Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СТРУКТУРА, СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СТРУКТУРА, СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЯШИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ «M.A.H.EAÏA

£ Q jg^^ На правах рукописж

СОЛОВЬШ Надежда Анатольевна

СТРУКТУРА, СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ ГЛУТАШНСИНТЕГАЗЫ ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА.

03.00.04 - биологическая хяижя

Автореферат днссертвцки на совоканве учено* степени кандидата бшологжчески наук

Москва - 1980

~ З&ЬОО и-ООО^

Работа выполнена в лаборатории йнэиыалогм Ордене Л&нияа Плотитута биохимии нм.А.Н.Бвха АН СССР

Научные руководители:

член-корреспондеят АН СССР профессор В.Л.Кретович

доктор биол.нвук 3.Г.Евстигнееве

Официальные опповенты:

доктор биэл.наук В.В.Горячешюва кандидат биол.наук М.С.КрицкиИ

Ведущее учреждение: Институт фнзйалохчш реотенкв им,К,А.Тимирязеве АН СССР

Защите диссертация ооот'овтоя У^ " _1990 г.

в/^'тео. на ввседашш спещилизирова нао го /сове та (К 002.96.01) по присуждению учено! степени кандидате нвуя в Институте биожи-мни им.А.Н.Баха АН СССР .{И№?1, Москва, В-71» Ленинский проспект, 33, кора.2)

С джссартацае! можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Ленински! проспект, 33, корлЛ)

Автореферат разослав V/ ъцгс^ша^ 19во г.

Учений секретарь // /

спесяяливнрованвого совета //

каююат биологических яаук /

М.И.МОЛЧАНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Замечательным свойством всех растительных организмов является их способность к усвоению неорганических форм азота и построению из них аминокислот и белков. Таким образом, в конечном счете, растительный мир являемся источником белка, необходимого для поддержания игзни на нашей планете. Этим определяется исключительная теоретическая и практическая важность проблема растительного белка и необходимость г.;следования процессов) лежащих в основе усвоения азота и синтеза белка у растений {Прянишников, 1945; Кретович, 1958, 1961, 1974, 1979).

Весьма важную роль в качестве источника пищевого и кормового белка играют бобовые культуры: соя, арахис, горох, фасоль и другие. Бобовые культура имеют е«е и то существенное преимущество, что они способны использовать для своих нужд молекуляргшй азот атмосфера, обогащая почву доступ тола для растения азотистыми соединениями. Поэтому увеличение количества ж улучшение качества производимого растительного белка, в первую очередь белков бобовых, является центральной задачей яри решении проблем» дефицита пиаевого белка. Из бобовых культур обраиает на себя внимание горох, Ptsum. sativum, , как ценная зернобобовая культура, под которой заняты большие посевные площади в СССР.

Выяснение путей и механизмов ассимиляции неорганического азота теснейшим образом связано с изучением соответствуют:* ферментных систем и их внутриклеточной регуляции. В процессах усвоения растениями неорганического азота почвы существенную роль играет реакция синтеза глутамкна (Кретович, 1972). Работами ряда исследователей {ШШ , 1951, 1953; Wkfahi* 1953; Я>с/»«, 1953) было показано, что у растений, так же как и у других организмов, реакция синтеза глутаминэ, катализируемая гдутамгнсинтетазой / (ГС) К.Ф. 6.3.1.2, L -глутамат:а1гмиак-лягаза (АДФ) /, протекает в соответствии со следующим уравнением:

+ А**' .

L-глутамат + N Ц4 +• АТФ — ■ L -глутамин + + Н^РО^

Синтез глутамына, катализируемый ГС - главный и, по-видпко-

j цмтрмышшучяая Есблссгетз!

5 г^гсвгсио» tfj. ЯссгггаСыьмз. 1 1 ■'■vr.-сася им. If. л. Тиифкг«м

- г -

му, единственный путь образования этого важнейшего метаболита у растений. Эта реакция представляет собой один из основных путей внлшсккя минерального азота в органические соединения.

Цель и зз;ючк исследования. В связи с большой значимостью исследований азотного обмена бобовых растений, как симбиотрофвых азотфкисаторэв, иыеюиос важное значение для сельского хозяйства, нам представлялось интересным и актуарным выяснить вопрос о локализации, структуре и регуляции ТС листьев гороха, поскольку клеило в листьях находится основная часть высокоактивной 1С, В задачи работы входило:

1. Выяснение вопроса о наличия 1С в различных органах растений гороха, а также в цитоэоле, хлоропластах и митохондриях листьев гороха.

2. Разработка метода получен1« гзг-югзкного препарата ГС из хлоропластов гороха.

3. Исследование аагиождслотного состава и установление природа N -кошевой акпяэотслотн исследуемого фермента.

4. Определение минимального молекулярного веса ГС методом электрофореза а полиакриламкдном гела в присутствии додецглсуль-фзта натрия и молекулярного веса олигомера методом ультрацентри-фугировангя.

5. Исследование четвертичной структуры ГС с поюсыо метода электронной микроскопии в построение пространственной модели фермента.

6. Изучение физико-химических свойств и определение кинетических характеристзя асследуемой 1С,

7. Исследование ретуляцаи синтеза и активпости ГС хлороплао-тов гороха.

Научная новизна работы. Результата представленной работы являются прпоритеткыют.Е: до установлено, что активная ГС содержится в листьях и созревают* семенах; активность ГС локализована как в цптозоле листьев, так и в хлоропласта*, Впертые обнаружен две множественные молекулярные формы 1С в одном организме.

Аммоний, инфильтрированный как в целые проростки гороха, так и в срезанные листья гороха, индуцировал синтез ГС Ле как в корнях, так и в хлорогизстах и цитозоле листьев гороха.

Разработан метод очистки ГС из хлоропластов гороха, позволяющей получить высокоочиаенный препарат фермента. Гомогенность

- 3 - с

ферментного белка показана методами влектрофореза в нолиакриламид-ном геле, аналитического ультрацеятрифугировашш к определением N -концевой аминокислоты,.

При исследовании аминокислотного состава 1С установлено, что этот фермент характеризуется наличием большого количества динар— бонових а серусодержаших аминокислот и, особенно, ыетионкна, по содержанию которого данная ГС значительно отличается от всех изученных ранее. Установлена N -концевая аминокислота 1С - глицин. Методами изоэлекгрофояусированая в геле и в градиенте платности сахароза определена я э о ал ектрическая точка 1С ( 4,2-4/ ). Молекулярный вес 1С хлоропластов найден равным 480 ООО. Исследование характера дассоинацип фермента под действием 8 Н мочевины или 6 М гуакидан-гидрохлорида показало, что ГС хлоропласт ов состоит из по-видимому, идентичных мономеров о молекулярным весом '60 ООО, Методом электронной микроскопии изучена четвертичная структура фермента. Показано, что ферлент состоит из 6 идентична! удлиненных мономеров, расположенных с точечной группой симметрии 42 по верш-нам двух квадратов, повернутых друг относительно друга на 40° относительно оси четвертого порядка.

Практическая ценность работы. Изучение природа тех первичных органических азотсодержащих соединений, в виде которых происходят ассимиляция аммиака, и ферментных систем, катализирующих реакции их образования, важно но только для понимания путей синтеза органических азотистых веществ в растениях, но имеет и большое практическое значепие ввиду широкого применения аммонийных солей н аммиака в качестве азотных удобрений. Предложенный метод внделепия и очистки 1С может быть использован в научных учреждениях, изучающих азотный метаболизм растений.

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано II печатных работ, из них 6 статей и 5 тезисов докладов.

Апробация работы. Материалы, наложенные в диссертация, докладывались и обсуждалась на:

I .Международной конференции по регуляции процессов развития у растений в Хадле, 1ДР, 1977.

2. Всесоюзной симпозиуме но методам получения шсокоочищен-ннх ферментов в Вильнюсе, 1978.

3. Всесоюзном симпозиуме ¿о азотному и белковому обмену растений в Тбилиси, 1978,

4. II международном биохимическом конгрессе в Торонто, Кена-до, 1979.

5. 17 Всесоюзном биохимическом съезде в Ленинграде, 1979.

Кроме того, материалы диссертационной работы докладывались

не конкурсах на лучшую работу Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР, где неоднократно премировались.

Структура и.рбърм диссертации. Диссертация состоит вэ введения, десяти глав и выводов. Работа содержит /Й-страниц машинописного текста,рисунков и таблиц. Библиография включает наймекований, в том числе /ЯР иностранных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В качестве опытного материала в данной работе использовались проростки, семена, корни и листья гороха сорта Победитель £ в некоторых опытах использовался рядовой горох.

Для выделения хлоропластов были использованы молодые листья двух-трехведельных растений гороха, выращенных в открытом грунте в садовой почве или э условиях оранжереи.

Инфильтрация различных веществ в листья и корки гороха. В опытах по изучению рефляции синтеза ГС в неотделенные от растений корни, а такие в листья десятидневных проростков гороха методом вакуум-и »фильтрации вводили 0,025 М раствор (N Н^ 11Я О., . Инфильтрацию проводили в вакуум-аксякаторе в течение 30 минут при непрерывном откачивании воздуха. Затем образцы вынимали из растворов, помещали на чашки Петри и экспонировали в течение пяти часов при дневном освещении.

Шделение хлоропластов.Выделение хлоропластов из листьев гороха проводили по методу и/лСХег (1971). Листья разрезали ножницами, после чего в течение 10 секунд гомогенизировали в размель-¡ителе тканей РТ-1 при 0000 об/мин в 50 кМ трис-НС? буфере, ¡1 7.8, содержащем 5 мМ цвете вн. 2 мМ ЭДТА, 2 кМ М^О^ Ю шЛч.^ : 0.4 и сахарозу. Разрушение хлоропластов проводили в буфере того а сзстзва, что и использованный для выделения атих структур, но е с.^дерхгюе?' сахарозы и Д/аСС . Все атепы выделения хлоропластов „у-.^ствлядк лрз температуре + 4°.

^-Т'уг.р.г^кие а^тиун^сти глутамкнеинтетазы проводами двумя мето-■ I) по о^гзэовеккю эртэфоофата (Пугаин и соавт., 1972); 2) цо

образованию ^глутвкалгидронсамозой кнслоты( SVtiott t 1951).

Белок определяли по метол? Лоури. Адииак определяли по Яес-слеру в модификации Любимова я соавт, (I9S8).

Аналит^есюй^электросворез^в iполнакъкг,змятшу.: геле проводила по методу Дэвиса и ОристейиаСйА*"^ , 1264; Ozmiein, 1364) к* приборе фирмы "Резная". Дгя электрофореза использовала 7,5л гель, рН 8,5. Для получения гелей готовили растворы по прописи Дэвкса, а непосредственно перед опытов-рабочие смеси. Во разо-

ряв гелей прибор дай электрофореза1 помесили в хзлодаявнак. 3 течение вервш: 10 кинут ток составлял 2 ш на трубку, а затек Спя увеличен до 3 га. По окончании электрофореза гель фиксировали в 0,2Й растворе аг.пдощээрца пра 37°в течение £0 минут. В качества растворителя использовали раствор, содержащий 75 шг уксусной кислоты, 50 мл метанола и 375 мл дтатпллированной вот; этот же раствор пргаелялл для обесцвечивать гелей.

Аналитический электрофорез мв полг.актзэтлемтаио:.? геле, в присутствии лодедплсульФата каток?: проводили по методу Зебера и Осборн (КГеёег, 1969)., В качестве маркерных белков использовали

альбумин сквороткя быка(65 ООО), явччыЯ альбуг«т:1н(44 ООО), трипсин {24 ООО) и цятохром с(13 ООО).Электрофорез проводили при постоянном токе 8 мэ на каждую трубку, причем отрицательный электрод был расположен в верхнем отсеке каг.;еры, а положительный-в никлем. Электрофорез прекращал п, когда краситель находился в 5 ид от нижнего края трубки.Гель фиксировали в 20£ растворе сульфосалкскло-вой кислоты в течение 18 часов. Затем раствор сульфосалппиловой jœ слоты заменяла 7% раствором трихлоруксусыой кислоты, которая дриады меняли с интервалом <0-50 иянут, Гели окраплвали при температуре 37° в течение 2-х часов, затем прогнивал- дистиллированно^ водой и помещали в обеспвечяваяеий раствор.

Аминокислотный анализ 1С хлоропластов проводили ка одкокс-лоночиом аминокислотном анализаторе 4101 фирьта "«^"(КдосляО. В работе использовали колонку шсотоД 54 см, наполненную ионообменной смелой Osliort, ЬСК$ 0303. Разделение t дноккслот проводили с помощьо трех цитрате левых буферов; nepBi-i - 0,2 П рзст-вор( рН 3,25; второй - 0,2 . ^створ, pli 4,25; третий - 0,35 й раствор,рН 6,45. Температура обогрева колонки е течете G0 ьзжут била 52а, а затем до конца анализа-68°. Скорость протекания буфера - 50 т/час, нингидрина - 25 мл/час.

Кроме того, аминокислота определяли методом распределительной нисходящей хроматографии на бумаге Ватман * I do Успенской и Кретовичу( 1962}, В качестве растворителя использовали о-креэол.

Определение пистеина. Для окисления цистеина в цистеиновую кислоту использовали иадмуравьиную кислоту{.ßcoie , 1963). Навеску белка помешали в фарфоровую чашку, добавляли I мл 30Z H^Og и 9 мл 88J НСООН и оставляли на I час при комнатной температуре до полного растворения белка. Далее раствор упаривали, осадок растворяли в 6 Н НСС и гидролизовалн при 105° в течение 20 часов. После упаривания аминокислоты растворяли в нитратном буфере, pH 2,2, с таким расчетом, чтобы в I мл раствора содержалось количество аминокислот, эквивалентное I мг белка при определении по методу Лоурн.

Электрофокусйрование белков в линейном градиенте плотности сахапозы. Для определения изоэлектрической точки 1С хлоропластов гороха применяли метод електрофокусироваяия белков в линейном гра-диенте^плотности сахароэи(0-50£) на колонке Вестерберга 81 ООО фирмы "ЛИВ * (Швеция) объемом НО мл. Анодный раствор - 1% Н3Р04, катодный - ЕСЛаОН, Ал од в нижней части колонки. В опытах использовали смесь ам^олвнов, образующих градиент pH от 3 до 10, а затем от 4 до 6. Продолжительность разделения 72 часа, напряжение 800 в при 4°.

Эл е ктрофокусирование в п олиа криламидном геле проводили на приборе, предложенном Дввисом( <£>а.гП& , 1964) для приведения диск-злектрофореэа. Реактивы смешивали непосредственно перед употреблением. Перед заполнением трубок рабочие раствор дегазировали во избежание появления пузырьков в геле во время влектрофокусирования. Электрофокусиравание вели так же, как и аналитический электрофорез в полиакрнламиднэм геле, с той лишь разницей, что в рабочую смесь добавляли аыфолжны. Анод - 0.2JC раствор H2S04 или катод -

О,Ü втаяэламин. Ло окончании ллектрофореза гель разрезали сначала на две части вдаль, а затем одну из частей окра ошва ли на белок, а вторую разрезали 1ш 15-20 частей. Каждую часть заливали I ил В^О н через 20 часов измеряли pH экстрактов.

Изучение седииентапионкых характеристик глутаманедятетазы хлоропластов гороха проводили методом скорости седиментации и седиментаиконного равновесия на аналитической ультрапентрифуте

с.

SpilWoE фирли "ВосАлииг.

Опт>еделение А/ -концевой аминокислоты глттаминсинтетазы хлоро-пластов гороха проводили дансилышм методом по Грею (Gicu^, 1972). 30 мкл белка в 0,1 Н HÍÍ помещали в ампулу и к нему добавляли 30 мкл даксялхлорида (6 m/мл ацетона). Смесь выдерживали 45 минут при 37°, а затем упаривали досуха в вакууме при 40-60°. К остатку добавляли 50 мкл 5,7 HHGL и ампулу запаивали в вакууме. Гидролиз проводили при 105° в течение 10 часов. Затем ампулу вскрыли, раствор упаривали в роторном испарителе, к остатку добавляли 20 мкл KgO в еще раз высушивала. Остаток растворяли в капле ацетона л наносили на пластинку с склккагелем,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Изменение активности глттаминсинтетазы в корнях и листьях горохе р течение суток.

Ранее нами было показано (Рэдюкива и соавт., 1973), что активность 1С в органах растений гороха (листьях, корнях, созревающих семенах) изменяется в связи с возрастом исследуемою органа. Предварительные даяние {fe«lov¡eft.#&rtlijft«f.u'a, 1974) показали, что активность 1С в течение суток также непостоянна, В связи с необходимостью получения очищенного препарата 1С из вегетативных органов нами было проведено исследование динамике активности 1С в корнях и листьях гороха в течение суток.

Енло установлено, что самая активная 1С содержится в листьях в период интенсивного фотосинтеза (рис. I), т.е. в утренние и дневные часы. „

Активности 1С в корнях в это время практически отсутствует

и начинает увеличиваться после 19 часов. Нативные корни гороха содержат 1С, особенность» которой является более высокая активность с Mni> в качестве кофакторе, а не сМд". Различия в характере динамики активности 1С в листьях и корнях гороха мэглк быть обусловлены различиями в. суточных изменениях содерхзнгя метаболитов в листьях и корнях гороха. Так, количество аммиака в питозоле клеток листьев и корней гороха в дневные чесы резко различалось в течение суток. Концентрация почти всех исследова^ых аминокислот в листьях возрастает а дневные часы, за псклтени'м аспарагиповой кгслоты, накопление которсЭ ивб.-лцзется в ъечь;.}-^ и ночные часы. В корнях же содержание всех свободных аутаок/слjt

уееданвдкгется в вечерние часы.-

В листьях гороха отмечается отрицательная корреляция между лкйашмой активности 1С и содержанием аспарагиновой кислоты. Наци Сило проведено изучение влияния аспарагянэйЗй кислоты на активность ГС в экстрактах из листьев гороха* Ш данных рисунка 2 можно видеть, что зейзрагЕноэая кислота бкайгйзет ингибирукдаев действие ко активность ГС в условиях ш1ъс , ^то согласуется с полуденными нами данными о динамике аспарагиновой кислоты и активности ГС в листьях гороха в течение суток.

£ о

г!

25 гас

ОРЕМЯ СУТОК

Рис, I. Изменение активности глутаминсинтетазц в течение сутой'..

1.2 - листья; 3,4 - корни;

1.3 - активность ГС сМ^4;

2.4 - активность ГС с№пг*

На осазвании полученных данных был выбрав объект для выделения фермента(листья) и оптимальное времй суток(12-14 час.) для сбора материала с целью выделения 1С.

/ЛмШЮКИСЛОГд] , мМ

Рис. 2. Влияние аспарагиновой.кислоты(1,2) и аспарагишО 41 ва активность глутаминсинтетазн из листьев гороха.

1.3 - активность 1С в присутствии ; * <

2.4 - активность 1С в присутствии Мл.1* .

Регуляция синтеза глутаминсинтетаэы и роль аммония как индуктора в атом процессе.

Б связи с тем, что к началу наших исследований отсутствовали двнше о регуляции синтеза 1С у растений, нами было проведено исследование регуляции синтеза 1С в листьях и корнях гороха в сравнении с ретуляплей этого процесса у представителя низачтх растений-одноклеточной зеленой водоросли хлореллы.

Особое вникание сшю обращено на действие а.'/мкэкя, уотогий, по выражению Д.и.Прянимнмягвэ, является альфой и окегой езотного обмена у растений.

При инфильтрации аммонийной соли в корня гороха наблюдается увеличен»« активности ТС ( табл. I). Увеличение вктигности фермента, но более слабое наблюдается также при инфильтрации а корни глутамата.

Таблица I.

Влияние «фильтрации аммония на удельную активность глутемнн-синтетаан корней проростков гороха (экспозиция 5 часов).

Инфильтрированное вещество ! Удельная ахтивноать t Белок г __

0,025 И -(ЫНч)гНРОч 0,05 М - глутамвт^о-0,05 и гдутаматЖ+ 0,025 М^МЦНРОу 0,05 М глутаматУо. + 0,025 М^Н^ИРО, + 30 Г/ мл никлогексимид Интахтные корни

1С 1ыкг/мл

0,75 675

6,04 735

2,98 700

9,35 735

следы 540

одо 530

Наиболее высокая активность была получена в опытах, где инфильтрировали оба субстрата, необходимый для синтеза глутамкна -аммоний н глутамат. Циклогекскмид полностью ингибкровал активирующее действие аммония. Эта данные указывают- не наличие субстратной индукции, или дерепрессии, образования 1С в корнях проростков гороха.

Аналогичные результаты по влиянию ионов аммония на активность 1С были получены на листьях гороха.

Известно, что у дрожхеЙ{ Sime ,1974; Ауэрман и соавт. 1969), бактерий{4lacttmanetai, 1973) и других низших организмов аммоний оказывает репрессирующее действие на синтез ГС.

В связи с втнм нам представлялось интересным выяснить, какое* действие оказывает аммоний на синтез 1С у одноклеточного, но фотосинтез« руссего организма - хлореллы. Полученные данные свидетельствуют о той, что у хлореллы,так » как у бактерий и дрожжей, акмоний, использованный как источник азота в питательной среде, вызывает подавление синтеза ГС.

Таким образом, сравнительное определение влияния ионов аммония на 1С хлореллы я гэроха, как представителей низших и высоих расте-тШ, соответственно, показывает, что в случае хлореллы atионий явлетел репрессором этого фермента, в то время как у гороха он

индуцирует образование 1С de

Индухдея глутат/инслнтета эы а'.тлзш'а?.': и лака лаз астм ее а хлэ-ропластах и питэзоле листьев гороха,

Нами было показано, что в листьях гороха, как и е коряях,аммоний усиливает синтез этого фермента. При изучении внутриклеточной локализации ГС в листьях гороха было установлено, что 1С присутствует как в дитоэоле, так а в хлоропластах клетсиС табл. 2).

Тзбл;ща 2.

Активность глутампнсиятетаза в хлэрогластах и цитоэолг листьев гороха при инфлльтоацж в вя акмэшгя или китрата( в качестве контроля инфильтрировали HgO).

JES Инфильтрируемое вещество Активность 1С, ед/мд экстракт. Активность1Уд.акттаге, "?. (ность 1С А:.т.шзк (Белок í,4t/f*jrimr/rji

с Hfl с М«1' | с Mfj с Мг»"| 0 Mf¡ с МГ| i

_ с fifi с Mn" ¡ с Hf | с МгП о Mfj с \

Х"л ороялаоти

1 КЛГ 7,6 2,6 ICO 100. 11,7 4,0 3,2 0,65

2 . ÜW 1:М 162 202 I7t° 7.9 °*67

3 ШЧхлорамфеникол 7,0 2,3 92 89 18,5 6,0 5,4 0,38

4 ЛчЗ'+цлклогексЕияд 12,9 5,5 170 210 19,5 8,3 6,8 0,С6 5. 7,4 ЗД 97 119 11,4 4,8 - 0,65

Цитозоль

1. Н-,0 9,4 4,0 100 IOO 15,7 6,7 14,6 0,60

2. , 13,1 6,3 140 160 17,0 8,2 32,0 0,77

3. Лй'Ахлошафенкхол 11,5 4,9 132 123 19,2 8,2 30,8 0,60

4. М&даклогекскмид 10,9 4,4 116 112 23,7\9,6 42,0 0,46

5. II¡8 4,9 127 122 19^4 -8¡0 . - 0,61

№ предположили, что эти данные могут свидетельствовать о наличии разных молекулярных форм ГС в клетках листьев гороха. В связи с этим мы провели изучение влияния аыдокия на синтез ГС отдельно в хлоропластах и цатозоле листьев гороха.

Из датги, представленных в таблице 2, го* чо а к деть, что аммоний усиливает синтез ГС. как в хлоропласта*, так и в цитоэоле ' листьев гороха.

На основании полученных результатов можно еще раз подчеркнуть наличие принципиальных различий в регуляция синтеза 1С у внсквх л низиих растений. Бели у шегскх растений аммоний югдуцпровал 1С, то у низших он оиазивост регрессирующее действие на этот фер\еат.

"нокестрентие молекулярные фзрттп глутауинсинтетазы а листьях

В литературе почти полностью отсутствуют данные о внутриклеточной локализации и наличии множественных молекулярных форт ГС. На основании приведенных высе результатов по изучению синтеза к внутриклеточной локализации ГС в листьях гороха нами было высказано предположение, что в клетках листьев гороха присутствуют, по крайней мере, две молекулярные формы ГС. Существование множественных молекулярных форм ГС в листьях гороха было показано методом электрофореза в пэлиакркламидном геле. На рисунке 3 приведены эинограмш 1С из схтоэоля и хлоропластов листьев гороха.

Рис. 3 Зкмогромкы глутаминскитетазы экстрактов из цитозоля листьев(о) и хлоропластов гороха(б):

I - 1С цитозоля;

II - ГС хлоропластов.

Зимограммы из целых лкстьев и цитозоля были идентичными. Из данных рисунка .следует, что в листьях гороха присутствуют две молекулярные формы этого фермента. В хлоропласта* была обнаружена только одна кз форм фермента, характеризующаяся довольно большой алектрофоретической подвижностью - фор^а II. В питэзоле, как и в экстракте из целых листьев, обнаружены две молекулярные формы ГС. Одна из них(форма II) по величине Я/ соответствовала 1С, обнаруженной в хлоропластах. Другая (форма I) имела значительно меньшую злектрофоретическу» подвижность. Известно, что при использовании современных методов выделения хлоропластов разрушается не менее 50^ этих структур, при этом содержимое хлоропластов переходит в цито-

гороха

I I

а

золь и, видимо, поэтому на эимограмме из цитоэоля было две полосы.

Очистка. Физико-химические свойства и структура глутвминскн-тетази хлоропластов гопоха.

К настоящему времени получены в высокоочищенном состоянии 1С лишь немногих растений. Так,имеются данные об очистке к свойствах 1С из семян гороха( iCÙoil, 1953; Пушкин и соавт., 1974), корней риса {На п. ата ii tMa.iweio* 1972). Гомогенный препарат ТС получен кз хлореллы(Расулов и соавт,, 1976).

В связи со стоявшей перед нами задзчей получения очищенвого препарата ТС из листьев гороха, а также на основании полученных нами данные о существовании двух молекулярных форм фермента в клетках листьев гороха, объектом дальнейших исследований была выбрана 1С хлоропластов гороха.

Очистка ГС хлоропластов гороха включала следующие этапы; I) разрушение хлоропластов; 2) осаждение хлорофилла при 144 ООО*J ; 3) осаждение нуклеиновых кислот I% стрептомицинсульфатом; 4) фракционирование сульфатом аммония, 30-602 насыщения; 5) сорбция на геле фосфата кальция; 6) хроматографу на ДЭАЭ-целлюлозе D£ -32, Очистку 1С из хлоропластов гороха проводили при температуре +4°. ■ Результаты очистки суммирована в таблице 3.

Избирательная сорбция фермента на кальцкЙ-фосфатном геле приводила к пятикратной очистке его, по сравнению с предыдущей стадией, в то же время активность 1С на этой стадии почти не терялась. Больная часть ферм(нто элюировалась с геля 0,5 M MjSO^, что согласуется с данными О'Ниа и ХлояЮ'Лелб , ;/оу , 1973), полученными для ГС целых листьев.

В результате очистки был получен фермент, очищенный в 150 раз. Гомогенность фермента была показана методами электрофореза в поли-акриламидном г:ле и седиментационного анализа(рисунок 4),

Ецло показано, что оптимум рН для действия фермента с Mjj составляет 7,2-7,3; с tin1'лежит в кислой зоне и равен 5",0, что согласуется с данными для 1С из других объектов.

Установлено, что оптимум температуры как с M J , так и с Hnf^ равен 45®. Энергия активации фермента в расчете на мономер была равна с h3^2900 кал/моль, а с Мп?*- 1193 ,кал/моль.

При изучении влияния времени инкубации на активность 1С хлоропластов гороха было установлено, что указанная зависимость имеет

Таблица Z.

Результате счиотки глутаминсинтетаза из хлоропластов листьев ХЭрСВСЗ*

Отвхяя очистки

Объем Белок фракции, во мл фракции,

ыг

Активность Выгод.Степень

удельная общая мкмоль

в I мин. в I мин. на I мг

белка_

очистки

Экстрах* хяорапласто® после осаждения при 18 000*2-

йкстракт после осаждения при 144 000*^

Осаждение нуклеиновых кислот

Фракционирование сульфатом гмиония, 30-бОй насыаения

Сорбция на геле фосфата калышн

Фракционирование на ДЭАЭ-иеллюлозе ОЕ-32.

880 479 1,03 487 100 I

810 229 2,(7? 445 91 2

900 136 3,03 420 86 3

10,3 10 20,0 200 41 20

4,8 1,9 100,9 182 37 100,5

19,7 1,0 150,1 150,6 19 150,0

лине&шй характер в интервале от 0 до 20 минут как в присутствии так и а присутствия Мп?'

Ис|3

Исследование Ь -глутаызта на активность изучаемого фермента показало, что кривая насыщения 1С указанным субстратом имеет не-пшерболический вид и характеризуется положительной кооператив-ностью. Константа Мгхаэляса, определенная по методу Диксона для концентраций субстрата, при.которых активность фермента превышает половину максимальной, была равна 7 мМ. Наличие положительной кооператпвности пря насыщении фермента глутакатом отличает 1С из хлоропластом гороха от ГС из семян гороха, корней риса и хлореллы.

Нами была изучено влияние концентраций АТФ и М^ на активность 1С хлорошшстоа гороха. Обнаружено, что максимальная активность наблюдается при концентрации АТФ, равной 15 мМ; при более высоких концентрациях АТФ наблюдается субстратное ингибирование 1С хлоропласт -в гороха. Максимальная же активность изучаемого фермента наблюдается при определенном соотношении АТФ = 3:1.

4..Электрофзреграп:а (в) s седиментограмыа (б) глутаминегететаэы иэроллаетоз гора».

- 16 -

Из данных,приведенных на рисунке 5,можно видеть, что при одновременном присутствии в опытной смеси Иди М а'происходит не только изменение активности ГС по сравнению с активностью в смеси с одним катионом, но и смешение оптимума рН в область фл-эиологичесних значений этого показатели. Аналогичные данные были получены для 1С из семян гороха(Пушкин в соавт., 1973).

На рисунке 6 ыожно видеть, что аспзрагиновая кислота оказыва« ингибирумцее действле на фермент а приводит к исчезновению положительной кооперативности по отношению к Ь -глутамату, а также увеличивает сродство втого фермента к субстрату.

[1-глутамат] , мМ

Рис. 6. Влияние асларагиновой кислоты на характер насыщения и - глутаматом на глутаминслнтетазу хлоропластов гороха в смеси с П^Ч

1 - ["Аспзрагиновая кислота ] еО;

2 - [Аспзрагиновая кислота} «¡15 ыМ;

3 - [Аспврагиновал кислота! >30 ыМ.

На основания исследования седииентациояных характеристик фермента вычислен коэффициент седиментации 1С хлорошшстов, ревнив 16,3, Молекулярный вес фермента, рассчитанный исходи из реэудьта-тов исследования ГС методом седжмевтапионвого равновесия, был равен 480 ООО.

При выборе оптимальных условий для очистки фермента необходимо Сило установить значение его изоэлектрической точки. Результаты одного из опытов но определении из о алектрическ ой точки ГС методом алеятрофокусированвя в градиенте плотности сахарозы приведена на рисунке 7.

F»c, 7- Кзозлектрофояусароваяив глутамансинтетаэы хлорошшстов гороха в градиента плотности сахароза. I- градиент рй; 2 - бедок (Е^); столбики - актаэшсть фермента.

Активность 1С эбларумна в узкой зой« алюируемого бедка во фракции 12 с рК 4,2.

Кроме того, изо электрическую точку ГС определяли методом S3 о влект рсфокусирэ вакия в гелэ(рисунок 8),

Р.Н

Нбырв фсаацци

-

г I • I

Рис. 8. Изэалектрэфокусяровянив глутаюшсянтвтаэы зыорогилстов горохе в поллакржламиднои голе, вверху - градиент рЭ; внхэу - алехгрэфэре греша.

Следует подчеркнуть, что величины кэоалектркчесхов точки ГС хлоропластов, определенные методам» «лехтрофэкусхроввкхя па колонке (4,2) я в полиякркламкдном геле (4,4). близки.

#е§яедованаб 1С методом электрофореза в полиакрилаищном геле $ ррдсутртвш! ¿шецплсульфата натрия показало, что фермент состоит, рогФВДкмому, из идентичных полипептщшнх цепей молекулярного веса около 60 рОО.

При исследовании ааеноквсдотного состава ГС хлоропластов гороха было установлено, что этот белок характеризуется наличием большого количества дякарбоновых аминокислот. Кроме того, моле^ла ис-рледуемой 1С содержит довольно значительные кслкчества лизина, ала-ркпа, валина, глицина, серика в фенилаланина. Вычисленный на основании данных аминокислотного анализа минимальный молекулярный вео Д? хлоропластов гороха равен 59 570. Полученная величина согласуется со .значением молекулярного веса, найдентсл посредством электрофореза в лолиакршимадцом геле в присутствии додецилсулзфата натрия. Э результате определения N -концевой аминокислоты установлено, что таковой является глнцкп.

Электронная_м^кРосг;рлпч глутэмкнс1эдтетазы- хлоропластов горохат

Суъютруя подученные даннне, можно предположат, что молекула £С хлоропластов гороха являвгсч одтаыером, состояякзл из идентичных мономеров.

Совместно с Цупрувом В.Л., Самсонидзе Т.Г. .Киселевы.! Н.А.(Иа-ртитут кристаллографии км.А.В.Щубаиг.ОБа АН СССР) было проведено вдектрэнноыЕкроскодическое исследование 1С хлоропластов гороха. По циклим этого анализа молекула фермента состоит из б идентичных мономеров, распалзаенных с точечной группой симметрии 42. Мономера расположены по вершшам двух квадратов, повернутых относительно оса 4-го порядка на угол 40°. Днаггзтр молекулы во фронтальной проекции 120 А(рисунок 9),

Ьиа отобраны л классифицированы характерные изображения молекул. Ыоянэ отметить четыре тепа изображений. К первое относятся округлые чзстида рзачером 115-125 А. На следуицих трех, типах изображений частиц наблюдаются две продольные полоски белка, разделенные контрастером. Ширина всех трех типов одинакова -70-75 А, но они отличаются по длине и деталям изображения. Характер боковых проекций указывает на то, что структура 1С хлоропластов города двухслойна. С использованием указанных проекций была построена модель 1С хлг"пластов гороха.

. Молекулы глутаашнсинтетазы жлорошшотов горохе, контрасти-ровешше уранелацетатоы. Увеличение,* 400 ООО.

а- изображения первого типа, в шоелеы ряду приведены рожения^ |рто£^мы1грованные о поворотом на 90 (увелхче-

Буквами А,В,Собозначены частица, с которыми биле проведена операция усреднения фотоыетодои. В - результируилая картина наложения 10 частиц,

Ь,с(о1 _ изобретении второго, третьего и четвертого типов соответственно.

В провой части< а- Л) показана модель 1С а ориентации, соответствующей приведенным проекциям частой

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что активность ГС растений гороха наиболее высока в листьях и семенах, в то время как в корнях активность практически отсутствует. В течение суток активность 1С в листьях и корнях гороха изменяется.

2. Показано, что в листьях гороха активность ГС локализована в хлоропласта» и цитозолв и отсутствует в митохондриях.

3. Впсрше обнаружена две множественные молекулярные формы 1С в листьях гороха.

. 4. Показано, что аммоний усиливает синтез 1С как в хлоропластах, так и цитозоле листьев i-opoxa.

• 5. Разработан метод наделения и очистки 1С из хлоропластов гороха, позволяющая получить гомогенный препарат, о выходом по активности I9J и удельной активностью 150 шодолеЗ фосфата в I мин. па Т мг. белка. Гомогенность фермента показана методами электрофорезе в полиакрилаыидном геле, аналитического удьтрацентри-фугироаания и путем определения W-концевой аминокислоты.

6. Молекулярный вес ГС .хлоропластов,. определенный методом седи-ментациоиного равновесия, равеу 480 ООО.

7. При исследовании ГС хлоропластов гороха методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилоульфата натрия показано, что фермент состоит из идентичных полипептидных цепей о молекулярным весом 60 ООО.

8. При исследовании аминокислотного состава 1С хлоропластов гороха установлено, что этот белок характеризуется наличием большого количества дгасарбоношх аминокислот, лизина, адалина, валика,

а также метяониня, по содержанию которого данная 1С резко отличается от изученных ранее. Определен», М -концевая аминокислота.

9. Методами иэоэлектрофонусирования в геле и в градиенте плотности сахарозы определена изовкектрическая точка 1С хлоропластов гороха, находящаяся в интервале 4,2-4,4.

10. Кинетика действия 1С хлоропластов гороха характеризуется наличием положительной кооперативное™ до отношение к L -глутамату.

11. Па активность 1С хлоропластов оказывает существенное влияние;

а)соотношение концентраций магния и АТ4;

б)вид катиона, металла-кофактора фермента;

в)некоторке аминокислоты(наибольшее влияние оказывает аспа-рагиномя кислота).

12. На основании данных электронной микроскопии предложена модель четвертичной структуры 10 хлоропластов гороха: восемь удлиненных субгединяц расположена с точечной группой симметрии 42 по вершинам двух квадратов, повернутых относительно друг друга на угол 40° вокруг оси 4-го порядка.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Кретович В.Л., Евстигнеева З.Г., Асеева К,Б., Мочалкина H.A. 1971. Регуляция глутсмкнсинтетазн растений аммонием и нитратом. Биохимия, т.Зб, №2, стр.388-392.

2. Радюкина Н.Л., Душкин A.B., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. 1973. Изменение активности глутаминспнтетазы при прорастании

и созревании гороха. Физиология растений, т.20, HZ, стр.376-380,

3. Евстигнеева З.Г., Радчжкна H.A., Пушкин A.B., Кретович В.Л, 1977. Суточный ритм активности глутаминсинтетаэи в листьях и корнях гороха. Доклады АН СССР, т,236, №1, стр.253-256,

4. Евстигнеев^ З.Г., Пушкин A.B., Рздадина H.A., Кретович В.Л. 1977. Индукция глутаминситстетаэы ашонием и локализация ее в хлоропластах и цитозоле листьев гороха. Доклады АН СССР, т.237, Jí4, стр.962-964.

5. Евстигнеева З.Г., Пугкия Л,В._ Радюкина H.A. 15,77. . .

The chances in the glutamic» synthetase activity In leaves, roots end seeds of Pisurn oat 1vus and nodules of Luplmie luteue during vegetation. Abstracts International conferencie of regulation of developmental processes in plants. Hallo, C.D.R.

6. Евстигнеева ;.Г., Радюкина H.A., Джохаридзе Т.З., Пужкин A.B., Кретович В.Л. 1977. Кножествегпше молекулярные формы глутамин-синтетаэы листьев гороха и тыквы. 1977. Доклады АН СОСР, т.247, Jf3, стр,742-744.

7. Евстигнеева И.Г.. Радюкина H.A., Пушкин A.B., Переведенцев О.В., Шапошников Г.Л., Кретович З.Л. 1979, Очистка и физико-химические свойства глутакпнсинтетазы.хлоропластов листьев гороха. Биохимия, т.44, JÍ7, стр. 1303-1309.

8. Евстигнеева З.Г., Пушкин A.B., Радюкина H.A. 1979.

Glutamine synthetase of рев chloroplaate.

Zl-th international congress of hoohenletry. Toronto, Canada, Abstracts, p.258. 05 - 9 - Й7«.

9. Радажина H.A., Шапошников Г.Д. 1978. Глутаминсиитетаьа хлоро-пластов горохе^ Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума со изот ному и белковому обмену растений. Тбилиси, 29-30 ноября.

10. Радюкина H.A., Евстигнеева З.Г. 1978. Выделение и очистка глу-таминсннтетазы кэ листьев Piium, laiivutrL . Тезисы докладов Всесоюзного сшпозиума по методам получения высокоочищенных ферментов. Вильнюс.

11. Пушкин A.B., Джохаридзе Т.З., Радвкина H.A., Евстигнеева З.Г. 1979. Множественные молекулярные формы глутаминзинтетазы в листьях гороха и тыква. Тезисы научных сообщении. IУ Всесоюзный биохимический съезд, т.1, стр.260 /Наука", Лосква.

зак. 86 тир. iso вц пы.икс

т -ooj2i> от '».оэ.вог.