Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электронная микроскопия олигомерных ферментов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электронная микроскопия олигомерных ферментов"

йиг иШЗ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.Н.СЕМЕНОВА

На правах рукописи

Ц У П Р У Н ВЛАДИМИР ЛЬВОВИЧ

УДК 577.332.54

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ

Специальность 03.00.02. - биофизика

296

л/Ъ

Автореферат *г диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1989

Работа выполнена в лаборатории электронной микроскопии ордена Трудового Красного Знамени Института щэисталлографии АН СССР им. А.В.Шубникова

Официальные оппоненты: доктор химических наук, црофессо]

Б.И.Курганов

доктор биологических,наук Б.П.Уланов

доктор биологических наук В.В.Леднев

Ведущая организация: Межфакультетская проблемная НИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломонос

Защита диссертации состоится " "_ 1990 I

в_чао. на заседании специализированного совета Д.002.26.С

при Институте химической физики АН СССР по адресу: 117334, Москва, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики АН СССР

Автореферат разослан " " _ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

А.Ф.Ванин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что большая часть ферментов обладает четвертичной (субъединичной) структурой, которая обычно необходима для проявления каталитической активности и ее регуляции.в ответ на изменение концентрации субстратов и эффектороЕ, способствует стабилизации субъединиц и определяет ряд других особенностей функционирования олигомерных ферментов. Б свою очередь некоторые ферменты способны образовывать комплексы друг с другом. Сближение ферментов одного метаболического пути в составе таких комплексов может обеспечивать увеличение скорости протекания суммарной реакции и сокращена е потерь нестабильных метаболитов за счет уменьшения времени диффузии.

Формирование олигомерной и надмолекулярной структуры ферментов, происходящее на основе белок-белковых взаимодействий, приводит во многих случаях к образованию симметричных агрегатов. Такие агрегаты связаны с выполнением вполне определенных функций, и изучение их структуры представляет актуальную задачу молекулярной биологии. Одним из наиболее эффективных методов, используемых для ее решения, является просвечивающая электронная шнфоскопия, которая позволяет непосредственно наблюдать изображения молекул. Возможности электронной микроскопии при исследовании структуры биологических макромолекул за последние годы заметно возросли, что объясняется применением разнообразных методов препарирования образцов и обработки изображений.

Целью настоящей работы являлось сравнительное исследование методом элетронной микроскопии четвертичной структуры ряда ферментов четырех классов, различающихся по степени родства и происхождению, а также установление возможной связи их структуры и функций. Изучаемые ферменты участвуют е важнейших ферментативных процессах: синтезе аммиака (нитрогеназа), азотном обмене (глутаминсинтетаза, ала-ниндегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа), синтезе АТР (АТР-синтаза), фотосинтезе (карбоангидраза), ионном транспорте (Са^+-АТРаза), окислении ксенобиотиков (цитохром Р-450) и метана (мвташ.юнооксигеназа) и других. Изучались также внеклеточные ферменты:р -Глюкозидаза, кислая фосфатаза и лнзертаза. Метод электронной микроскопии использовался в данной работе для непосредственного наблюдения образования комплекса двух ферментов:- глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и фосфоглицераткииазы. Изучению подобных относительно непрочных комплексов уделяется большое внимание в современной энзимологаи.

Научная новизна. В работе было проведено определение и сопоставление четвертичной структуры (числа л расположения субъединиц) большого числа ферментов, относящихся к разным классам. Какие-либо достоверные сведения о четвертичной структуре большинства ферментов к началу нашего исследования отсутствовали. Существование олигомерной структуры у мембранных монооксигеназных ферментов (цитохром Р-450 и метанмонооксигеназа) и внеклеточных ферментов (^-Глюкозидаза, кислая фосфатаза и инвергаза) было установлено впервые. Представления о структуре МоЗРе-белка, молекулы нитрогеназы, Pj-АТРазы, изложенное ранее другими авторами, не удолетворяли полученным нами данным, что привело к созданию их новых моделей. Было определено как присоединяется 5е-белок к МоРе-белку и число субъединиц Ре-белка в молекуле нитрогеназы, Еыяснена стерическая возможность переноса электронов от Ре-белка к МоРе-белку. Было показано двухслойное строение Pj-ATP азы, которая ранее считалась плоской. При исследовании митохондри-альной Р^-АТРазы была разработана и применена новая методика изучения локализации SH-групп в белках с помощью ферритиновой метки, которая может найти црименение в исследованиях структуры и свойств других белков. С помощью данной методики непосредственно обнаружена неэквивалентность отдельных ß-субъединиц в Fj-АТРазе. Предложена модель АТР-синтазы (Р0?^-АТРазы) и выяснена ее локализация в мембране, что необходимо для понимания процессов синтеза АТР - основного источника энергии клетки.

В диссертационной работе впервые было проведено комплексное сравнительное исследование структуры множественных форм глутаминсинте-тазы еысших растений, одноклеточных зеленых водорослей и азотфикси-рующих клубеньков бобовых растений. Это позволило выявить наличие определенных связей между их структурой, свойствами и происхождением. Полученные данные удалось применить к исследованию ранее неизвестных молекулярных форм фермента, например, глутаминсинтетаз II и III клубеньков желтого люпина.

В работе удалось непосредственно подтвердить биохимические данные о существовании комплекса между двумя растворимыми ферментами: гли-церальдегид-3-фосфатдегидрогеназой и фосфоглицераткиназой. Исследование подобных непрочных комплексов методом электронной микроскопии ранее не проводилось.

Практическая значимость. В диссертационной работе сформулированы общие представления и проведено сравнение субъединичной структуры и внутренней симметрии более 20 ферментов различных классов, групп и происхождения, изучено строение одного из ферментных комплексов.

Результаты диссертационной работы могут иметь значение для углубления знаний о структуре и свойствах олигомерных ферментов и представлять интерес для биофизиков и биохимиков, занимающихся проблемам биологической фиксации азота, биоэнергетики и другими.

Методические приемы, разработанные в ходе изучения данных структур, могут оказаться полезными при электронно-микроскопических исследованиях других биологических объектов.

Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертационной работе, докладывались на УН Европейском конгрессе по электронной микроскопии (Гаага, 1980); Всесоюзных симпозиумах "Структура биологических макромолекул" (Звенигород, 1981; 1984; 1986); Всесоюзном симпозиуме "Механизмы усвоения азота и биосинтеза белка в растениях (Алма-ата, 1981); ШСоветско-итальянском симпозиуме по макромолекулам в функционирующей клетке (Сиена, Италия, 1982); II Советско-швейцарском симпозиуме по структуре биологических мембран (Ташкент, 1983); У1П Европейской конференции по электронной микроскопии (Будапешт, Венгрия, 1984); 16 конференции ФЕБО (Москва, 1984)," Н Международной конференции по электронной микроскопии (Киото, Япония, 1986); XIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Звенигород, 1988).

Структура и объем работы. Диссертация-состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части и обсуждения результатов (5 глав) и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 281 странице машинописного текста, включая 89 рисункоЕ-и 6 таблиц. Список цитированной литературы включает 314 названий.

Положения, выносимые на защиту.

1. Установление наличия олигомерной структуры у ряда ферментов: мембранных монооксигеназ (цитохром Р-450, метанмонооксигеназа), внеклеточных ферментов ($ -глюкозидаза, кислая фосфатаза, инвертаза).

2. Исследование и сравнительный анализ четвертичной структуры молекул около 20 растворимых и мембранных ферментои, а также изучение строения некоторых -белковых (ферментных) комплексов.

3. Рассмотрение связи симметрии и других структурных особенностей изученных олигомерных ферментов и белковых (ферментных)комплексов

с их функцией и свойствами.

4. Разработка различных подходов исследования структуры одиночных молекул и надмолекулярных образований методом электронной микроскопии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования

Выделение и очистка препаратов

Аланиндегидрогеназа. Фермент был изолирован 0.В.Казаковой (Институт биохимии ш. А.Н.Баха) из бактероидов корневых клубеньков желтого люпина. Бактероиды выделяли по методу Бергерсена и Тернера (Bergersen,Turner , 1987). Ддя очистки фермента применялась ионно-обменная хроматография на ДЭАЭ-сефацеле, хроматография на фенил-се-фарозе и гельфильтрация через Toyopearl hw-55 (Казакова и др., 1988).

Глутаматдагидрогеназа. Фермент получали из биомассы одноклеточной зеленой Еодоросли Chlorella pyrenoiàoea 82Т с помощью иммунноаффан-ной хромотографии на колонке сефарозы 4В с пришитыми к ней антителами против глутаматдегидрогеназы, выделенной и очищенной В.И.Лосевой и В.Р.Шатиловым в Институте биохимии АН СССР им. А.Н.Баха (Лосева и др., 1986).

Гидрогеназа водородокдсляющей бактерии А1са11кепея eutrophun 7.1. Выделешш и очистка фермента Доводились В.О.Поповш и И.Б.Уткиным (Институт биохимии АН СССР им. А.Н.Баха). Для получения фермента биомассу разрушали ультразвуком. Фермент очищали двухкратной хроматографией на фенил-сефарозе и гельфильтрацией (Газарян и др., 1983).

Нигрогеназа азотобактера Azotobacter vinelandü. МоРе-белок был зыделен И.З.Мицовой, И.С.Блаячук и Р.И.Гвоздевым (Институт химической физики АН СССР). Рекомбинированный нитрогеназный комплекс получали смешванием Ре-белка и МоРе-белка в присутствии Mg-ATP (Tsuprun et al., 1985).

Штохром P-450 LM2 микросом печеш: кролика. Фермент был выделен К.Н.МясоедоЕОй и П.Берндтом (Институт химической физики All СССР) с использованием детергента холата натрия (Цупруи и др., 1985; Tsuprun et al., 1986). После очистки eco исследованные препараты цитохрома Р-450 были активны в реконструированной монооксигеназной системе.

Метанмонооксигеназл метанокислятей бактерии Methyiococcus с-гови-latus M. Метанглонооксигеназа была выделена II.П. Акентьевой и Р.И.Гвоздевым (Институт химической физики АН СССР) из мембранной фракции с использованием дезоксихол^та (Цупрун и др., 1987).

р -Глюкозидаза термофильных глйлро.'мцетор Ag.>orryjllus vent il. Выделение и очистка ферменте выколшии Г.И.Квеситадзе, Р.С.Сванидзе, Т.К.Буачидзе, Д.Н.11ижарадзе(Ипстптут биохимии растеши АН ТрССР).

Белок осаждали этанолом из культуральной жидкости гриба и очищали до гомогенного состояния ультрафильтрацией, иошюобменной хромото-графией е градиенте ионной силы и рН и гельфильтрацией (Квеситад-зе и др., 1990).

Кислая йосфатаза и инвертаза дрожжей ЗассЬагоиуссз сегеу!в1ае 282С. Ферменты были Еыделены С. Н. Егоровым и М.Г.Шныревой (Биологический факультет МГУ). Для этого использовалиоь концентрирование культуральной жидкости ультрафильтрацией, аффинная хроматография, гельфильтрацет.

Получение кристаллов Са^+-АТРазц. Мембранные пузырьки фракции продольных трубочек и терминальных цистерн саркоплазматического рэ-тикулума (СР) были выделены из гомогената задних конечностей кролика Е.В.Меньшиковой и В.Б.Рятовым (Меньшикова, Ритое, 1986). Для кристаллизации белка в мембранах СР суспензию пузырьков терминальных цистерн смешивали со средой кристаллизации, содержащей ванадат натрия (Цупрун и др., 1987).

?д--АТРаза из анаэробной бактерии 1асЬоЬас111ия сазе! была выделена С.Ф.Бикетовым и Е.И.Милейковской (Институт биохимии АН СССР ем. А.Н.Баха) с помощью изотахофореза и гельфильтрации на колонке с сефарозой 6В (В1ке-!;оу et а1, 1982).

Р-ц-АТРаза из митохондрий сердца быка. Выделение, очистка Р-^-АТР азы и получение конъюгатов Р^-АТРазы с ферритином выполнено И.В.Ме-сянжиноеой а Я.М.Мильгромом (Лаборатория им. А.Н.Белозерского МГУ). Субмитохондриальные пузырьки, содержащие мембранно-связаннув Р^-АТР азу, были получены яри обработке митохондрий ультразвуком. ^-АТРаза была выделена из митохондрий по методу Ноэлса и Поневского (кпоиДевз, Репе Гаку, 1972).

Получение препаратов для исследования локализации зн-групп в ми~ тохондриальной Р^-АТРазе с помощью сЬерритиновой метки. Для получения модифицированного ферритина, способного взаимодействовать с ¡зн-грун-пами белков, использовали его обработку 2-иминотиоланом и 5,5'-дит®> бис(2-нитробензоатом)или сокращенно - 11Ь32. Конъюгаты получали добаа ляя к раствору ^-АТРазы модифицированный ферритин. Число доступных зн-групп в Р^-АТРазе было увеличено путем обработки фермента холодным я-этилмалеимидом и дитиотроитолом (твиргип et а1., 1987).

Распределение доступных зн-групп в Р-рАТРазе было исследовано по включению е них n-[^0] этилмалеимида. Включение метки в отдельные субъединицы Р-г-АТРазы, отражающее наличие в них свободных эн-гру™,

было установлено измерением радиоактивности геля после sds электрофореза. Как для нагивной (рис- 1а), так и модифицированной ïj-АТРазы (рис. 16) н-[*4С]этилмалаимид включался только в а + fi - и у -субъединицы и практически полностью отсутствовал в других минорных субъединицах.

АТР-синтаза митохондрий йыла выделена с использованием детергента (холата натрия) по методу Кагавы И Рэкера (Kagawa,Hacker , 1971).

Электрофорез Pj-ATP азы, модифицированной Nэтилмалеими-дом, до (а) и после (б) последовательной обработки холодным -этималеимидом и дитио-треитолом.

очищена до гомогенной состояния Д.А.Алиевым, Н.Г.Гулиевым, Т.Г.Мамедовым (Институт общей физики АН АзССР) (Алиев и др., 1985; 1986).

Глутаминсинтетазы. Биохимическая часть работы по выделению, очистке и исследованию физико-химических свойств фермента выполнены в Институте биохимии АН СССР им. А.Н.Баха' А.В.Пушкиным, Н.А.Соловьевой, З.Г.Евстигнеевой, В.Л.Кретовичем, Л.П.Антонюк, Т.З.Джохаридзе, Т.П. 1Ъловой, Г.Э.ШиффелоЕой, Х.Данг, А.С.РасулоЕым, М.С.Турухановой. Все глутаминсинтетазы (ГС) были очищены до гомогенного состояния: ГС хлоропластов 'листьев гороха (Евстигнеева и др., 1979); ГС цитозоля листьев и семян гороха (Pushkin et al., 1985 )', цитозоля и хлоропластов листьев тыквы (Пушкин и др., 1982, 1983); корней тыквы (Голова И др., 1984); одноклеточной зеленой Еодоросли Ankistoüesmus fcraunii (Расулов и др., 1986); хлореллы (Расулов и др., 1976); цитозоля клубеньков люпина (Садыкова и др., 1985); бактероидов клубенькоЕ люпина (Шиффелова, 1986, 1987); цианобактерий Hostос muscorum (ТуруханоЕа

и др., 1986) и Spirulina platensis(ÄaHr Хоанг Фыок Хьен и др., 1988).

Комплекс глиперальдегид-З-ФосФатдегидрогеназы и З-Фоссвоглинерат-киназн был получен М.Суходольцем, В.И.Муронцом, Н.К.Наградовой (Лаб. им. А.Н.Белозерского МГУ). Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназу (ГАФД) и 3-фосфоглицераткиназу выделяли из скелетных Мышц кролика методом аффинной элгации (Суходолец и др., 1987). Ферментный комплекс получали добавляя к ацилировавной ГАФД фосфоглицераткиназу (Sxüchodolete et al., 1988).

Электронная микроскопия и методы анализа изображений

Приготовление препаратов и получение микрофотографий. Препараты для электронной микроскопии получали используя методику негативного контрастирования. В качестве контрастеров использовали 1-2 % раствор уранилацетата, 2 % раствор фосфорновольфрамовой кислоты (ФЕК), 5 % раствор молибдата аммония. В качестве подложки для препарирования использовали тонкую коллодиевую или углеродную пленку. Конкретные условия препарирования (выбор буфера, контрастера, подложки) для каждого из ферментов подбирались индивидуально.

Микрофотографии были получены на электронных микроскопах Philips ЕМ 400 (Нидерланды) и jem-IOOC (Япония) при увеличении 50000 и ускоряющем напряжении 80 кВ.

Оптическая дифракция и фильтрация. Оптические дифракционные исследования бшш выполнены на оптическом дифрактометре ИКАЛ.

Цифровая обработка изображений. Для обработки изображений.на ЭВМ они были переведены в цифровую форму с помощью барабанного автоматического микроденситометра Фотосхан Р-1000 (Оптроникс, США) или автоматического микроденситометра с плоским столом PDS -I0I0A (Пер-кин-Эрмлер, США). Расчеты проводились на мини-ЭВМ Н0РД-100 и ЕС -1045. Вывод результатов обработки осуществляли на графический дисплей Тектроникс 4010 (США), Фоторайт Р-1000 (Оптроникс, США), полутоновой дисплей конструкции Института автоматики и электрометрии СО АН СССР.

Шевровое усреднение изображений отдельных частиц. Улучшение отношения сигнал/шум объекта й работе было осуществлено цифровым методом усредняя серию однотипных изображений. Для оценки идентичности изображений была использована функция корреляции. Расчеты проводились с использованием комплекса программ, поставленного Е.В.Орловой на мини-ЭВМ НОРД-ТОО (в последнем варианте с процессором Н0РД-500). Прг работе с комплексом участок изображения, содержащий исследуемую час-

типу, выделялся круглой маской, его плотность нормировалась, и рассчитывался спектр Фурье. Затем осуществлялась низкочастотная фильтрация. С этой целью спектр объекта умножался на функцию фильтра, определяемую кривой Гаусса с круговой симметрией. На следующем этапе на основе функции корреляции определялось относительное смещение изображений и степень их сходства по величине коэффициента корреляции. После этого выполнялось совмещение и суммирование изображений для их усреднения. Усреднение проводилось для изображений, коэффициент корреляции которых по отношению к изображению, принятому е качестве эталонного, был выше некоторого заданного порога.

Вращательная Фильтрация изображений. Для обработки изображений частиц, которые предположительно характеризовались Еращательной симметрией, был использован метод вращательной фильтрации, основанный на разложении функции плотности по цилиндрическим волнам (Crow-ther , Amos, 1971). С помощью данного метода определялся порядок, оси симметрии вращения и рассчитывалось фильтрованное изображение. При расчете использовался комплекс программ еы group, адаптированный О.Н.Зо13>аф для ЭВМ EC-I040 (Zograph et al., 1984).

Цифровая Фильтрация изображений двухмерных кристаллов. Фурье-трансформанта изображения (512 х 512) элементов вычислялась на ЭВМ, используя программу быстрого Фурье-преобразования. Затем определялись параметры решетки (Еектора решетки и угол между ними). Фильтрация осуществлялась путем наложения маски на трансформанту, используя для обратного преобразования только амплитуды и фазы растровых точек, находящихся внутри небольшого радиуса вокруг положения рефлексов в узлах обратной решетки. Для расчета использовался комплекс программ бы group, адаптированный И.В.ТагуноЕой и О.Н.Зограф для ЭВМ ЕС-1045.

Трехмерная реконструкция спиральных объектов осуществлялась методом модифицированных проектирующих функций (Вайнштейн, 1973). Параметры спиральной упаковки частиц определялись из дифракционной картины. Расчеты проводились на ЭВМ СМ4-20 с использованием комплекса программ, разработанного О.Н.Зограф. Предварительно с помощью системы ibas 2000(Kontron, ФРГ) была осуществлена цифровая Фурье-фильтрация изображения, и профильтрованное изображение использовалось для трехмерной реконструкции.

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ФЕРМЕНТОВ КЛАССА ОКСИРЕДУКГАЗ

Модели гогридинзависимых дегидрогеназ: аланиндегидрогеназы л глугаматдептюгеназы.

Аланишгегидрогеназа бактероидов Rhlzobium luplni. Аланиндегидро-геназа ( L-аланин: нло+оксиредуктаза, дезаминирувдая, КФ I.4.I.'I) участвует в образовании аланина у микроорганизмов. Этот фермент довольно широко распостранен у бактерий, в том числе азотфиксирующих, и может играть определенную роль в ассимиляции аммиака. В литературе имеются весьма различающиеся друг от друга данные о молекулярной массе и числе субъединиц бактериальной аланиндегидрогеназы. По мнению многих исследователей фермент является гексамером и имеет молекулярную массу 200 - 300 кДа, в то же время имеются данные, что аланин-дегидрогеназа из бактероидов Rhizobium japonicua является тетраме-ром M = 170 кДа (Müller, Werner, 1932).

В настоящей работе исследовалась аланиндегидрогеназа, изолированная из бактероидов азотфиксирующих клубеньков желтого люпина. На микрофотографиях преимущественно наблюдались проекции частиц, имеющие прямоугольные очертания дойной 8-9 ни и шириной 7 - 8 нм, содержащие четыре области белковой плотности и характеризующиеся симметрие оси 2-го .порядка (рис. 2а), а также близкие к равностороннему треугольнику со стороной 8 - 9 нм (рис. 26). Наличие указанных проекций позволяет заключить, что фермент состоит из четырех субъединиц, расположенных с симметрнй 222 (Д2).

По 'своей четвертичной структуре молекула аланиндегидрогеназы имеет сходство с лактадегидрогеназой. Одним из субстратов обоих ферментов является пируват..Такое сходство двух указанных ферментов позволяет предположить наличие определенной гомологии их внутренней структуры.

Глутаматдегидрогеназа одноклеточной зеленой водоросли Chlorella nvrenoidoHfl 82Т. Глутаматдегидрогеназа (l -глутамат: nad(p)+ оксире-дуктаза (дезаминирующая)КФ1Д.4.2-4). Фермент катализирует окислительное дезаминированае L-глутамата в 2-оксоглутарат и аммоний за счет восстановления одной молекулы had или nad(p)Все изученные до сих пор глутаматдегидрогеназы имеют олигомерное строение (Шатилов, 1987). Однако определение четвертичной структуры фермента в большинстве случаев сделано по соотношению молекулярных масс молекулы и ее субъединиц. При этом часто были получены противоречивые ре-

Рис. 2. Характерные проекции аланиндегидрогеназы и ее модель в соответствующей ориентации. Негативное контрастирование 2 % фосфорноволъфрамовой кислотой.

Рис. 3. Подборка изображений глутаматдегидрогеназы и ее модель в двух характерных ориентациях. Негативное контрастирование уранилацетатом. (а) -Фронтальная проекция (вдоль оси 3-го порядка); (б) - боковая проекция (вдоль оси 2-го порядка).

зультаты.

В диссертационной работе методом электронной микроскопии было исследовано строение ИА1)(г)-глугаматдегидрогеназы с. pyrenoidosa. На микрофотографиях фермента наблюдались преимущественно два характерных .типа изображений. Один из них имел форму, близкую к равностороннему треугольнику (рис. За), а другой - прямоугольника (рис. 36). На многих аз треугольных изображений (рис. За) снаружи частиц хорошо видны шесть небольших выступов. На основе анализа полученных изображений предложена упрощенная модель молекулы, представленная в правой части рис. 3. Согласно этой модели шесть мономеров расположены с симметрией 32 в двух слоях по Еершинам двух треугольников, слегка повернутых друг относительно друга вокруг оси 3-го порядка.

Недавно методом рентгеноструктурного анализа (Rice et al., 1987) была определена структура глугаматдегидрогеназы из бактерий о. зуи-biosun при разрешении 0,6 ни. Четвертичная структура исследуемой нами глугаматдегидрогеназы оказалась аналогичной глутаматдегидро-геназе С. aymbioaum , а также печени быка (Plshkin et al., 1971). Таким образом глутаматдегидрогеназы из трех совершенно различных в эволюционном отношении организмов (бактерий, одноклеточных зеленых водорослей и животных) являются гексамерами симметрии 32.

Модель молекулы гидрогеназы водородокисляющей бактерии Alcalige-пеэ eutrophua 21. Гидрогеназа катализирует обратимое окисление водорода. Она является ключевым ферментом метаболизма водорода многих организмов, которые используют Н2 как источник энергии (Schlegel, Sohneifler, 1978; Кондратьева, Гоготов, 1981).

В нашей работе изучалась структура гидрогеназы из К. eutrophua (водород: ш>-оксиредуктаза, КФ 1.12.1.2). Это NAB-зависимый фермент представляет сложный полифункциональный олигомерный белок, относящийся к железо-серусодержащим фпавоферментам. Он состоит из четырех субъединиц с молекулярными массами 66, 55, 29 и 26 кДа соответственно. Фермент катализирует гидрогеназную реакцию с физиологическим HAD и искусственными акцепторами электропоЕ и диафоразную с одно- и дЕухэлектроннымл акцепторами.

На электронных микрофотографиях гидрогеназы преимущественно наблюдались палочкообразные проекции частиц с размерами (13 - 14) х (5 - 6) нм. Удалось выделить несколько типов изображений (ряс. 4), которые можно трактовать с помощью модели, состоящей из двух больших и двух малых субъединиц, находящихся между большими. Наилучшее

соответствие меаду моделью и проекциями молекулы на микрофотографиях получается, если считать, что большие субъединицы имеют близкую форму и погернуты на угол около 45° относительно продольной оси молекулы. Молекулу гидрогеназы можно приближенно охарактеризовать симметрией оси 2-го порядка, связывающей два протомера, каждый из которых состоит из одной большой и одной малой субъеданицы.

Совокупность биохимических данных позволили выделить в составе гидрогеназы специальную диафоразную субъединицу (~60 кДа), диафо-разный гетеродомер 90 кДа) и особый гидрогеназный фрагмент (6090 кДа), ответственный за появление соответствующих активностей. Зле' ктронно-микроскопическое исследование гидрогеназы показывает, что эт: два функциональных фрагмента ("подфермента") могут быть локализованы на двух протомерах белка, содержащих кавдый по одной большой и одной малой субъединице.

Рис. 4. (а-г) - Характерные проекции молекулы гидрогэназы :; ос

модель е ориентациях, соответствующих различным ;углам поворота молекулы вокруг ее продольной оси. Негатиг-ноэ контраста рование 2% фосфорноЕОЛЬфрамовой кислотой.

Модель молекулы нитрогеназы азотДикоируидей бактерии Aaotobacter vinelandlí. Нитрогеназа (к2-оксиредуктаза, КФ I.18.6.1) катализирует восстановление молекулярного азота до аммиака биологическими (ферродоксин, флаводоксин) или модельными (дитионит) восстановителями сопряженно с реакцией гидролиза AIP. Нитрогеназа состоит из двух легко разделяемых белковых компонентов: МоРе-белка и ïe-белка. МоРе-белок состоит из четырех субъединиц - Sa и 2ß , с молекущной массой et- и ß-субъединиц около 60 и 50 кДа соответственно. МоРе-белок содержит 32 - 34 атома негемоЕОго железа и деа атома молибдена Атомы молибдена включены в состав неорганического кофактора, содержащего Fe и Mo (FeМо-кофактор). Fe-белок имеет молекулярную массу около 62кДа и состоит из двух идентичных субъединиц (Shah, Brill, 1977; Лихтенштейн, 1979, 1986; Шилов, 1982; Lowe et al., 1985; Orme-Johneon, 1985; Eady, 1986). Согласно современным представлениям субстрат связывается с FeMo-кофактором МоРе-белка и восстанавливается электронами, поступающими от Fe - s кластера Fe-белка через Уе - s кластеры МоРе-белка в сопряженной с этим процессом редокс-зависииой АТРазной реакции. Несмотря на предпринятые усилия многие фундаментальные вопросы, осуществляемого нитрогеназой катализа, остаются неясными. Дяя их понимания чрезвычайно важно знать трехмерную структуру нитрогеназы.

Нами изучалась четвертичная структура МоРе-белка и молекулы нитрогеназы азотобактера A. vinelandii. Среди отдельных частиц МоРе-белка удалось выявить четыре характерных типа изображений. Первый тип (рис. 5а) тлел форму параллелограмма с размерами сторон 8 и 9 нм и углом 75'- 80°. Было выполнено цифровое усреднение изображений рассматриваемого типа. На усредненном изображении -(рис. 6а) выявляются четыре максимума белковой плотности. Корреляционный анализ показал присутствие у данной проекции оси симметрии 2-го порядка. Наряду с рассмотренным типом изображений, встречались квадратные (рис. 56), крестообразные (рис. 5в), а также треугольные цроекции частиц (рис. 5г). Наблюдаемые проекции можно трактовать с помощью модели (рис. 5), в которой две а -субъеданицы смещены относительно двух ß -субъединиц вдоль оси 2-го порядка. МоРе-белок имеет форму сплющенного тетраэдра, т.е. не является плоским, как было предложено ранее (Hardy et al., 1975). Эта модель подтверждается также данными, полученными при трехмерной реконструкции трубчатых кристаллов МоРе-белка, образованных в присутствии Mg2+ и характеризующихся спиральной симметрией

(рис. 5д).

Рис. 5. (а-г) - Характерные проекции МоЕе-белка и его модель в

соответствующей ориентации. Негативное контрастирование уранилацетатом. д - Модель четырех частиц МоРе-белка, связанных симметрией оси 4-го порядка, полученная в результате трехмерной реконструкции трубчатых кристаллов.

Для определения четвертичной структуры молекулы нитрогеназы использовался рекомбинпроЕанный нитрогеназный комплекс, полученный, из МоРе-белка и. Ре-белка. На микрофотографиях нитрогеназы наблюдались типы изображений частиц, очень близкие тем, что ранее были выявлены для МоРе-белка. Изображения молекулы в форме параллелограмма были усреднены цифровым методом. Усредненное изображение характеризовалось высоким коэффициентом корреляции при повороте на 180° (~0,88), поэтому оно было симметризовано по оси 2-го порядка (рис. 66). Было произведено сравнение результата усреднения (рис. 66) с уже упомянутой проекцией МоРе-белка (рис. 6а). Указанные изображения МоРе-белка (рис. 6а) и нитрогеназы (рис. 66) имеют одинаковую форму и размер и

содержат четыре максимума белковой плотности по вершинам параллелограмма. Однако в центральной части усредненного изображения молекула нитрогеназы (рис. 66) отчетливо видны два максимума плотности. Так как при сравнении рис. 6а и 66 не обнаруживается существенных различий кроме наличия двух дополнительных максимумов-белковой плотности на изображении нитрогеназного комплекса, то совершенно естественно связать появление этих максимумов с присоединением Ре-белка к МоРе-белку в этих местах. Расстояние между центрами максимумов составляем около 2,5 - 3 нм. Это указывает, что каждый максимум соответствует одной субъединице Ре-белка, а сам Ре-белок имеет гантелеобразную форму. С использованием других проекций нитрогеназного комплекса была предложена модель молекулы нитрогеназы, согласно которой она образована из одного МоРе-белка и одного димера Ре-белка и обладает как и МоРе-белок симметрией вращения 2-го порядка. В ряде работ, нацримвр, (НогЧепзоп, ТЬогпеНу , 1979) приводятся данные о структуре молекулы нитрогеназы, в которой МоРе-белок и димер ре-белка имеют стехиометрию 1:2. Такой вариант противоречит нашим данным. В пользу того, что па МоРе-белок приходится один димер Ре-белка указывают прямые физические измерения скорости седиментации с различной стехиометрией белковых компонентов тьогпеИу, 1975). На рис. 6а,б представлены модели МоРе-белка и молекулы нитрогеназы. Молекулу нитрогеназы можно представить в виде двух половинок, каждая из которых состоит из одной а - и р -субъединицы МоРе-белка и одной субъединицы Ре-белка, связанных симметрией вращения 2-го порядка.

Недавно было выполнено рентгеноструктурное исследование МоРе-белка при разрешении 0,8 нм (Сосфенов и др., 1986). Была получена структура, с которой хорошо согласуется модель МоРе-белка, предложенная в диссертационной работе. Анализ карт электронной плотности показал, что внутри ол —субъединиц наблюдаются несколько особенно высоких пиков электронной плотности, группирующихся вокруг оси 2-го порядка. Исходя из относительных Бесов пиков, было предложено, что два смежных пика принадлежат РеМо-кофакторам, с которыми происходит связывание азота. В этом случае согласно электронно-микроскопической модели нитрогеназь каждая из Ре-субъединиц находится в непосредственной близости от места возможной локализации РеМо-кофакторов (около оси 2-го порядка). Благодаря такой близости становится возможной непосредственная передача электронов от Ре-белка к РеМо-кофактору МоРе-белка.

5нм

- к

¿шш

W Fe-proti

Рис. 6. Проекция структуры и модель Мо£з-белка (а) в молекулы нитрогеназы (б). Представлены усредненные изображения 20 совмещенных частиц МоРе-белка и нитрогеназного комплекса (б) в виде полутоновых картин и в изолиниях плотности.

Электронная Микроскопия мембранных монооксигеназных Ферментов: штохрома Р-450 и метанмонооксигеназы

Четвертичная структура ттохпома Р-450 из мембран микросом печени. Цитохром Р-450 (КФ I.14.14) эндоплазматического ретикулума клеток печени, относящийся к семейству гемопротеинов, в составе моно-оксигеназной ферментной системы осуществляет окисление широкого ряда ксенобиотиков и эндогенных субстратов. Микросомальная цепь ферментов, осуществляющая гидроксилирование, содержит цитохром Р-450 и hadph-зависимый флавопротеин (на1)рн-цитохром-Р-450-редуктаза) (Арчаков, 1979, 1983; Black, Coon, 1986, 1987). Цитохром Р-450 мик-

росомальных мембран печени кролика представлен рядом изоформ. Солю-билиэированные изоформы цитохрома Р-450 в глицерине существуют в виде олигомеров с молекулярной массой 300-500 кДа (по данным разных авторов), причем максимальная активность фермента проявляется в оли-гомерном состоянии (Wagner et al., 19В4-).

В диссертационной работе исследовалась четвертичная структура цитохрома Р-450 LU2 из микросом печени кролика. Анализ изображений одиночных частиц, негативно контрастированных кремниевовольфрамово-кислым калием, показал, что молекула состоит из шести мономеров, расположенных в двух слоях по вершинам треугольной антипризмы с симметрией 32 (Д3). Дие усредненные с помощью ЭВМ молекулярные проекции фермента (фронтальная и боковая) представлены на рис. 7. Предложенная модель четвертичной структуры цитохрома Р-450 хорошо объясняет данные по диссоциации и самосборке фермента с использованием метода ковалентной иммобилизации (Мясоедова, Берндт, 1987).

Структура метанмонооксигеназы внутрицитоплазматических мембран метанокисляющих бактерий Methyloccocua capsulatu3. Метанмонооксиге-наза (метан, аш(Р)Н: кислород оксиредуктаза, КФ I.14.13.25) катализирует реакцию превращения СН4 до СН30Н. Реакция протекает по моно-оксигеназному механизму. Компонентами меганмонооксигеназы (ММО) являются ферменты монооксигеназа и НАДН-редуктаза.

В диссертационной работе было проведено определение четвертичной структуры как монооксигеназы, так и НАДН-редуктазы. В препаратах на-тивной ММО фракции наблюдались заполненные контрастером пузырьки различного диаметра. Медленное удаление детергента (дезоксихолата) из раствора очищенной монооксигеназы в детергенте вызывало образование кристаллических агрегатоЕ, близких к симметрии Р6, с постоянной решетки около 8,5 нм. Выла осуществлена цифровая Фурье-фильтрация изображений таких агрегатов. На профильтрованном изображении (рис. 8а) отчетливо видна гексагональная проекция частиц с шестью пиками белково: плотности и диаметром около 9 нм. Принимая во внимание молекулярную массу монооксигеназы (~220кДа) и ее субъединиц (~35кДа), из проекции структуры можно сделать вывод, что фермент является гексамером.

В препаратах очищенной НАДН-редуктазы большинство изображений одиночных частиц имело квадратные очертания со стороной около 8,5 нм Ряд таких изображений был усреднен с помощью ЭВМ. На окончательном изображении (рис. 86) четыре области белковой плотности расположены по вершинам квадрата. Эти даннко, учитывая молекулярную массу бежа

3

I

Рис. 7. Молекулярные проекции цитохрогла Р-450. Усредненные с помощью ¿ЗЕМ изображения фронтальной проекции (после усреднения по оси 3-го порядка) - (а) и 6окоеой проекции - (б). . Изображения представлены в еидс полутоновых картин и в изолиниях.

б^;.* . '«¿г-

5НМ

Рис.8. Электронная микроскопия мотанмопоксигенази.

(а) - Цифровая фильтрация двухмерного кристаллического агрегата

монооксигеназы.

(б) - Результат усреднения.10 изображений молекул НДдН-редуктазы

(после усреднения по симметрии оси 2-го порядка), представленный в виде полутоновой картины и в изолшшях.

(~180кДа) и его субъединиц (~45кДа), показывают, что молекула НАДЯ-редуктазы состоит из четырех идентичных или близких субъединиц и имеет квадратную проекцию со стороной около 8,5 нм.

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ФЕРМЕНТОВ КЛАССА ГИДРОЛАЗ

Четвертичная структура внеклеточных ферментов: ^-Глюкозидазы, кислой фосфатазы и инвертазы.

В настоящей работе изучались внеклеточные'ферменты:уз -Глюкозидаза из термофильных микромицетов АарегвШиз wentli, кислая фосфатаза и инвертаза дрожжей ЗассНаготуоеэ сегет1в1ае. ¡1 -Глюкозидаза гидролизу ■ ет целлобиозу до.р-и-глюкозы (КФ 3.2.1.21). Кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2) относится к группе неспецифических фосфогидролаз и осуществляет гидролиз.ортофосфорного моно эфира с образованием спирта и орто-фосфата. В настоящее■время-обнаружены две формы кислой фосфатазы, конститутивная и репрессибельная, которые еходят в состав клеточной стенки и могут секретироЕаться в среду культивирования. ИнЕертаза (р- с-фруктофуранозидаза, КФ 3.2.1.26) расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу. Все указанные ферменты являются гликопротеинами и имеют различную степень гликозилирования. В кислой фосфатазе и ипвер тазе указанный компонент составляет около половины их молекулярной массы. Нами было.проведено электронно-микроскопическое исследование четвертичной структуры- этих экзоферментов, так как в литературе не существует определенного мнения по этому.вопросу.

^-Глюкозидаза термофильного гриба А. уге^И. В негативно контрас тированных препаратах фермента наблюдалось несколько характерных прс екций одиночных частиц. Преобладающий тип изображений имел вид шести угольника диаметром около 9 нм (рис. 9а). Наблюдались также проекции в форме параллелограмма (рис. 96), прямоугольника (рис. 9в), крестообразные (рис. 9д). Анализ Есех указанных проекций позволил прёдлои модель молекулы: шесть субъединиц расположены в даух слоях по вершинам треугольной антипризмы с точечной группой симметрии 32. Полученные нами данные о гексамерной структуре фермента подтверждаются исследованиями двухмерных кристаллов молекул, на которых отчетливо ви; гексагональная проекция частиц (рис. 9е).

Олигоморное строение молекулы может способствовать ее высокой термостабильпости, так как процесс термоинактивации фермента сопровождается распадом гоксамера на отдельные субъединицы (Квеситадзе и др., 1990).

Рис. 9. (а-д) - Характерные изображения р -Глэкозидазы. Негативное контрастирование 2% ФВК. Различные проекции модели показаны в правой части рисунка. (е) - ]ТройилътроЕанкое изображение двухмерного кристалла.

20 им

Р2С. 10. ИзобрзЕЛШЯ пвадратао2 проекции молекул рсггрзсслЗ;.-.:.::^.: фаргг хо;С£0& фосфатазы.

20 нм

Рис. II. Подборка изображена;! молекул шгеертазы.

Кислая фосфатаза и инвертаза дрожжей s. cerevlalae . Изучение кислой фосфатазы, а также инеертазы методом электронной микроскопии выявило сходстео их четвертичной структуры. В очищенных препаратах эти: ферментов большинство изображений одиночных частиц имело квадратные очертания со стороной 12 ± 0,5 m с четырьмя областями белковой плотности(рис. 10,11). Эти данные с учетом молекулярных масс молекул и их субъединиц показывают, что эти экзоферменты представляют собой квадратные тетрамеры.

Сравнительное исследование двухмерных кристаллов Са^+-АТРазы из фракции терминальных цистерн и продольных трубочек саркоплазматиче-ского ретикулума. Сокращение волокон скелетных мышц и миокарда запускается в результате освобождения ионое Са^+ из цистерн саркоплаз-матического ретикулума (СР). Исследования, проведенные.на изолированных мембранах СР, показали, что они'могут быть разделены на две фракции: терминальных цистерн и продольшх трубочек. Мембраны терминальных цистерн содержат систему освобождения Са^+, отсутствующую ео фракции продольных трубочек. В состав обех фракций входит транспортная Са2+-зависимая АТРаза (КФ 3.6.1.38). Ca -АТРаза в мембранах продольных трубочек образует упорядоченные агрегаты в присутствии вана-дата натрия, когорне были использованы для электронной микроскопии с последующей цифровой фильтрацией изображений (.Taylor et al., 1984) и трехмерной реконструкции (Taylor et al., 1985). Что касается фракции терминальных цистерн, то для нее такие исследования не проводились. Одна из целей нашего исследования состояла в получении предварительных данных о структуре. Са^+-АТРазы терминальных цистерн с использованием ванадата натрия е качестве специфического агента, вызывающего кристаллизацию фермента.

На микрофотографиях препарата мембран фракции терминальных цистер] СР, инкубированных с ванадатом, наблюдались замкнутые пузырьки, имеющие форму сплющенных труб шириной 60 - 70 нм, дающих картину наложения кристаллических решеток двух плоских мембранных слоев. Изображения этих слоев были разделены с помощью цифровой фильтрации. На рис. 12а представлен результат фильтрации. В элементарной ячейке хорошо видны дне близкие по форме и размеру морфологические единицы, сгруппированные в димер. Димеры образуют линейные цепочки. Кристаллические агрегаты белка мембран фракции терминальных цистерн, как оказалось, имеют значительное сходстео с кристаллическими агрегатами Са^+-АТРази мембран фракции продольных трубочек СР, образованных при

тех же условиях в присутствии ванадата (рис. 126).

Из наших данных еидно, что в мембранах фракций терминальных цистерн и продольных трубочек присутствуют димеры Са2+-АТРазы. Одна из возможных функций димерной формы Са2+-АТРазы может заключаться в образовании каналов между дамерами для пассивного освобождения Са2+ по концетрационному градиенту для мышечной активации (Болдырев и др., 1985).

р,

Рис. 12. Цифровая Фурье-фильтрация трубчатых кристаллов Са -АТРазы мембран фракции терминальных цистерн (а) и продольных трубочек (б) саркоплазматического ретикулума.

Структура АТР-синтазы (FQ?j-ATPa3H)

Синтез (гидролиз) АТР осуществляется крупным мебранносвязанным ферментом АТР-синтазой (КФ 3.6.1.34). АТР-синтаза состоит из интегральной мембранной части, PQ, которая, как полагают, действует, как протонный канал через мембрану, и гидрофильной части, Pj-АТРазы. Fj-АТРаза состоит из пяти типов субъединиц е стехиометрии За, ЗуЗ , у , б , £ ; причем а - И Р -субъединицы составляют основную ее массу и Еключают каталитические и нуклеотидсвязыЕающие центры( Kozlov, Sculachev, 1977; Senior, Wise, 1983; Pederaen, Amzel, 1985).

Ранее при электронно-микроскопическом исследовании было показано, что Fj-АТРаза в фронтальной проекции имеет форму шестиугольника размером около 10 нм (Kagawa et al., 1976). Однако наличие только одной проекции не позволяло судить о пространственном расположении ее субъединиц. Поэтому такое исследование было проведено в данной работе док

для двух Pj-ATPas: бактериальной и митохондриальной. Изучалась также -структура полной молекулы АТР-синтазы.

Двухслойная организация Pj-ATPa3 из анаэробной бактерии Lapto-bacilitia' caael и митохондрий сердца быка. На микрофотографиях как бактериального фермента, так и изолированного из митохондрий сердца быка, удалось установить пять характерных типов изображений отдельных молекул. Анашгз этих изображений позеолил предположить, что шесть больших субъединиц (3d. , 3£ ) Fj-АТРазы расположены в двух слоях по вершинам треугольной антипризмы. Диаметр молекулы Ю±1 нм, Еысота 7-8 нм(рис. 13).

Дш получения дополнительной информации о структуре фермента cepi однотипных изображений фронтальной проекции Fj-АТРазы из митохондр: была обработана на ЭВМ с помощью корреляционного анализа. Усредненное изображение (рис. 13а) по распределению плотности характеризуется небольшим отклонением от вращательной симметрии, что, по-видимому, связано с вкладом в изображение малых субъединиц (^ ,8 , £ ).

Двухслойная структура, характерная для Pj-АТРазы из L. casei и митохондрий сердца быка, обнаружена также дая Pj-АТРазы из митохонд рий печени крысы (A&zel at al., 1982) и Е. coll ( Curgy et al.,IS85 Это свидетельствует в пользу того, что такая структура является, по Еидимому, универсальной док разных ij-АТРаз.

Рис. 13. Молекулярные проекции ^-АТРазы.

(а) - Результат усреднения с помощью ЭВМ 10 совмещенных изображений фронтальной проекции митохондриальной Р^АТГ азы и (б) - оцифрованное изображение типичной частицы в боковой проекции (после низкочастотной Фурье-фильтрада

Исследование локализации ЗН-групп в Р^-АТРазе с помощью ферри-новой метки. Для изучения структуры ¡Е^-АТРазы был применен новый метод, основанный на электронно-микроскопическом исследовании кн-групп с помощью ферритиновой метки. Негативно контрастировавшие молекулы ферритина легко идентифицируются на микрофотографиях в Биде колец с наружным диаметром около 12 нм и внутренним-около 7 ни. Был получен модифицированный ферритин (см. Материалы и метода исследований), реакция которого с содержащими сульфгидрильные группы белками сопровождается.образованием конъюгатов ферритина с этими белками, связанных мевду собой лзгко разрываемыми дисульфидными мостиками (рис. 14).

F, NDSSPrCNH-Ft

Рис. 14.' Схема модификации доступных SH-rpynn Fj-АТРазы ферритином.

После преинкубации Fj-АТРазы с модифицированным ферритином в некоторых препаратах наблюдалось, что около 20 - 30 /5всех молекул fj-АТРазы образуют конъюгаты с ферритином.- Присутствовали конъюгаты, в которых Fj-АГРаза связана с ферритином при участии нескольких своих белковых масс (до четырех), различимых в -гексагональной проекции (рис. 15).

Так как р-субъедшшцы не содержат остатков цистина и ци'стеина • ■ (Walker et el., 1985) и не происходит включения SK-роагснтов в 6 г субъединицу (Senior, 1975), то модификация'фермента модифицированным ферритином возможна только по a-, J- £-субъоданицам. В наших условиях (рис. I) SH-группы, доступные для модафикации, наиболее вероятно, находятся в а- и ^"-субъедшшцах. В соответствии с этим, белковыми массами, взаимодействующими с ферритином, могут быть только а~субъеди!шцы или комплекс а- и р-субъедшшц с малой субъедп-ницей. Из полученных д_анпых следует, что одна из белковых масс представляет комплекс между р-субъединицей и одной из малых субъедшшц, (наиболее вероятно -f). Тот факт, что одна из jj-субъедшшц образу-

от комплекс с одной или двумя малыми субъединицами, указывает на неэквивалентность отдельных jj-субъеданиц, что может иметь-важное функциональное значение.

Структура АТР-синтазы и ее локализация в мембране. На поверхност субмитохондриальных частиц были отчетливо видны частицы Fj-АТРазы, связанные с F , находящейся в мембране, узкой ножкой. Около 120 изо бражений подобного типа были усреднены корреляционным методом. На результирующем изображении (рис. 16а) видны: Fj-АТРаза, ножка (~4,2 х 3,5 нм), гидрофобная часть - 3? , диаметром 6 - 8 нм (рис. 16а). Так как размеры FQ несколько превышают толщину 5 - 6 нм фосфолипид-ного бислоя, то некоторая часть F , по-видимому, находится Ене мембраны.

Предполагаемая модель структуры АТР-синтазы и ее расположение по отношению к мембранному'бислою показаны на рис. Йб. Через гидро фобную часть FQ и ножку осуществляется сопряжение транспорта протонов из водной фазы через мембрану с синтезом или гидролизом АТР. Так как общая длина F -сектора и ножки превышает 10 нм, а толщина ножки всего 3 - 3,5 нм, то представляется маловероятным, чтобы механизм сопряжения-осуществлялся за счет движения протонов на такое большое расстояние и через стожь узкую ложку. Более вероятно, что е результате перемещения протонов через мембранный FQ-сектор ион-формационные изменения в ножке передаются на каталитический центр Fj-АТРазы.

ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА МОЛЕКУЛЫ КАРБОАНЕВДРАЗЫ

ИЗ'ЛИСТЬЕВ НУТА (КЛАСС ЛИАЗ).

Карбоангидраза (карбонат-гидро-лиаза, КФ4.2.1.1.), катализирующая обратимую реакцию гидратации СО^ в клетке, может играть важную роль в'регуляции фотосинтетической деятельности растений. Однако конкретная физиологическая роль, структура и свойстеэ растительных карбоангидраз остаются ещо малоизученными. В литературе имеются сильно различающиеся данные об их четвертичной структуре. Так молекулярная масса зтого фермента у деудолышх растений по оценкам разных авторов колеблется в пределах 145 - 270 кДа. В ряде работ (Косе цин, 1977; Reed, 1981) указывается, что карбоангидраза растений является гсксамером. В единственной работе (Kandel et al ., 1978), основываясь на молекулярных массах мономера и олигомера, было cooö-

>ис. 15. (a-e) - Типы изображений коныогатов Р-рАТРазы с ферритином. Негативное контрастирование 5% молибдатом аммония. Модели присоединения ферритина к Рг-АТРазе показаны справа.

1:e. IG. Уереднешгос изображение молекулы АТР-синтазы (а) и схема расположения ее в мембранном бислое (б).

щено, что карбоангидраза листьев шпината является октамером.

В данной работе методом электронной микроскопии изучена четвертичная структура карбоангидразы листьев нута.- В препаратах раствора белна, негативно контрастировании уранилацетатом, преобладали округлые проекции частиц размером около 10 нм. Такие изображения содержали восемь Еыступов и характеризовались симметрией вращения.4-го порядка (рис. 17а). Встречались также проекции частиц, у которых видны два параллельных белковых слоя, размером 10 х 7 нм. В предложенной модели фермента Еосемъ субъединиц расположены с точечной группой симметрии 422 (Д^) по вершинам двух квадратов. Вдоль оси 4-го порядка тетрамеры двух слоев не полностью перекрывают друг друга (рис. 17в,г). Октамерная структура карбоангидразы листьев нута подтверждается данными по измерению молекулярной массы молекулы (210 кДа) и ее субъединиц (26 кДа).

Рис. 17. Молекулярные проекции (а,б) и модель карбоангидразы лист! ев нута (в,г).

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗ (КЛАСС СИНГЕГАЗ)

Глутаминсинтетаза (ь-глутамат: аммоний лигаза, АДР-образующая, КФ 6.3.1.2) катализирует синтез глутамина. Глутамин является первичным продуктом, в виде которого ассимилируется аммиак, à его ами-дная группа используется в синтезе наиболее важных азотсодержащих метаболитов: стр, шр , акр, HAD, многих аминокислот и других веществ (Евстигнеева, Пушкин, 1983; Кретович, 1983, 1987). Глутаминсинтетаза является одним из самых сложных регуляторных ферментов. Важнейшей особенностью глутаминсинтетаз является различие четвертичной структуры и свойств ферментов у организмов, находящихся на различных уровнях эволюционного развития. Глутаминсинтетазы прокариотов имеют молекулярную массу около 600 кДа и содержат 12 идентичных субъединиц, расположенных с точечной ipynnoft симметрии 622 (Valentine et al., 1968).

Другой характерной особенностью глутаминсинтетаз является наличие у многих организмов множественных форм фермента, локализованных в различных органах или частях клетки и различающихся по молекулярной массе, первичной и вторичной структуре, а также свойствам. В связи с обнаружением множественных форм глутаминсинтетазы возникает задача сравнительного изучения их четвертичной структуры и свойств.

Четвертичная структура множественных форм глутаминсинтетазы гороха и тыквы. В работе проведено сравнительное исследование четвертичной структуры множественных форм глутаминсинтетазы двух высших растений: гороха и тыквы. Растения гороха содержат, по крайней мере, четыре молекулярныефэрмы глутаминсинтетазы (Antonjuk et al., 1982; Евстигнеева и др., 1987). Три из этих форм, выделенные из хлоро-пластов (480 кДа) и цитозоля (520 кДа) листьев, а также цитозоля семян (385 кДа), мы изучали методом электронной микроскопии. Было найдено, что эти ферменты состоят из восьми идентичных мономеров, расположенных с точечной группой симметрии 422 (Д4). Характерные изображения фронтального вида (верхний ряд), трех боковых видов и модели молекул глутаминсинтетаз из цитозоля листьев и семян гороха показаны соответственно на рис. 18а и рис. 186. Усредненные изображения фронтальной проекции, этих двух ферментов представлены на рис. 18в и рис. 18г. Эти изображения показывают восемь пиков плотности и могут быть интерпретированы как проекция двух квадратных тетрпморов, лишь частично перекрывающих друг друга в направлении

оси 4-го порядка. В отличие от глутаминсинтетаз из хлоропластов и цитозоля листьев, глутаминсинтетаза из дитозоля семян гороха имеет значительную внутреннюю полость, образованную, по-видимому, за счет выемок в мономерах (рис. 186), доступных для проникновения контрастера.

к..,.. Л

. о

20 нм

5НМ

Рис. 18. Характерные изображения глутаминсинтетаз из цитозоля листьев (а) и семян (б) гороха. Негативное контрастирование УЛ. Различные проекции модели показаны справа, (в,г) - Результат цифрового усреднения изображении глута-гяшеинтетазы из цитозоля листьев (в) и семян гороха (в).

Были исследованы также три молекулярные формы глутаминсинтетазц изолированные из цитозоля (480 кДа) и хлоропластов (370 кДа) листьев, а также ее корней (460 кДа). Они имели такую же четвертичную структуру, как молекулярные формы глутаминсинтетазы цитозоля и хлоропластов листьев гороха.

Таким образом множественные формы глутаминсинтетаз высших растений являются октамерами симметрии Д^. Октамерная структура этой симметрии наблюдалась для всех изученных глутаминсинтетаз эукарио-тических организмов. Некоторые отличия заключаются в том, что у глутаминсинтетазы И. сгааза (Ра1ас1оив, 1976), жиеотных (НазсЬе-теуег, 1968), дрожжей (31тз et а1., 1974) два квадратных тетрамера практически полностью перекрываются едоль оси 4-го порядка и молекула имеет конфигурацию, близкую к кубической.

Четвертичная структура множественных Форм глутаминсинтетазы бактероидов и растительной части корневых клубеньков желтого люпина. Ассимиляция аммиака, образованного ¿.процессе фиксации молекулярного азота, происходит как в растительной, так и бактериальной части (бактероидах) симбиотической системы. Ключевую.роль при этом играет катализируемая глутаминсинтегазой реакция синтеза глутамина. Согласно литературным данным основная масса аммиака ассимилируется в растительной части (цитозоле) клубенькоЕ (Евстигнеева, Пушкин, 1983; Кауш и др., 1984; Шиффелова и др., 1987). Известно о двух формах глутаминсинтетазы в цитозоле клубеньков желтого люпина. Одна из них - глутаминсинтетаза II (410 кДа) преобладает в азотфиксирую-щих условиях и на ее долю приходится более 30% суммарной активности фермента клубеньков (Садыкова и др., 1985). Б работе Кауш и др. (1984) в бактероидах Ю112оМит iupi.nl было показано присутствие трех форм глутаминсинтетазы.

В настоящей работе было проведено изучение методом электронной микроскопии четвертичной структуры глутаминсинтетазы II растительной части и глутаминсинтетаз II и III бактероидов корневых клубеньков люпина. Фронтальные проекции структуры этих ферментов показаны 1П рис. 19.

Глутаминсинтетаза растительной части клубеньков является октамер-ной и имеет конфигурацию куба со стороной 9 - 10 нм (рис. 19а).

Глутамаисштетаза II из бактероидов состоит из еосьми одинаковых :.'онл\:орср, ■ расположенных с симметрией Д^ по вершинам двух КЕадратоЕ,

' рне ¡> отл!гп19 от глутаминсиитетази II цитозоля не перекрываются

' . у*-:

5нм

Рис. 19. Молекулярные проекции множественных форм глутаминсинтетазы цитозоля и бактероидов корневых клубеньков желтого люпина (а,б,в) - Усредненные с помощью ЭВМ изображения глуташш-схгатетазы II цитозоля корневых клубеньков (а); глуташн-синтетазы II (б) и глутаминсинтетазы III бактероидов а. 1 upi.nl (в). Усредненные изображения представлены в виде

5

полутоновых картин и в изолиниях.

полностью при наблюдении вдоль оси 4-го порядка (рис. 196). Четвертичная структура этой молекулы типична для глутаминсинтетаз высших растений, но не бактериальных додекамерных глутаминсинтетаз. Наибольшее сходство наблюдалось с глутаминсинтетазой семян гороха (см. рис. 196 и рис. Г8г). Возможно, что глутаминсинтетаза II бактероидов имеет растительное происхождение. Иммунохимические исследования также свидетельствуют в пользу этого предположения, так как глутаминсинтетаза II, но не III бактероидов осаждалась антителами кролика, полученными против глутаминсинтетазы II растительной части клубеньков (Пущин, 1988).

Глутаминсинтетаза III бактероидов состоит из двенадцати идентичных мономеров, расположенных с точечной группой симметрии jüg по вершинам двух правильных шестиугольников. Молекула имеет диаметр 13 -14 нм и высоту около 9 нм. Четвертичная структура глутаминсинтетазы III бактероидов подобна четвертичной структуре других бактериальных глутаминсинтетаз. На усредненной гексагональной проекции молекулы глутаминсинтетазы III бактероидов (рис. 19в) можно видеть деление мономеров на два домена. Изображение имеет неболыцую "за1фученноеть". Недавно было сообщено о структуре бактериальной глутаминсинтетазы, полученной методом рентгеноструктурного анализа при разрешении 0,35 нм С AImassy et al., 1986). Проекция структуры одного гексамера вдоль оси 6-го порядка показывает отчетливую закрученность, возникающую из-за изогнутой формы мономеров. Мономер имеет область низкой белковой плотности, куда может проникать контрастер, приводя к двум пикам плотности в проекции мономера, наблвдаемым при электронной микроскопии. Таким образом структура глутаминсинтетазы III бактероидов r. lupinl находится в соответствии с рентгеноструктурными данными.

Структура глутаминсинтетаз шанобактерий Kostoc muscorum и Spirulina piatensis. Наблюдаемые на микрофотографиях проекции молекул показывают, что указанные ферменты состоят из 12 субъединиц, расположенных в двух слоях с точечной симметрией 622. Диаметр молекул 13 - 14 нм, высота 9 - 10 нм. Пространственное расположение субъединиц и размеры молекул не отличаются от глутаминсинтетаз других прокариотов (Valentine et al., 1968,* Deuel et al., 1970,* Siedel, Shelton, 1979,' Orr et al„ 1981).

Для получения более детальной информации о структуре глутаминсинтетазы цианобактерий было выполнено цифровое усреднение электронно-микроскопических изображений молекулы s. piatensis. Усредненное изо-

браженио (рис. 20а) имеет четко выраженную закрученностъ. В центре изображения наблюдается центральный канал диаметром около 4 нм. Прилегающие к каналу части субъединиц образуют контакты между собой. Не рис. 206 представлен результат усреднения изображений боковой проекции молекулы, лежащей "на грани". На нем видны два белковых слоя.

5 нм

Рис. 20. Молекулярные проекция глутаыинсинтетазн з. р1а*епз18.

(а) - Результат усреднения с помощью ЭВМ 20 изображений .фронтальной проекции частиц (после симметризации по оси вращения 6-го порядка), (б) - Усредненное по 20 частицам изображение боковой проекции частиц. Изображения представлены в Биде полутоновых картин и в изолиниях.

Структура молекулы, установленная методом электронной микроскога оказалась вполне сопоставимой с моделью структуры глутаминсинтетазы бактерии 3. typhimuгiu:n при атомном разрешении (А1таззу et а1., 19& Из близости формы субъединиц и расположения их контактов можно пред-

юложить, что активный центр глутаминсинтетазы 3. рз^епв1в также :шк и в бактериальной глутаминсинтетазе, образован соцрикасащимися участками двух субъединиц.

Четвертичная структура глутаминсинтетаз цитозоля и хлоропластов адноклеточных зеленых водорослей АпкЛ^гоаееппш Ьгаип11 и СМогеНа дугепо1Дова 82Т. В настоящей работе была определена четвертичная структура двух молекулярных форм глутаминсинтетазы одноклеточной зе-теной водоросли А. ЬгаидИ, вькеленной из цитозоля (340 кДа) и хлоропластов (350 кДа), а также цитозоля С. ругепо1йова (390 кДа). Для зыявлешя основных деталей проекций структуры молекул было выполнено дафровое усреднение наиболее часто встречающихся типов изображений рассматриваемых ферментов. Результаты усреднения представлены на

Рас. 21. Молекулярные проекции глутаминсинтетаз од-воклеточных зеленых водорослей: цитозоля (а), хло-.ропластов (б) А. Ьгаип11 8 ЦИТОЗОЛЯ С. ругепо1<1ова (в). В левой части показаны результаты цифрового усреднения 20-25 изображе-ееё фронтальной проекции частиц после дополнитель-Еого усреднения по оси 4-го порядка.

В правой части - усредне-Шя по 15-20 изображениям боковой цроекции частиц после симметризации по оси 2-го порядка.

5нм

Ан два типа изображений соответствуй* молекуле, состоящей из двух полностью перекрывающихся вдоль оси 4-го порядка тетрамеров.

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ

Исследование ассоциации З-ФосФоглипэраткиназы с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой из шщ кролика. Изучение комплексов, образующихся при ассоциации функционально связанных ферментов, в последшо годы привлекает пристальное внимание энзимологов. Образование и распад таких относительно непрочных комплексов регулируется субстратам: и эффекторами ферментов и, как полагают, эти процессы могут играть ванную роль в регуляции сопряженных каталитических реакций. Примере? этому служит комплекс между двумя гликолитическими ферментами: глл-церальдегид-3-фосфатдегидрогеназой (ГАФД, КФ I.2.1.12) и фосфогли-цераткиназой (ФГК, КФ 2.7.2.3). Впервые получить достаточно стабильный комплекс ГАФД и ФГК, выделенных из дрожжей, удалось с помощью иммобилизации одного из партнеров (дегидрогеназы) на нерастворимом носителе (Ashmarlna et al., 1984). Однако вопрос о взаимодействии несвязанных с матрицей ферментов и о пространственном их расположении в комплексе оставался открытым. По этой причине в диссертационной работе была сделана попытка получить прямые доказательства существования комплекса ГАФД - ФГК методом электронной микроскопии. Было исследовано образование комплексов между свободными ферментами после добавления к ГАФД, содержащей 2 моля НАД на тетрамер, избытка 3-фосфоглицеринового альдегида. В этих условиях, как было показано, (Суходолец и др., 1987; Sukhodolets et al., 1987) ацилированная де-гидрогеназа из мышц образует комплекс с 3-фосфоглицераткиназой.

На микрофотографиях ацилированной ГАФД, инкубированной с ФГК, были обнаружены комплексы этих ферментов. На рис. 22 показаны различные типы изображений комплексов ГАФД - ФГК, в которых к молекулаг ГАФД присоединена одна (рис. 22,а-в) и две (рис. 22г) молекулы ФГК. Полученные изображения указывают на специфическое связывание двух ферментов. Так как продукт дегидрогеназной реакции является субстратом ФГК, то пространственное сближение этих двух ферментов в комплексе может, по-видимому, повышать эффективность суммарной реакции.

20 им

Рис. 22.(а-г) - Характерные типы Еэобрахений комплексов ГАФД-ФГК.

Негативное контрастирование "2$ ФВК. Модель связывания ГАФД (белая) с ФГК (черная) показана справа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе методом электронной микроскопии определена четвертичная .структура растворимых и мембранных ферментов четырех классов. Данные то четвертичной структуре каждого из ферментов щшведе-ны в Табл. 1,2. Часть указанных молекул представляет собой стабильные комплекы нескольких белков. Так нитрогеназа состоит из МоРе-белка и Ре-белка, АТР-синтаза из гидрофильной Р^-АТРазы и внутри-мембранного Р0-сектора, каждый из которых содержит несколько субъединиц. Молекула гидрогенаэы включает два функциональносвязанных фрагмента, обладающих разным типом активностей,и может рассматриваться как модель ферментного комплекса. На примере глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и фосфоглицераткиназы показана возможность применения электронной микроскопии при изучении строения относительно непрочных комплексов растворимых ферментов.

Общее свойство строения рассмотренных ферментов и белковых (ферментных) комплексов заключается в том, что их основой служат белок-болковые взаимодействия, когда определенные области белковых поверхностей узнают друг друга. Это, как правило, ведет к появлению повторяющихся контактов и образованию структур, обладающих кристалло-

графической симметрией. Характерной особенностью четвертичной структуры данных ферментов является наличие у них четного числа протомеров. Такие белки можно рассматривать как состоящие из ди-меров, агрегированных в тетрамеры, гексамеры и т.д. Димерный характер связи, связанный с точной или приближенной симметрией оси 2-го порядка, может придавать олигомеру особую стабильность.

Сравнивая ферменты между собой можно заметить, что четвертичная структура не зависит от принадлежности фермента к тому или иному классу. Различная четвертичная структура может быть у одного и тоге же фермента в зависимости от его происхождения или даже отдельных его молекулярных форм. У некоторых ферментов, в частности, глутамиЕ синтетазы, эволюция четвертичной структуры подчиняется определенной 'закономерности. На примере множественных форм фермента высших растений и одноклеточных зеленых водорослей видно, что глутаминсинтетазы эукариотических организмов состоят из восьми мономеров и характеризуются симметрией 422. При этом выявляются некоторые различия в структуре указанных молекул. Глутаминсинтетазы циано-бактерий явлйются додекамерами симметрии 622 и близки по своей структуре глутаминсинтетазам бактерий. В бактероидах клубенькоЕ желтого люпина обнаружена глутаминсинтетаза, содержащая 12 субъединиц, что указывает на ее бактериальное происхождение, а также октамерный фермент, сходный по своей четвертичной структуре и свойствам с растительными глутаминсинтетазами.

Четвертичная структура многих ферментов, различных по происхождению, оказалась одинаковой. Например, глутаматдегидрогеназа одноклеточной зеленой Еодоросли С.рутепо1йо0а является гексамером симметрии 32, также как в бактериях и животных, исследованных ране< Близкая четвертичная структура обнаружена у ряда родственных ферментов. Так молекулы мембранных монооксигеназ: цитохрома Р-450 мик-росом печени и метанмонооксигеназы метанокисляющих бактерий имеют гексамерное строение. Внеклеточные ферменты: кислая фосфатаза и инвертаза дрожжей 3. сегетг1з1ае яеляются плоскими квадратными тет-рамерами.

Некоторые совершенно несхожие между собой ферменты, относящиеся разным классам, как оказалось, таете имеют близкую четвертичную структуру. Например, растительные карбоангидраза (класс лиаз) и глутаминсинтетаза (класс синтетаз) - октамеры симметрии 422; цито-хром Р-450 (класс оксиредуктаз) и р -Глюкозидаза (класс гидролаз)

гексамеры симметрии 32. Такое совпадение, наиболее вероятно, объясняется ограниченностью типов образования симметричных олигомерных структур.

Функциональная роль олигомерной структуры для большинства исследованных здесь ферментов, состоящих из идентичных субъединиц, остается пока неясной. У /3-Глюкозвдазы термофильных микромицетор а. \ventii она, по-видимому, способствует термостабильности субъединиц. В глутаминсинтетазе прокариотов (бактерий и цианобактерай) активный центр, вероятно, образован полипептидными цепями двух субъединиц.

Наибольшей сложностью отличаются ферменты, состоящие из разных субъединиц: гидрогеназа, нитрогеназа, АТР-синтаза. Однако структура этих ферментов (или отдельных их частей) также содержит элементы симметрии. Молекулу гидрогеназы водородокисляющей бактерии А. еи1;го-р!шв можно представить в виде двух цротомеров, связанных псевдоосью симметрии 2-го порядка. Отдельные типы каталитической активности (гидрогеназная и диафоразная), по-видимому, локализованы на этих протомерах. Молекуда нитрогеназы (обладающая и гидрогеназной активностью) также характеризуется симметрией оси 2-го порядка, связывающей две половины молекулы, в каждую из которых входит по одной а-субъединице и одной субъединице Ре-белка. Такая структура предполагает, что субстратсвязывающие центры в молекуле должны быть взаимосвязаны. В Р-рАТРазе, гидрофильной части АТР-синтазы, За и 3 £ -субъединицы расположены в двух слоях с псевдосимметрией 32. Исследование РрАТРаэы с помощью ферригиновой метки на зн-груплы выявило асимметрию ее строения (неэквивалетность больших субъединиц одного типа), связанную с присутствием малых субъединиц, что может иметь определенное функциональное значение.

При исследовании комплекса двух функционально связанных ферментов: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) и фосфоглицерат-киназы (ФГК) встречались агрегаты, в которых с молекулой ГАфЦ специфически связаны, по-крайней мере, две молекулы ФГК. Такие агрегаты, вероятно, имеют вполне определенную симметрию, подобно хорошо известным стабильным мультиферментным комплексам. В этом случае можно говорить, что соответствие структуры и функции свойственно не только индивидуальным ферментам (ГАФД и ФГК), но и их комплексу.

Таким образом данная работа позволила обнаружить как индивидуальные особенности, так и общие черты структурной организации большого с .т.: г о,"/ерша ферментов.

Таблица Г

ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА ИССЖПУЕМЫХ ФЕРМЕНТОВ

Фермент Число и мол. масса субъединиц (Da) Расположение субъединиц и симметрия молекулы*

Аланиндегидрогеназа R. lupin! 4 х 41000 4 идентичные субъединицы расположены с симметрией 222 (л2)

Глутаматдегидрогеназа С. pyrenoidoea 82Т КФ 1.4.1.3 6 х 50000 6 идентичных субъединиц расположены по вершинам треугольной антипризмы с симметрией 32 №-,)

Гидрогеназа A. eutrophus Z1 КФ I.I2.I2 66000 55000 29000 26000 Два фрагмента, содержащих одну большую и одну малую субъедининц связаны псевдоосью 2-го порядка

Нитрогеназа A. vinelandii КФ I.18.6.1 MoFe-белок 2а- 2 х 60000 2JÍ - 2 х 50000 Ре-белок 2 х 32000 В МоРе-белке 2а и 2/3 субъединицы расположены с псевдосимметрией 222. В молекуле нитрогена-зы субъединицы МоРе и 3?е-белка связаны осью 2-го порядка

Цитохром Р-450 микросом печени КФ I.14.14.I 6 х 56000 6 идентичных субъединиц расположены по вершинам треугольной антипризмы с симметрией 32 (Бэ)

Метанмонооксигеназа Ы. capsulatus КФ I.14.13.25 мокооксигеназа 6 х 35000 Проекция структуры С6

NADH-peдукта з а 4 х 45000 Проекция структуры С^

р-Глюкозидаза A. went11 КФ 3.2.1.21 6 х 38000 6 идентичных субъединиц расположены по вершинам треугольной антипризмы с симметрией 32

Кислая фосфатаза КФ 3.1.3.2 4 х 125000 4 субъединицы расположены с симметрией С4

Инвертаза КФ 3.2.1.26 4 х 150000

Са^-АТРаза CP скелетных мышц кролика КФ 3.6Л.38 100000 В ¿фисталлах фракции терминальных цистерн и продольных трубочек молекулы связаны в димеры

АТР-синтаза (?05гАТРаза) митохондрий сердца быка КФ 3.6.1.34 íj-АТРаза За, 3p,y,8,t fo В ^-АТРазе большие субъединицы (За. и ЗуЗ ) расположены по вершинам треугольной антипризмы и £0 связаны узкой нотой

Таблица 2

Фермент Источник Число и мол. масса субъ-еданиц (Ра) Расположение субъединиц и симметрия молекулы*

Карбоангидраза КФ 4.2.1.1 листья нута 8 х 27000 8 идентичных субъединиц расположень по вершинам квадратной призмы с симметрией 422 (ю.), так что суоъединицы не полностью заслоняют друг друга вдоль оси 4-го порядка

Глутаминсинтетаза КФ 6.3.1.2 цитозоль листьев гороха 8 х 64000

хлоровласты листьев гороха 8 х 60000

цитозоль семян гороха 8 х 48000

цитозоль листьев тыквы 8 х 58000

хлоропласта листьев тыквы 8 х 50000

корни тыквы 8 х 53000

бактероиды й. 1ир1п1 (ГСП) 8 х 45000

цитозоль А. Ъг&ипИ 8 х 42000 8 идентичных субъединиц расположень по вершинам квадратной цризмы с симметрией 422 (субъединицы полностью заслоняют друг друга вдоль оси 4-го порядка)

хлоропласты А. ЬгаипИ 8 х 43000

ЦИТОЗОЛЬ С. ругепо1(1ова 8 х 47000

расг. часть клубень ков люпина (ГС II) 8 х 51000

цианобактерия И. тиасогиа 12 х 52000 12 идентичных субъединиц расположены по вершинам гексагональной призмы с симметрией 622 (1>6)

цианобактерия 3. р1а*епэ18 12 х 53000

бактероиды Л. 1 upi.nl (ГСП] 1 12 х 50000 3

«с Группа сишетрии дана в символах Германа-Моргена и Шенфлиса (в скобках)

ВЫВОДЫ

1. Выполнено электронно-микроскопическое исследование четвертичной структуры (числа и расположения субъединиц) ферментов четырех классов: оксиредуктаз (аланиндегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа, гдцрогеназа, нитрогеназа, цвтохром Р-450, метанмонооксигэназа); гидролаз (]Ь-Глюкозидаза, кислая фосфатаза, инвертаза, Са2+-АТРаза, АТР-синтаза); лиаз (карбоангидраза); синтетаз (глутаминсинтетаза). Для ферментов: цитохрома Р-450, метанмонооксигеназы, ^-Глюкозидазы, кислой фосфатазы, инвертазы наличие олигомерной структуры показано впервые.

2. Методом электронной микроскопии в соответствии с биохимическими данными показано образование комплекса двух относительно непрочно связанных гликолитических ферментов: глицеральдегид-3-фосфатде-гидрогеназы и фосфоглицератклназы.

3. Обнаружено, что в исследованных ферментах и белковых (ферментных) комплексах белок-белковые взаимодействия осуществлялись, как правило, с образованием симметричных структур, имеющих четное число протомеров.

4. Обнаружено, что четвертичная структура фермента не зависит от принадлежности его к тому или иному классу. Совпадение четвертичной структуры цитохрома Р-450 (класс оксиредуктаз) и р -Глюкозидазы (класс гидролаз), которые являются гексамерами симметрии 32, а также карбоангидразы (класс лиаз) и глутаминсинтетазы (класс синтетаз) растений, представляющих собой октамеры симметрии 422, наиболее вероятно, объясняется ограниченностью числа способов образования симметричных олигомерных структур.

5. Установлено, что различную четвертичную структуру могут иметь не только ферменты разных классов или одного класса, но и одноименные ферменты, и даже некоторые молекулярные формы фермента одного организма. На примере множественных форм глутаминсинтетазы высших растеши, одноклеточных зеленых водорослей показано, что глутаминсинтетазы эукариотических организмов состоят из восьми мономеров и характеризуются симметрией 422. Глутаминсинтетазы цианобактерий являются додекамерами симметрии 622, близкими по структуре бактериальным ферментам. В бактероидах клубеньков люпина обнаружена глутаминсинтетаза, содержащая 12 субъединиц, что указывет на ее бактериальное происхождение, а также октамерный фермент, сходный с глу-таминсинтетазой растительного происхождения.

6. Найдено, что четвертичная структура многих ферментов, различных по происхождению, оказалась одинаковой. Например, глутаматде-гидрогеназа одноклеточной зеленой водоросли с. pyrenoidoea является гексамэром, также как у бактерий и животных, исследованных ранее. Са^+-АТРаза фракции терминальных цистерн и продольных трубочек сар-коплазматического ретикулума скелетных мышц образует димеры в присутствии ванадата натрия.

Сходная четвертичная структура обнаружена у ряда родственных ферментов. Аланиндегидрогеназа бактероидов R. lupinl является тетрамером симметрии 222, подобно лактатдегидрогеназе. Мембранные монооксигеназ-ные ферменты: цитохром Р-450 Ы12 микросом печени и монооксигеназа метанокисляющих бактерий м. capsuiatus представляют собой гексамеры. Внеклеточные ферменты: кислая фосфатаза и инвертаза дрожжей s. сеге-vieiae являются плоскими квадратными тетрамерами.

7. Исследовано расположение и симметрия отдельных частей, а такжа их возможная взаимосвязь в ферментах, состоящих из нескольких различных белков или субъединиц.

Молекулу гидрогеназн водородокисляющей бактерии к. eutrophus модно представить в виде двух цротомеров, связанных псевдоосью симметрии 2-го порядка. Отдельные типы каталитической активности фермента (гидрогеназная и диафоразная), по-видимому, локализованы на этих цротомерах. Молекула нитрогеназы A. vinelaadil, обладающая и гидро-геназной активностью, также характеризуется сишетрией оси 2-го порядка, связывающей две половины молекулы, в каждую из которых входит по одной a, J3 -субъединице и одной субъединице Ре-белка. Рассмотрена возможная связь Ре- и МоРе-белка при передаче электронов между ними.

Изучена структура митохондриальной АТР-синтазы и ее локализация в мембранном бислое, Исходя из модели фермента сделано предположение, что механизм сопряжения транспорта протонов через мембрану с синтезом (гидролизом) АТР осуществляется через информационные изменения в ножке, связывающей Pj-AT Разу и Р0-сектор, которые передаются на каталитический центр Рд-АТРазы. Показано, что в Pj-АТРазе бактерий и митохондрий За и 3j5 -субъединицы расположены в двух слоях с сишетрией 32. С помощью разработанной методики локализации SH-групп белках с использованием ферритиновой метки показана асимметрия строения Fj-АТРазы (неэквивалентность субъединиц одного типа), связанная с присутствием минорных субъединиц.

Основные материалы диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Tauprun T.Ii., Samsonidze T.G., Radukina H.A., Pushkin A.V., Evstigneeva Z.Gr., Kretovich W,L. Electron microscopy of glutamine synthetase from pea leaf ehloroplasts // Biochim. Biophya. Acta. -1980. - Vol. 626, No. 1. -P. 1-4.

2. Цупрун В.JI., Самсонидзе Т.Г., Радюкина H.A., Пушкин A.B., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Электронная микроскопия глутамин-синтетазы из хлоропластов листьев гороха // Биохимия, - 1981,

- Т. 46, № I, - С. 29-32.

3. Pushkin A.V., Tsuprun V.L., Dzhokharidze T.Z., Evstigneeva Z.G., Kretovich V.l.. Glutamine synthetase from the pumpkin leaf cytosol // Biochim. Biophys. Acta. - 1931, - Vol. 662, No. 1,

- P. .160-162.

4. Пушкин A.B., Цупрун В.Л., Джохаридзе Г.З., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Глутаминсинтетаза цитозоля листьев тыквы // Докл. АН СССР. - 1982. - 263, JÉ 5, - С. 1274-1276.

5. Цупрун В.Л., Бикетов С.Ф., Милейковская Е.И., Тихонова Г.В., Козлов И.А. Модель четвертичной структуры Fj-АТРазы из мембран Lactobacillus casei // Докл. АН СССР. - 1982. - Т. 265, № 3, С. 246- 247.

6. Biketov S.F., Kasho V.N., Kozlov I.A., Mileykovskaya Ye. I., Ostrovsky D.H., Skulachev V.P., Tikhonova G.V., Tsuprun V.L. P^like ATPase from anaerobic bacterium Lactobacillus casei contains six similar subunits // Eur. J. Biochem. - 1982. - Vol. 129, - P. 241-250.

7. Пушкин A.B., Джохаридзе Т.З., Цупрун В.Л., Евстигнеева З.Г. Кретович В.Л. Четвертичная структура и некоторые свойства глутамин-синтетазы хлоропластов листьев тыквы // Докл. АН СССР. - 1983. - Т.

' 271, - С. 234-237.

8. цупрун В.Л., Месянжинова И.В., Козлов И.А. Модель четвертиной структуры íj-АТРазы из мембран митохондрий // Докл. АН СССР. -1983. - Т. 272 JÍ6, С. 1488-1490.

9. Tsuprun V.L., líesyanzhinova I.V., Kozlov I.A., Orlova E.V. Electron microscopy of beef heart mitochondrial I^-ATPase // FEBS Letters. - 1984. - Vol. 167. No 2. - P. 285-290.

10. Kretovich W.L., Evstigneeva Z.G., Pushkin A.V., Tsuprun V.L. Evoluiion of the quaternary structure of glutamine synthetase // La Recerca Scientifica. - 1984. - Vol. 113, P. 109-115.

11. Цупрун В.Л., Мицова И.З., Блаячух И.О., Гвоздев Р.И. Электрон-хая микросколия MöFe-йвжа ннтрогенаэы Azotobacter vinelandii // {окл. АН СССР. - 1984. - Т. 273, Js 5. - С. 731-734.

12. Голова T.Ii., Душкин A.B., Цупрун В.Л., Евстигнеева З.Г., Кре-гович В.Л. Очистка, четвертичная структура и некоторые свойства глу-гаыинсинтетазы из корней тыквы // Биохимия. - 1984. - Т. 49, ß 4.

- С. 599-606.

13. Tsuprun V.L., Mitsova I.Z., Blazhchuk I.S., Gvozdev R.I., Drlova E.V., JClselev N.A. Electronmicroaoopy of the HoFe-proteln from Izotobacter vinelandi± nitrogenase // Eur. J. Biochem. - 1985. - Vol. 149. - P. 389-392.

14. Pu3hkin A.V., Antoniuk L.P., Solovieva 1Г.А., Shubin V.V., Svstigneeva Z.G., Kretovlch. W.L., Cherednilcova T.V., Tsuprun V.L., Sogrsph O.H., Klselev H.A. Glutamine synthetases of pea leaf and зеей cytosol. Structure and propertiea // Biochim. Biophya. Acta. -1985. - Vol. 828, ilo. 2. - Р. 33б~350.

15. Цупрун В.Л., Уткин И.Б., Попов В.О., Егоров А.М., Березин A.B. Киселев H.A. Электронная микроскошя гидрогеназы водородоокисляюпщх бактерий Alcaligenes eutrophus Z1 // Докл. АН СССР.,- 1985. - Т. 283, К I. - С. 219-221.

16. Цупрун В.Д., Орлова Е.В., Киселев H.A., Мицова'И.З., Блавдк И.С., Гвоздев Р.И. Электронная микроскопия нитрогеназы Azotobacter vinelandü // Дохл. АН СССР. - 1985. - Т. 285, Jä 5. — С. 1230-1232.

17. Цупрун В.Л., Мясоедова К.Н., Берндт П., Зограф О.Н., Орлова Е.В. Черняк В.Я., Арчаков А.И., Скулачев В.П. Гексамерная организация цито-хрома Р-450, изолированного из микросом печени // Докл. АН СССР. -1985. - Т. 285, tö 6. - С. 1496-1497.

18. Козлов И.А., Месянжинова И.В., Мильгром Я.М., Цуцрун В.Л. Электронно-микроскопическое исследование локализации зн-групп в миго-хондриальной Р^-АТРазе с помощью ферритиновой метки // Биологические мембраны. - 1985. - Т. 2, & 7. - С. 697-702.

IS. Садыкова Г.Э., Соловьева H.A., Пушкин A.B., Цупрун В.Л., Шубин B.ü., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Вторичная и четвертичная структура глутаминсинтотазы из растительной фракции корневых клубеньков люпина // Биохимия. - 1985. - Т. 50, № 6. - С. 936-940.

'2С. Алиев Д.А., Цупрун В.Л., Гулиев U.M., Мамедов Т.Г. О четвер-ткчноИ структуре карбоангидразы листьев двудольного растения Cicer iriotimm /У Докл. АН СССР. - 1985. - Т. 285, №. - С. 1472-1475.

21. Tauprun V.L., Utkin I.3., Popov V.O., Egorov A.M., Berezin I.V., Kioclov :;.A. Electron nicroscopy oi" the hydrogen oxidizing

bacteriuia A. eutrophua Z1 // FBBS Lett. 1986. Vol. 197. -P. 225-228.

22. Isuprun V.Xj., Orlova E.V., KLaelev U.A., Mitaova I.Z., Blazh-chuk 1.3., Gvozdev R.I. Electron microscopy of the nltrogenaae from Azotobaeter vinelandii // J. Inorganic Bioohea. - 1986. - Vol. 27, Ho. 2. - P, 141-146.

23. Tsuprun V.L., Myaooedova K.N., Zograph O.H., Orlova B.V., Chernjak V. Ya., Archakov A.I., SKulachev V.P. Quaternary otructurc of the liver microsomal, oytocüronie Р-450 // PEBS Letters. - 1986.

- Vol. 205, Ho. 1. - P. 35-40.

24. Расулов A.C., Шакиров З.Г., Евстигнеева З.Г., Цупрун В.Л., Кретович В.Л. Четвертичная структура глутаминсинтетазы Ankiatrodesmus braunii // БИОХИМИЯ. - 1986. - Т. 51, Л 3. - С. 413-419.

25. Гуруханова М.С., Евстигнеева З.Г., Цупрун В.Л., Ходздбаева С.М., Кретович В.Л. Очистка, четвертичная структура и свойства глутаминсинтетазы Hoatoc тиэсогша // Биохимия. - 1986. - Т. 51, $ 10, -С. 1635-1640.

26. Пйффелова Г.Э., Пушкин A.B., Соловьева H.A., Цупрун В.Л., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Очистка, структура и свойства глутаминсинтетазы III из бактероидов Hhizobium lupini // Биохимия. - 1986.

- Т. 51, Ü II. - С. 1776-1784.

27. Алиев Д.А., 1>лиев Г.М., Мамедов Г.Г., Цупрун В.Л. Физико-химические свойства и четвертичная структура карбоангидразы листьев нута // Биохимия. - 1986. - Т. 51, .»в II. - С. 1785-1794.

28. Шиффелова Г.Э., Соловьева H.A., Пушкин A.B., Цупрун В.Л., Евстигнеева З.Г.,-Кретович В.Л. Регуляция аммиаком и четвертичная структура глутаминсинтетазы II бактероидов Hhizobium lupini // Биохимия. - 1987. - Т.52, № 2. - С. 264-269.

29. Цупрун В.Л., Акентьега Н.П., Тагунова И.В., Орлова Е.В., Гри-горьян А.Н., Гвоздев Р.И., Киселев H.A. Электронная микроскопия ме-танокислотцих бактерий Hethylоcoccus capsulatus // Докл. АН СССР. -1987.- Т. 292, Jb 2. С. 490-493.

30. Цупрун В.Л., Зограф О.Н., Кафтанова A.C., Орлова Е.З., Меньшикова^. В., Ритов В.Б., Киселев H.A. Электронная микроскопия криста лов Са^-АТРазы в мембранах фракции терминальных цистерн и продольны трубочек СР. // Докл. A4 СССР. - 1987/ - Т. 296, J£ 3. - С. 760-762.

31. Цупрун З.Л., Орлова Е.В., Зограф О.Н., Киселев H.A., Пушкин А.Б,, Шлффелова Г.Э., Соловьева H.A., Евстигнеева З.Г., Кретович B.Ji Электронная микроскопия множественных фор;.: хмутакинсинтотазы бактерс идов и растительной части клубеньков лптша // Ьпохииш. - 1987. - 1 52, » '3. - С. -¿74-о 83.

32. Cauprun V.L., Meayanzhinova I.V., Milgrom Ya. M., Kalashnl-кота T. Yu. Electron-microscopic studies on location of SH-groups in mitochondrial F1-ATPазе using a ferritin label // Biochim. Bio-phys. Acta. 1987. - Vol. 892. -P. 130-137.

33. Csuprun V.L., Zograph O.N., Orlova E.V., Kiselev И.А., Pushkin A.V., Shiffelova G.E., Solovieva И.А., Evatigneeva Z.G., Kre-tovich W.L. Electron microscopy of multiple forms of glutamine synthetase from bacteroids and the cytosol of yellow lupin root nodules // Biochim. Biophys. Acta. - 19S7. - Vol. 913. - P. 369-376.

34. Казакова O.B., Цупрун B.I., Иванушкин А.Г., Кафтанова A.C., Пушкин А.В., Кретович В.Д. Четвертичная структура и кинетические характеристики аланиндегидрогеназы из бактероидов Bhizobium lupini // Докл. АН СССР. - 1988. - Т. 300, - С. 479-482.

35. Казакова О.В., Цупрун В.Л., Иванушкин А.Г., Кафтанова А.С., Душкин А.В., Кретович В.Л. Очистка, структура, свойства и регуляция аланиндегидрогеназы из бактероидов Hhizo.bium lupini // Биохимия.

- 1988. - Т. 53, В II. - С. I864-I87I.

36. Данг Хоанг Зыок Хьен, Соловьева Н.А., Цупрун В.Л., Кафтанова А.С., Пушкин А.В., Шубин В.В., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Структура Глутаминсинтетазы из Spirulina platensis // Биохимия. - 1988.

- Т.53, fi 10, С. 1648-1653.

37. Орлова Е.В., Цупрун В.Л., Евстигнеева З.Г., Соловьева Н.А., Данг Х.Ф.Х., Киселев Н.А. Цифровое усреднение электронно-микроскопических изображений Spirulina platensis // Докл. АН СССР. - 1988. -Т. 320, » I. - С. 231-234.

38. Орлова Е.В., Расулов А.С., Цупрун В.Л., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л., Киселев Н.А. Структура молекулярных форм одноклеточных зеленых водорослей // Докл. АН СССР. - 1988. - Т. 302, № 3. -С. 742-745.

39. Цупрун В.Л., Месянжинова И.В. Электронно-микроскопическое исследование структуры АТР-синтазы и ее локализация в мембране // Биологические мембраны. - 1988. - Т.5, Jfc II. - С. II52-II55.

40. Sukhodolets M.V., Nagradova N.K., Muronetz V.I., Tsuprun V.L. Kaftanova a.S. Aaaociation of rabbit muscle dlyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase and 3-phoaphoglусerate kinase // FEBS letters

- 1963. - Vol. 238, Hoi. - P. 161-166.

41. Цупрун BJI., Стольмащук В.Я., Шнырева М.Г., Егоров C.H. Электронно-микроскопическое исследование секретлруешх гликопротеинов: кисло!: ^сфатазы и инвертазы // Тезисы XIII Всес. конф. электр. микр.

M. - 1988. - С. 48.

42. Лосева Л.П., Шатилов В.Р., Цуцрун В.Л., Кафтанова A.C. Четвертичная структура НАД(Р)-глугаматдегидрогеназы Chlorella pyrenoi-do за // Биохимия. - 1989. - Г.54, Ж - С. 651-655.

43. Shatilov V.R., Loseva L.P., Tsuprun V.L., Kaftanova A.3., Kretovich iV.L. Coenzyme non-specific glutamate dehydrogenase fron Chlorella pyrenoidosa 82T: electron microscopic studies // Biochlm.

Biophys. Acta. - 1989. - Vol. 995. - P. 17-20.

44. Tsuprun V.L., Mesyanzhinova I.V., Orlova E.V. Structure of the ATP-aynthase studied by electron microscopy and image processing // FE BS Letters. - 1989. - Vol. 244, №2. - P. 279-282.

• 45. Цупрун В.Л., Зограф О.Н., Орлова Е.В., Киселев H.A. Трехмерная реконструкция трубчатых кристаллов МоРе-белка нитрогеназы Azotobacter vinelandii // Докл. АН СССР. - 1989. -Т. 309, ¡'Л. - С. 994-996.