Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические свойства и регуляция активности митохондриальной креатинкиназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства и регуляция активности митохондриальной креатинкиназы"

рппЬш ^и* А/ 005% еЪ 01. м.%3. ¿£¿0

А4>

Московский ордена Ленива, ордона Октябрьской революции и ордона Трудового Красного Знаыани государственный унивирситат имени М.В. Ломоносова

На правах рукописи ОТ 576.311.347:57?Л53.36

ЛИПСКАЯ Татьяна Юрьовна

ЭДиЛКО-ХШИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРШШОЙ КРШШКИНАЗЫ

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соиснанио ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1989

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АН СССР, доктор биологических наук, профессор VI.С. 1С/ХЛЕБ доктор биологических наук, профессор СЛ. ШЗТ, ОБА

доктор биологических наук, профессор В.А. САКС

Ведущее учреждение - Институт биохимии имени А.Н. Баха

Защита состоится 19 года в часов на

заседании специализированного совета Д 053.05.32 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова ло адресу: Москва, ПЭ899, Ленинские Горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 19 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е.Б. ПЗТУШКСВА

ХАРАКТЕРИСТИКА, РАБОТЫ

Актуальность тайн. Креатинкинаэная система обнаружена в значительных количествах в.тканях, периодически испытывающих потраб-нссть в большом количества энергии: скелетной и сердечной иыицах, а также в мозге. С момента открытия крватинкюшзы* в цитоплазме скелетных мышц (Lohman 193*0 физиологическая роль креатинкиназпой системы рассматривалась в тесной связи с энергетическим метаболизмом указанных тнакейс хотя и до настоящего времени эта роль понята не до конца» Современная точка зрония заключается в том, что кроа-тинниназная система выполняет в тканях тесно между собой связанные и обусловливающие одна другую буферную и транспортную функции,поддерживая в тканях постоянный уровонь АТФ и осуществляя перенос макроэргического фосфата в виде молекул КФ от мест запасания энергии к местам потребления ( меуег et ai 1984,). В аэробных условиях основный местом запасания энергии являются митохондрии, поэтому, согласно современным представлениям, эффективность процесса передачи энергии зависит от того, насколько эффективно ККЦ может переносить фосфорильний остаток от синтезированного в матриксе митохондрий А""> на Кр ( ensarnan 198", Сакс 1983, jacobus 1985;. Уста-яовлоно, что в митохондриях нет избытка активности ККЦ над активностью системы окислительного фосфорилирования ( Vial et al 1972,

Jaccbus t Lehninger 1973( Saks et al 1975), ПОЭТОМУ изучение

механизмов, обеспечивающих высокую активность ККЦ, имеет важное значение. Исследования работы ККЦ в разных эксперимент иных условиях привели i. представлению о том, что во время окислительного фосфорилирования в межмембранном пространстве митохондрий возникает больших или меньших размеров микрокомпартмент адениловых нук-деотидов, в результате чего в области активного центра ККЦ создается более высокая, чем в окружающей среде, концентрация АТФ и

Принятые сонрацения: КК - креатинкиназа СЕ.С. 2.7,3.2), ККМ - т-тохондриальная КК; КФ - креа^инфосфат, Кр - креатин, ПАН - переносчик адониловых нуклеотидов, Ф - неорганический фосфат, ДСН -- додецилсульфат натрия, ПААГ - полиакриламидный гель, ГА - глута-ровый альдегид, ДМСИ - диметилсуберимидат, ДМПИ - диметилпимелими-дат, ДМАИ -'^иметиладипимидатдтт - дитиотрейтол, ИЭФ - изоэлектри-ческое фокусирование, ШЗБ-Н-морфолиноэтансульфоновая кислота.

- г -

более низкая концентрация АДФ, что и обусловливает эффективную работу ЭТОГО фвриента( Erickeon-Vlltanen ot al 1982, Saks et al 1985, Jacobus 1985;. В указанных работах свойства ККЦ и возможность их изменения остались вне поля зрения исследователей. Между тем, хотя ККц открыта относительно недавно ( Jacobs et al 1964) и свойства ае до настоящего времени изучены недостаточно, уже сейчас совершенно ясно, что ККМ - это самостоятельный изофермент, по ряду свойств резко отличающийся от цитоплазматических форы КК. Вероятно, это отличие в свойствах связано с функцией ККЦ.

Цель и задачи исследования. В связи со всей сказанным, целы) настоящей работы было изучить фиэино-химичоскив свойства ККЦ, а также исследовать возможности регуляции активности этого фермента, обеспечивающие эффективную работу ККЦ в разных физиологических состояниях мышечной ткани. Исследование было выполнено на ККЦ из двух источников: сердца (бык) и красных скелетных мышц (голубь), чтобы иметь возможность оценить, насколько универсально то или иное обнаруженное свойство ККу и чтобы попытаться в будущем установить корреляцию между свойствами этих ферментов и их функцией. При выполнении работы основное внимание било уделено решению следующих задач.

1. Исследовать природу сил взаимодействия, а также химическую природу мест связывания ККЦ с мембранами митохондрий.

2. Изучить свойства ККМ в растворе.

3. Идентифицировать олигомерныв формы ККМ, присутствующие в митохондриях.

Научная новизна работы. Показано, что после разрушения наружной мембраны митохондрий в результате гипотонической обработки солюбилизирующее действие на ККЦ различных веществ определяется в основном ионной силой их растворов, а не химической природой веществ. Таким образом доказано, что ККЦ связана с цембранами силами электростатического взаимодействия. Проведено сравнительное изучение способности ККЫ связываться с мембранами митохондрий сердца и печени, а также с мембранами липосом, изучена кинетика ыембраносвязанного фермента и рН-зависимость этой связи. Совокупность полученных результатов позволила заключить, что структурными элементами иембран митохондрий, с которыми связана ККЦ, являются фосфолипиды.

Разработан единый для митохондрий сердца и скелетных ишц метод получения очищенной ККЦ, особенностями которого являются доступность использованного оборудования, малое число стадий, отсутствие денатурирующих воздействий в процессе выделения, а также высокий выход в сочетании с высокой удельной активностью фермента. Проведено сравнительное изучение свойств очищенной ККЦ из двух источников. Показано, что оба фермента представлены в растворе равновесной смесью только двух олигонерных форм, димера и октаыера. Ок-тамерное строение высокомолекулярного олигомера доказано с помощью сшивания его субъединиц ДМСИ. С помощью сшивающих бифункциональных реагентов, а также метода электронной микроскопии установлено, что октамер имеет квазисферическув структуру. Показано, что электростатические взаимодействия не играют существенной роли в объединении димеров в октамеры.

Исследовано влияние на равновесие между динаром и октамером. ряда факторов, имеющих физиологическое значение: ионного состава среды, рН, субстратов, ряда метаболитов. Установлено, что рН, а так~е каталитическое превращение субстратов смещают положение равновесия в сторону димера. При физиологических концентрациях адониловых нуклеотидов действие субстратов зависит от соотношения концентраций Кр и КФ, от рН и присутствии 4>н. Определены константы диссоциации октамера в разных экспериментальных условиях. Установлено, что потеря активности фермента при хранении связана с денатурацией диыора. Установлено, что изоэлоктрические точки димера и октаыера близки для ферментов из двух источников и лояат Ь щелочной области рН. Определены кинетические параметры димера а октаыера очищенной КНЦ из митохондрий сердца.

С использованием сшивающего бифункционального реагента-ГЙ -- показано, что связывание ККЦ с мембранами митохондрий но приводит к появлению новых олигомерных форм. Единственной олигомерной формой ККЦ, которая связана с мембранами в митохондриях сердйа, является октамер. Количественный анализ пришиваемой к мембранам ККЫ показал, что в митохондриях имеется по крайней мере два типа участков локализации ККЦ, различающихся своим окружением. Совокупность полученных результатов указывает на то, что активность ККи в разных функциональных состояниях мышечной ткани может регулироваться за счет обратимого связывания с мембранами и взаимного пере ода олигомерных форм. На основании полученных данных предполагается также, что функция КК,. заключается не только в синтезе

молекул КФ, но и в поддержании в можмомбранном пространство митохондрий такого отношения концентраций ЛТФ и /ДФ, которое обеспочи-вавт возможность синтоза АТФ в митохондриях в условиях, ио-да стационарная концентрация АДФ в цитоплазма низка.

Практическая значимость работы. Проведанное изучение свойств ККЦ обнаружило, что этот изофермант отличается от цитоплазматичес-них форм по ряду свойств: рН-устойчмвости, константами Михазлиса для аданиловых нуклаотидов, способности связываться с мембранами митохон/^ий и липосом, олигомерным составом и гН-зависимлстыо равновесия манду олигомирными формами. Найденные различия могут быть использованы при разработке эффективных методов дифференциального опредолени" активности ККЦ и других фо^ц КК при их одновременном присутствии в сыворотка крови, что может имоть диагностическое значоние при лпухоиях некоторых органов и прогностическое значение при инфаркте миокарда. Получонныа розуль-аты позволяют глубже понять процессы, лежащие в осног связанных с ишемией ц гипоксией изь.о.наний активности ККЦ. Практическое значение имеют подобранные в работ условия раз; "ления адениловых нуклоотидов, КФ, Фц и глюкозо-б-фосфата на пластинках Силуфол, выделения митохондрий из грудной мышцы голубя, выделения ККЦ из митохондрий сердца и скелетных мышц, сшивания ККЦ с мембранами митохондрий в присутствии ГА, а также сшивания субъединиц фермента в присутст-: ли ДМСИ, изоэлоктрического Фокусирования димара и октамора ККМ, которые могут быть использована в работе других научно-исследовательских лабораторий. Маториалы работы используются при чтении курса лииций "Основы тормодинамики ь биохимич" для студентов кафедры биохимии МГУ.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях, съездах и симпозиумах: 1 и 5 Всесоюзных биохимических съездах (Ленинград 1979, Киев 1985); 5,7,8, 10 Объединенных симпозиумах биохимических обществ СССР-ГДР (Веймар 1979, Лейпциг 1983, Рига 1985, Ташкент 1989); 10 Международном конгрессе по изучении сердца (Москва 1980.); 1 Международном симпозиума "Множественные формы ферментов" (Веймар 1980); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва 1982), Всесоюзной конфарен-ци"' по применению ферментов в биохимических анализах (Паланга

1984), 16 Конференции Федерации европейских биохимических обществ (Москва 19§4), 5 Всесоюзной конференции по биохимии иышц (Тбилиси

1985), 5 засоюзном симпозиума по медицинской энзимологии (Ма-

хачкала 1986).

Объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах, включает таблиц, рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и 1« обсуждения, а также выводов. Список литературы состоит из наименований.

I. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИРОДЫ СИЛ, СВЯЗЫВАЮЩИХ ККи С МЕМБРАНАМИ МИТОХОНДРИЙ

К началу нашей работы относительно природы сил взаимодействия ККу с мембранами в литературе не было единой точки зрения; били получены данные как указывающие на то, что KKU непрочно связана с мембранами силами электростатического взаимодействия и логко солю-билизнруется (Jacobus, Lehninger 1973, Schölte et al 1973),T8K и на то, что часть (Дмитроико, Буханович 1973) или д^о вся КК„

м

( Booth, ciark 1978) прочно связана с мембранами; третьи результаты свидетельствовали, что ККЫ является интегральным белком внутренней МОЫбпанЫ ( Iyengar, Iyengar 1980). КК1( раСПОЛОЗСОНВ H3 H3-РУ2Н0Й поверхности внутренней номораны митохондрий ( Jacobus, Lehninger 1973, Вава et al 1976, Левицкий и др. 1977), поэтому мы предположили, что указанные расхождения литературных данных относительно эффективности солюбилизации ККу связаны с тем, что в работах разных авторов наружная мембрана у митохондрий была разрушена в разной степени.

При анализе влияния степени целостности наружной мембраны на экстракция ККИ из митохондрий сордца мы установили, что 0.I25M KCl экстрагирует из свежевыделонных митохондрий с неразрушенной наружной мембраной только 17/а активности ККЦ, посла разрушения нарук-ной момбраны в результате однократного замораживания-оттаивания доля экстрагируемой КК,, увеличивается до 50%, тогда как поело гипотонической обработки водой 0.125М KCl солюбилизируот до 90$ активности ККМ . В последующих опытах для разрушения наружной мембраны митохондрий использовали гипотоническую обработку водой. На рис.1 представлены результаты опытов по солюбилизации ККЦ из митохондрий сордц-" веществами различной химической природы. Активность ККЦ а этих и всех последующих опытах измеряли, регистрируя изменения pH, сопровождающие протекание креатинкинаэной реакции. На рис.1 зи; :о, что солвбилизирующао действие исследованных нами веществ (за исключением аданиловых нуклеотидов) проявляв^ я при

'.«кзких значениях ионной силы, причем по мере*увеличения ионной силы эффекты различных воществ сближаются. При физиологи зской ионной сило 0,2 с мембранами митохондрий остаются связанными только 8-I3JS активности ККЦ. Мы установили, что сахароза, молекулы которой не зарянены, и Кр, молекулы которого имеют суммарный заряд, равный нулю, но снимают КК с мембран митохондрий при всех исследованных концентрациях. На основании приведенных опытов был сделан вывод, что ККЫ связана с мембранами силами электростатического вз8"чодействия. На рис.1 видно также, что ¿олюбилиз"рующоо действие адениловых нуклеотидов является более эффективным; эти вещества при низкой ионной сило 0,02 пореводнт в раствор 75-80$ активности ККу. Bey пятно, их действие включает какие-то болео специфические механизмы, чем просто солевой эффект. Солюбилизирующее действие АДФ и Mg АТФ ищо бплее усиливается в растворах, ионная сила которых сама по себе недостаточна для снятия ККЦ мембран. Так, в одном из опытов было установлено, что \ДФ и М^АТф. солюби-лизируют SO/o активности ККЦ в концентрациях около 3 м.У, а в присутствии 50 мМ KCl при концеитрац и 0,2 uU (АДФ) и О,С» мМ (МдАТФ). Мы установили также, что растворы KCl различной ионной слы одинаково эффективны при солюбилизации ККМ с мембран митохондрий сердца и скелетных мышц. Сделанное нами заключение об электростатической природе связи ККЦ с мембранами митохондрий (Липская и др. 1979, -ЛЮ) было подтверждено в бс ое поздних исследованиях, проводонных на митохондриях ИЗ других ИСТОЧНИКОВ ( Font et al 1981, Wonger et ai 1985, Brooks, suoiter 1987). Таким образом, в настоящее время электростатический характер связи с мембр'чшми митохондрий, очевидно, следует признать универсальным свойством ККМ.

п. исследование химической природы компонентов мыбран

митох :1дрий, с которыми связана ккы

На основании кинетического анализа поведения ККЦ в газных экспериментальных условиях Сакс и соавт. (. Saks et ai 1975) предположили, что в митохондриях ККЦ образует с UAH мультиферментный • комплекс, в результате чего АТФ с .транслоказы прямо переносится в активный центр ККЦ, а АДФ - в обратном направлении. При прогорне этого предположения с помощью метода меченых атомов были получены результаты как подтверждающие ( Yang et ai 1977J, так и опровергающий ОГО ( Altschuld, Brierley 1977), В СВЯЗИ С ТИМ ПОрвиа наш;; опыт- также были посвящены вопросам структурного сопрякокия.

та

N I

о

1

-Лл-д

20 12 4

I

& МИН

8 12 16 '¿0 ^ Ионная сила»100 Рис.1. Влияние различных веществ на долю ККЦ, связанную с мембранами митохондрий сердца быка. I - АДФ, рН 7,0; 2 -- М„АТФ (1:1;, рН 7,9: 3 - АТФ, рН 6,9; 4 - М<,С1?; 5 -

- фосфат калия, рН 6,9; 6 - КФ, рН 7,9; рН й,3; 8 - ИаС1; 9 - имидазол, рН 6,6;

- т

10 - :

¡ис^ЙС!," СС1.

Рис.2. Изменение удельной радиоактивности АТФ и КФ при синтезе КФ, сопряженном с окислительным фосфорилированиеи. о-АТФ, о - КФ, л- Фн.

Мы установили, что объемный ингибитор ПАН - карбоксиатрактилозид не влияет "ч солюбилизацию ККЦ с мембран митохондрий. В наших изотопных опытах (Липская и др. 1980), посвященных исследованию образования КФ в митохондриях сердца при окислительное фосфорилирова-нии, среда инкубации содержала немеченые АТФ и Кр и меченый Р. Б ходе окислитель..ого фосфорилирования из моченого фосфата образовывался мочоний по у-фосфату АТФ. Ми предполагали, что если фос-форильный остаток от этого АТФ будет прямо переноситься на Кр, то удельная радиоактивность образованного КФ будет равна удельной радиоактивности Ф„, а удельная радиоактивность АТФ в среде должна быт - равна нулю. Если прямого переноса но будот, то меченый АТФ будет смешиваться с немеченым АТФ среды и удельная радиоактивность КФ и АТФ в среда будот раст" примерно с одинаковой скоростью. Для разделения компонентов адениловой системы, КФ и Ф был использован метод двумерной тонкослойной хроматографии на пластинах Силуфол в подобранных нами условиях. Концентрацию АТФ и КФ в пробах определяли спектр^отометрически при 340 ни с помощью систомы сопрпяон-ных формонтоз. Полученные результаты (рис.2; свидетельствуют, что в наших опытах меченый АТФ, превде чем попасть в активный цен-т) КК„, сиешгаался с АТФ среда, то есть структурной сопряжение наяду

ККЦ и ПАН отсутствовало. В этих опытах концентрация АТФ в среда Оыла равна 0,5-0,6 мМ.

Для получения дополнительных доказательств отсутствия структурного сопряжения между ККЦ и ПАН исследовали связывание ККМ с мембранами митохондрий сердца и печени (Липская ь др. 1Т60). Для посадки использовали содержащий ККЦ экстракт из митохондрий сердца, ионная сила которого была снижена диализом. На рис.3 видно, что количество ККМ, которое мокат связаться с предварительно лишенными этого фермента митохондриями сердца, а измеримо с количеством форманта, связываомого митохондриями печени, хотя исходные митохондрии почени но содержат ККЦ, а содержание ПАН в них в 4 рапа ниже его содержрния в МИТОХОНДРИЯХ сердца ( Ие1с1оп1апп е1 а1 1970). Учитывая близкий фосфолипидный состав мембран митохондрий сордца И почени ( Сиа1 1ег1 еЪ а1 1971, КгеЬэ ее а1 1979), ьа основании приведенных опытов мы предположили, что в ммтохондриях сердца ККЦ связана электростатически с фосфо-ипидами мембран. Одновременно аналок.чные результаты были получены в другой работа ( паи, оешса 19£0), однако уг-чанные авторы не высказали никаких соображений относительно химической природы мает связывания ККЦ с мембранами.

Для проверки предположения о взаимодействии ККЦ с фосфолипи-дами исследовали способность ККЦ связываться с липосонами, приго-вленными из смеси экстрагированных из митохондрий сердца фосфо-липидов. Предварительный анализ показал, что количественные и качественные характеристики полученного нами фссфолипидного экстракта соответствуют литературным данным по фосфплипиднсму составу митохондрий сердца быка. Связывание ККЫ с липосомами характеризовалось кривой с насыщением; максимальной связывание составило около 10 НМОЛЬ ДИМера ККМ На I МКМОЛЬ фОСфОра фОСфОЛИПИДОВ ( Ь1рзкауа et а1 1980). Таким образом, опыты по посадке ККЦ на липосомы указывали на справедливость предположения о том, что в митолондриях ККМ связывается с фосфолипидаыи мембран, а на со специфическими белками.

Учитывая электростатический характер взаимодействия ККИ с мембранами митохондрий и щелочную природу фермента (р1а9,2-9,о; аагоЬз 1974, Белоусова и др. 1983), мы предположили, что положительно заряженные группы на поверхности молекулы ККЦ (аминогруппы остатков лизина или аргинина) взаимодействуют с отрицательно заряжа: шми фосфатными группами фосфолипидов митохондриальной

fe?

о

Рис.3. Связывание ККЦ с

митохондриями печени крысы (1) и сердца быка (2)

Добавленная КК

нмоль лимера мг.белка

мембраны (Липская и др. 1980). Для проверки этого предположения и для оценки природы функциональных групп, принт .ощих участие в связывании ККЦ с мембранами митохондрий, исследовали влияние рН на овязь ККЦ из митихондрий сердца с мембранами, а также рЯ-устойчи-вость этого фермента в растворе. Мы установили, что при использовании буферов, ионная сила которых недостаточна для солюбилизации ЮСЦ (10-20 мМ ацетатный, ииидааольный и трис-HCI буферы), связь фермента с мембранами митохондрий устойчива в области рН от 5 до 9,5, и это совпадает с областью рН-устойчивости ККЦ в растворе (60 мин при 30°) (Липская, Молокова 1983). Полученные результаты указывают нп то, что функциональные группы ККЦ, рК которых лежит в близкой к нейтральной области значаний рН (иыидазольное кольцо остатка гистидина, сульфгидрильиая группа цистеинового остатка) не принимают участия в связывании KKjJ с мембранами митохондрий. Таким. образом, эти результаты не противоречат представлению о связи ККЦ с фосфолипидаыи, так как из них следует, что в связывании участвуют функциональные группы, имеющие 10 <рК <5, Таким образом, кислотная группа вполно может бить фосфатом фосфолипида (pK«I-2; Ленинд-зер 1974). Однако мы не могли определить рК принимающих участие в связывании кислотной и основной групп из-за нестабильности ККЦ за пределами указанного интервала рН. Аналогичные результаты по рН-ус-тойчиво^ти били получоны на ККЦ из сердца человека (oiura et ai 1983). "Противоречащие нашим результаты были получоны в работе ( vial et al 979), авторы которой установили, что солюбилизируи-щос действие 20 м,М фосфата зависит от рН в интервале значиний от 6 до 8. Однако специально проведанные нами опыты "оказали, что в этом случае изменение степени солюбилизации КК< определялось не

изменением рН, а изменением ионной силы растворов фосфата при разных значениях рН (Липскан и др. 1980). Фонт и соавт. ( ?r,nt et al 1981, 1983) на основании опытов по солюбилизации ККЦ органическими соединениями ртути пришли к выводу, что sH-групл" KKU участвуют в связывании ое с мембранами митохондг"й. Ошибочность этого представления была доказана в более поздних исследованиях ( wenger et ai 1985, Mullet et al 1985).

Для получения дополнительных доказательств того, что в митохондриях ККИ связана именно с фосфолипидами моиоран, исс эдовали влкяиио связывания с маморанами митохондрий и липосон на кинетику креатинкиназной реакции ( Lipskaya, Moiokova 1982, Липская, Молокова 1983, Lipsk-ya et al 1983). На рис.4 видно, что ККМ в экстракте из митохондрий подчиняется уравнению Михаэлиса-Мент'-ч; Км (М9АТФ)=0,08 мМ, Кц(Кр>\0 мМ, v »0,742 мкг-экв Й^/мин.мг белка исходных митохондрий. В то же время поведение К..ц, связанной с момбршшг- митохондрий и лкпосоы, обнаруживает две кинетические формы, имеющие близкие параметры. ККЦ в митохондриях: Кы(М^АТФ)j=0,034, Км(М9АТФ)2=0,3.> мМ; K^Kp^^-V.O ull, v upl« =0,410 и v мкг-экв Н^/иин-мг болка;'кКи в липе омах

КЦ(МЭАТФ)jbO,(W8, Кы(М9АТФ)2=0,561 мМ; vnpi=0.387 и vnp2=o,363 мкг-экв Н /мин-иг белка (Обработка результатов проведена по мотору Reiner 1969). Таким образом, связанные с мембранами формы отличаются от ККЫ в раствори константами Михаэлиса для М^АТФ; максимальные скорости обоих форм приблизительно равны между собой и составляют каждая половину максимал'чой скорости в зкетракто. Причину найденных различий мы обсудии позже, 3j,jcb ка нам важно отметить, что связывание с чисто фосфолипидной мембраной приводит к таким же изменениям кинетических характеристик ККЦ в прямой реакции, как и связыва; :е с болково-фосфолипидной мембраной митохондрий.

На основании совокупности полуениых результатов иы сформулировали представление о том, что в ыитохон; риях связь ККМ с мем-^ бранами осуществляется не через аденилатный переносчик, а через фосфолипиды в результате электростатического взаимодействия; при физиологических значениях ионной силы и концентрациях адениловых ну«леотидов ККЦ может существовать в митохондриях как в связанном о мембранами, так и в свободном состоянии в мехмембранноц пространстве; изменение кинетических характеристик лКц при переходе из связанного с мембранами в свободное состояние указывает

Рис.Зависимость скорости прямой крватинкиназной реакции от концентрации АТФ при следующих фиксированных концентрациях Кр, мМ: 5(1), 10(2), 25(3). а -экстракт из митохондрий, б - митохондрии, в - липо-сомы.

на пзможность того, что такой обратимый пароход, осуществляемый з физиологических условиях, может выступать в качество регулятора активности фермента. Позднее вывод о связи ККМ с фосфолипидами был подтверадон s нескольких лабораториях, где было показано,что ККМ взаимодействует с кислым фосфолипидом - кардиолипином ( Newman et al 1982, Huiler et al 1985, Schlame, Augustin 1985). Были- акха получены доказательства участия остатков лизина и аргитша» но на гисгидина и на цистеина в связывании ККЦ с мембранами ( Chenc/al, Carafoli 1988).

I/V, Дкг-окв tT/~^мннь

мг

8

Л

/

-15 16

I/Q»gATç] „ м!Г

I

И. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ОЛИГОМЕРНЫХ ФОРМ KKU СЕРДЦА И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ

I. Очистка ККЦ. Наши предыдущие исследования указывали на возможность того, что в физиологических условиях КК. лишь частично связана с мембранами, поэтому следу-'чий этап нашей работы был посвящен изучению свойств ККЦ в растворе. Было известно, что формант может существовать в растворе в виде смеси по крайней мере двух олигомерных форы I Jacobs 1974, Hall et al 1977,1979; Белоусова .. др.1983). Мы поставили перед собой задачу выясчть, какие множественные формы ККМ могут существовать в растворе и каковы факторы, влияющие на взаимные переходы форм Митохондрии сердца выделяли по крестной методике ( valiin, Low 196З), условия выделения больших количеств митохондрий из грудной мышцы голубя были подобраны нами. Разработанный единый метод выделения и очистки ККМ из митохондрий сердца и с елетных мышц (Лит лая и др. 1985, Липская, Рь^ина 1987) включает: гипотоническую обработку митохондрий, в результате которой удаляются водорастворимые белки можмембранного пространства и отчасти матрикса; экстракцию ККЦ 0,25М раствором KCl; освобождение экстракта от обрывков мг 'бран в результате центрифугирования при 105000 g ; концентрирование и частичную очистку экстракта на фосфате целлюлозы; элюцию с фосфата целлюлозы части примесных белков 0,121¡ Щи последующую элюцию KKU 0,25М KCl; гель-фильтрацик, элюата на колонке с сефакрилом s -300. Метод позволяет получать ККМ с удельной активностью около 300 ед/мг болка (при определении б^чка с кумасси) и с выходом около 50?« от активности в исходных митохондри! : (около 70# от активности в экстракте из митохондрий в 0,25М KClJ. ■ При электрофорезе в присутствии ДСН препарат давал одну белковую полосу при содержании до 30 мкг в фобе. При электрофорезе на полосках ацетата целлюлозы очищенная ККЦ двигалась к катоду в виде одной п^посы со скоростью, характерной для ККЦ (Hall ^t ai 1977). Фермонт разделяли на небольшие порции и хранили при -18° Сопоставление разработанного нами метода с другими известными в настоящее время методами выделения ККМ из митохондрий сердца быка ( Farreii et ai 1972, Hall et al 1979, Белоусова и др. 1986) и из других источников ( Roberte, Grace 1980, Blum et al 1983, Sehl .^ol et al 1988) показывает, что особенностью нашего метода является доступность использованного оборудования, малое число стадии, отсутствие

денатурирующих воздействий в процессе выделения, а также высокий выход в сочетании с высокой удильной активностью фермента.

2. Олигомарный состав и четвертичная структура ККЦ. Сравнительное изучение свойств ККЦ из двух источников (Липская и др. 1985, Липская, Рыбина 1987} показало, что оба фермента очень близки по своим свойствам, а найденные различия носят количественный характер.

Таблица I. Количественные характеристики олигоиерных форм ККМ из сердца и скелетных мышц

!Молекулярная масса, тыс. Да!Ради.уо Стонса, 1 Константа ' I 1 питянпп 1 \Q «седимонта-

Источник ! 1- Ди-'?Р-i 0KT^QP i-Í.-1 ции s9n

фермента t ! 1 ! ! t._

! moho-! a j б ! а ] б ! димер|октамер1ед^^д

_!ывр I I ! ! } (_{димарнттамар

Сердце A3,5 87 89 355 325 37,2 58,9 5,4 11,8. Грудная

мышца 43,7 91 89 380 334 37.4 59,3 5,4 .12,0

Примечание: а - по даяния гель-фял&трация, б - расчет ¡по величине константы седиментации. Из табл.1 видно, что в раствора оба фермента присутствуют а виде cauca двух олигоиерных форм. Сопоставление молекулярной массы олягомерных ijopM с молекулярной массой субъединицы, определенной ;.мтодоа электрофореза s присутствии ДСП,, показало, что олиго-моряъга формы являются диморон и октамером. Нам не удалось .обнару--жить присутствие приаокутсчних форм но только во время голь-фильтрации, но и при ультрацентрифугироьснии в градиенте плотности сахарозы, дающ-ом достаточное для обнаружения промежуточных форм разрешение. Таким образом, мы уста.ч.'вилн, что при нейтральных зннчв-нинх pH ККМ присутствует в растворе в нидо смеси только двух оли-гомарных форм. Позднее к такому же выводу призил другие исследователи С Schlegel et al lv88, SchnyJer ot л1 1988).

В литература до настошцего примени нет единого мнения о числе субъадиниц в высокомолекулярном олигоыирз ККЦ. Особенно противоречивы сведения, касающиеся ККЦ из сердца быка. Есть данные, что это октамер ( Jacobs, Graham 1978) ИЛИ ГОКСамер ( Farrell et al 1972, Hall et al 1979). Некоторые авторы считают, что фермент может сукествовать как в гексамерной, так и в октамерной форме

(Москвитина, Балоусова 1985, Балоусова, Москвктина 1985). Дла. ,. уточнения числа субъединиц в высокомолекулярном олигомерс ККИ из сердца быка мы сшивали субъединицы в молекуле фермента с помощью ДМСИ, а аатом ¡доводили электрофорез в присутствии ДСН. Условия оиивания подбирали так, чтобы оно проходило достаточно глубоко. В ¿том случае электрофорез обнаруживает столько белковых полос, сколько субъодиниц иазот олигомер (Фридрих 1986). В наших опытах число белковых полос было равно 8, причем увеличение времени сшивания ппчводило к исчезновению низкомолекулярн^ полос v к накоплению белка в 7-ой и 8-ой полосах. Для доказательства того, что все 8 белковых покос образуются в розультато сшивания только внут-риолигоморных контактов, были поставлены опыти, в которых ККц спивали ДИСК, а затем ультрацентрифугировали в градиента плотности сахарозы.

Формант после сшивания имел сакую ко константу седиментации (vj2 s), как и несшитый олигомер. Несколько фракций из области пика сиитого о^лгомера объединяли, упаривали до небольшого объема и подвергали электрофорезу в присутствии ДСН. На злектрофорограмме были обнаружены 7 белковых полос, расположение которых соответствовало расположению со 2-ой по 8-ю белковых полос првдыдущнх опытов. Учитывая, что обнаруженные полосы могли образоваться только за счет сшивания внутриолигомерцых контактов и что общее число по-оо равно 8, мы заключили, '-о высокомолекулярный олигомер ККЦ из сердца быка является октамзром, а не гексаыаром ( Lipskaya et ai 1989). Характерно, что приводимые в других работах константа седиментации (Балоусова И др. 1983) И радиус Стгчса ( 'FarreU et al 1972) гексамера совпадают с соответствующими найденными параметрами октамзра. Недавно показано, что высокомолекулярный олиго-uop ККМ из других источников также представляет собой октамер

( Font et al I937t Schlegel, Wyss et al 1988, Schlegel,Zur-briggen et ai 1988). Вероятно, октаыерное СТрООНИь является

отличительным признаком ККЦ.

Мы использовалг метод сшивания бифулкционалышми реагентами для выяснения пространственного расположения субьединиц в октамо-ро ККу из сердца ( upskaya et ai 1989). Теоретическое paccuoT-ре"ие дает четыре наиболее вероятные структуры для октамерных белков: полностью гахарологичаскан пленарная, где всо области контактов одинаковы; полностью изологичаская планар; ля (татрамар динаров), -.{вазисфарическая с "заслоненной" упаковкой (куб) и ква-

зисфаричоскап о "шахматной" упаковкой (Фридрих 1986). Структурной одишщой октамера ККЦ является динар, поэтому в случая пленарной упаковки субъодиниц октамор должен быть полностью изологичесиим, то ость доллон обладать двумя типами областей контакта между субь-одиницами: виутрйдиыорнши и ыеждимерншш. При сшивании субъодшшц разные области контакта будут сшиваться о разной скоростью, поэтому при электрофорезе в присутствии ДСП следовало ожидать чередования интенсивности полос, образованных чотнш и нечетным числом сст-тих протоиоров (Фридрих 1986). Для сшивания субъодиниц К1Си из сердца использовали 3 бифункциональных роагонта, образующих гомологичный ряд: ДИСИ, ДШ5, ДМАИ. Мы установили, что при сшивании субъодшшц ККЦ с помощью ДМСИ в точение разных промежутков времени число и интенсивность болковых полос, выявленных при электрофореза в присутствии ДСП, изменяются во времени равномерно, "то больше соответствует гетерологичоской пленарной упаковка, которая для ККЦ невозможна. При сшивании субъодиниц ККЦ с помощью ДМПИ и ДМАИ число обнаруживаемых белковых полоо составляло 6-7 и 4-5 соответственно, причем по 1ЕОНИО концентрации э 'ос веществ и удлинение времени ип-кубации но увеличивали глубину сшивания. Полученные результаты • также противоречили предположению о пленарной структуре октаыора, так как в случае пленарной упаковки число различных областей контактов но больше двух, поэтому если возможно сшивание болео двух субъодиниц, то со враманец при электрофорезе должны бы;-я бы образоваться все Ь полос.

При свивании можпротомарных контактов в димерах ККЦ мы установили, что тогда как ДМСИ и ДМАИ сшивают внутридимерныо контакты, хотя и с разной скоростью, ДМПИ на сшивает 1«. Следовательно, в случао планарной структуры октаыера сшивание в присутствии Д1.'.ПИ дол.г..!0 было бы давать только мономеры или мономеры и диморы. Таким образом, из этой части нашей работы мы сделали вывод, что октамор ККЦ обладает квазисферическо!'. конфигурацией. Этот вывод был под-, тверздои .с помощью метода электронной микроскопии54. На фотографии ККЦ видиа о виде квадрата пли розетки, именной 6-8 лопостков. Такая картина соответствует квазвсферичаской структуре с "шахматной" упаковк.Д, построенной из двух пленарных тетрамеров, субъа-

й Злвятронномикроскопическое исследование выполнено в сотрудни чоствь со ст.н.о. йн-та кристаллографии АН СССР В.Я.Стальмаду-коа.

диницы которых.снащены одна относительно другой, поэтому, в зависимости от0проокции, видны от 4 до 8 субъединиц. Диаметр частиц равен 120 А, что0хорошо соответствует найденному нами радиусу Сток-са онтамора, 59 А. На фотографии видны также боковые проекции ( ырзкауа е1 а1 1989). Найденная нами структура с расположением субъодиниц в два слои является типичной для изученных к настоящему времени октамерных белков (Фридрих 1986). В конце 1988 г. были опубликованы работы ( БсЫеде1, гигЬг1ддеп а1 1988, БсИпудег еЬ а1 1988, БсЫеде1, Нувз еЬ а1 1988), В КОТОРЫХ ПРИВОДЯТСЯ результаты электронной микроскопии ККЦ из сердца и мозга цыплоика. По данным авторов, высокомолекулярный олигомор ККМ из обоих источников представляет собой октамер, имеющий форму куба. Таким обри-аом, вероятно, в пределах октаиорной структуры в ККЦ из разных источников возможны некоторые различия в расположении субъединиц.

Для ответа на вопрос о том, какими силами связаны димеры в октаыире, исследовали влияние ионной силы на распределение молекулярных форм. С этой целью ККи из митохондрий сердца и скелетных мышц диали.чоъали против сроды с ионной силой ~ 0,025, затем к отдельным порциям диализоианных ферментов добавляли КС1 для создания нужной величины ионной силы, и через несколько часов пробы ультрацентрифугировали в градиенте плотности сахарозы. На рис.5 видно, что снижение ионной силы вызывает обратимую диссоциацию онтамора ККЫ из грудной мышцы и не влииот на диссоциацию октамора ККЫ из сердца. Однако при болов низких концентрациях белка и более низкой ионной силе раствора ККЦ из сердца быка также диссоциировала. Увеличение температуры от 5 до 20° незначительно смощало положение равновесия в сторону октамора. Полученные результаты позволили предположить, что в ККи из обоих источников электростатические взаимодействия не играют существенной роли в объединении диморов в октамеры, ток как в случае электростатических взаимодействий следовало ожидать ослабления связей между субъединицами при увеличении, а не снижении ионной силы среды.

3. Факторы, влияющие на распределение олигомерных форм.

Исследовали влияние факторов, которые могут иметь физиологическое значение: ионного состава среды, рН, субстратов и некоторых других метаболитов. С помощью метода ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы мы установили, что природа присутствующих в среде одновалентных анионов (С1~, Я03~, ацетат-ион) и катионов (К+ или 8а+) не влияет на распределение олигомерных форм

ioq

tA

<d n.

a>

I Щ

3

Рис.5. Влияние ионной силы на диссоциация октамира ККЦ из сердца быка

(I) и грудной мышцы голубя (2). Градиенты сахарозы 2-10% содержали 25 мМ НЕ я рН 7,0, 0,25 ыМ ДТТ и КС1 в количестве, необходимой для создания указанных на оси абсцисс значений ионной силы. Концентрация балка ККЫ после диализа, мкг/мл:

_,_. 480(1), 450(2). За 100% принимали

ОД 0„2 0,3 содержание октамера в препарате до

Ионная сила диализа' KKU из двух источников (Липская и др. 1985, Липская, Рыбина 1987). В то же время увеличение рН усиливает диссоциацию октамера. На рио. б видно, что диссоциирующее действие рН сильнее выражено на фермента из грудной ыышцы голубя, так что при физиологических значениях рН этот фермент присутствует в растворе в вида смеси димера и октамера, тогда как ККЦ из сердца быка - преимущественно в форма октамера. При рН 9,6 КК^из грудной мышцы полностью диосоциирует до димера, а в ККМ из ыышцы сердца при рН 9,0-9,6 появляется форма о константой седиментации 3,0-3,5 s, очевидно, мономер. Вероятно, падение активности ККЦ из сердца быка при значениях рН больше 9,5, которо! кы наблюдали при изучении рН-ус'тойчивости этого фермента, связано с диссоциацией его димаров на мономеры.

Мы установили, что субстраты креатинкиназной реакции, взятые в отдельном)1.« ка влияют на распредолонио олигоыорнцх форм фермента из«обоих источников; тогда как равновесная смось субстратов приводит к диссоциации октамера (рис-?). Получены доказательства 4 того» что эффект субстратов связан о конформационньши изменениями в активном центре ККЦ, происходящими во время катализа! диссоциация октамаров в присутствии субстратов не происходит, если из среды удален М^+-необходимый кофактор креатинкиназной реакции; в то ае время диссоциация идет в присутствии аналога комплекса переходного состояния ( Miiner-white, watts 1971), имитирующего переходное состояние реакции. Аналог комплекса переходного состояния образуется в присутствии невзаимодействующей пары субстратов - ДДф я Кр - и некоторых анионов - CI" или нитрата, ко из ацетат-иона. При физиологических концентрациях адениловых аухлео-тидов степень диссоциации октамера зависит от соотношения концентраций Кр и КФ„ уменьшаясь с ростом концентрации К® (рис.8).

РТЪакт субстратов зависит от рН. При рН 6,0 (по сравнению о

20 ,w

Рис.

6. Влияние рН на распределение олигоыерных форм ККЦ из

грудной мышцы голубя (А) и сердца быка (Б). Градиенты сахарозы 7-20% содержали 0.2М КС1, 0,25 м& ДТТ и 0,0511 одного из следующих буферов: а,б - ИЕя (рН 6,0 и 7,0 соответственно); в,г-трис-НС1 (рН 8,0 и 9,0 соответственно); д - глициновый буфер, рН 9,6. Средние данные из ^вух-пяти опытов. Исходная концентрация ККы,мкг/мл:

Рис.7. Влияние сиеси субстратов на распределение олигоыерных форм ККЦ из скелетной мышцы.

. Градиенты сахарозы 7-20$ содераа-ли 0,1211 KCl. 20 Uli трис-HClj pH 8,0, 4,5 mU ßgCI2, а также (б) -

- 0,1 мМ АДФ, 3 мМ АТФ, 10 utl Кр, 3 мн КФ. Исходная концентрация KKU- 320 мкг/ил.

к

С9 p. О)

6Û

40

g 20

5

Рис.8. Влияние соотношения КФ:Кр на распределение олигомерных форм ККЦ из сордца быка. Градиенты сахарозы 2-10$ содержали 0,1211 СНдСООК, 50 мМ ME s, рН

7,0, 0.25 мМ ДТТ, 10 мМ М9(СН3С0О)2, 3 мМ АТФ и указанные на оси абсцисс концентрации КФ и Кр. За 100$ принята доля . октамора и среде без субстратов.

) 5 10 15 20 м.4 КФ Исходная концентрация ККЦ -

20 15 10 5 0 мМ Кр - 333 икг/мл. рН 7,0) доля октамера увеличена при любом соотношении концентраций Кр и КФ. На ККЦ из грудной мышцы голубя эффект КФ выражен слабее, чем на ККЦ из сердца быка, и требует присутствия ионов CI". Мы установили, что Фн подавляет диссоциацию октамера под влиянием АТФ и высоких концентраций Кр, но маноо зффоктивно, чем КФ. Остальные исследованные нами регуляторы энергетического метаболизма (АМФ, НАД+, НАДН, цитрат) в физиологической концентрации и в более • высо:чх концентрациях но вгчяли на распределение олигомерных форм. Лактат, который в опытах Четвериковой и Розановой (Четверикова, ^озанрча 1983) ингибировал активность ККЦ сердца и скелетных мышц, также не влиял на распределение олигомерных форм. Подавно опубликованы работы ( MarCillat et al 1997 f Schlegel, Zurbriggen et al

1988), авторы которых на ККЦ из других источников подтвердили наши данные с влиянии рН и субстратов на распределение олигомерных фора фермента. Вероятно, чувствительность равновесия октаыоргз-х ди-иор к рН и присутствии субстратов' является общим свойством всех ККЦ.

С помощью метода голь-фильтрации мы установили, что происходящее во время хранения при 0° снижение активности ККЦ связано с накопленной малоактивного дииора, тогда как удельная активность октамера но изменяется * течение нескольких модель хранении при 0°. Полученные результаты свидетельствуют о тон, что снижение активности ККЦ во время хранения при 0° связано с потерей частью ssí-норов каталити'иской активности. Так как удельная активность октамера не изменилась, то, по-видкиоиу, иоактизныо диаеры утрачивает способность к ассоциации в октаыерц; очевидно, они представляют собой данатуу..рованиув форму ККЦ. Отношение моаду форыаии ч раствор j, вероятно, моано изобразить такой схемой: октамер^=г димер

(активный) —— динар (ноантивный). Необратимость последней стадии приводит к постоянному смещению равновесия октамер 5=-. активный димер и накоплению неактивного димера. Накопление димера чри хранении, наблюдали и другие авторы ( Hall et ai 1979, Schlegel, Zurbrlggen et al 1988).

4. Скорости взаимного перехода о...лгоидр1шх форм. Знание скорости взаимного перехода олигоморных форм важно как с практической точки зрения, так и для понимания физиологического значения этих переходов. То обстоятельство, что ним удалось поручить отчетливые пики димора и октаиера ККЦ при ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы, в ходе которого равновесие между формами нарушается вследствие их разделения и разведения, et .0 по собе свидетельствует, что скорость взаимного перехода форм невелика. Мы установили, что в отсутст-че субстратов взаимные переходы форм по« влиянием изменения pli также происходят медленно (Липская, Рыбина 1987). В этих опытах ККЫ из сердца и скелетных мышц проинкубировали в точение 15—7 3 ч при одном значении pH, а затем наносили на градионт плотности сахарозы с другим значением pH, отличавшимся от исходного на 2 од. В этих опытах время раздолония форм в градиенте плотности составляло б ч при темпоратуро 20°. По окончании ультрацентрифугирования распределение олигомерных форм фермента в гради-онте было значительно блико к распределению, характерному для исходного pH раствора фермонта, чоы для pH сахарозного градиента. Данные литературы ( Marcil'lat ot al 1987, Schlegel, Zurbrlggen et aijgggj показывают, что взаимные переходы олигомерных фори ККЫ из разных источников в отсутствие субс .-ратов происходит с разной скоростью м занимают от досятков минут до unoi„ix. часов. В то чее время диссоциация октачиров под влиянием субстратов происходит существенно быстрее, чем под влиянием pH. В наших опытах фермент обоих источников, проинкубированный при pH 7,4 без субстратов и нанесенный на градиент сахарозы, содержащий субстраты, дал симметричный пик димора. Вероятно, парврасщ ^деление форм под влиянием субстратов произошло, как только фермент бил ьииесон на градиент. Однако на основании эт.ос опытов нельзя было решить, происходит ли диссоциация под влиянием субстратов в течение минут или секунд. Ёолое детальное исследование этого вопроса описано в следующем разделе.

5. Кинотические свойства олигомерных форм. Когда мы подошли к решении дчнной задачи, кинетические свойства ККЦ из разных ис-

ючников в растворе уо были описаны рядом авторов ( 1Ia11 et al 1979, Saks et al 1980, »lu™ ot al 1983, Tanaka et al 1983, Basson et al 1985), однако оставалась неясной связь между этими кинетическими парамотрпми и олигомерным составом ККЦ. Трудность опроделонип кинетических параметров индивидуальных олигокориых форм ККМ связана с тем, что в растворе ККМ существует в видо равновесной смеси октамера и дииира. Кроне того, имеется неопределенность, обусловленная возможностью диссоциации октамера на димеры во вримн определения активности под влиянием присутствующих в среде инкубации субстратов. Таким образом, дли определения кинотичоских параметров октамера и динара надо было I) получить их в индивидуальном состоянии, 2) убедиться, что за время кинетического опыта не происходит хоти бы частичная диссоциация октамера на динары. В качестве препарата октамера использовали свежовыделеиную ККЦ из сордца быка, которая при рН 7,4 и концоктра:ги балка около 2 мг/мл содержит, по данным ультрацентри}>угирования в градкоито плотности сахарозы, 10-15;» димера. Для получения димора использовали преинкубацию ККЦ из сердца с насыщающими концентрациями субстратов, образующих аналог коиг.'икса переходного сос гонкий: АДФ и Кр в присутствии ионов Ci". В предварительных опытах ККМ в разной концентрации проинкубировали с этой смесью субстратов в течение 18-20 ч, a затем наносили на градиент плотности сахарозы без субстратов или подвергали гель-фильтрации в системе fplc , где олю-ирующий буфер также не содержал субстратп. Как мы пока '¡ли в предыдущем разделе, в отсутствие субстратов взаимные пароходы олиго-мерных форм происходят достаточно медленно, поэтому мы предположили, что картина распределения олиго..:ерных форм КК , полученная при разделении их в отсутствие субстратов, отражает равновесии между димером и октамером, существовавшее в исходном растворе ККЦ, н;.не-cen.iOM на градиент плотности сахарозы или на колонку дли гель-фильтрации. По результатам каждой опыта была рассчитано величина KÎMC Кз табл.2 видно, что величин-: Кдис , полученные двумя методами при разных концентрациях ККЦ, хорошо совпадают. Это служит подтверждением правильности сделанного выше предположения. Кдис октамера ККЦ из' сердца быка и грудной мышцы голубя в отсутствие субстратов оказались разными I,8'I0~i9M3 и 3,0'iO'^U3 соотаеютвенно. Сопоставление этих величин с данными табл.2 свидетельствует, что К,„„

Д il

октамера ККЦ из сердца быка на 5 порядков меньше К„ис октамар; ;ц грудной мышцы и что присутствие субстратов увеличивает ио на 2 порядка.

Таблица 2. Определенно Кдис для октамера ККЦ из сордца быка в присутствии субстратоп Lipskaya et al 1989)

Метод Щонцен-'Распподолоние ¡Концентрация

i ф°'рц' % ¡форм. м-юб

ЛОНИЯ !лЛ,,» I ■; I '—'■ '

¡цкг/мл |Д1Ш()Р j октаиир |дицир|октаиар

КДИС [Димер]

I 1100 26,0 74,0 3,30 2,3" 5,0

I 978 30,9 09,1 3,51 1,97 ' 7,7

I 550 36,2 63,8 2,31 1,02 2,8

п 398 52,0 48,0 2,40 0,56 5,9

п 140 78,0 22,0 1,27 0,09 2,9

среднее: 4,9 + 0,9

Примочанио: 1 - голь-фильтрация, П - ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы. ККЦ в указанной конц< трации проинкубировали при 0° в среде, содержавшей 0,2 U KCI, 20 мМ трис-HCl рН 7,4, 0,25 uU ДТТ, 0,5 АДФ, 3,3 ыМ М^СIg, 60 мМ Кр. Концентрации белка КК, определяли при 280 ¡ш, приняв А^о ■ Н,7 ( Blum et 1933).

ТОО

Используя найденную величину Кдис, 4,9»10~А'й , цы выводи уравнонио, устанавливающее зависимость пожду общей концонтраци! белка в препарате ККЦ из сердцо быка и содержание)! в ней дииорг О,127*10 А^ х Ч 10-2х »I, где А - общая концентрация болка 1 ыкг/мл, х - доля димера в % (при расчетах молекулярную массу с; единицы ККд принимали равной 43000 Да). Используя это уравнена можно путей подбора найти величину х при заданном значении Á и; рассчитать величину А яри заданной значении х. Уы нашли, что ei димор составляет 95$ всего белка, концентрация ККЫ равна 78 мкг/мл. Результаты расчетов были использованы при получении npi ратов димеров.

Длн определения времени диссоциации октамера были поставл'

ОПЫТЫ 1 Lipskaya et »i 1989), В КОТОРЫХ ККЦ В раССЧИТаННОЙ К01

центрации проинкубировали с субстратами в точение "разных проме;

коз времени. Реакцию диссоциации останавливали добавлением сви:

ulero бифункционального агента - ГА, затем пробы подвергали

электрофорезу в присутствии ДСН. Результаты опытов свидетельст:

ют о той, что в течение первых пяти кинут инкубации с субстрат картина распределения белковых полос в пробах не отличается от

- 23 -

троля-, где сшивали октамер ККЦ в отсутствие субстратов; что дис-иация октамара в присутствии субстратов становится заметной чс-30 мин инкубации и практически завершается чарез 60 мин. Анало-ныо результаты были получоны в опыте, где ККЦ проинкубировали в де кинетического опита, содержавшей 500 мкМ АТО и 25 мМ Кр, а ем подвергали быстрой гель-фильтрации в система HPU3. Реакция социации октамера являет ci; иономолекулярной; как известно, в омолзкуллрних реакциях вроыя превращения одной и той so доли ве-тва на зависит от ого исходной концентрации (Корншх-Боуден 9). В наших кинетических опытах мы регистрировали гктивность в течение первой минуты поело добавления фермента в среду икании; таким образом, мы сделали вывод, что диссоциация под яниам субстратов происходит достаточно'медленно по сражению с маном кинетического опыта, то есть за время кинетического опыта амер не диссоциирует на димеры. Качественные данные других ав-ОВ ( Harcillat et al 1987, Schlegel, Zurbriggen et al 1988) детольствуют о том, что диссоциация октамера ККЦ из других иски- эв под влиянием субстратов также происходит в течение минут.

Ha рис.9 приведены полученные в одном из опытов кинетические зыо для октамера и димара ККЦ 'в прямой 'реакции. Аналогичного а кривыо были получоны и для обратной реакции. При построении отичоских кривых использовали графический метод наименьших дратов (Шонк 1972). Суммарные данные содержатся -з табл.3. Зид-что октамар и динар ККЦ в растворе подчиняются уравнению Ми-лиса-Мантен и что кинетические кривыо пересекаются на продолг.р-оси абсцисс. Это соответствует быстроравновосному механизму езависимыц присоединенном субстратов, когда самой медленной дней является превращение тройного фермент-субстратного комп-са в тройной ферионт-продуктный комплекс. Таким образом, ката-ичаский аоханизм раакции, осуществляемой октамаром и динаром из сардца быка, соответствует каталитическому механизму,, пай-ному для цитоплазматичоской КК ( Morrison, James 1965, tts 1973) и для ККЦ из сердца крысыЧ Saks et al 1975). инкубация октамера только с АДФ или Кр на влияла на кинотичас— параметры октамера. Рассчитанные по уравнению Холдзйна конс-гы равновесия креатишшназной реакции (0,016-0,017) хорощо тветствуют величине 0,01, найденной в равновесных опытах при 7,4 ( Nichai et al 1961).

[М^АТФ] /гГ,. мин-мг

[кр}//..

шн-мг

X "ТТбО" [М^АТф] „ мкМ

10 20 [Кр],. мМ

[н9т] /ту .

мин-мг

[кй /у',. мин. иг 400 Г

м'

... ——^

[МчАТр] ,. мк1| []<р] , мМ

Рис.9. Кинетический кр'ивие для октамера (а,б) и димора (в,г) КК, а,в - первичные графики зависимости ШдАТф1/ V от 'МдАТф1

при следующих фиксированных клщентрациях Кр (мМ): а -5(1) 10(2), 243); в - 3(1), 7,5(2), 20(3). б.г - вторичные графики завиг -мости IКр I / V от I Кр1 . V рассчитано из перосочоний ординат, нп первичных графиках а или в соответственно.

Таблица 3. Кинотическио параметры октамера и дицора ККЦ из сердца быкак ( Llpskaya et al I989)

Параметр

Размерность

Окгаиер 1 (4) * 1 Дим ер (3)

82+4 42+5

Р <0,01

8,1+0,9 3,4+0,8

Р <0,02

61+9 60+5

43+8 17+0,6

Р <0,05

0,68+0,06 0,23+0,04

Р <0,01

162+16 III+I0

Р«0,05

0,017+0,0015 0,016+0,0017 .

Кц(МдАТФ) Кц(Кр)

V

пр

Кц(Н9АДФ)

КЦ(КФ)

v обр

мкМ мМ

ынг-экв Н+ мин.мг Оилка

мкМ мМ

мкг-экв 1г мин.мг оелка

каа

Упр.Км1М9АДФ)Км(КФ)

vo6p Кц(й9АТФ) Кц(Кр)

к Статистический анализ результатов проводили, используя t-тест по Стюдонту. Значонип Р < 0,05 считали статистически достоверными. В скобках указано чиоло опытов. Белок определен при 280 ни (А^о = 11,7; Blum et al 1983).

6. Изоэлоктрические точки олигоморных форм. Исследования, предшествовавшие нашей работе ( Jacobs 1974, Белоусова и др. 1983) показали, что изоэлектрическая точка ККЦ из сордца быка лежит в области pH 9,2-9,6, однако было но известно, к каким олиго-мерным формам относятся эти значения. Для определения изоэлектри-ческих точек олигоыерных форм мы использовали ыогод ИЗФ в трубочках ПААГ. Чтобы идентифицировать олигомерные формы ККЦ, необходимо было провести ИЭФ в условиях, когда преобладает та или иная форма фермента. Для решения поставленной задачи мы воспользовались чувствительностью равновесия между димером и октамером к изменении pH, а также разной степенью диссоциации октамера KKU из сердца и скелетных мышц при низкой ионной силе, которая характерна для опытов с ИЭФ. Были подобраны 3 смеси аыфолитов так, чтобы исходный

рН их был равен 6,0, 7,5 и 9,6; эти смоси после проведения ИЭФ создавали градиенты рН, охватывающие области рН 3,0-9,6, 3,9-10,4, 7,6-10,9 соответственно. ККЦ'помещали в сноси амфолитов до полимеризации голой; при этом мы ожидали, что при рН 7,5 основной оли-гомерной формой ККЦ из грудной мышцы станот димер, а ККЦ из сердца - октамер; что при рН 9,6 в ККМ из сердца увеличится содержание димора, a при рН 6,0 в форменто из грудной мышцы появится октамер. Используя указанный подход, мы нашли следующие величины pi для октамера и димора ККЦ из сердца и сколотных мышц: 8,93, 8,91 и 9,^7, 9,56 соатвотственно (Липская и др. 1987). Таким образом, изоэлоктричоские точки обеих олигоморних форм ККЦ ложит при щелочных значениях рН и практически совпадают для соответствующих форм из двух источников. Нодавно были определены изоэлоктричоские ТОЧКИ олигоморных форм ККМ ИЗ сордца кролика И СВИНЬИ ( Quemeneur et ai 1989); они оказались равны 8,8 и 8,2 для октамера и димора соответственно. По данным других авторов, р! димера ККЦ из сердца крысы равен 9,4 (Кузнецов, Сакс 1986), а из сердца человека - 6,8 ( Blum et ai 1983). Воронтно, большой разброс в воличи— нах р! дицера связан с неустойчивостью его информации в растворе.

Завершая раздол о свойствах олигоморных форм ККЦ в растворе, следует еще раз подчеркнуть, что важной чертой исследованных нами воздействий является их обратимый характер, и это служит убедительным доказательством того, что димор и октамор ККИ в растворе находятся в состоянии динаиичоского равновесия. Так, диморы, образовавшиеся в среде с низкой ионной силой, реассоциируют при повышении ионной силы раствора (рис.5), эффект рН также обратим; степень диссоциации октамера при образовании аналога комплекса переходного состояния (табл.2) и в отсутствие субстратов зависит от концентрации белка и определяется константой равновесия реакции диссоциации. Эти результаты противоречат предположению ( "ail et ai 1977), что димарц ККЦ объединены в октамере s- s -связями.

1У. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ОЛИГОМЕРНОЙ ФОРШ ККЦ, СВЯЗАННОЙ С

МЕМБРАНАМИ МИТОХОНДРИЙ, И ВЫЯВЛЕНИЕ РАЗЛИЧИЙ В СВОЙСТВАХ УЧАСТКОВ ЛОКАЛИЗАЦИИ ФЕР1ШТА НА МЕМБРАНАХ Изучив олигомерный состав и свойства ККЦ в растворе, мы исследовали далее олигоморные формы ККЦ, связанные с мембранами. Определение изоэлектрических точек димора и октамора указывало на то, что обе эти формы могут связываться с момбранааи, однако

мы допускали, что связывание с мембранами может изменить олиго-мерныИ состав ККМ. Например, можно было предположить, что взаимодействие с мембраной стабилизирует какую-то промежуточную форму форманта, например, титрямер, или что насколько октаморов на мембране объединяются в болаа высокомолокулярнио агрогаты подобные

тем, KOTOpue образуются При ВЫПадоНИИ ККЦ В ОСаДОК ( Farrell ot al 1972). Можно било предположить, далее, что димор и сктамор - зто те формы, в которые ККЦ мгновенно ироврамается при ее солюбилизации с мембраны. Для идентификации связанных с мембранами олигомерных форм ККЦ использовали "копиречно-садиаюций" бифункциональный реагент - ГА, который при нейтральных значениях рН нообратимо сшивает "Hg-rpynnu в точеиие секунд, что позволяет фиксировать определенное состояние MU,Убран митохондрий И форманта ( Deamer et al 1967, Monsan et al 1975, Quiocho 1976). Кроме того, ГА MO-жит сшивать NHg-rpynnu, находящиеся на разном расстоянии, так как в свивании принимают участие мономеры, димерц и триморы ГА. ' Сшивание проводили в 0,25М сахарозе, когда вся КК(1 связана с мам-брочаии митохондрий. Мы полагали, что свивание должно стабилизировать олигоморнио формы, присутствовавшие на мембранах в момент сшивания, даже если в отсутствие сшивания'они но устойчивы при переходе в раствор. После сшивания митохондрии отмывали от ГА, момбраны разрушали ультразвуком в 0,25М KCI и осаждали их при 230000 ч. Активность ККЦ распределялась между осадком и суперна-тацтом приблизительно поровну, тогда как в отсутствие сшивания 95/á активности ККу экстрагировалось из митохондрий. Супернатантц концентрировали, и анализ присутствующих в них олигоморных форм проводили с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Анализ показал { Lipskaya, Troflmova 1989), что при рН 7,4 в экстракте из митохондрий посла сшивания ГА присутствуют то же олигомерныо формы, что и в контрольном экстракте, с константами седиментации около 5 s и 12 s , то ость димор и октдшф» При нанесении па градиент плотности сахарозы, содержащий субстраты реакции, KKU в контроле полностью диссоциировала до димара, тогда как фермент после сшивания диссоциировал лишь частичное Очевидно, это связано с тем; что часть октамеров оказалась неспособной к диссоциации в результате сшивания субъединиц, которое произошло, когда фермент был связан с мембранами митохондрий. Праин-куб^ция при рН 5,5 приводила в переходу части динара в октамер,

•причем эта ассоциация осуществлялось без видимой разницы между контрольным экстрактом и экстрактом поело сшивания ГА. Если бы на мембранах в момонт сшивания присутствовал димор, то образование сшивок на его поверхности, вероятно, должно было бы затруднить ассоциацию диморов в октамеры (Муропац, Наградова 198'0. Взроятно, димор, обнаруживаемый в градиента плотности сахарозы, образовался из неполностью сшитого ГА октамора ужо после порехода последнего в раствор во время ультразвуковой обработки митохондрий и последующего ультрацентрифугирования в градиенте плотности. Можно было предположить, что сшитые комплексы октамеров могут осаждаться при 230000 я. Однако ступенчатое центрифугирование суспензии митохондрий после ультразвуковой обработки показало, что распределение активности ККЦ в осадках соответствует распределению маркерного фермента внутренней мембраны-цитохромоксидазы; то есть в осадок уходит та часть ККЦ, которая связана с мембранами митохондрий. Кинетический анализ показал, что та часть ККЦ, которая при ультразвуковой обработке не экстрагируется из митохондрий, по своему олиго-ыерному составу на отличается от экстрагируемого фермента, поскольку как суммарная фракция, тан и ноэкстрагированнап ККЦ обнаруживали сложную кинотику (см. рис. 4 б), причем константы Михаэлиса для субстратов у части и целого совпали. Таким образом, эта часть иашой работы дала доказательства того, что на мембранах митохондрий в иомант сшивания присутствовал октамер. Нам на удалось обнаружить признаки присутствия каких-либо других олигомерных форм.

Основываясь на наших предыдущих исследованиях, которые показали, что в растворе в срода с высокой ионной силой равновесие между октамором и динаром ККЦ устанавливается медленно, мы провели анализ содержания олигомарных форм ККЦ в экстракта из митохондрий (без предварительного сшивания ГА) методам быстрой гель-фильтрации в системе НРиС: Опыты показали, что экстракт, подвергнутый анализу сразу после ого получения, содержит только октамвр ККи, а через 22 ч хранения в нам появилось некоторое количество динара, соответствующее равновесному распределению двух форм в раствора. В наших опытах экстракт из митохондрий содержал 80-85$ активности ККЦ, поэтому шшю заключить, что по крайней мере 80-85$ ККЦ в митохондриях, выделенных в 0,25М сахарозе, присутствуют ь вида октамора. Одновременно к аналогичному выводу пришли французские исследователи ( МагсШаъ а1 1987, циетепеиг еъ а1 1988),

использовавшие другио матодичоские подходы. Таким образом, олиго-мерными формами ККЦ, которые могут присутствовать в нативных митохондриях как в свободном, так и в связанном с мембранами состоянии, являются только октамер и димар.

Почему связывание октамера с мембранами митохондрий приводит к тому, что субъодиницы, которые в растворе были кинетически равноценными (рис.а, рис.9,а), утрачивают это свойство? Как ш ви-доли, октамер ККЦ обладает квазисферической структурой, построенной из двух пленарных тетрамеров. Вероятно, взаимодействие о мембраной осуществляется чероз один из тотраыиров, что и приводит к появлению различий в кинетических свойствах субъединиц связанных и не связанных с мембраной.

Для получения доказательств, что та часть ККЦ, которая посла обработки ГЛ не удаляется из митохондрий, пришита к мембранам, исследовали влияние ультразвуковой обработки на содержание в сшитых ГА митохондриях аденилаткинази и малатдегидрогеназы - маркерных, ферментов мижмомбраиного пространства и ыатрикса соответственно. Опыт" показали, что сшивание ГА практически по влияет на виход м&. иерных ферментов. Аналогичные результаты были получены при разрушении момбран высокими концентрациями дигитонина. Таким образом, два совершенно различных по своей природе способа разрушения момбран митохондри!) после обработки ГА дали сходящиеся результаты относительно содержания ККЦ в осадке мембран. Трехкратная последовательная экстракция ККЫ с помощью ультразвука в. 0,2511 KCl показала, что хотя третий супарнатант практически но содержит ККЦ, активность фермента в осадко остается высокой. Вся совокупность' приведенных опытов свидетельствует, что повышенное содержание ККЦ в осадке митохондрий посла их обработки ГА не связано с существо- . ваниом физических барьеров, препятствующих переходу фермента в раствор, а обусловлено пришиванием KKU к момбранам. Сшивание ККЦ одной и той же концентрацией ГА в течение разных промежутков времени, а также сшивание с помощью увеличивающихся концентраций ГА в теченио постоянного времени показало, что максимальное количество фермента, которое может быть пришито к момбранам, составляет '»5-50$ всей присутствующей в митохондриях ККу. Неполное пришивание ККЦ к мембранам не было обусловлено разной доступностью отдельных участков связывания фермента для сшивающего реагента, так как предварительная гипотоническая обработке, вызывающая набуха-

ии митохондрий и разворачиииние мембран нрист, но увеличивала .■•зле пришиваемой 1СКЦ. Учитывая, что в условиях эксперимента с мембранами митохондрий была связана только одна олигоморнан форма ККЦ (октамор), что связи, образуемые ГА, устойчивы,что все участки связывания ККЦ доступны для сшивающего реагента, мы пришли к заключению, что неполное пришивание формонта к мембранам обусловлено том, что участии связывания различаются по своему окружению. Напри* мор, это могут быть участки, расположенные в кристах и на поверхности внутренней мембраны между кристами. Электронно-микроскопические работы действительно обнаруживают ККЦ в соответствующих участках митохондрий ( ваьа а а1 1976, Левицкий и др. 1977); по мнению Шестранда, строение мембран крист, гдо расположены ферменты системы окислительного фосфорилирования, резко отличается от строения внутренней мембраны между кристами ( э^зйгапа 1978). Противоречит ли этот вывод представлению о связи ККЦ с кардиоли-пином? Очевидно, нот. Расстояние между функциональными группами в мономере ГА равно 6,1 8 (Фридрих 1986). Имеются доказательства

ТОГО, ЧТО В СШИВаНИИ участвуют В ОСНОВНОМ ТриИврЫ ГА ( Мопзап et а:

1975, Ои1ес1ю 1976). Таким образом, использование ГА позволяет сшить ККЦ с молекулами, но взаимодействующими с ной непосредственно, и таким образом проанализировать окружение фермента на моыбра-не. Вероятно, в сшивании могут участвовать как мембранные белки, так и содержащие аминогруппы фосфолипиды мембран.

В раздоло 1 ыы показали, что АТФ, образованный в матриксе митохондрий во вромя окислительного фосфорилирования, прежде чои попасть в активный центр ККЦ, смешивается с АТФ среды. Позднее было показано, что при более низких, чем в наших опытах, концентрациях АТФ в среда ( < 100 мкМ) ККЦ использует хотя и не исключительно АТФ, синтезированный в матриксе митохондрий, но все же использует его в большей степени, чем АТФ среды. В связи с этим представление о тесном структурном взаимодействии ККЦ и ПАН было заменено представлением о существовании в ыожмембранном прос ран-стве ограниченного нрпужной моыбраной минрокоылартыонта для аде-1ШЛОВЫХ нуклеотидов ( Ег1скБОП-Л/11йапеп ей а1 1982). БЫЛО ПОКЗ-зано, что вклад в синтез КФ молекул АТФ, поступающих в активный центр ККЦ непосредственно с ПАН, и вклад со стороны ККЦ в переносимый транслоказой АДФ ( вагЬоиг а1 1984) зависит от концентрации АТФ или АДФ в среде; экстраполяция концентрации этих веществ в среде к нулю дала максимальный вклад, равны!) 50$. В связи

с этим Барбур и соавторы предположили, что в митохондриях сердца в непосредственной близости от ПАИ находится только около 50/» молекул ККЦ. Описанные выше опиты с пришиванием ККЦ, которыо показали существование двух типов участков локализации ККЦ на мембране, являются веским аргументом в пользу правильности этого предположения.

Однако наши результаты противоречат представлению о локальной концентрации аденилових нуклоотидов как эффективном регуляторе активности ККЦ в физиологических условиях. Действительно, сопоставление найденных нами кинетических параметров олигоморних форм ККЦ в растворе и в связанном с мембранами состоянии с описанными в литературе константами Михаэлиса для МдАТФ (76-100 ыкМ) и Кр (6-7 ыЫ) во время ОКИСЛИТОЛЬНОГО фосфорилирования ( Bossman, Fonio 1966, Jacobus, Lehninger 1973, Erlckson-Viltanen et al 1982) ПОКЭ-зывает, что эти параметры очень близки для ККЦ из разных источников и совпадают с параметрами октамара в раствора (табл.3). Эти результаты свидетельствуют, что во время окислительного фосфорилирования октамор КН переходит с мембран митохондрий в ыежмомбран-ное пространство. Вероятно, при более длительном воздействий субстратов, чом в условиях кинетического опыта, октамор может частично диссоциировать до димера. Из табл.3 видно, что константы Михаэлиса для МдАТФ и МдАДФ у обоих олигоморних форм ККЦ малы и соизмеримы. В физиологических условиях стационарная концентрация АТФ в цитоплазма равна 5-10 мМ, а стационарная концентрация АДФ по крайней норе в 100 раз меньше ; jacobus 1985, vaech et ai 1979). В связи с этим представляется, что в физиологических условиях активный цонтр ККЦ будет насыщен АТФ и создание локальных концентраций адениловых нуклеотидов вряд ли сможет существенно повысить активность ККЫ. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что локальные концентрации аденилових нуклеотидов вряд ли играют существенную роль в регуляции активности ККЦ в физиологически условиях. С другой стороны, стационарные концентрации АДФ и. АТФ в клотко соизмеримы с Кц и KL соответственно для этих вещоств у ПАН ВО время окислительного фосфорилирования ( jacobus 1985), поэтому присутствие высокоактивной ККЦ в цежыомбранноы пространство митохондрий, создающее там болео низкую концентрацию АТФ и более высокую концентрацию АДФ по сравнении с теми концентрациями, которыо были бы в отсутствие ККМ в мекмембранном пространство, должно значительно повышать скорость процесса окислительного фоо-форилировапия, для которого порокос адениловьк нуклоотидов транс-

локазой является стадией, вносящей большой вклад в контроль дыхания' митохондрий ( Tager et al 1983). Таким образом, полученные лани результаты указывают еще на одну важную функцию НКЦ, которая заключается в том, чтобы поддерживать в межмембранноц пространстве митохондрий определенный уровень отношения концентраций ЛТФ и АДФ, обеспечивающий возможность синтеза АТФ в митохондриях в условиях, когда стационарная концентрация АДФ в цитоплазме низка.

Общее заключение

Как отмечалось во введении, для более глубокого понимания мох..:.измов функционирования ККЦ необходимо изучить оо физико-химические свойства, а также исслодовать разные возможности регуляции активности этого фермента. В роаультато проведанного изучения взаимодействия ККц о мембранами митохондрий установлено, что ККЦ связана с мембранами силами электростатического взаимодойствия; полу-^ чены новые данные, совокупность которых доказывает, что связь с мембранами осуществляется чарез фосфолипиды. Количоствннныа параметры исследованных взаимодействий евидотольствуют, что обратимая связь ККЦ с мембранами возможна в физиологических условиях и сопровождается измененном активности фермента. Исследование свойств ККЦ в растворе позволило уточнить ео олигомерный состав, получить новыа данные, касающиося четвертичной структуры ККЦ, факторов, регулирующих взаимные переходы олигомерных форм, изучить их кинетические и некоторые другие свойства. Эта часть работы также дала доказательства, что взаимные переходы олигомерных форм могут быть регулятором активности фермента in vitra Установлено, что связывание KKU с мембранами митохондрий на приводит к появлению новых олигомерных форм. Сопоставление свойств ККЦ, выделанных из митохондрий сердца и скалатных мышц, указывает на то, что относительный вклад олигомерных форм в активность ККЦ in vitro , вероятно, мокат быть различным в митохондриях из разных тканой. Таким образом, результаты исследования открывают новыа пути регуляции ак- . тивности ККМ и расширяют представления о механизма функционирования этого фермента.

ВЫВОДЫ

,1. КК связана с мембранами силами электростатического взаимодействия.

2. Структурными компонентами мембран митохондрий, с которыми связана КК„, являются фосфолипиды.

3. Разработан единый для митохондрий сердца и скелетных мышц :од получения ККЦ в очищенной виде. Проведено сравнительное изу-1ие свойств очищенного фермента из двух источников.

4. Оба фермента в растворе представлены равновесной смесью тс олигомерких форм, димера и октамера; октаиер имеет квазисфе-юскую структуру; электростатические взаимодействия не играют (ествонной роли в объединении димаров в октаморы.

5. Увеличение рН, а также каталитическое превращение субстра-I смещают положение равновесия в сторону димера. При физиологя-!ких концентрациях адениловых нуклеотидов диссоциирующее дейст-

! субстратов зависит от соотношения концентраций Кр и КФ, от юутствия Фн и рН. Определены константы диссоциации октамера в них экспериментальных условиях. ■

6. Изоэлонтрические точки димера и октамера близки для фертов из двух источников и лежат в щелочной области рН.

7. Определены кинетические параметры октамора и димера очи- ' ной ККЙ из митохондрий сердца.

8. В митохондриях сердца с мембранами связан октаиер ККЦ; охондрии содержат два типа учоитков локализации ККЦ, различаю-ся сзоим окруасениом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Липская Г.В., Темпл В.Д., Белоусова Л.В., Молокова Е.В. ледовонио взаимодействия митохондриальной формы- креатинкиназы <!мбранами митохондрий // 4 Всесоюзный биохимический съезд:

. научн. сообщен. - М.: изд. Наука, 1979. - Т.2..- С.44.

2. Липская Т.Ю., Темпл В.Д., Белоусова Л.В., Молокова Е.В., ина И.В. Исследование взаимодействия митохондриальной формы атинкиназы с мембранами митохондрий // Биохимия. - 1980. - Т.

- С. 1155—1166.

3. Липская Т.Ю., Темпл В.Д., Белоусова Л.В., Молокова Ь'.В. имодойствие между кроатинкиназой митохондрий сердца и окисли-ьным фосфорилированиза // Биохимия. - 1980. - Т.45. - С.1347-51.

4. Молокова Е.В., Рыбина И.В., Липская Т.Ю. Об электростатикой природе взаимодействия креатинкиназы о мембранами митохонд-

// I Всесоюзный биофизичесний съезд: Тез. докл; стенд.сообщен. ., 1982. - Т.4. - С.22.

5. Липская Т.Ю., Молокова E.B. Проблама связи креатинкиназы со структурами митохондрий. - Биохимия и биофизика мышц. - ü.i изд. Наука, 1983. - С.118-129.

■6. Липскря Т.Ю., Молокова t.В., Рыбина И.В.. Кедишвили Н.Ю. Свойства митохондриальной изоформы кроатинкиназы // Всесоюзн.нонф. по применен, ферментов в биохимич. анализах: Тез. сообщен. - Вша нюс, 1984. - T.I. - C.I00-I0I.

7. Кедишвили Н.Ю., Рыбина И.В., Липская Т.Ю. Свойства олигоморных лорм митохондриальной кроатинкиназы // 1б-я Конференция ФЕБО: Тез.докл. - М., 1984. - C.I86.

8. Липская Т.Ю., Рыбина И.В., Кедишвили Н.Ю., Каленова М.Е. Факторы, влияющие ча взаимные переходы олигсмерных форм иитохондриальной кроатинкиназы // 8-ой Объединен, симп. биохимич. обгоств СССР-ЩР: Тез.докл. - Рига 1985. - С.107.

9. Липская Т.Ю., КодшнвиДи Н."., Каленова М.Е. Гзловия взаимного парохода олигоморных форм митохоидриал..юй кроатинкиназы сердца И Биохимия. - 1985. - Т.50. - C.157I-158I.

10. Липскан Т.Ю., Каленова I' Î., Рыбина И.В., Кедишвили Н.Ю. Сравнительная характеристика свойств олигоморных форм м-тохокчри-альной кроатинкиназы сердца и сколотных мышц // 5-я Всесоюзн. конф'. по биохимии мышц: Тез .докл. - Тбилиси, 1985. - С.66-67.

11. Липская Т.Ю. Проблема рогуляции активности кроатинкиназы :итохондрий // 5-ый Всосоюз . биохим. съозд: Тез. симпоэ.докл. -- М.: изд. Наука, 1985. - С.64-65.

12. Липская Т.Ю. Физиологическая роль креатинкиназной системы и проблема рогуляции активности митохондриа зной кроатинкиназы // Биологич. науки. - 1986. - Т.9. - С.5-14.

13. Липская Т.Ю., Рыбина И.В., Кедишвили Н.Ю., Трофимова М.Е. Свойства митохондр"чльной кроатинкиназы, позволяющие идентифицировать еа в смеси с другими формами кроатинкиназы // 5-нй Всосоюзи. симп. по мед.энзимол.: Тоз.докл. - Махачкала, 1986. - С.139.

14. Липская Т.Ю., Рыбина И.В. Свойства "реатинкиназы'из митохондрий сколотных и- ц // Биохимия. - 1987. - Т.52. - С.697-707.

15. Липская Т.Ю., Борисова Т.Д., Трофимова М.Е., Кедишвили Н.Ю. Определение изодле'ктрических точек олигомерных форм митохонд-pr-льной креатинкиназы // Биохимия. - 1987. - Т.52. - С.1512-1522.

16. Липская Т.Ю. Проблема регуляции активности креатинкиназы митохондрий. - Регуляция сократительной функции и метаболизма миокарда. - Ы.: изд. Наука, 1987. - С.136-163.

17. Липская Т.Ю., Трофимова U.E. Влияние связывания с мембранами на свойства йитохондриалъной креатинкиназы // б-ой Всвсоюзн. зимп. по шшонврн. энзймол.: матар. - Вильнюс, 1988. - T.I. -С.30--31.

18. Липскан Т.Ю., Трофимова ü.E., Кедшивили II.Ю., Моловова S.B. Возможные пути влияния ишемии на митохондриальную креатинки-(азу // Научн. нонф. Биохимия медицина: Тез.докл. - Л., 1988. -

■ c.w-izz.

19. Трофимова М.Е., Липская Т.Ю. Кинетические свойства димера октамера митохондриальной креатинкиназы//10-ый Объединен, симп.

иохимич. обществ СССР-ГДР: Тез. докл.-Ташкент, 1989.-С.

20. Lipskaya T.Yu., Temple V.J., Belousova L.V. , Holokova E.V. >tudy on the interaction between the creatine kinase of mitochondria ind adenine nucleotide translocase// 5 Joint Symp. Biochem. Soc. ;dr-USSR: Abstr. - Weimar, 1979. - P. 44.

21. Lipskaya T.Yu., Temple V.J., Belousova L.V., Molokova E.V., tybina I.V. Studies on the interaction of mitochondrial creatine .lnase with the mitochondrial membrane// J.Mol.Cell. Cardiol, - 1980. • V. 12. - Suppl. 1. - P. 95.

22. Lipskaya T.Yu., Belousova L.V., Temple V.J., Rostovtzev A.P. lolokovs E.V., Rybina I.V. Mitochondrial creatine kinase: physico-hemical and functional properties// I Leonor Michaelis Fvmposium ;ultiple Formen v n Enzymen: Kurzref. - Weimar, 1980. - P. 49.

23. Lipskaya T.Yu., Belousova L.V. , Temple V.J., Rostovtzev .P., Molokova E.V., Rybina I.V. Mitochcyidrial creatine kinase: phy-ico-chemlcal and functional properties. - Multiple Forma of Enzymes. . Leonor-Michaelis-Symposium (Scheuch D.W., Haschen R.J., Hofman E., ds). - Berlins VEB Verlag Volk und Gesundheit, 1982. - P.220-236.

24. Lipskaya T.Yu., Temple V.J., Belousova L.V., Molokova E.V., ybina I.V. Studies on the interaction mitochondrial creatine kinase ith the mitochondrial membrane// Adv. Myocardlol. - 1983. - V. 3.

P. 597-611.

25. Lipskaya T.Yu., Molokova E.V. The kinetics of free and mem-rane-bound mitochondrial creatine kinase// Special FEBS Meet. Cell inct. Different.: Abstr. - Athens - Greece, 1982. - P. 212.

26. Lipskaya T.Yu. The problem of mitochondrial creatine k' iase Jtivity regulation. - Regulation of Myocardial Contractile Function id Metabolism. - Lond: Harwood Academ. Publ., 1989. - P.

27. Lipskaya T.Vu., Troflmova M.E. Study on heart mitochondrial creatine kinase using a c^oas-linklng bifunctional reagent.

I The binding involves the octameric form of the enzyme// Blochem Internat. - 1989. - V. 18. - P. 1029-1039.

28. Lipskaya T.Yu., Troflmova M.E. Study on heart mitochondrial creatine kinase using a cross-linking bifunctional reagent. II.The binding Bites for creatine kinase octamer on mitochondrial membranes have different properties// Blochen). Internat. - 1989.

- V.' 18. - P. 1149-1159.

29'. Lipskaya T.Yu., Molneeva N.S., Troflmova M.E. The quater nary structure of bovine heart mitochondrial creatine kinase// Bi ehem. Internat. - 1989. - V. 18. - P. 1161-1171.

30. Lipskaya T..Yu., Troflmova M.E. , Moiseeva M.S. Kinetic properties of the octameric and dimerlc forms of mitochondrial cr tine kinase and physiological role of the enzyme// Biochem. Inter nat. - 1989. - V.

Автор глубоко благодарен академику С.Е. Северину и коллекти кафедры биохимии биологического факультета МГУ за создание благе приятных условий работы, своим коллегам - В.Д. Темплу, Е.В. Ыолс новой, И.В. Рыбиной, Н.Ю. Кедишвили, Ы.Е. Трофимовой, Т.А. Борис вой, Н.С. Моисеевой, в рааное время принимавшим участие в работе а также Л.В, Белоусовой, А.Н. Бессонову, И.Д. Бобрускину и В.Я. Стельыащуку за сотрудничество при выполнении данной работы.