование несовершенных тройных комплексов между предформированным дуплексом и достаточно удаленным от него одноцепочечным участком ДНК-мишени.

- Охарактеризованы структурные изменения в молекуле ДНК, происходящие в результате связывания с ней олигонуклеотидов и идентифицированы основания ДНК, участвующие в образовании несовершенных тройных комплексов.

- Продемонстрировано, что связывание олигонуклеотидов изменяет биологическую активность участков ДНК вследствие стабилизации или дестабилизации несовершенных тройных комплексов, определяющих функциональную активность данного участка.

3. Исследована возможность избирательного связывания олигонуклеоти-дов с областью а-сарциновой петли 23S pPHK M. tuberculosis и подавления функции рибосом микобактерий.

- Идентифицированы олигонуклеотиды, комплементарные областям 26572666 и 2667-2674, а также области 2661-2674, способные с высокой эффектив-

ностью и специфичностью связываться с фрагментом 23 S pPHK M. tuberculosis.

- Выбран олигонуклеотид, комплементарный участку 266]-2674 23S рРНК, который способен избирательно взаимодействовать с 23S рРНК микобактерий, находящейся в составе рибосом и подавлять пептидилтрансферазную активность рибосом.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Brossalina E., Demchenko E., Demchenko У., Vlassov V., Toulme J.-J. Triplex-forming oligonucleotides trigger conformation changes of a target hairpin sequence // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3342-3348.

2. Slama-Schwok A., Brossalina E., Demchenko Y., Best-Belpommeb M. and Vlassov V. Structural flexibility of a DNA hairpin, located in the Long Terminal Repeat of the Drosophila 1731 retrotransposon // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5142-5151.

3. Демченко Ю.Н., Бросалина Е.Б., Зенкова M.A., Власов В.В. Макроциклы на основе акридина — потенциальные зонды для изучения структуры нуклеиновых кислот // Известия Академии наук, Серия химическая. 2002. Т. 7. С. 11201124.

Подписано к печати "19" октября 2004г. Формат бумаги 60x84 1/16. Объём 2 псч. л. Тираж 100 экз. Заказ № 1325. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 356-600

1*2025 S

РНБ Русский фонд

2005-4 21672

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Демченко, Юлия Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ -ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДСТВА БОРЬБЫ С ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ.

1.1. Введение.

1.2. Структура, химический состав и функции клеточной стенки прокариот.

1.3. Барьерные функции клеточных стенок бактерий.

1.3.1. Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий.

1.3.2. Микобактериальная клеточная стенка.

1.4. Методы доставки антисмысловых олигонуклеотидов и их производных в клетки бактерий.

1.4.1. Использование липосом в качестве средства доставки олигонуклеотидов

1.4.2. Использование ПНК и пептид-ПНК конъюгатов для подавления роста бактериальных клеток.

1.4.3. Доставка олигонуклеотидов и их производных в клетки микобактерий.

1.5. Выбор РНК-мишеней для подавления роста и жизнедеятельности бактерий с помощью антисмысловых олигонуклеотидов и их производных.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Олигонуклеотиды.

2.3. Методы.

2.3.1. Введение 32Р метки по 5'-концевому положению олигонуклеотидов.

2.3.2. Модификация ДНК диэтилпирокарбонатом.

2.3.3. Модификация ДНК КМпО4.

2.3.4. Гидролиз ДНК эндонуклеазой S1.

2.3.5. Гидролиз ДНКрестриктазой BamHI.

2.3.6. Фотомодификация ДНК-мишени.

2.3.7. Получение РНК с помощью реакции транскрипции in vitro.

2.3.8. Выделение рибосом ирибосомных субчастиц из М. smegmatis и Е. coli.

2.3.9. Гибридизация олигонуклеотидов с РНК-транскриптом.

2.3.10. Гибридизация олигонуклеотидов с 23SрРНК в составе рибосом и рибосомных субчастиц.

2.3.11. Синтез дипептида Phe-Phe на рибосомах.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Структурная подвижность шпилечного ДНК-элемента, расположенного в U области длинных концевых повторов 1731 ретротранспозона drosophila

MEL ANOGA STER.

3.1.1. Исследование вторичной структуры фрагментов Вс и комплементарного ему Впс.

3.1.2. Анализ структуры Вс с помощью макроциклов, созданных на основе акридина.

3.2. Исследование влияния образования комплексов олигонуклеотидов со шпилечной ДНК-мишенью на структурную организацию и функционирование близлежащих областей ДНК.

3.2.1. Антисмысловые олигонуклеотиды модулируют расщепление комплекса 69T-OL7рестриктазой BamHI.

3.2.2. 3 '-Область 69Т-мишени взаимодействует с ее 5 '-областью.

3.2.3. Комплекс ОЫ-69T-OL7 образуется с участием несовершенных триплексов.

3.2.4. 5 '-Область OL5 взаимодействует с мишенью 69Т.

3.3. Повышение специфичности связывания антисмысловых олигонуклеотидов при использовании в качестве мишени РНК-шпилек.

3.3.1. Олигонуклеотиды способны специфично связываться с областью а-сарциновой петли 23SрРНК М. tuberculosis.

3.3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с 70S рибосомами М. smegmatis и Е. coli, и влияние их на функциональную активность рибосом.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурированные участки нуклеиновых кислот - мишени для избирательного воздействия низкомолекулярных лигандов и олигонуклеотидов"

Важной задачей современной молекулярной биологии является создание методов регуляции биологических процессов в исследовательских и терапевтических целях. Одним из наиболее перспективных подходов к решению этой задачи является направленное воздействие на выбранные участки нуклеиновых кислот с помощью олигонуклеотидов и их производных [1-4], а также низкомолекулярных лигандов, способных распознавать определенные структуры молекул ДНК или РНК [5-7]. Синтез различных аналогов олигонуклеотидов, устойчивых к действию нуклеаз [8,9], создание коньюгатов олигонуклеотидов с поликатионными или гидрофобными лигандами, облегчающими их проникновение в клетку [10,11], значительно расширили возможности применения олигонуклеотидов в качестве ген-направленных агентов и инструмента для молекулярно-биологических исследований. В то же время, выбор в составе молекул ДНК и РНК оптимальных мишеней для воздействия олигонуклеотидов остается актуальной задачей и на сегодняшний день.

Так как, в составе природных нуклеиновых кислот практически отсутствуют открытые участки [12], фактическими мишенями для связывания олигонуклеотидов служат некоторые элементы вторичной структуры ДНК- и РНК-молекул. Наиболее перспективными мишенями для регуляции функциональной активности нуклеиновых кислот с помощью олигонуклеотидов представляются шпилечные структуры, петлевые участки которых доступны для образования комплексов с олигонуклеотидами. Кроме того, некоторые шпильки являются функционально значимыми элементами нуклеиновых кислот, поскольку служат местами связывания регуляторных белков [13-15], а конформационные перестройки шпилечных участков часто лежат в основе природной регуляции биологических процессов [16].

При выборе области природной нуклеиновой кислоты, доступной для связывания с олигонуклеотидами, необходимо иметь полную информацию о строении и функциональной значимости конформационных состояний потенциальной мишени, а также о факторах, которые могут вызывать ее структурную реорганизацию. Следует учитывать и то, что взаимодействие с олигонуклеотидами вызовет изменение структуры мишени не только в области комплексообразования, но и с большой вероятностью будет инициировать перестройки в близлежащих областях нуклеиновой кислоты, что в свою очередь может привести к изменению их функциональной активности.

При конструировании олигонуклеотидов для экспериментов in vivo необходимо, кроме других факторов, оптимизировать соотношение эффективности и специфичности их взаимодействия с мишенью. Следует учитывать, что стандартные методы, используемые для повышения специфичности связывания олигонуклеотидов на модельных ДНК или РНК, не всегда оказываются применимы для природных молекул, имеющих сложную пространственную структуру.

Наряду с олигонуклеотидами, способными с высокой степенью специфичности взаимодействовать с мишенью, существует большое количество химических лигандов, распознающих и стабилизирующих определенные элементы вторичной структуры нуклеиновых кислот. Такие химические соединения могут быть использованы как в качестве реагентов для исследования структуры нуклеиновых кислот, так и для биотехнологических целей.

Целью настоящей работы являлось изучение функционально значимых шпилечных структур нуклеиновых кислот как потенциальных мишеней для связывания олигонуклеотидов и анализ изменений в структуре и биологической активности ДНК- и РНК-шпилек, происходящих при связывании с ними олигонуклеотидов.

В ходе исследования решались следующие задачи: изучение возможных конформаций фрагмента ДНК, являющегося сайтом связывания регуляторного белка NssBF и входящего в состав U3 области длинных концевых повторов ретротранспазона 1731 Drosophila melanogaster, а также факторов, влияющих на структурные перестройки этого фрагмента; исследованние влияния комплексообразования олигонуклеотидов с ДНК на структурную организацию и биологическую активность близлежащих областей ДНК, не вовлеченных непосредственно в образование комплексов; выявление олигонуклеотидов, способных специфически связываться с областью а-сарциновой петли 23S рРНКМ tuberculosis.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Демченко, Юлия Николаевна

выводы

1. Изучена структура 40-звенного функционально значимого элемента ДНК (Вс), входящего в состав U3 области длинных концевых повторов ретротранспозона 1731 Drosophila melanogaster, с которым взаимодействует регуляторный белок NssBF.

- Показано, что в отсутствие ионов Mg2+ данный фрагмент ДНК (Вс) существует в виде двух равновесных шпилечных структур, содержащих 6 нуклеотидных пар в стебле и 4 или 8 нуклеотидов в петле. В присутствии ионов Mg2+ сохраняется равновесие двух шпилечных структур, содержащих 4 или 8 нуклеотидов в петле, а неструктурированные ранее 3' и 5'-концы Вс образуют несовершенный стебель, содержащий 4-звенную боковую петлю. Связывание акридиновых макроциклов с Вс в отсутствие ионов Mg2+ также приводит к стабилизации такой структуры.

- Фрагмент ДНК, комплементарный Вс (Впс), существует только в виде шпильки с четырьмя нуклеотидами в петле.

- Показано, что при определенных условиях (10 мМ MgCh, рН 6.0) в присутствии олигонуклеотидов вторичная структура ДНК претерпевает изменения, которые определяются не только Уотсон-Криковскими, но и взаимодействиями Хугстиновского типа: происходит образование несовершенных тройных комплексов между предформированным дуплексом и достаточно удаленным от него одноцепочечным участком ДНК-мишени.

3. Исследована возможность избирательного связывания олигонуклеотидов с областью а-сарциновой петли 23 S рРНК М. tuberculosis и подавления функции рибосом микобактерий.

- Идентифицированы олигонуклеотиды, комплементарные областям 2657-2666 и 26672674, а также области 2661-2674, способные с высокой эффективностью и специфичностью связываться с фрагментом 23 S рРНК М. tuberculosis.

- Выбран олигонуклеотид, комплементарный участку 2661-2674 23S рРНК, который способен избирательно взаимодействовать с 23 S рРНК микобактерий, находящейся в составе рибосом и подавлять пептидилтрансферазную активность рибосом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Демченко, Юлия Николаевна, Новосибирск

1. Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonucleosides and diribonucleoside phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues. // Tetrahedron Lett. 1967. V. 37. P. 3557-3562.

2. Helene C., Toulme J.J. Specific regulation of gene expression by antisense, sense and antigene nucleic acids. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1049. P. 99-125.

3. Demidov V.V., Frank-Kamenetskii M.D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. // Trends Biochem. Sci. 2004. V. 29. P. 62-71.

4. Benimetskaya L., Stein C.A. Antisense therapy: recent advances and relevance to prostate cancer. // Clin. Prostate Cancer. 2002. V. 1. P. 20-30.

5. Chen X., Burrows C.J., Rokita S.E. Ligand effects associated with the intrinsicselectivity of DNA oxidation promoted by nickel(II) macrocyclic complexes. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 322-325.

6. Kappen L.S.,Goldberg I.H. Site-specific cleavage at a DNA bulge by neocarzinostatin chromophore via a novel mechanism. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 13138-13145.

7. Kappen L.S., Goldberg I.H. Characterization of a covalent monoadduct of neocarzinostatin chromophore at a DNA bulge. // Biochemistry. 1997 . V. 36. P. 14861-14867.

8. Marshall W.S., Caruthers M.H. Phosphorodithioate DNA as a potential therapeutic drug. // Science. 1993. V. 259. P. 1564-1570.

9. Stein C.A.,Cheng Y.C. Antisense oligonucleotides as therapeutic agents—is the bullet really magical? // Science. 1993. V. 20. P. 1004-1012.

10. Vlassov V.V., Balakireva L.A., Yakubov L.A. Transport of oligonucleotides across natural and model membranes. // Biochim. Biophys. Acta . 1994. V. 1197. P. 95-108.

11. Leonetti J.P., Degols G., Clarenc J.P., Mechti N., Lebleu B. Cell delivery and mechanisms of action of antisense oligonucleotides. // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1993. V. 44:143-66. P. 143-166.

12. Kikinis Z., Eisenstein R.S., Bettany A.J., Munro H.N. Role of RNA secondary structure of the iron-responsive element in translational regulation of ferritin synthesis. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4190-4195.

13. Witherell G.W., Gott J.M., Uhlenbeck O.C. Specific interaction between RNA phage coat proteins and RNA. // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1991. V. 40:185-220. P. 185-220.

14. Oubridge C., Ito N., Evans P.R., Тео C.H., Nagai K. Crystal structure at 1.92 A resolution of the RNA-binding domain of the U1A spliceosomal protein complexed with an RNA hairpin. // Nature. 1994. V. 372. P. 432-438.

15. Jacks T. Translational suppression in gene expression in retroviruses and retrotransposons. // Curr. Top.Microbiol.Immunol. 1990. V. 157:93-124. P. 93-124.

16. Murray B.E. New aspects of antimicrobial resistance and the resulting therapeutic dilemmas. II J. Infect. Dis. 1991. V. 163. P. 1184-1194.

17. Neu H.C. Antimicrobial agents: the old and the new. И Am. J.Infect. Control. 1989. V. 17. P. 276 -285.

18. O'Sullivan N., Wise R. Macrolide, lincosamide, and streptogramin antibiotics. // Current Opinion in Infectious Diseases. 1990. V. 3. P. 743-750.

19. Neu H.C. The crisis in antibiotic resistance. // Science. 1992. V. 257. P. 1064-1073.

20. Гусев M.B., Минеева JI.А. Микробиология. M.: Мир. 1992.

21. Katz A.H.,Caufield С.Е. Structure-based design approaches to cell wall biosynthesis inhibitors. // Curr.Pharm.Des. 2003. V. 9. P. 857-866.

22. Nikaido H. Preventing drug access to targets: cell surface permeability barriers and active efflux in bacteria. // Semin.Cell Dev.Biol. 2001. V. 12. P. 215-223.

23. Nikaido H.,Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. // Microbiol. Rev. 1985. V. 49. P. 1-32.

24. Schulz G.E. Bacterial porins: structure and function. // Curr. Opin. Cell Biol. 1993. V. 5. P. 701-707.

25. Cowan S.W., Schirmer Т., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit R.A., Jansonius J.N., Rosenbusch J.P. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. // Nature. 1992. V. 358. P. 727-733.

26. Decad G.M., Nikaido H. Outer membrane of gram-negative bacteria. XII. Molecular-sieving function of cell wall. // J.Bacteriol. 1976. V. 128. P. 325-336.

27. Nikaido H., Rosenberg E.Y., Foulds J. Porin channels in Escherichia coli: studies with beta-lactams in intact cells. II J. Bacteriol. 1983. V. 153. P. 232-240.

28. Sen К., Hellman J., Nikaido H. Porin channels in intact cells of Escherichia coli are not affected by Donnan potentials across the outer membrane. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 11821187.

29. Nikaido H. and Hancock R. Outer membrane permeability of Pseudomonas aeruginosa. The Bacteria. 145-193.

30. Nikaido H., Nikaido K., Harayama S. Identification and characterization of porins in Pseudomonas aeruginosa . II J.Biol.Chem. 1991. V. 266. P. 770-779.

31. Sugawara E., Nikaido H. OmpA protein of Escherichia coli outer membrane occurs in open and closed channel forms. II J.Biol.Chem. 1994. V. 269. P. 17981-17987.

32. Pautsch A., Schulz G.E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. II Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. P. 1013-1017.

33. Sugawara E., Steiert M., Rouhani S., Nikaido H. Secondary structure of the outer membrane proteins OmpA of Escherichia coli and OprF of Pseudomonas aeruginosa. // J. Bacterial. 1996 . V. 178. P. 6067-6069.

34. Nikaido H. Outer membrane barrier as a mechanism of antimicrobial resistance. // Antimicrob. Agents Chemother. 1989. V. 33. P. 1831-1836.

35. Plesiat P., Nikaido H. Outer membranes of gram-negative bacteria are permeable to steroid probes. II Mol.Microbiol. 1992. V. 6. P. 1323-1333.

36. Nikaido H.,Thanassi D.G. Penetration of lipophilic agents with multiple protonation sites into bacterial cells: tetracyclines and fluoroquinolones as examples. // Antimicrob. Agents Chemother. 1993. V. 37. P. 1393-1399.

37. Nikaido H., Kim S.H., Rosenberg E.Y. Physical organization of lipids in the cell wall of Mycobacterium chelonae. // Mol. Microbiol 1993. V. 8. P. 1025-1030.

38. Liu J., Barry C.E., III, Besra G.S., Nikaido H. Mycolic acid structure determines the fluidity of the mycobacterial cell wall. II J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 29545-29551.

39. Jarlier V.,Nikaido H. Permeability barrier to hydrophilic solutes in Mycobacterium chelonei. II J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 1418-1423.

40. Senaratne R.H., Mobasheri H., Papavinasasundaram K.G., Jenner P., Lea E.J., Draper P. Expression of a gene for a porin-like protein of the OmpA family from Mycobacterium tuberculosis H37Rv. II J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 3541-3547.

41. Brennan P.J., Nikaido H. The envelope of mycobacteria. // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 29-63.

42. Liu J., Nikaido H. A mutant of Mycobacterium smegmatis defective in the biosynthesis of mycolic acids accumulates meromycolates. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. V. 96. P. 40114016.

43. Takayama K., Kilburn J.O. Inhibition of synthesis of arabinogalactan by ethambutol in Mycobacterium smegmatis. // Antimicrob. Agents Chemother. 1989. V. 33. P. 1493-1499.

44. Li X.Z., Nikaido H., Poole K. Role of mexA-mexB-oprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. // Antimicrob. Agents Chemother. 1995. V. 39. P. 1948-1953.

45. Nikaido H. Multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria. // J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 5853-5859.

46. Koranyi P., Burg K., Berenyi M. Stable electrotransformation of symbiont candidate diazotrophic bacterium with plasmids carrying selectable and screenable marker genes. // Res. Microbiol. 1998. V. 149. P. 361-372.

47. Dower W.J., Miller J.F., Ragsdale C.W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. 11 Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 6127-6145.

48. Барсуков Л.И. Липосомы. // Соросовский образовательный журнал. 1998. Т. 10. С. 29.

49. Bangham A.D., Standish М.М., Watkins J.С. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. II J. Mol. Biol. 1965. V. 13. P. 238-252.

50. Gershon H., Ghirlando R., Guttman S.B., Minsky A. Mode of formation and structural features of DNA-cationic liposome complexes used for transfection. // Biochemistry. 1993. V. 20. P. 7143-7151.

51. Oh Y.K., Nix D.E., Straubinger R.M. Formulation and efficacy of liposome-encapsulated antibiotics for therapy of intracellular Mycobacterium avium infection. II Antimicrob. Agents Chemother. 1995. V. 39. P. 2104-2111.

52. Heath T.D., Lopez N.G., Papahadjopoulos D. The effects of liposome size and surface charge on liposome-mediated delivery of methotrexate-gamma-aspartate to cells in vitro. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 820. P. 74-84.

53. Ng K.Y., Heath T.D. Liposome-dependent delivery of pteridine antifolates: a two-compartment growth inhibition assay for evaluating drug leakage and metabolism. // Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 981. P. 261-268.

54. Feigner P.L., Gadek T.R., Holm M., Roman R., Chan H.W., Wenz M., Northrop J.P., Ringold G.M., Danielsen M. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987. V. 84. P. 7413-7417.

55. Gao X., Huang L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 179. P. 280-285.

56. Farhood H., Bottega R., Epand R.M., Huang L. Effect of cationic cholesterol derivatives on gene transfer and protein kinase С activity, // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1111. P. 239246.

57. Feigner J.H., Kumar R„ Sridhar C.N., Wheeler C.J., Tsai Y.J., Border R., Ramsey P., Martin M., Feigner P.L. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. И J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 2550-2561.

58. Zabner J., Fasbender A.J., Moninger Т., Poellinger K.A., Welsh M.J. Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 18997

59. Zelphati O., Szoka F.C., Jr. Mechanism of oligonucleotide release from cationic liposomes. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. P. 11493-11498.

60. Sachetelli S., Khalil H., Chen Т., Beaulac C., Senechal S., Lagace J. Demonstration of a fusion mechanism between a fluid bactericidal liposomal formulation and bacterial cells. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1463. P. 254-266.

61. Good L., Nielsen P.E. Inhibition of translation and bacterial growth by peptide nucleic acid targeted to ribosomal RNA. II Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 2073-2076.

62. Good L., Nielsen P.E. Antisense inhibition of gene expression in bacteria by PNA targeted to mRNA. II Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 355-358.

63. Good L., Sandberg R., Larsson O., Nielsen P.E., Wahlestedt C. Antisense PNA effects in Escherichia coli are limited by the outer-membrane LPS layer. // Microbiology. 2000. V. 146. P. 2665-2670.

64. Eriksson M., Nielsen P.E., Good L. Cell permeabilization and uptake of antisense peptide-peptide nucleic acid (PNA) into Escherichia coli. II J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 7144-7147.

65. Good L., Awasthi S.K., Dryselius R., Larsson O., Nielsen P.E. Bactericidal antisense effects of peptide-PNA conjugates. II Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 360-364.

66. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. // Science. 1991. V. 254. P. 14971500.

67. Egholm M. Peptide nucleic acid (PNA). Oligonucleotide analogues with an achiral peptide backbone. II J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 1895-1897.

68. Egholm M., Nielsen P.E., Berg R.H. Recognition of guanine and adenine in DNA by cytosine and thymine containing peptide nucleic acids (PNA). // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 9677-9678.

69. Demidov V.V., Potaman V.N., Frank-Kamenetskii M.D., Egholm M., Buchard O., Sonnichsen S.H., Nielsen P.E. Stability of peptide nucleic acids in human serum and cellular extracts. I/Biochem. Pharmacol. 1994. V. 48. P. 1310-1313.

70. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O. Peptide nucleic acids (PNAs): potential antisense and anti-gene agents. // Anticancer Drug Des. 1993. V. 8. P. 53-63.

71. Hanvey J.C., Peffer N.J., Bisi J.E., Thomson S.A., Cadilla R., Josey J.A., Ricca D.J., Hassman C.F., Bonham M.A., Au K.G. Antisense and antigene properties of peptide nucleic acids. II Science. 1992. V. 258. P. 1481-1485.

72. Mollegaard N.E., Buchardt O., Egholm M., Nielsen P.E. Peptide nucleic acid.DNA strand displacement loops as artificial transcription promoters. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91. P. 3892-3895.

73. Zorzopulos J., de Long S., Chapman V., Kozloff L.M. Evidence for a net-like organization of lipopolysaccharide particles in the Escherichia coli outer membrane. // FEMS Microbiol. Lett. 1989. V. 52. P. 23-26.

74. Sekiguchi M., Iida S. Mutants of Escherichia coli permeable to actinomycin. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1967. V. 58. P. 2315-2320.

75. Normark S., Boman H.G., Matsson E. Mutant of Escherichia coli with anomalous cell division and ability to decrease episomally and chromosomally mediated resistance to ampicillin and several other antibiotics. И J. Bacteriol. 1969. V. 97. P. 1334-1342.

76. Beja O., Bibi E. Functional expression of mouse Mdrl in an outer membrane permeability mutant of Escherichia coli. И Proc. Natl Acad Sci. U.S.A. 1996. V. 93. P. 5969-5974.

77. Derossi D., Joliot A.H., Chassaing G., Prochiantz A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 10444-10450.

78. Frankel A.D.,Pabo C.O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. II Cell. 1988. V. 55. P. 1189-1193.

79. Green M., Loewenstein P.M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. // Cell. 1988. V. 55. P. 1179-1188.

80. Elliott G., O'Hare P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. // Cell. 1997. V. 88. P. 223-233.

81. Futaki S. Arginine-rich peptides: potential for intracellular delivery of macromolecules and the mystery of the translocation mechanisms. // Int. J. Pharm. 2002. V. 245. P. 1-7.

82. Morris M.C., Depollier J., Mery J., Heitz F., Divita G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 1173-1176.

83. Wadia J.S., Dowdy S.F. Protein transduction technology. // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. V. 13. P. 52-56.

84. Vaara M., Porro M. Group of peptides that act synergistically with hydrophobic antibiotics against gram-negative enteric bacteria . // Antimicrob. Agents Chemother. 1996. V. 40. P. 18011805.

85. Hancock R.E. The bacterial outer membrane as a drug barrier. II Trends Microbiol. 1997. V. 5. P. 37-42.

86. Lehrer R.I., Barton A., Ganz T. Concurrent assessment of inner and outer membrane permeabilization and bacteriolysis in E. coli by multiple-wavelength spectrophotometry. // J. Immunol. Methods. 1988. V. 108. P. 153-158.

87. Rapaport E., Levina A., Metelev V., Zamecnik P.C. Antimycobacterial activities of antisense oligodeoxynucleotide phosphorothioates in drug-resistant strains. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. P. 709-713.

88. Takayama K., Armstrong E.L., Kunugi K.A., Kilburn J.O. Inhibition by ethambutol of mycolic acid transfer into the cell wall of Mycobacterium smegmatis. // Antimicrob. Agents Chemother. 1979. V. 16. P. 240-242.

89. Silve G., Valero-Guillen P., Quemard A., Dupont M.A., Daffe M., Laneelle G. Ethambutol inhibition of glucose metabolism in mycobacteria: a possible target of the drug. // Antimicrob. Agents Chemother. 1993. V. 37. P. 1536-1538.

90. Rastogi N., Goh K.S., David H.L. Enhancement of drug susceptibility of Mycobacterium avium by inhibitors of cell envelope synthesis. // Antimicrob. Agents Chemother. 1990. V. 34. P. 759-764.

91. Hoffner S.E., Kallenius G., Beezer A.E., Svenson S.B. Studies on the mechanisms of the synergistic effects of ethambutol and other antibacterial drugs on Mycobacterium avium complex. // Acta Leprol. 1989. V. 7. P. 195-199.

92. Cirillo J.D., Weisbrod T.R., Pascopella L., Bloom B.R., Jacobs W.R., Jr. Isolation and characterization of the aspartokinase and aspartate semialdehyde dehydrogenase operon from mycobacteria. // Mol. Microbiol. 1994. V. 11. P. 629-639.

93. Cirillo J.D., Barletta R.G., Bloom B.R., Jacobs W.R., Jr. A novel transposon trap for mycobacteria: isolation and characterization of IS 1096. // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 77727780.

94. Martineau R., Kohlbacher M., Shaw S.N., Amos H. Enhancement of hexose entry into chick fibroblasts by starvation: differential effect on galactose and glucose. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1972. V. 69. P. 3407-3411.

95. Agrawal S., Tang J.Y., Brown D.M. Analytical study of phosphorothioate analogues of oligodeoxynucleotides using high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. 1990. V. 509. P. 396-399.

96. Iseman M.D. Treatment of multidrug-resistant tuberculosis. // N. Engl. J. Med. 1993. V. 329. P. 784-791.

97. Harth G., Clemens D.L., Horwitz M.A. Glutamine synthetase of Mycobacterium tuberculosis: extracellular release and characterization of its enzymatic activity. // Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 1994. V. 91. P. 9342-9346.

98. Dryselius R., Aswasti S.K., Rajarao G.K., Nielsen P.E., Good L. The translation start codon region is sensitive to antisense PNA inhibition in Escherichia coli. // Oligonucleotides. 2003. V. 13. P. 427-433.

99. Huttenhofer A., Noller H.F. Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes. IIEMBOJ. 1994. V. 13. P. 3892-3901.

100. Knudsen H., Nielsen P.E. Antisense properties of duplex- and triplex-forming PNAs. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 494-500.

101. Gasparro F.P., Edelson R.L., O'Malley M.E., Ugent S.J., Wong H.H. Photoactivatable antisense DNA: suppression of ampicillin resistance in normally resistant Escherichia coli. // Antisense Res. Dev. 1991. V. 1. P. 117-140.

102. Belisle J.T., Vissa V.D., Sievert Т., Takayama K., Brennan P.J., Besra G.S. Role of the major antigen of Mycobacterium tuberculosis in cell wall biogenesis. // Science. 1997. V. 276. P. 1420-1422.

103. Lee B.Y., Horwitz M.A. Identification of macrophage and stress-induced proteins of Mycobacterium tuberculosis. И J. Clin. Invest. 1995. V. 96. P. 245-249.

104. Cohen S.P., Yan W., Levy S.B. A multidrug resistance regulatory chromosomal locus is widespread among enteric bacteria. II J. Infect. Dis. 1993. V. 168. P. 484-488.

105. Cohen S.P., Levy S.B., Foulds J., Rosner J.L. Salicylate induction of antibiotic resistance in Escherichia coli: activation of the mar operon and a mar-independent pathway. // J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 7856-7862.

106. Cohen S.P., Hachler H., Levy S.B. Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance (mar) locus in Escherichia coli. II J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 1484-1492.

107. Gambino L., Gracheck S.J., Miller P.F. Overexpression of the MarA positive regulator is sufficient to confer multiple antibiotic resistance in Escherichia coli. // J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 2888-2894.

108. George A.M., Levy S.B. Amplifiable resistance to tetracycline, chloramphenicol, and other antibiotics in Escherichia coli: involvement of a non-plasmid-determined efflux of tetracycline. // J. Bacteriol. 1983. V. 155. P. 531-540.

109. George A.M., Levy S.B. Gene in the major cotransduction gap of the Escherichia coli K-12 linkage map required for the expression of chromosomal resistance to tetracycline and other antibiotics. HJ. Bacteriol. 1983. V. 155. P. 541-548.

110. Goldman J.D., White D.G., Levy S.B. Multiple antibiotic resistance (mar) locus protects Escherichia coli from rapid cell killing by fluoroquinolones. // Antimicrob. Agents Chemother. 1996. V. 40. P. 1266-1269.

111. McMurry L.M., George A.M., Levy S.B. Active efflux of chloramphenicol in susceptible Escherichia coli strains and in multiple-antibiotic-resistant (Mar) mutants. // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. V. 38. P. 542-546.

112. Ariza R.R., Cohen S.P., Bachhawat N., Levy S.B., Demple B. Repressor mutations in the marRAB operon that activate oxidative stress genes and multiple antibiotic resistance in Escherichia coli. // J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 143-148.

113. Asako H., Nakajima H., Kobayashi K., Kobayashi M., Aono R. Organic solvent tolerance and antibiotic resistance increased by overexpression of marA in Escherichia coli. // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 63. P. 1428-1433.

114. White D.G., Goldman J.D., Demple В., Levy S.B. Role of the acrAB locus in organic solvent tolerance mediated by expression of marA, soxS, or robA in Escherichia coli. // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 6122-6126.

115. Jayaraman K., McParland K., Miller P., Ts'o P.O. Selective inhibition of Escherichia coli protein synthesis and growth by nonionic oligonucleotides complementary to the 3' end of 16S rRNA. II Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1981. V. 78. P. 1537-1541.

116. Endo Y.,Wool I.G. The site of action of alpha-sarcin on eukaryotic ribosomes. The sequence at the alpha-sarcin cleavage site in 28 S ribosomal ribonucleic acid. // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 9054-9060.

117. Schindler D.G., Davies J.E. Specific cleavage of ribosomal RNA caused by alpha sarcin. // Nucleic Acids Res. 1977. V. 4. P. 1097-1110.

118. Endo Y., Huber P.W., Wool I.G. The ribonuclease activity of the cytotoxin alpha-sarcin. The characteristics of the enzymatic activity of alpha-sarcin with ribosomes and ribonucleic acids as substrates. II J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 2662-2667.

119. Ackerman E.J., Saxena S.K., Ulbrich N. Alpha-sarcin causes a specific cut in 28 S rRNA when microinjected into Xenopus oocytes. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 17076-17083.

120. Hobden A.N., Cundliffe E. The mode of action of alpha sarcin and a novel assay of the puromycin reaction. // Biochem. J. 1978. V. 170. P. 57-61.

121. Wool I.G. The mechanism of action of the cytotoxic nuclease alfa-sarcin and its use to analyze ribosome structure. // Trends.Biochem. Sci. 1984. V. 9. P. 14-17.

122. Chan Y.L., Endo Y., Wool I.G. The sequence of the nucleotides at the alpha-sarcin cleavage site in rat 28 S ribosomal ribonucleic acid. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 1276812770.

123. Gutell R.R., Schnare M.N., Gray M.W. A compilation of large subunit (23S- and 23S-like) ribosomal RNA structures. II Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 2095-2109.

124. Marchant A., Hartley M.R. Mutational studies on the alpha-sarcin loop of Escherichia coli 23S ribosomal RNA. // Eur. J. Biochem. 1994. V. 226. P. 141-147.

125. Tapio S., Isaksson L.A. Base 2661 in Escherichia coli 23S rRNA influences the binding of elongation factor Tu during protein synthesis in vivo. // Eur. J. Biochem. 1991. V. 202. P. 981984.

126. San Jose C., Kurland C.G., Stoffler G. The protein neighborhood of ribosome-bound elongation factor Tu . IIFEBS Lett. 1976. V. 72. P. 133 -137.

127. Correll C.C., Munishkin A., Chan Y.L., Ren Z., Wool I.G., Steitz T.A. Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 13436-13441.

128. Macbeth M.R., Wool I.G. The phenotype of mutations of G2655 in the sarcin/ricin domain of 23 S ribosomal RNA. II J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P. 965-975.

129. Endo Y., Gluck A., Chan Y.L., Tsurugi K., Wool I.G. RNA-protein interaction. An analysis with RNA oligonucleotides of the recognition by alpha-sarcin of a ribosomal domain critical for function. II J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 2216-2222.

130. Szewczak A.A., Chan Y.L., Moore P.B., Wool I.G. On the conformation of the alpha sarcin stem-loop of 28S rRNA. // Biochimie. 1991. V. 73. P. 871-877.

131. Shine J., Dalgarno L. Determinant of cistron specificity in bacterial ribosomes. // Nature. 1975. V. 254. P. 34-38.

132. Hagenbuchle O., Santer M., Steitz J.A., Mans R.J. Conservation of the primary structure at the 3' end of 18S rRNA from eucaryotic cells. // Cell. 1978. V. 13. P. 551-563.

133. Грязнов C.M., Горн В.В., Зарытова В.Ф., Кумарев В.П., Полищук А.С., Шабарова З.А. Автоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов фосфитамидным способом на установке "Виктория-4М". // Изв. СО АН СССР. Сер.Хим. 1987. Т. 1. С. 119-123.

134. Maxam A.M., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. // Methods Enzymol. 1980. V. 65. P. 499-560.

135. Jones M.D. Reverse transcription of mRNA by Thermus aquaticus DNA polymerase followed by polymerase chain reaction amplification. // Methods Enzymol. 1993. V. 218. P. 413419.

136. Milligan J.F., Uhlenbeck O.C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. // Methods Enzymol. 1989. V. 180:51-62. P. 51-62.

137. Yamada T. Characterization of an SI-like protein in Mycobacterium smegmatis ribosomes. // FEBS Lett. 1982. V. 142. P. 267-270.

138. Kuzmic P. Program DYNAFIT for the analysis of enzyme kinetic data: application to HIV proteinase. // Anal.Biochem. 1996. V. 237. P. 260-273.

139. Rheinberger H.J., Geigenmuller U., Wedde M., Nierhaus K.H. Parameters for the preparation of Escherichia coli ribosomes and ribosomal subunits active in tRNA binding. // Methods Enzymol. 1988. V. 164. P. 658-670.

140. Heckler T.G., Roesser J.R., Xu C., Chang P.I., Hecht S.M. Ribosomal binding and dipeptide formation by misacylated tRNA(Phe),S. II Biochemistry. 1988. V. 20. P. 7254-7262.

141. Анкилова В., Горшкова И.Н., Кононова Т.А., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Блокирование тРНК-узнающего участка фенилаланин-тРНК-синтетазы из Е. coli MRE-600 с помощью N-хлор-амбуцилил-фенилаланин тРНК. // Молек. биолог. 1978. Т. 12. С. 10851095.

142. Marino J.P., Gregorian R.S., Jr., Csankovszki G. , Crothers D.M. Bent helix formation between RNA hairpins with complementary loops. // Science. 1995. V. 268. P. 1448-1454.

143. Mitas M., Yu A., Dill J., Kamp T.J., Chambers E.J., Haworth I.S. Hairpin properties of single-stranded DNA containing a GC-rich triplet repeat: (CTG)15. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 1050-1059.

144. Bruzik J.P., Van Doren K., Hirsh D., Steitz J.A. Trans splicing involves a novel form of small nuclear ribonucleoprotein particles. II Nature. 1988. V. 335. P. 559-562.

145. Knaus Т., Nassal M. The encapsidation signal on the hepatitis В virus RNA pregenome forms a stem-loop structure that is critical for its function. // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 3967-3975.

146. Yang S., Temin H.M. A double hairpin structure is necessary for the efficient encapsidation of spleen necrosis virus retroviral RNA. // EMBOJ. 1994. V. 13. P. 713 -726.

147. Wilson K.S., von Hippel P.H. Transcription termination at intrinsic terminators: the role of the RNA hairpin. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. V. 92. P. 8793-8797.

148. Gacy A.M., McMurray C.T. Hairpin formation within the human enkephalin enhancer region. 1. Kinetic analysis. //Biochemistry. 1994. V. 33. P. 11951-11959.

149. Peronnet F., Becker J.L., Becker J., d'Auriol L., Galibert F., Best-Belpomme M. 1731, a new retrotransposon with hormone modulated expression. // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 9017-9033.

150. Fourcade-Peronnet F., Codani-Simonart S., Best-Belpomme M. A nuclear single-stranded-DNA binding factor interacts with the long terminal repeats of the 1731 Drosophila retrotransposon . II J. Virol. 1992 . V. 66. P. 1682-1687.

151. Lacoste J., Fourcade-Peronnet F. The NssBF element, a sequence of the Drosophila melanogaster retrotransposon 1731 potentially implicated in transcriptional repression and replication. // FEBS Lett. 1995. V. 357. P. 283-286.

152. Lacoste J., Codani-Simonart S., Best-Belpomme M., Peronnet F. Characterization and cloning of pi 1, a transrepressor of Drosophila melanogaster retrotransposon 1731 . // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 5073-5079.

153. Teulade-Fichou M.P., Vigneron J.P., Lehn J.M. Molecular recognition of nucleosides and nucleotides by a water-soluble cyclo-bis-intercaland receptor based on acridine submits. // Supramolecular Chem. 1995. V. 5. P. 139-147.

154. Slama-Schwok A., Teulade-Fichou M.P., Vigneron J.P., Taillandier E., Lehn J.M. Selective binding of a macrocyclic bisacridine to DNA hairpins. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 6822-6830.

155. Fukui К., Tanaka K., Fujitsuka M., Watanabe A., Ito O. Distance dependence of electron transfer in acridine-intercalated DNA. II J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1999. V. 50. P. 18-27.

156. Burrows C.J., Muller J.G. Oxidative nucleobase modifications leading to strand scission. // Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1109-1151.

157. Bruce A.G., Armitage E. Photocleavage of nucleic acids. // Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1171-1200.

158. Bhattacharyya A., Murchie A.I., Lilley D.M. RNA bulges and the helical periodicity of double-stranded RNA. // Nature. 1990. V. 343. P. 484-487.

159. Gohlke C., Murchie A.I., Lilley D.M., Clegg R.M. Kinking of DNA and RNA helices by bulged nucleotides observed by fluorescence resonance energy transfer. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91. P. 11660-11664.

160. Brossalina E., Pascolo E., Toulme J.J. The binding of an antisense oligonucleotide to a hairpin structure via triplex formation inhibits chemical and biological reactions. // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 5616-5622.

161. Borst P. Discontinuous transcription and antigenic variation in trypanosomes. // Annu. Rev. Biochem. 1986. V. 55. P. 701-732.

162. Pascolo E., Blonski C., Shire D., Toulme J.J. Antisense effect of oligodeoxynucleotides complementary to the mini-exon sequence of the protozoan parasite Leishmania amazonensis. // Biochimie. 1993. V. 75. P. 43-47.

163. Toulme J.J., Tinevez R.L., Brossalina E. Targeting RNA structures by antisense oligonucleotides. // Biochimie. 1996. V. 78. P. 663-673.

164. Brossalina E., Demchenko E., Vlassov V. Effect of magnesium ions and low pH on interaction of pyrimidine oligonucleotides with dsDNA: affinity modification study. // Nucleic Acids Symp. Ser. 1991. P. 107-111.

165. Maher L.J., Wold В., Dervan P.B. Inhibition of DNA binding proteins by oligonucleotide-directed triple helix formation. // Science. 1989. V. 245. P. 725-730.

166. Germann M.W., Kalisch B.W., van de Sande J.H. Relative stability of parallel- and antiparallel-stranded duplex DNA. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 8302-8306.

167. Otto C., Thomas G.A., Rippe K., Jovin T.M., Peticolas W.L. The hydrogen-bonding structure in parallel-stranded duplex DNA is reverse Watson-Crick. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 3062-3069.

168. Robinson H., van der Marel G.A., van Boom J.H., Wang A.H. Unusual DNA conformation at low pH revealed by NMR: parallel-stranded DNA duplex with homo base pairs. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 10510-10517.

169. Liu K., Miles H.T., Frazier J., Sasisekharan V. A novel DNA duplex. A parallel-stranded DNA helix with Hoogsteen base pairing. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 11802-11809.

170. Meyer H.A., Triana-Alonso F., Spahn C.M., Twardowski Т., Sobkiewicz A., Nierhaus K.H. Effects of antisense DNA against the alpha-sarcin stem-loop structure of the ribosomal 23S rRNA. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3996-4002.

171. Leffers H., Egebjerg J., Andersen A., Christensen Т., Garrett R.A. Domain VI of Escherichia coli 23 S ribosomal RNA. Structure, assembly and function. // J. Mol. Biol. 1988. V. 204. P. 507-522.

172. Petyuk V.A., Serikov R.N., Zenkova M.A., Vlassov V.V. Hybridization of antisense oligonucleotide with a-sarcin loop region of Escherichia coli 23 S rRNA. // Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acids. 2004

173. Kandimalla E.R., Manning A., Lathan C., Byrn R.A., Agrawal S. Design, biochemical, biophysical and biological properties of cooperative antisense oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3578-3584.

174. Colossi N., Dervan P.B. Cooperative Binding of 8-mer Oligonucleotides Containing 5-(l-Propynyl)-2'-deoxyuridine to Adjacent DNA Sites by Triple-Helix Formation . // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 785-786.

175. Jolles В., Refregiers M., Laigle A. Opening of the extraordinarily stable mini-hairpin d(GCGAAGC). // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4608-4613.

176. Lima W.F., Monia B.P., Ecker D.J., Freier S.M. Implication of RNA structure on antisense oligonucleotide hybridization kinetics. II Biochemistry. 1992. V. 31. P. 12055-12061.

177. Heym В., Cole S.T. Isolation and characterization of isoniazid-resistant mutants of Mycobacterium smegmatis and M. aurum. // Res. Microbiol. 1992. V. 143. P. 721-730.

Информация о работе

Демченко, Юлия Николаевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структурированные участки нуклеиновых кислот - мишени для избирательного воздействия низкомолекулярных лигандов и олигонуклеотидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы