Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные группы активного центра и механизм действия глутаминсинтетаз листьев гороха

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Акентьева, Наталья Павловна

ОБЗСР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. СТРУКТУРА И КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗ.II

1.1. Четвертичная структура глутаминсинтетаз.II

1.2. Аминокислотный состав глутаминсинтетаз

1.3. Вторичная структура глутаминсинтетаз.

Глава 2. СТРУКТУРА АКТИВНОГО ЦЕНТРА ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗ

2.1. Функциональные группы активного центра глутаминсинтетаз

2.2. Пространственная организация, локализация и число активных центров глутаминсинтетаз.

Глава 3. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗ.

ЭКСПЕРЙМЕНТАОЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТ0.Щ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Объект исследования и условия выращивания опытного материала.

4.2. Методы определения активности. а) гидроксаматный метод. б) фосфатный метод.

4.3. Определение белка.

4.4. Аналитический электрофорез в полиакриламидном геле

4.5. Метод скорости седиментации.

4.6. Определение аминокислотного состава фермента а) Гидролиз белка. б) Определение цистеина.

4.7. Метод кругового дихроизма.

4.8. Оцределение содержания двухвалентных металлов

4.9. Химическая модификация s Н-групп цистеина.

4.10. Определение констант ионизации субстратсвязывающих групп на основе изучения влияния рН на К^.

4.11. Фотоокисление фермента в присутствии метиленового синего.

4.12. Метод субстратной защиты фермента от ингибирования сульфгидрильными реагентами.

4.13. Ингибирование глутаминсинтетазы метионинсульфокси-мином.

4.14. Метод субстратной защиты глутаминсинтетазы от ингибирования метионинсульфоксимином.

4.15. Метод субстратной защиты фермента от тепловой инактивации.

Глава 5. ВДЦЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ИЗ ЦИТ030ЛЯ

И ХЛ0Р01ШАСТ0В ГОРОХА.

Глава 6. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ИЗ

ЦИТОЗОЛЯ И ХЯ0Р01ШАСТ0В ГОРОХА.

6.1. Оцределение аминокислотного состава глутаминсинтетазы из цитозоля.

6.2. Вторичная структура глутаминсинтетазы из хлоро-пластов гороха.

6.3. Содержание металлов в молекуле глутаминсинтетазы из хлоропластов гороха.

Глава 7. КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ИЗ

ЦИТОЗОЛЯ И ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА.

Глава 8. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ЦИТОЗОЛЯ И ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА.

8.1. Химическая модификация SH-групп цистеина сульфгид-рильными реагентами.

8.2. Определение констант ионизации субстратсвязывающих групп на основе изучения влияния рН на

8.3. Защитное действие субстратов и кофакторов от ингибирования глутаминсинтетазы из цитозоля и хлоропластов гороха сульфгидрильными реагентами

Глава 9. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ИЗ ЦИТОЗОЛЯ

И ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА.

9.1. Изучение механизма действия глутаминсинтетазы из цитозоля и хлоропластов гороха с использованием специфического ингибитора - метионинсульфоксимина

9.2. Изучение механизма действия глутаминсинтетазы из цитозоля и хлоропластов гороха методом стационарной кинетики.

9.3. Защитное действие субстратов и кофактора от тепловой инактивации глутаминсинтетазы из цитозоля и хлоропластов гороха

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональные группы активного центра и механизм действия глутаминсинтетаз листьев гороха"

Растительные организмы обладают уникальной способностью усваивать неорганические формы азота и использовать их для синтеза аминокислот и белка, В настоящее время цроблема растительного белка и исследование процессов, лежащих в основе его синтеза приобретает особую актуальность в связи с задачами, поставленными партией перед народом по выполнению Продовольственной программы.

Растительный мир является основным источником кормового и пищевого белка на нашей планете. Главным условием, необходимым для синтеза белка, является обеспечение растений азотом. Именно этим определяется вся теоретическая и црактическая важность исследования ферментативных процессов, лежащих в основе усвоения неорганических форм азота растениями /Кретович, 1971,1972/.

В своих классических исследованиях Прянишников /Прянишников, 1945/ подчеркивал, что цроцессы образования азотсодержащих органических соединений в растениях цри питании любыми формами азота сводятся, в конечном счете, к ассимиляции аммиака. Так, нитраты и нитриты, составляющие большую гасть потребляемого растениями неорганического азота, восстанавливаются до аммиака под действием ферментов нитратредуктазы и нитритредуктазы. Атмосферный азот, фиксированный клубеньками симбиотрофных растений, также восстанавливается ниарогеназой до аммиака, который поступает в ткани растения-хозяина, где и происходит его ассимиляция.

Работами ряда исследователей /Кретович и соавт.,1964; Евстигнеева и соавт.,1970/ установлено, что одним из первых продуктов усвоения аммиака в растительной клетке является глутамин, реакцию образования которого катализирует фермент глутаминсинтетаза /ГС; К.Ф.6.3.1.2/.

Известно, что глутамин является центральным метаболитом и иоточником азота для биосинтеза многих аминокислот, нуклеотидов, глюкозамина, карбамоилфосфата, НАД и других соединений.

Глутамин, образующийся под действием ГС, служит субстратом для образования глутаминовой кислоты в реакции, катализируемой глутаматсинтазой / Miflin, Lea ,1976,1977; ГСТ, К.Ф. 1*4.1.13; 1.4.7. I/. По современным представлениям реакнии усвоения аммиака, последовательно катализируемые ГС и ГСТ, являются главным путем ассимиляции неорганического азота в растениях.

В связи с этим закономерно, что ГС различных организмов является аллостерическим ферментом и подвергается строгому и многообразному контролю метаболитами клетки / Hoizer et al ,1967; Кретович и соавт.,1976; Евстигнеева и соавт.,1974/.

В настоящее время установлено, что ГС сама выступает у ряда организмов в качестве индуктора и репрессора синтеза некоторых ферментов, в частности, нитрогеназы /streicher et al ,1974/ и глутаматдегидрогеназы / Magasanik ,1977/.

В связи с этим изучение различных уровней структурной организации ГС, ее активного центра и механизма действия имеет значение не только для понимания процесса синтеза глутамина, но и дает возможность разобраться в ряде сложнейших реакций азотного метаболизма, протекающих в клетке.

Имееется ряд исследований, касающихся четвертичной саруктуры /Tsupinn et al ,1980; Кретович и соавт. ,1983/, а также регуля-торных свойств ГС высших растений / Mann et al ,1979; Hirel, Gadai ,1980; Кретович ,1983/, В то же время данных о структуре активного центра и механизме действия ГС растительных организмов, роль которых в усвоении неорганического азота отмечалась выше, в настоящее время совершенно недостаточно.

Прямые данные о функциональных группах активного ценара ГС имеются только для ГС мозга свиньи / Schnackerz, Jaenicke, 1966/ и хлореллы /Расулов и соавт.,1978/.

Данные о функциональных группах активного центра ГС высших растений в литературе практически отсутствуют.

В противоположность необычайной скудности данных по изучению функциональных группировок в активном центре ГС, в настоящее время имеется значительное количество работ по механизму действия данного фермента, правда, главным образом, у бактерий. Следует подчеркнуть, что механизм действия ГС пока еще не может считаться окончательно выясненным. Ранние исследования механизма действия ГС с црименением различных аналогов глутамата показали, что реакция синтеза глутамина протекает с образованием промежуточного соединения ( I-глутамилфосфата) по так называемому "ступенчатому" механизму/ Meister et al ,1962; Ronzio, Rowe ,1969 а,б,в; Weisbrod, Meister ,1973/. Применение методов изотопного обмена и стационарной кинетики для изучения механизма действия ГС позволило выдвинуть предположение о согласованном механизме реакции, без образования Ц-глутамилфосфата/ Wedler et al ,1972;1974а/.

В настоящее время существует мнение, что в процессе реакции синтеза глутамина образуется Й-глутамилфосфат, однако, все субстраты должны присоединиться к ферменту, прежде чем активный центр станет способным к функционированию/ Midelfort, Rose » 1976; Jaenicke, Jesior ,1978; Meek, Villifranca ,1980; Wedler et al ,1980/. Порядок связывания субстратов на активном центре фермента, выделенного из различных источников различен /Wedler et al ,1974; Wedler, Horn ,1976,1980/.

В литературе имеется довольно большое количество работ, в которых приведены кинетические характеристики ГС бактериального и животного происхождения.

Что касается ГС высших растений, то их кинетические свойства изучены в значительно меньшей степени. Необходимо отметить, что одним из возможных подходов при выяснении механизма ферментативного процесса, наряду с изучением функциональных групп активного центра является сравнение данных кинетических исследований с результатами, полученными при изучении структуры фермента.

В настоящее время в литературе имеется большое количество работ, касающихся двух форм ГС в листьях высших растений, одна из которых локализована в цитоплазме, а другая в хлоропластах клеток листа /Евстигнеева и соавт.,1977; Джохаридзе и соавт.,1979; Mann et al ,1979; Hirel, Gadal ,1980; Winter et al ,1982; Ahmad et al ,1982/. Исследование четвертичной структуры этих форм показало, что они имеют одинаковый тип структуры / Tsuprun et al, 1980; Евстигнеева и соавт.,1979; Кретович, 1983/. Вместе с тем, применение специфических ингибиторов синтеза белка /Евстигнеева и соавт.,1977/ и исследование иммунохимического поведения ГС цито-золя и ГС хлоропластов / Мс Ually ,1983; Антонюк и соавт.,1984/ показало, что данные ферменты являются изоферментами и кодируются разными генами. Цитозольная ГС кодируется ядерной ДНК, а синтез хлоропластной ГС происходит на ДНК хлоропластов.

Необходимо оилетить, что наряду с большим числом работ о множественных формах ГС в листьях высших растений, в настоящее время в литературе совершенно отсутствуют данные о структуре активного центра ГС цитозоля и хлоропластов, особенностях их механизма действия.

Основываясь на этом, мы выбрали в качестве объекта исследования изоферменты ГС листьев гороха: ГС цитозоля (цл) и ГС хлоропластов (хл).

В связи с вышесказанным в задачи данного исследования входит:

1. Получение в гомогенном состоянии ГС^ и ГС^д листьев гороха.

2. Исследование аминокислотного состава ГС^. и вторичной структуры ГС^д для сравнения структурной организации ГСцд и ГСХЛ гороха.

3. Изучение кинетических характеристик ГСцд и ГС^ гороха.

4. Изучение структуры активного центра ГС^ и ГС^ гороха с помощью следующих методов: химической модификации s Н-групп цистеина, определения рКе субстратсвязывающих групп, субстратной защиты фермента от ингибирования сульфгидрильными реагентами.

5. Изучение механизма действия ГС^ и ГС^ гороха с помощью следующих методов: метода стационарной кинетики, использования специфического ингибитора ГС - метионинсульфоксимина, субстратной защиты фермента от ингибирования данным реагентом, а также защитного действия субстратов от тепловой инактивации.

- II

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава I. СТРУКТУРА И КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРШЕРИСЯЖИ ГЛУТЖИНШНТЕТАЗ.

В настоящее время установлено, что структура играет фундаментальную роль в каталитической активности фермента. Она не только определяет форму молекул фермента в целом, но и формирует активный центр из химических групп и обеспечивает правильную его ориентацию в пространстве, определяя тем самым специфичность фермента. Одним из подходов при выяснении механизма действия фермента является сопоставление структуры фермента с его кинетическими характеристиками.

Информация, имеющаяся в настоящее время, свидетельствует о том, что глутаминсинтетазы, выделенные из разных организмов, различаются по своей структуре и кинетическим характеристикам. I.I. Четвертичная структура глутаминсинтетаз

По особенностям четвертичной структуры все глутаминсинтетазы можно разделить на три основных типа: I) "бактериальный", 2) "животный" и 3) "хлорелльный" /Кретович, 1983/.

К первому типу относятся бактериальные глутаминсинтетазы (из E.coli, B.subtilis, Azotobacter vinelandli и др.). "Бактериальный" фермент имеет молекулярную массу 600 000-700 000 и состоит из 12 идентичных мономеров с молекул^ной массой 50 000-60 000, расположенных с точечной группой симметрии 62 в виде двух, лежащих точно одно под другим, гексагональных колец.

Среди ГС "бактериального" типа наиболее изученной является ГС Е. coli . Фермент очищен до гомогенного состояния и получен в кристаллическом виде /Woolfoik ,1966/. ГСЕ. coli имеет моле-кул^ную массу 592 000 и состоит из 12-ти идентичных мономеров с молекулярной массой 50 000 /Sbapiro, Stadtman ,1967; Valentine et al ,1968; Eisenberg et al ,19^/. Методом оптической диффракции установлена цространственная структура этого фермента. ГСЕ.соИ способна полимеризоваться в присутствии с образованием трубок, которые объединяются в пучки / Frey et al ,1975/.

Кинетические исследования ГС Е. coli показывают, что комплексы Mg2+ -АТФ и Мп2+ -АТФ являются каталитически активными субстратами для данного фермента. К^ для этих комплексов одинакова и равна 0,16 Ш / Woolfdlk ,1966; Denton, Ginsburg ,1970/.

Величины для L -глутамата, АТФ и аммония в присутствии Mg2+ составляют 2,4; 0,68 и 1,8 мМ, а в присутствии Ш2+ 3,4; 0,36 и 2,7 мМ, соответственно / Woolfolk ,1966/. Для ГС Е. coli наблюдается отрицательная кооперативность при связывании аммония на ферменте / Meek, Viliifranca ,1980/. Это свидетельствует о взаимодействиях между каталитическими центрами субъединиц.

Бактериальный" тип структуры характерен также для ГС Б. subtilis / Deuel, Stadtman ,1970; Deuel ,1971/, В. stearother-mophilus / Wedler, Hoffman ,1974; Hachimori et al ,1974, 1975/, B. licheniformis /Hubbard, Stadtman ,1967/.

Молекулярная масса нативной ГС Б. subtilis равна 600 000, молекулярная масса мономеров - 50 000. Детальные электронно-микроскопические исследования показали, что ГС В. subtilis , подобно ГС Е. coli , состоит из 12-ти идентичных субъединиц, расположенных в виде параллельных гексагональных колец одно над другим. Это соответствует структуре с точечной группой симметрии 62 / Deuel f 1971/. Однако, в отличие от ГС Е.coli ГС Б. subtilis характеризуется более плотной упаковкой субъединиц в олигомере.

При исследовании кинетических характеристик ГС Б.subtilis установлено, что АТФ связывается на ферменте в виде комплекса Мп2+ -АТФ. Kjyj для Мп2+ -АТФ составляет 0,2 мМ / Deuel,stadtman, 1970/. Авторы показали, что связывание Мп2+-АТФ на ГС В.subtilis является кооперативным процессом. Предполагается, что связывание комплекса Мп2+-АТФ на ферменте может раскрывать или разрыхлять структуру белка, облегчая связывание других субстратов на каталитических центрах. Наблюдаемая различная степень коопера-тивности при различной температуре (37° и 25°) указывает на то, что температура может контролировать конформационную гибкость этого фермента.

Подробно изучены структура и кинетические характеристики ГС ИЗ В. stearothermophilus / Wedler, Hoffman ,1974; Hachimori et al ,1974,1975; Matsunaga, Nosoh ,1974; Hachimori et al, 1975; Wedler et al ,1976a/.

Из клеток В. stearothermophilus получен гомогенный препарат ГС с молекулярной массой 630 ООО. Молекулярная масса мономеров равна 51 ООО. Электронно-микроскопические исследования показали, что аналогично ферментам из E.coli и B.subtilis , молекула ГС В.stearothermophilus состоит из 12-ти субъединиц, расположенных в виде двух гексагональных колец с точечной группой симметрии 62.

Кинетические константы ГС В. stearothermophilus (К^ для субстратов) зависят от используемого катиона, что также характерно для ГС E.coli . Величины К^ для L-глутамата, аммония и AT® в присутствии Mg2+ равны 8,3; 0,67 и 3,3 мМ, а в присутствии Мп2+ 2,0; 0,15 и 3,5 мМ, соответственно. В отличие от ГС E.coli ГС В. stearothermophilus обладает значительно большим сродством к аммонию, чем к А1Ф.

Установлено, что АТФ связывается на ферменте в виде комплекса

2+

Ме -АТФ, что также характерно для других бактериальных ГС. Изучение зависимости степени насыщения фермента от концентрации субстрата показало, что аммоний и глутамат имеют гиперболические кривые насыщения, тогда как для АТФ наблюдается отклонение от равнобочной гиперболы, что свидетельствует о кооперативности связывания. Исследование зависимости активности ГС В.stearothermophilic от концентрации Мп2+ -АТФ также показало, что связывание Мп2+-АТФ с ферментом является кооперативным цроцессом. Это предполагает существование кооперативных субъединичных взаимодействий и указывает на многообразие конформационных состояний фермента.

Хьюбард и Стэдман / Hubbard, Stadtman ,1967/ выделили из клеток B.licheniformis ГС с молекулярной массой 612 ООО. К^ для L-глутамата, аммония и Мп2+-А1Ф составляет 3,6; 0,4 и 0,9 мМ, соответственно. Данные по структуре ГС В. lichenlformis в литературе отсутствуют. Однако, можно предположить, что данный фермент также как и другие бактериальные ГС состоит из 12-ти субъединиц.

Такой же тип четвертичной структуры имеет ГС Azotobacter vinelandii / Kleinschmidt, Kleiner ,1978/ и азотфиксирующих щанобактерий Anabaena cylindrica и Noatoc sp. / Sampaio, Rowell, Stewart ,1979; Sawhney, Mcholds ,1978/. ГС Azotobacter vinelandii очищена до гомогенного состояния. Молекулярная масса нативного фермента равна 640 ООО, а молекулярная масса мономеров 53 ООО. Анализ четвертичной структуры показал, что большинство молекул фермента состоит из 12-ти идентичных субъединиц. Однако, были найдены активные олигомеры, состоявшие из 8, 10 и 24 субъединиц. Интересно отметить, что ГС A. vinelandii /Kleinschmidt, Kleiner ,1978/ находится в связанном с плазматической мембраной состоянии.

Величины K^ для L -глутамата, аммония и AT® в присутствии Щ2+ равны 1,1; 0,45 и 2,2 мМ, а в присутствии Со2+ - 2,7; 1,6 и 1,3 мМ, соответственно / Lepo et al ,1982/. Следует подчеркнуть, что ГС A. vinelandii обладает значительным сродством к аммонию, что также характерно для ГС В, stearothermophilus и В. licheniformis.

ГС, выделенные из азотфиксирующих цианобактерий A. cylindrica и Nostoc sp. , имеют молекулярную массу олигомера 660 ООО и 630 ООО, и молекулярную массу мономеров - 49 ООО и 50 ООО, соответственно / Sampaio et al ,1979/.

Электронно-микроскопические исследования показали, что ГС цианобактерий состоят из 12-ти субъединиц, подобно ГС E.coli ,

В. subtilis , В. stearothermopMlus.

ГС цианобактерии A. cylindrica имеет для L-глутамата, А1Ф и аммония равные 2,1; 0,32 и 0,02 мМ, соответственно /Огг, Haseikorn ,1981/. Следует отметить, что среди всех бактериальных ГС данный фермент обладает самым высоким сродством к аммонию.

Таким образом, все рассмотренные выше ферменты имеют близкую молекулярную массу и единый тип структурной организации белковой молекулы. Однако, ГС "бактериального" типа отличаются между собой различной формой, размерами и ушковкой субъединиц. Вероятно,этим объясняются и различия в кинетических свойствах ГС бактерий.

Таким же типом четвертичной структуры, т.е. так называемым бактериальным, характеризуется ГС, выделенная из пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae / Mitchell, Magasanik ,1983/, являющихся микроорганизмом эукариотического типа. Установлено, что ГС Sacch.cerevisiae состоит из 10-12 идентичных субъединиц. Молекулярные массы олигомера и мономера равны 470 000 и 43 000, соответственно. К^ для L -глутамата и АТФ составляет 6,5 и 1,ЗмМ, соответственно.

Большая серия работ выполнена по изучению структуры ГС кормовых дрожжей Candida ufilis / Ferguson, Sims ,1971,1974; Sims, Toone, Box ,1974/.

- 16

Симсом и соавт. показано /Sims, Toone, Box ,1974/, что фермент кормовых дрожжей является октамерным белком, состоящим из двух слабо связанных половин молекулы. Для ГС Candida utilis молекулярные массы олигомера и мономера равны соответственно 390 ООО и 45 ООО.

Таким образом, ГС кормовых дрожжей по сравнению с ГС пекарских дрожжей имеет другой тип структурной организации и относится к так называемому "животному" типу структуры, к рассмотрению которого мы переходим ниже.

В литературе имеется довольно обширный материал по структуре и кинетическим характеристикам ГС, выделенных из животных организмов .

ГС "животного"типа имеет молекулярную массу 340 000-400 000 и состоит из 8 идентичных мономеров, расположенных с точечной группой симметрии 42 по вершинам куба.

Из мозга свиньи выделена и получена в гомогенном состоянии ГС, молекулярная масса которой равна 370 000 /Stahl, Jaenicke, 1972/. Эта ГС состоит из 8 идентичных мономеров с молекулщшой массой 46 000.

При низкой ионной силе в присутствии 2 М мочевины ГС диссоциирует на тетрамеры с молекулярной массой 185 000, не обладающие активностью.

Кинетические исследования показали, что АТФ связывается на ферменте в виде комплекса Щ2+ -АТ£ /Jaeniake, Jesior ,1978/.

К "животному" типу структуры относится структура ГС, выделенной из мозга овцы /Wilk et al ,1969/. Однако, данный фермент характеризуется более высокой молекулярной массой олигомера и мономеров, равной 525 000 и 65 000, соответственно. Авторы полагают, что остатки тирозина играют существенную роль в поддержании струко, турной целостности фермента. Интересно отметить, что Mg и АТФ в эквивалентных количествах сообщают дополнительную устойчивость структуре ГС и защищают фермент от диссоциации / Wilk et al , 1969,1970/. Величины для этой ГС по отношению к L -глутамату, аммонию и АТФ в присутствии Mg2+ равны 2,5; 0,18 и 2,3 wM, соответственно / Wedler et al ,1982 а,б/. Максимальная активность ГС наблюдается цри соотношении big2+] : [АТф] = 2 : I и [мп2+] : [аТф] = 1:1. Эти данные авторы объясняют образованием субъединичного комплекса Mg2+ -ГО- Mg2+-AIM», который обладает оптимальной активр . 2 4ностью ГС в присутствии Mg . С ионами Мп^"1" оптимальная активность ГС выявляется в комплексе ГС- Мп2+-АТФ или в комплексе

Mh2+ -ГС- Мп2+-АТФ. Методом ЭПР установлено, что на каждый моль

2+ октамера ГС при связывании приходится 4 моля Мп .

Тейт и Майстер / Tate, Meister ,1971,1972/ выделили и очистили до гомогенного состояния ГС печени крысы. Молекулярная масса данного фермента идентична молекулярной массе ГС мозга свиньи и равна 352 ООО, молекулярная масса мономеров составляет 44 ООО. ГС печени крысы состоит из 8 субъединиц. Авторы высказывают цред-положение, что ГС печени крысы состоит из неидентичных субъедшшц. Это предположение экспериментально не доказано, но оно цредставля-ет интерес, поскольку высказано впервые.

ГС печени крысы похожа на ГС мозга овцы по субстратной специфичности и кинетическим характеристикам. Величины для L-глу-тамата, аммония и А1Ф равны 2,5; 3,0 и 2,0 мМ, соответственно /cimino et al ,1983/. Однако, ГС печени крысы обладает более низким сродством к аммонию в отличие от ГС мозга овпы.

Очень подробно изучены структура и свойства ГС, выделенной из гомогенатов культуры ткани китайского хомячка / Tiemeier, Milman ,1972/. Молекулярная масса ГС равна 335 ООО, молекулярная масса мономеров - 42 ООО. Электронно-микроскопические исследования показали, что фермент состоит из 8 идентичных субъединиц, расположенных с точечной группой симметрии 42. ГС из культуры ткани китайского хомячка отличается от других животных ГС более низкой молекулярной массой. Величины для L -глутамата, аммония и АТФ равны 3,1; 0,16 и 1,2 мМ, соответственно. Показано, что А1Ф связывается на ферменте в виде комплекса Mg2+ -А1Ф.

Таким образом, ГС животных, несмотря на единый тип структурной организации, "животный" тип, имеют различные кинетические характеристики в зависимости от вида животной ткани.

Вероятно, различия в сродстве по отношению к субстратам отражают вариации в первичной структуре ферментов, выделенных из различных тканей, поскольку показано различие в их аминокислотном составе (ал .разд.1.2).

ГС высших растений изучена в меньшей степени по сравнению с ГС из микроорганизмов и животных. ГС растительного происхождения, также как ГС животных и дрожжей С. utilis по особенностям четвертичной структуры относится ко второму типу.

Впервые среди растительных ГС наиболее подно изучены структура и свойства ГС из листьев и корней тыквы /Цжохаридзе и со-авт.,1979; Евстигнеева и соавт.,1979/, семян и листьев гороха /Elliott ,1953; Пушкин и соавт.,1975; Евстигнеева и соавт., 1977; O'Neal, Joy ,1975/.

На основании данных о наличии многочисленных молекулярных форм ГС в листьях высших растений /Джохаридзе и соавт.,1979; Евстигнеева и соавт.,1977/ получены гомогенные црепараты ГС цитозо-ля и хлоропластов листьев гороха и тыквы /Евстигнеева и соавт., 1979; Кретович и соавт.,1983/.

Молекулярная масса этих ферментов находится в пределах

370 ООО - 520 ООО, а молекулярная масса мономеров 50 ООО - 64 ООО.

Кинетические характеристики исследованы для ГС семян гороха и ГС листьев и корней тыквы. Величины К^ для ГС семян гороха в отношении l -глутамата, аммония и АТФ равны 14; 0,04 и 1,1 мМ, соответственно. Максимальная активность фермента наблюдается при соотношении [ig2+]: [аТф] = 5:1. Кривые зависимости активности ГС

2 + от концентрации Mg имеют сшмоидный вид, что свидетельствует

2+ о наличии положительной кооперативности при взаимодействии Mg с исследуемой ГС.

2 +

При насыщении ГС семян гороха аммонием в смеси с ш наблюдается отрищтельная кооперативность.

Для ГС корней тыквы в отношении 1 -глутамата, аммония и АТФ равны 6,2; 0,36 и 0,4 мМ. Максимальная активность фермента проявляется при соотношении [Mg2+J : [А1ф] =3:1.

ГС хлоропластов листьев тыквы, подобно ГС семян гороха, характеризуется низким сродством к ь-глутамату, равна 46 мМ. Другие кинетические характеристики не изучены.

Электронно-микроскопическими исследованиями установлено, что изоферменты ГС листьев и корней тыквы, листьев и семян гороха состоят из 8 идентичных мономеров, расположенных с точечной группой симметрии 42 по вершинам двух квадратов, повернутых вокруг общей оси четвертого порядка. ГС семян гороха отличается от других растительных ГС наличием значительной внутренней полости и иной формой мономеров. ГС хлоропластов гороха имеет несколько удлиненную форму мономеров по сравнению с другими ГС. Кроме того, мономеры этих ферментов расположены не строго один над другим, что характерно для ГС "животного" типа, а повернуты вокруг общей оси четвертого порядка в различной степени. Показано, что эти изоферменты имеют определенные различия в аминокислотном составе и вторичной структуре /Евстигнеева и соавт.,1977; Антонюк и соавт., 1983, 1984/.

Интересен вопрос о структуре ГС плесневого гриба Neurospora crassa . Первые исследования по четвертичной структуре ГС N.cras-sa обнаружили, что под влиянием возрастающих концентраций мочевины фермент диссоциирует с образованием промежуточных форм: тримера, димера и четырех мономеров с молекулярной массой 90 ООО каждый. Димер имеет молекулярную массу 180 ООО и обладает каталитической активностью / Kapoor et al ,1969; Ward, Kapoor ,1971/. На основании этих данных было выдвинуто предположение, что ГС и.crassa является тетрамером.

Однако Палациос и сотр./ Paiacios et al ,1976/ показали, что ГС н.crassa имеет молекулярную массу 385 ООО, а молекулярная масса мономеров равна 47 ООО. На основании данных электронной микроскопии был сделан швод, что нативный фермент является окта-мером, состоящим из идентичных мономеров.

В последующих работах Теми же авторами / Paiacios, Mora , 1978/ получены новые результата, заставившие расширить ранее выдвинутое предположение о четвертичной структуре этого фермента. В диком штамме и.crassa было обнаружено присутствие нескольких форм ГС : октамера, тетрамера и димера. При этом выявлено, что в диком штамме цреобладает октамер, а в случае мутанта-тетрамер, причем довольно часто встречается и димер.

Опытами по иммунопреципитации показано, что как тетрамер, так и октамер состоят из мономеров двух видов - оС и J> . Причем, тетрамерная форма состоит из oi -мономеров и незначительного количества ^-мономеров, а октамерная из ^-мономеров и незначительного количества U -мономеров / Sanckez et al ,1980/.

Таким образом, в настоящее время имеются данные о наличии неидентичных мономеров в молекуле ГС u.crassa и ГС печени крысы. Но для большинства изученных ГС показано, что они состоят из идентичных мономеров.

Значительный интерес цредставляет изучение структуры ГС корневых клубеньков бобовых растений, поскольку основным источником азота для них является аммиак, образующийся в процессе азотфикса-ции. Имеются три работы, посвященные изучению структуры ГС корневых клубеньков сои, люцерны и люпина. Так, показано, что ГС корневых клубеньков сои /Мс Parland ,1976/ состоит из 8 идентичных субъединиц, которые образуют структуру куба с точечной группой симметрии 42. Молекулярная масса нативного фермента равна 376 ООО, молекулярная масса мономеров 46 ООО. В присутствии 10 мМ

ЭДТА ГС распадается на мономеры. Исходя из этого, авторы предпо

2+ 2 + лагают, что ионы Mg и ш играют значительную роль в поддержании четвертичной структуры фермента.

Аналогичный тип структуры имеет ГС растительной фракции клубеньков люпина / Мс Cormack et al ,1982/. Фермент имеет молекулярную массу 358 ООО и состоит из 8 идентичных мономеров с молекулярной массой 44 700.

Величины К^ для L-глутамата, аммония и АТФ равны 4,1;0,16 и 0,24 Ш, соответственно. При кинетическом исследовании установ

2 + лено, что АТФ связывается на ферменте в виде комплекса Mg -АТФ.

Необычную структуру имеет ГС, выделенная из азотфиксирующих клубеньков люцерны /Medicago sativa L. / / Groat, Schrader ,1982/. ГС клубеньков люцерны очищена до гомогенного состояния и представлена двумя основными полипептидами с молекулярной массой 40 000 и 45 000. Авторы предполагают, что нативная ГС клубеньков люцерны состоит из двух основных субъединиц.

В работах на корневых клубеньках сои, люпина и люцерны не было цроведеыо фракционирование клубеньков на растительную и бакте-роидную часть. Но поскольку активность ГС цитозоля растительных клеток клубенька значительно выше, чем активность ГС бактероидов, полученные этими авторами данные можно рассматривать как относящиеся именно к растительной ГС корней этих растений.

Таким образом, рассмотренные ГС корневых клубеньков трех видов растений, хотя этот орган является симбиотрофной азотфиксиру-ющей системой, относятся по своей четвертичной структуре к так называемому "животному" типу, свойственному и ГС высших растений, как показали в группе Евстигнеевой в лаборатории Кретовича Дрето-вич и соав.,1983/.

ГС хлореллы цредставляет собой третий тип структурной организации, по сравнению с известными по этого времени, "бактериальным" и "животным". Фермент имеет молекулярную массу 320 ООО и состоит из 6 идентичных мономеров, расположенных с точечной группой симметрии 32 по вершинам антипараллельной призмы /Расулов и соавт., 1977/.

Кинетические характеристики ГС хлореллы, подобно ГС бактерий, зависят от используемого катиона. В присутствии Mg2+ для L -глутамата, аммония и комплекса Mg2+ -АТФ равны 8,0; 0,25 и 2,0мМ, а в присутствии Мп2+ - 6,0; 0,5 и 1,0 мМ, соответственно /Акимова и соавт. ,1976/. Кривые зависимости активности ГС от концентраций Mg2+ и ш2+ имеют сигмодцный вид. Это свидетельствует о кооперативном связывании Mg2+ и Мп2+с ГС хлореллы, что предполагает существование межсубъединичных взаимодействий.

Таким образом, ГС хлореллы отличается от ГС первого и второго типа отсутствием двуслойности и более плотной упаковкой мономеров в олигомере, а также меньшей молекулярной массой и меньшим числом мономеров.

- 23

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Акентьева, Наталья Павловна

- 152 -ВЫВОДЫ

1. Получены в гомогенном состоянии ГСцд и ГС^ гороха с выходом по активности 10,3 и 6,0%, соответственно.

2. Исследованы аминокислотный состав и вторичная структура ГСцд и ГС^ гороха.

3. Исследованы кинетические характеристики ГС^ и ГС^ гороха: а) установлено, что степень сродства по отношению к глутамату для обоих ферментов одинакова; б) установлено, что ГСцд, в отличие от ГСХЛ, обладает более высоким сродством по отношению к аммиаку и АТФ.

4. Исследована структура активного центра ГСцд и ГС^ листьев гороха: а) установлено, что связывание глутамата происходит на имида-зольном кольпе остатка гистидина; б) установлено, что аммиак, а не аммонийный ион, является истинным субстратом в реакции синтеза глутамина и что связывание аммиака происходит на SH-группах цистеина, вероятно,

2 + в виде аммиачного комплекса с Mg - аммиаката магния; в) установлено, что связывание АТФ происходит в виде комплекса Mg2+ -АТФ на двух функциональных группах активного центра -на имидазольном кольце гистидина и SH-группах цистеина.

5. Исследован механизм действия ГС^ и ГС^ листьев гороха: а) установлено, что механизм действия ГСцд и ГС^ является последовательным процессом, требующим присутствия всех субстратов на ферменте; б) установлено, что связывание субстратов на активном центре

ГСцд и ГС^ является упорядоченным процессом и происходит

2+ в следующем порядке: сначала связывается комплекс Mg-АТФ, затем глуталдат, и, наконец, аммиак; в) показано, что в реакции синтеза глутамина имеет место образование четверного комплекса фермента со всеми субстратами, структура которого аналогична структуре метионинсульфо-ксиминфосфата; данный комплекс образуется только при связывании всех субстратов на исследуемых ГС.

6. Данные по ингибированию ГСцд и ГС^ гороха метионинсульфокси-мином позволяют заключить, что каждая субъединица исследуемых ГС имеет свой активный центр.

Б заключение выражаю глубокую и искреннюю благодарность моему научному руководителю доктору биологических наук Зинаиде Гавриловне Евстигнеевой и руководителю лаборатории энзимологии члену-корреспонденту АН СССР, профессору Вацлаву Леоновичу Кретовичу за предложенную тему, постоянное внимание и ценные указания в ходе выполнения данной работы. Кроме того, мне хочется выразить сердечную благодарность всему коллективу лаборатории энзимологии Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР за постоянную помощь и внимание, оказанные при выполнении данной работы.

- 154

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Многочисленные исследования, касающиеся двух форм ГС высших растений, локализованных в цитоплазме и хлоропластах клеток листа, показали, что эти ферменты, несмотря на единый тип структуры /Евстигнеева и соавт.,1979; Джохаридзе и соавт.,1979; Tsuprun et al, 1980; Hirel, Gadal ,1980; Winter ,1982/, имеют определенные различия в структурной организации субъединиц (форма, размеры, угол поворота, плотность упаковки), аминокислотном составе, кинетических характеристиках /Евстигнеева и соавт., 1977; Кретович, 1983/. Исследование иммунохимического поведения этих двух форм / Мс Naily ,1983/, а также применение специфических ингибиторов синтеза белка /Евстигнеева и соавт.,1977/ показало, что данные ферменты являются генетически разными белками и синтез их происходит как в цитозоле, так и в хлоропластах.

Полученные нами данные по аминокислотному составу, вторичной структуре, кинетическим характеристикам ГСцд и ГС^ листьев гороха, а также степени субстратной защиты от ингибирования специфическими ингибиторами, подтверждают точку зрения о том, что данные ферменты являются изоферментами.

Как уже отмечалось ранее, литературные данные о структуре активного центра ГС, особенно высших растений, очень скудны. Прямые данные о функциональных группах активного центра ГС в настоящее время имеются только для ГС из мозга свиньи / Schnackerz, Jaenicke ,1966/ и хлореллы /Фасулов и соавт.,1978/. Для обоих ферментов показано, что связывание глутамата происходит на имида-зольном кольце гистидина, а связывание комплекса Mg2+~AT$ на s Н-группах цистеина.

Что касается аммиака, то в настоящее время известно лишь, что центр связывания аммиака расположен вблизи центра связывания

- 146 концевого фосфата АТФ и центра связывания g-ОООН группы глутамата / Mora,Palacios ,1980/. В литературе совершенно отсутствует представление о том, какие функциональные группы активного центра ГС участвуют в связывании аммиака. Неизвестно также, в какой форме связывается аммиак, или как таковой, или в форме аммонийного иона.

Проведенные нами исследования позволяют дать гипотетическую схему строения активного центра ГСц^ и ГС^, приведенную на рис .31.

Полученные нами данные указывают на наличие в активном центре ГСцдИ ГСдд остатка гистидина, участвующего в связывании глутамата. Таким образом, наши данные хорошо коррелируют с имеющимися литературными данными по исследованию связывания глутамата на ГС из мозга свиньи /schnackerz, Jaenicke ,1966/ и хлореллы /£асулов и соавт.,1978/. Следует отметить, что данные о связывании глутамата на имидазольном кольце гистидина получены для ГС высших растений впервые.

Для ГСцд и ГСэд гороха опытами по зависимости величины К^ от рН установлено, что аммиак, а не аммонийный ион, является истинным субстратом в реакции синтеза глутамина. Результаты наших опытов (определение рКе субстрат связывающих групп, защитный эффект аммиака от ингибирования фермента сульфгидрильными реагентами) по выяснению природы функциональных групп, участвующих в связывании аммиака показали, что связывание аммиака происходит на s Н-группах цистеина, вероятно, в виде аммиачного комплекса с Mg2+ - аммиаката магния (см.рис.31). Необходимо отметить, что данные в отношении связывания аммиака, являются приоритетными. Нами было проведено исследование связывания АТФ и установлено, что АТФ связывается в виде комплекса Mg2+~AT$ не только на s Н-группах цистеина, но и на имидазольном кольце гистидина своей нуклеотидной "ручкой" (см. ермент

Рис, 31. Предполагаемая схема строения активного центра ГС цл и ГС хл гороха.

- 148 рис.31). Как видно из рисунка, остаток гистидина, на котором связывается нуклеотидная "ручка" АТ$, удален от второго остатка гистидина, на котором связывается глутамат, в результате этого молекула АТФ имеет вытянутую конформацию и через фосфорильную часть поддерживает молекулу глутамата в вытянутом состоянии. Данные в отношении двух центров связывания АТФ являются приоритетными не только для ГС высших растений, но и для всех ранее изученных ГС.

Мы даем единую схему строения активного центра ГСцд и ГС^ листьев гороха, поскольку функциональные группы активного центра, по-видимому, идентичны. Однако, установленные нами различия в их структуре, кинетических характеристиках и в степени защитного эффекта субстратов и кофактора при действии ингибиторов указывают на то, что аминокислотные остатки, окружающие функциональные группировки этих двух ГС, различны.

Хотя в настоящее время установлено, что реакция синтеза глу-тамина у всех исследованных организмов протекает с участием одних и тех же субстратов и кофакторов (глутамата, аммиака, АТФ, щ2+ или Мп2+) и что механизм действия всех изученных ГС относится к механизму последовательного типа с образованием промежуточного комплекса ( J-глутамилфосфата), однако, кинетический механизм, т.е. порядок связывания субстратов и выделения продуктов реакции, имеет некоторые различия у ГС бактерий, животных и растений. В то же время следует подчеркнуть, что вопрос о механизме действия ГС изучен еще далеко не полностью, особенно для ГС высших растений. .

Полученные нами данные позволяют сделать заключение, что механизм действия ГСцд и ГС^ листьев гороха является последовательным процессом, требующим присоединения всех субстратов на активном центре фермента, чтобы произошла реакция. Результаты наших иссле

- 149 дований о порядке связывания субстратов на активном центре ГСцд и rcviT, позволяют сделать вывод о том, что связывание субстратов

Jwl является упорядоченным процессом и происходит следующим образом: сначала на активном центре связывается комплекс Mg2+ -АТФ, затем глутамат, и, наконец, аммиак. Наши данные хорошо согласуются с данными новейших исследований механизма действия ГС E.coli / Meek, Villifranca ,1980,1982; Wedler, Horn ,1980/ и ГС растительной фракции клубеньков люпина / Мс Cormack et al ,1982/, для которых показан последовательный и упорядоченный механизм действия.

При изучении механизма действия ГС^ и ГС^ листьев гороха нами также установлено, что основной особенностью механизма действия данных ферментов является образование четверного комплекса фермента со всеми субстратами ( Mg2+ -АТФ, глутамат, аммиак), структура которого аналогична структуре метионинсульфоксиминфоо-фата. Таким образом, наши данные позволяют считать, что образование промежуточного комплекса имеет место в реакции синтеза глутамина, катализируемой ГС^ и ГС^ гороха. Однако, согласно нашим данным, этот комплекс образуется полько после присоединения всех субстратов (в том числе и аммиака) на активном центре фермента. Б этом состоит отличие наших данных от гипотезы Майстера, который считает, что промежуточный комплекс ( й-глутамилфосфат) образуется до присоединения аммиака. Необходимо отметить, что все работы Майстера выполнены на ГС животных /Ronzio, Rowe, Meister , 1969; Weisbrod, Meister ,1973; Mora, Palacios ,1980/. Полученные нами данные позволяют предложить схему механизма действия ГС высших растений, представленную на рис.32.

При исследовании числа активных центров ГСТТП. и TCY7T нами

I f

T + ЯФ H

-ЛАФ

-ттнтн w @ЦАФ]к-С-тг] -p. шты-шм

Синтетазная реакция

R="COO-Cu-(UH3)+(CHg)2

Рис.32. Механизм действия ГС высших растений: I - присоединение Mg2+ -АТФ; П - присоединение L -глутамата; Ш - присоединение ин^ U - образование \-глутамилфосфата; У, У1 - переходные состояния фермента в реакции амидирования; УП - отщепление

УШ - отщепление глутамина, отщепление ДЦФ.

- 151 получены данные, позволяющие предположить, что каждая субъединица исследуемых ферментов имеет свой активный центр. Следует подчеркнуть, что данные о числе активных центров ГС высших растений в литературе отсутствуют.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Акентьева, Наталья Павловна, Москва

1. Акимова Н.И. .Евстигнеева З.Г. Дретович В.Л. Регуляция метаболизма глутамина у Chioreiia pyrenoidosa . Исследование механизмов регуляции активности глутаминсинтетазы в процессе ассимиляции аммония.- Биохимия,1976,т.41, $ 7,c.I306-I3II.

2. Акимова Н.И.,Евстигнеева З.Г.,Кретович В.Л. Регуляция метаболизма глутамина у Chioreiia pyrenoidosa . Регуляция активности глутаминсинтетазы компонентами адениловой системы,- Биохимия, 1977,т.42, № 5,с.947-951.

3. Антонюк Л.П., Пушкин А.В.,Соловьева Н.А., Воробьева Л.М.,Евстигнеева 3 .Г. Дретович В.Л. Множественные молекулярные формы глутаминсинтетазы в семенах гороха.- Докл.АН СССР, 1983,т.263, №6,с.1492-1493.

4. Антонюк Л.П.,Пушкин А.В.,Шубин В.В. Евстигнеева З.Г. Дретович В.Л. Очистка и некоторые свойства глутаминсинтетазы семян гороха.-Прикл.биох. и микробиол.,1984,т.20, № I,с.31-37.

5. Бальхаузен К. Введение в теорию поля лигандов.- М.: Из д.Мир, 1964.272 с.

6. Болотина И.А.,Чехов В.О. Дагаускас B.IO. ,Птицын О.Б. Определение вторичной структуры белков из спектров кругового дихроизма. П. Учет вклада ^/-изгибов.-Молекулярная биология, 1980,т. 14, вып.4,с.902-909.

7. Болотина И.А.,Чехов В.О. Дагаускас В.Ю.,Птицын О.Б. Определение вторичной структуры белков из спектров кругового дихроизма. Ш. Белковые реперные спектры для антипараллельной и параллельной ^/-структур.-Молекулярная биология,1981,т.15,вып.1,с.X67-I75.

8. Громыко Е.А. Глутаминсинтетаза хлореллы, ее свойства и регуляция.-Дис. . канд.биол.наук.-Москва,1972.-148 с.- 155

9. Дей К., Се лбин Д. Теоретическая неорганическая химия.-М.:Химия, 1976.-877 с.

10. Джохаридзе Т.З. ,Радюкина Н.А. .Пушкин А.В.Евстигнеева З.Г.,Кре-тович B.JI. Множественные молекулярные формы глутаминсинтетазы в листьях гороха и тыквы .-Докл.АН СССР,1979, т.247, № 3, с.742-744.

11. Диксон М.,Уэбб Э. Ферменты.- М.:Мир,1982.- 82 с.

12. Евстигнеева З.Г. Ассимиляция аммиака и его регулирующая роль в азотном метаболизме растений.- Дис. . докт.биол.наук.-Москва,1970.-423 с.

13. Евстигнеева 3.Г.,Пушкин А.В. Дретович B.JI. Некоторые кинетические характеристики глутаминсинтетазы семян гороха.-Биохимия,1974, т.39,вып.5, с.964-967.

14. Евстигнеева 3.Г.,Пушкин А.В. ,Радюкина Н.А. ,Кретович B.JI .Индукция глутаминсинтетазы аммонием и локализация ее в хлоропластах и цитозоле листьев гороха.-Докл.АН СССР, 1977,т.237, № 4, с.962-964.

15. Евстигнеева 3.Г.,Радюкина Н.А.,Пушкин А.Б.Переведенцев О.В., Шапошников Г.Л. Дретович Б.Л. Очистка и физико-химические свойства глутаминсинтетазы хлоропластов листьев гороха.-Биохимия, 1979,т.44, № 7, с.1303-1309.

16. КЛесов А.А.,Березин И.В. Ферментативный катализ,- М.:Изд.МГУ, 1980.-32 с.

17. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики.- М.: Мир, 1979.31 с.

18. Кретович В.Л.Евстигнеева 3.Г.,Асеева К.В. Усвоение аммиака растениями с различными типами обмена веществ.- Физиол.раст., 1964, т. II, вып. I ,с.165-168.

19. Кретович БД. Основы биохимии растений,- М.: Высшая школа, 1971.150 с.

20. Кретович В.Л. Обмен азота в растениях.- М.: Наука, 1972.- 524 с.

21. Кретович В.Л., Серебренников В.М., Ауэрман Т.Л. Регуляция активности глутаминсинтетазы кормовых дрожжей Candida tro-picaiis конечными продуктами обмена глутамина.- Биохимия, 1976, т. 41, Я I, с. 167-170.

22. Кретович В.Л., Евстигнеева З.Г., Карякина Т.Н. Молекулярные механизмы усвоения азота растениями.- М.: Наука, 1983,160 с.

23. Ленинджер А. Биохимия.- М.: Мир, 1976.- 957 с.

24. Мецлер Д., Биохимия.- М.: Мир, 1980, том. 2.- 137 с.

25. Прянишников Д.Н. Азот в жизни растений и в земледелии СССР .МЛ.: Изд-во АН СССР, 1945.- 197 с.

26. Пушкин А.В., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Определение активности глутаминсинтетазы в экстрактах из семян гороха по образованию ортофосфата.- Прикл. биохим. микробиол., 1972, т.8, Jfc I, с. 86-91.

27. Пушкин А.В., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Очистка и некоторые свойства глутаминсинтетазы из семян гороха.- Биохимия, 1974 а, т. 39, № 5, с. 533-538.

28. Пушкин А.В., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Влияние аминокислот на активность глутаминсинтетазы гороха.- Физиол. растений, 1974 б, т. 21, № 3, с.512-517.

29. Пушкин А.В., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Регуляция активности глутаминсинтетазы у семян гороха кетокислотами и АМФ.-Биохимия, 1975, т. 40, № I, с. 53-56.

30. Расулов А.С., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Физико-химические свойства глутаминсинетазы хлореллы,- Докл. АН СССР, 1977, т.233, №4, с. 726-729.

31. Расулов А.С., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. 0 наличии s Н-групп и гистидина в активном центре глутаминсинтетазы хлореллы.-Биохимия, 1978, т.43, №6, с. 1090-1096.

32. Торчинский Ю.М. Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков.-М.: Наука, 1971,- 109 с.

33. Уралец Т.И., Ауэрман Т.Л., Кретович В.Л. Влияние п- хлормер-курибензоата на глутаминсинтетазы кормовых дрожжей Candida tropicalis Микробиология, 1977, т. 46, №4, с. 632634.

34. Уэстли Д. Ферментативный катализ.- М.: Мир, 19^.- 159 с.

35. Ahmad I., Larher P., Mann A.F., Mc Nally S.F., Stewart G.R. Nitrogen metabolism of halophytes. IV. Characteristics of glutami-ne synthetase from Triglochin maritima L. New Phytol., 1982, vol. 91, N 4, p. 585-595.

36. Alberty R.A., Bloomfield V. Multiple intermediates in steady state enzyme kinetics. V. Effect of pH on the rate of a simple enzymatic reaction. J. Biol. Chem., 1963, vol. 239, N 8, p. 2804-2810.

37. Boyer P.D. spectrophotometric study of the reaction of proteinsulfhydryl groups with organic mercurials. J. Amer. Chem. Soc., 1954, vol. 76, N 5, p. 4331-4338.

38. Boyer P.D., Koeppe O.J., Luchsinger W.W. Direct oxygen transferin enzymatic synthesis coupled to adenosine triphosphate degradation. J. Amer. Chem. Soc., 1956, vol. 78, N 2, p.356-357.

39. Chang Ch.T., Wu C.-S.C., Yang J.T. Circular dichroic analysis of protein conformation : inclusion of the B-turns. Analyt. Biochem., 1978, vol. 91, N 1, p. 13-31.

40. Cimino P., Tramonti C. Mammalian glutamine synthetase : molecular and regulatory properties. Acta Vitaminol.et Enzymol., 1973, vol. 27, N 1-4, p. 135-144.

41. Cleland W.W. The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. Biochim. Biophys. Acta, 1963, vol. 67, N 1 , p. 104-137.

42. Davis B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application tohuman serum proteins. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1964, vol. 121, N 2, p. 404-427.

43. Denes G. Glutamine synthetase : its stereospecificity and changesinduced by activating ions. Biochim. Biophys. Acta, 1954,vol. 15, N 2, p. 296-302.

44. Denton M.D., Ginsburg A. Conformational changes in glutamine syn2+thetase from Escherichia coli : I. The binding of Mn m relation to some aspects of the enzyme structure and activity.- Biochemistry, 1969, vol. 8, N 4, p. 1714-1720.

45. Deuel T.F., Stadtman E.R. Some Kinetic properties of Bacillus sub-tilis glutamine synthetase. J.Biol. Ghem., 1970, N 20, p. 5206-5213;.

46. Deuel T.F. Bacillus subtilis glutamine synthetase. Specific catalytic changes associated with limited sulfhydryl modification.- J. Biol. Ghem., 1971 , vol. 246, N 3, p. 599-605.

47. Dixon M. The effect of pH on the affinities of enzymes for substrates and inhibitors. Biochem. J., 1953, vol. 55, N 1, p. 161-171 .

48. Elliott W.H. Isolation of glutamine synthetase and glutamotransferase from green peas. J.Biol. Chem., 1953, vol. 201, N 2, p. 661-672.

49. Elliott W.H. Clutamine Synthesis. Methods in Enzymology. Eds. S.P.Collowick, N.O.Kaplan. 1955, vol. 2, p. 337-342.

50. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys., 1959, vol. 82, N 1, p. 70-77.

51. Fasekas S., Denes G. Purification and properties of glutaminesynthetase from chicken liver. Acta Biochem. Biophys.Acad. Sci. Hung., i1966, vol. 1 , N 1 , p. 45-52.

52. Ferguson A.R., Sims A.P. Inactivation in vivo of glutamine synthetase and NAD-specific glutamate dehydrogenase : its role in the regulation of glutamine synthetase in yeast. J. Gen. Microbiol., 1971, vol. 69, part 3, p. 423-427.

53. Ferguson A.R., Sims A.P. The regulation of glutamine metabolismin Candida utilis : the role of glutamine in control of glutamine synthetase. J. Gen. Microbiol., 1974, vol. 80, part 1, p. 1 59-1 71.

54. Forter W.B., Griffith M.J., Kingdon H.S. Affinity labelling of the active site of E.coli glutamine synthetase by 5'-p-fluorosul-fonylbenzoyladenosine.-J. Biol. Chem., 1981, vol. 256, N 2, p. 882-886.

55. Frey T.G., Eisenberg D., Eisenberg F.&. Glutamine synthetase forms three and seven-stranded helical cables. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975, vol. 72, N 9, p. 3402-3406.

56. Friedrich P., Polgar b., Szabolcsi G. Effect of photooxidation on glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Nature, 1964, vol. 202, No3, p. 1214-1218.

57. Gass J., Meister A. Computer analysis of the active site of glu-tamine synthetase. Biochemistry, 1970 a, vol. 9, N 6, p. 1380-1 389.

58. Gass J.D., Meister A. L-amino-1,3-dicarboxycyclohexane (cyclo-glutamic acid). A new glutamic acid analog and a substrate of glutamine synthetase. Biochemistry, 1970 b, vol. 9, N 4, p. 842-846.

59. Ginsburg A., Stadtman E.R. Regulation of glutamine synthetase in E.coli. In : The Enzymes of Glutamine Metabolism, Acad. Press.,New York - London,1973, vol. 1, p. 9-20.

60. Groat R.G., Schrader L.E. Isolation and immunochemical characterization of plant glutamine synthetase in alfalfa (Medicago sativa L.) nodules. Plant Physiol., 1982, vol. 70, N 6, p. 1759-1761.

61. Hachimmri A., Matsunaga A., Shimizu M., Samejima Т., Nosoh Y. Purification and properties of glutamine synthetase from B. stearothermophilus. Biochim. Biophys. Acta, 1974, vol. 350, N 2, p. 461-472.

62. Hachimori A., Takeda N., Nagasha Т., Suzuki H., Nosoh Y., Same-jima T. The modification of sulfhydryl groups with 5,5'-di-thiobis-(2-nitrobenzioc acid).- J.Biochem., 1975, vol. 78, N 6, p. 1235-1240.

63. Hirel В., Gadal P. Glutamine synthetase in rice. A comparative study of enzymes from roots and leaves. Plant Physiol.,vol. 66, N 4, p. 619-623.

64. Holzer N. Inactivation et activation enzymatiques controles par un metabolite de la glutamine synthetase de la E.coli.-Bull. Soc. Chem. Biol., 1967,vol. 49, N 1, p. 95-102.

65. Hsu R., Singer S., Keim P., Deuel Т., Heinrikson R.L. Structural studies of B.subtilis glutamine synthetase. Further purification, sulfhydryl groups, and the NHg-terminal amino acid sequence. Arch. Biochem. Biophys., 1977, vol. 178, N 2, p. 644-651.

66. Hubbard J.A., Stadtman E.R. Regulation of glutamine synthetase. V. Partial purification and properties of glutamine synthetase B.licheniformis. J. Bacteriol., 1967, vol. 94, N 4, p.1007-10015.

67. Hunt J.В., Smyrniotis P.Z., Ginsburg A., Stadtman E.R. Metal ion requirement by glutamine synthetase of E.coli in catalysis of ^-glutamyl transfer. Arch. Biochem. Biophys., 1975, vol. 166, N 1, p. 1 02-1 24.

68. Jaenicke L., Jesior J.C. Pig brain glutamine synthetase : an interpretation of the sigmoidal kinetics for magnesium and adeno-sinetriphosphate. PEBS Lett., 1978, vol. 90, N 1, p. 115118.

69. Kanamori Т., Matsumoto N. Glutamine synthetase from rice plantroots. Arch. Biochem. Biophys., 1972, vol. 152, N 1, p.404-412.

70. Kapoor M., Bray D.P., Ward G.W. Glutamine synthetase of N.crassa. Inactivation by urea and protection by some substrates and allosteric effectors. Arch. Biochem. Biophys., 1969, vol. 1 34, N 2, p. 423-433.

71. Khedouri E., Wellner V.P., Meister A. Enzymatic synthesis of6.aminoglutaramic acid (6-glutamine) by glutamine synthetase: evidence for the utilization of B-aminoglutarylphosphate.-Biochemistry, 1964, vol. 3, N 6, p. 824-828.

72. Kingdon H.S., Noyes C., Lahird A., Heinrikson H.L. Primary structure of E.coli glutamine synthetase. III. Chemical evidence for subunit identity : amino acid sequences at the HHg-and-COOH termini. J. Biol. Chem.,1972, vol. 247, N 24, p.7923-7926.

73. Kleinschmidt A., Kleiner D. The glutamine synthetase from Azotobacter vinelandii : Purification,Characterization, regulation and localization. Eur.J.Biochem., 1978, vol. 89, N 1, p. 61-66.

74. Kowalsky A.:,Wittenbach C., Langer L., Koshland D.E. Transfer of о oxygen in the glutamine synthesis reaction. J. Biol, Ghem., 1956, vol. 219, N 2, p. 719-725.

75. Krebs H.A. Metabolism of amino acids. IV. The synthesis of glutamine from glutamic acid and ammonia, and the enzymatic hydrolysis of glutamine in animal tissues. Biochem. J., 1935, vol. 29, N 2, p. 1951-1962.

76. Krishnaswamy P.R., Pamiljans V., Meister A. Studies on the mechanism of glutamine synthesis : evidence for the formation of enzyme-bound activated glutamic acid. <JT Biol. Chem.,1962, vol. 237, N 3, p. 2932-2937.

77. Biochemistry, 1969, vol. 8, N 6, p. 2681-2685.

78. Matsunaga A., Nosoh Y. Conformational change with temperatureand thermostability of glutamine synthetase from B.stearothermophilus. Biochim. Biophys. Acta, 1974, vol. 365, N 1 , p. 2008-2111 .

79. Maurizi M.R., Ginsburg A. Active site ligand stabilization ofquaternary structures of glutamine synthetase from E.coli.-J. Biol. Chem., 1982, vol. 257, N 12, p. 7246-7251.

80. Mc Cormack DtK. , Parnden K.J., Boland M.J. Purification and properties of glutamine synthetase from the plant cytosol fraction of lupin nodules. Arch.Biochem. Biophys.,1982,vol. 218, N 2, p. 561-571.

81. Mc Parland R.H., Guevera J.G., Becker R.R., Evans H.J. The purification and properties of the glutamine synthetase from the control of soybean root nodules. Biochem. J., 1976, vol. 153, N 3, p. 597-606.

82. Meek T.D., Villifranca J.J. Kinetic mechanism of E.coli glutamine synthetase. Biochemistry, 1980, vol. 19, N 24, p. 55135519.

83. Meek T.D., Johnson K.A., Villifranca J.J. Determination of rate-limiting steps by rapid-quench and isotope partitioning experiments. -Biochemistry, 1982, vol.21, N9,p.2158-2167.

84. Meister A. Glutamine-Synthesis. In : The Enzymes, Acad. Press, ' New-York, 1962, vol.6, p. 443-450.

85. Midelfort C., Rose I.A. A stereochemical method for detection of ATP terminal phosphate transfer in enzymatic reactions glutamine synthetase. J. Biol. Chem., 1976, vol. 251, N 19, p. 5881-5887.

86. Miflln B.J., Lea P.J. The pathway of nitrogen assimilation in plants. Phytochemistry, 1976, vol. 15, N 6, p. 873-885.

87. Miflin B.J., Lea P.J. Ann. Rev. Plant Physiol., 1977, vol. 28, p. 299-305.

88. Millar D.B., Schwert G.W. Lactic dehydrogenase. IX. Effect of photo-oxidation upon activity and complex formation. J.Biol. Chem., 1963, vol. 238, N 4, p. 3249-3257.

89. Mitchell A.P., Magasanik B. Purification and properties of glutamine synthetase from Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 1983, vol. 258, N 1, p. 119-124.

90. Moore S. On the determination of cystine as cysteic acid. -J. Biol. Chem., 1963, vol. 238, N 1, p. 235-239.

91. Mora J., Palacios R. Glutamine : Metabolism, enzymology and regulation. Acad. Press. New York London-Toronto-Syd.-San. Franc., 1980. p. 1-41 .

92. O'Neal D.O., Joy K.W. Pea leaf glutamine synthetase. Regulatory properties. Plant Physiol., 1975, vol. 55, N 6, p.968-974.

93. Nesselhut Т., Harnischfeger G. Characterization of glutamine synthetase from Beta vulgaris. Physiol, plant., 1981, vol. 51, N 4, p. 329-334.

94. Orr J., Haselkorn R. Kinetic and inhibition studies of glutaminesynthetase from cyanobacterium Anabaena 7120. J.Biol.Chem.,1981, vol. 256, N 24, p. 13099-13104.

95. Pace J., Mc Derraitt E.E. Methionine sulfoximine and some enzyme systems involving glutamine. Nature, 1952, vol. 169, N 4297, p. 415-416.

96. Palacios R. Neurospora crassa glutamine synthetase. Purification by affinity chromatography and characterization of subunit structure. J. Biol. Chem., 1976, vol. 251, N 14, p. 41874191.

97. Palacios R., Mora J. Genetics and physiology of Neurospora crassa glutamine auxotrophs. J. Bacteriol., 1978, vol. 134, N 3, p. 693-698.

98. Pishak M.R., Phillips A.T. Glucocorticoid stimulation of glutamine synthetase production in cultured rat glioma cells. -J. Neurochem., 1980, vol. 34, N 4, p. 866-872.

99. Powers S.G., Riordan J.P. Functional arginyl residues as ATP binding sites of glutamine synthetase and carbamoylphosphate synthetase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975, vol. 72, N 7, p. 2616-2620.

100. Purich D.L., Dahlquist F.W. Regulation of E.coli glutamine synthetase. Evidence for the action of some feedback modifiers at the active site of the unadenylylated enzyme. Biochemistry, 1 975, vol. 14, N 9, p. 1980-1989.

101. Ravel J.M., Numphreys J.S., Shive W. Control of glutamine synthetase in Lactobacillus arabinosus. Arch. Biochem. Biophys., 1965, vol. 111, N 2, p. 720-728.

102. Rhee S.G., Chock P.В., Stadtman E.R. Mechanistic studies of glutamine synthetase from E.coli. An integrated mechanism for biosynthesis, transferase, ATPase reactions. Biochimie,1976 a, vol. 58, N 1-2, p. 35-49.

103. Rhee S.G., Chock P.B. Mechanistic studies of glutamine synthetase from E.coli; kinetic evidence for two reaction intermediates in biosynthetic reaction. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1976 b, vol. 73, N 2, p. 476-480.

104. Rhee S.G., Chock P.B. Mechanistic studies of glutamine synthetasefrom E.coli : kinetics of ADP and ortophosphate binding to the unadenylylated enzyme. Biochemistry, 19761?, vol. 15, N 8, p. 1755-1760.

105. Robinson D., Stallar D., White S., Kaplan N.O. Structural and catalytic alterations of dehydrogenases after photooxidation. -Biochemistry, 1963, vol. 2, N 1, p. 486-491.

106. Ronzio R.A., Meister A. Phosphorylation of methionine sulfoximine by glutamine synthetase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1968, vol. 59, N 1, p. 164-1 70.

107. Ronzio R.A., Rowe W.B., Meister A. Studies on the mechanism of inhibition of glutamine synthetase by methionine sulfoximine.-Boichemistry, 1969 a, vol. 8, N 3, p. 1066-1075.

108. Ronzio R.A., Rowe W.B., Wilk S., Meister A. Preparation and studies on the characterization of sheep brain glutamine synthetase. Biochemistry, 1969 b, vol. 8, N 6, p. 2670-2674.

109. Roselli M., Berti A,, Stefani M., Camici G., Nassi P., Ramponi G.

110. An investigation on a possible regulatory role of acyl phosphatase on glutamine synthetase. Ital. J. Biochem., 1977, vol. 26, N 5, p. 376-377.

111. Rowe W.B., Ronzio R.A., Meister A. Inhibition of glutamine synthetase by methionine sulfoximine. Studies on methionine sulfoximine. Biochemistry, 1969, vol. 8, N 6, p. 2674-2680.

112. Sanchez F., Calva E., Campomanes M., Blanco L., Guzman J., Sabo-rio J.L., Palacios R. Heterogeneity of glutamine synthetase polypeptides in Neurospora crassa. J. Biol. Ghem., 1980, vol. 255, N 6, p. 2231-2234.

113. Sawney S.K., Nicholds D.J. Some properties of glutamine synthetase of Anabaena cylindrica. Planta, 1978, vol. 139, N 3, p. 289-299.

114. Schnackerz K., Jaenicke L. Reinigung und Eigenschaften der gluta-min-synthetase aue schweinehirn. H,S. Zeitschrift physiol. Chemie, 1966, vol. 347, N 1, p. 127-131.

115. Seethalakshmi s.,,. Vaidyanathan G.S., Appaji R.N. Kinetic mecha -nism of gamma glutamyl transferase reactions catalyzed by the mung bean (Phaseolus aureus) glutamine synthetase. -Indian J. Biochem. Biophys., 1977, vol. 14, N 2, p. 112-117.

116. Sekura R., Meister A. cL -aminomethylglutarate, a B-amino acid analog of glutamate that interacts with glutamine synthetase and the enzymes that catalyzed glutathione synthesis. -J. Biol. Chem., 1976, vol. 251, N 8, p. 2263-2270.

117. Shampaio M.L., Rowell P., Stewart W.D. Purification and some properties of glutamine synthetase from the nitrogen-fixing cy-anobacteria Anabaena cylindrica and a Nostoc sp. J. Gen. Microbiol., 1979, vol. Ill, part I, p. 181x191.

118. Shapiro B.M., Stadtman E.R. Regulation of glutamine synthetase. IX. Reactivity of the sulfhydryl groups of the enzyme from E.coli., 1967, vol. 242, N21, p. 5069-5079.

119. Shrake A., Ginsburg A., Wedier F., Sugiyama Y. On the binding of L-S- and L-R-diastereoisomers of the substrate analog, L-me-thionine sulfoximine to glutamine synthetase from E.coli.

120. J. Biol. Chem., 1982, vol. 257, N 14, p. 8238-8243.

121. Sims A.P., Toone J., Box V. The regulation of glutamine synthetase in food-yeast Candida utilis : the purification and subunit structure of glutamine synthetase and aspects of enzyme deactivation. J. Gen. Microbiol., 1974, vol. 80, part 2, p. 485499.

122. Stadtman E.R., Shapiro B.M., Kingdon H.S., Woolfolk C.A., Hubbard J.S. Cellular regulation of glutamine synthetase activity in E.coli. Adv. Enzymol. Regul., 1968, vol. 6, N 2, p.257-289.

123. Stadtman E.R., Chock P.B. Metabolic regulation of coupled covalent modification cascade system. Tenth internat. congr. of biochem,, Abstract, 1976, 07-3-4-, p. 362.

124. Stadtman E.R., Hohman R.J., Wittenberger M.E. Multiple molecular forms of adenylylated glutamine synthetase. Biochem. Soc. Trans. , 1981, vol. 9, N 2, p. 69.

125. Stahl J., Jaenicke L. Investigation of the structure of glutamine synthetase from pig brain. Eur. J. Biochem., 1972, vol. 29, N 3, p.' 401-407.

126. Streicher S.L., Shanmugam K.P., Ausubel P., Morandi C., Golberg

127. K.B. Regulation of nitrogen fixation in Klebsiella pneumonia : evidence for a role of glutamine synthetase as a regulator of nitrogenase synthesis. J. Васteriol.,1974, vol. 120, N 4, p. 81 5-822.

128. Tat6 S.S., Meister A. Regulationoof rat liver glutamine synthetase : activation by oC-ketoglutarat e and inhibition by glycine, alanine and carbamyl phosphate. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1971, vol. 68, N 4, p. 781-785.

129. Tate S.S., Leu F.Y., Meister A. Rat liver glutamine synthetase: preparation, properties and mechanism of inhibition by carbamyl phosphate. J.Biol.Chem.T 1972, vol. 247, N 17, p. 531295321.

130. Tiemeier D.C., Milman G. Chinese hamster liver glutamine synthetase. Purification, physical and biochemical properties. -J. Biol. Chem., 1972, vol. 247, N 8, p. 2272-2277.

131. Todhunter J.A., Purich D.L. Use of the sodium borohydride reduction technique to identify a ^-glutamyl phosphate intermediary in the E.coli glutamine synthesis reaction. J. Biol. Chem., 1975, vol. 250, N 9, p. 3505-3509.

132. Tsuda Y., Stephani R.A., Meister A. Direct evidence for the formation of an acyl phosphate by glutamine synthetase. Biochemistry, 1971, vol. 10, N 17, p. 3186-3189.

133. Tsuprun V.L., Samsonidze T.G., Radukina N.A., Pushkin A.V., Evsti-gneeva Z.G., Kpetovich W.L. Electron microscopy of glutamine synthetase from pea leaf chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 1980, vol. 626, N 1, p. 1-4.

134. Valentine R.C., Shapiro B.M., Stadtman E.R. Regulation of glutamine synthetase. XII.Electron microscopy of the enzyme from Escherichia coli. Biochemistry, 1968, vol. 7, N 6,p. 21432152.

135. Varner J.E., Webster G.C. Studies on the enzymatic synthesis of glutamine. Plant Physiol., 1955, vol. 30,N 1, p.393-397.

136. Villifranca J.J., Ash D.E., Wedler E.G. Manganese (II) and substrate interaction with unadenylylated glutamine synthetase (E.coli). I.Temperature and frequency dependent nuclear magnetic resonance studies. Biochemistry, 1976, vol. 15, Ы 3, p. 536-543.

137. Villifranca J.J., Balakrishnan M.S., Wedler P. Determination ofmetal-metal distances in E.coli glutamine synthetase by EPR.-Biochem. Biophys.Res. Commun., 1977, vol.75,N 2,p. 464-471.

138. Plant Physiol.', 1953, vol. 28, N 3, p. 725-731 . Webster G.C., Varner J.E. On the mechanism of the enzymatic synthesis of glutamine. J.Amer.Chem. Soc.,1954, vol.76, N 2, p. 633-640.

139. Wedler P.C., Boyer P. Substrate binding and reaction intermediates of glutamine synthetase (E.coli W) as studied by isotopeexchanges. J.Biol.Chem., 1972, vol.247, N 2, p. 984-993.

140. Wedler P.O. Equilibrium isotope exchanges with the ovine brain, pea seed and E.coli enzymes, J. Biol. Chem.,1974 a, vol. 249, N 16, p. 5080-5087.p .

141. Wedler P.O. Evidence for cooperative Mn -ATP binding with Bacillus subtilis glutamine synthetase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1974 b, vol. 60, N 2, p, 737-742.

142. Wedler P.O., Hoffman P.M. Glutamine synthetase of B.stearothermo-philus. I. Purification and basic properties. Biochemistry, 1974 b, vol. 13, N 16, p. 3207-3214.

143. Wedler P.O., Carfi J., Ashour A.E. Glutamine synthetase of Bacillus stearothermophilus. Regulation, site interactions and functional information. Biochemistry, 1976, vol. 15, N 8, p. 1749-1755,

144. Wedler P.G., Horn B.R. Catalytic mechanism of glutamine synthetase enzymes. Studies with analogs of possible intermediates and transition states. J. Biol. Chem., 1976, vol. 251, N 23, p. 7530-7538.

145. Wedler P.C., Horn B.R., Roby W.G. Interaction of a new J-gluta-myl-phosphate analog, 4(phosphonoacetyl-)-L-^-aminobutyrate and mammalian sources. Arch. Biochem. Biophys., 1980, vol. 202, N 2, p. 482-490.

146. Wedler F.C., Sugiyama Y., Pisher K.E. Catalytic cooperativity and subunit interactions in E.coli glutamine synthetase : binding and kinetics with methionine sulfoximine and related inhibitors. Biochemistry, 1982 a, vol. 21, N 9, p. 2168-2177.

147. Wedler P.C., Denman R.B., Roby W.G. Glutamine synthetase fromovine brain is a manganese (II) enzyme.- Biochemistry, 1982b,vol. 21, N 25, p. 6389-6396.

148. Weisbrod R.A., Meister A. Studies on glutamine synthetase from

149. E.coli. Formation of pyrrolidone carboxylate and inhibition by methionine sulfoximine. -J.Biol.Ohem., 1973, vol. 248, N 14, p. 3997-4002.

150. Wieland Т., Pfleiderer G.,Sandmann B. Zum wirkungs mechanismus der glutaminsynthetase aus erbsen. Biochemistry, 1958, vol. 330, N 1, p. 198-204.

151. Wilk S., Meister A., Hashemeyer R. Studies on the subunit structure of ovine brain glutamine synthetase. Biochemistry, 1969, vol. 8, N 8, p. 3168-3174.

152. Wilk S., Meister A.,Hashemeyer R. Dissociation of native octameric brain glutamine synthetase to a tetramer by treatment with N-acetylimidazole. Biochemistry, 1970, voliS, N 10, p.2039-2044.

153. Winter H.C., Powell G.K., Dekker E.E. Glutamine synthetase of germinating peanuts. Properties of two chromatographically distinct forms and their activity toward 4-methyleneglutamic acid. Plant Physiol., 1982, vol. 69, N 1, p. 41-47.

154. Woolfolk G.A., Shapiro B.M., Stadtman E.R. Regulation of glutaminesynthetase. I. Purification and properties of glutamine synthetase from E.coli. Arch. Biochem. Biophys., 1966, vol. 116, N 1 , p. 177-183.

155. Wu G. Glutamine synthetase. V. Mechanism of the dithiol-dependent inhibition by arsenite. Biochim. Biophys, Acta, 1965, vol. 96, N 1, p. 134-142.