Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура микробных популяций возбудителей микст-инфекций в эксперименте

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структура микробных популяций возбудителей микст-инфекций в эксперименте"

' > у ил

1 1 НОЯ 1996

На правах рукописи

ШАТАЛОВА Елена Васильевна

СТРУКТУРА МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКСТ - ИНФЕКЦИЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете.

Научные консультанты:

член - корр. МАИ, доктор медицинских наук, профессор В.В. Вельский

засл. деят. РФ, академик СПбИА, доктор биологических наук, профессор Н.П. Блинов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А. Ф. Мороз, доктор биологических наук, профессор Л. К. Катосова, доктор медицинских наук, профессор A.A. Алексеев.

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования.

Защита состоится 1996г. в 14 часов

на заседании специализированного совета Д 001.38.01 при Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Академии медицинских наук РФ по адресу: 103064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

Автореферат разослан 1996г.

Ученый секретарь

специализированного ученого совета кандидат медицинских наук

Н.Г. Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Смешанные (микст) инфекции занимают особое положение в патологии человека в связи с их широким распространением, тяжестью клинических проявлений, трудностями диагностики, лечения и высокой смертностью (Г.А. Тимофеева и др., 1980; О.Ф. Белая, Ю.А. Белая, 1986; В. Pottecher, 1979).

По разным источникам ( Л.В. Быстрякова и др., 1980; А.Ф. Быковский, 1986; В.П. Венцель, 1990) на долю микст-инфекции в структуре инфекционных заболеваний приходится от 50% до 75%.

Тенденция к возрастанию удельного веса смешанных инфекций прослеживается, прежде всего, у больных хирургических стационаров и, особенно, у больных с ожоговой травмой (М.Г. Григорьев и др., 1984; A. Morrison, 1984).

Профилактика и лечение микст-инфекций у больных с ожогами представляют до настоящего времени особые трудности по нескольким причинам, основными из которых являются многообразие и нестабильность этиологии микст-инфекций. Ведущая роль здесь принадлежит условно-патогенным микроорганизмам: псевдомонадам, стафилококкам,

энтеробактерпям, в частности, кишечной палочке, которые, как правило, обладают множественной лекарственной устойчивостью. Ситуация с микст-инфекциями осложняется еще и тем, что в составе ассоциантов этих инфекций все чаще стали обнаруживать и дрожжеподобные грибы (Р.Н. Реброва, 1989; Н.П. Блинов, 1994; M.J. Spebar, 1979), что значительно затрудняет возможности хшютерапии таких больных.

Важными причинами, затрудняющими профилактику и лечение мшсетчтфе:.сций у больных с ожогами, являются также широкое распространение, способность к длительному выживанию условно-патогенных микробов во внешней среде (В.В. Влодавец, 1986) и развитие смешанных инфекций на фоне снижения иммунологического статуса организма больных (И.И. Колкер, 1980; Р.И. Муразян и др., 1984).

Применение химиотерапевтическпх препаратов на фоне снижения механизмов антиинфекционной защиты создает усцовия для селекции возбудителей с определенными биологическими свойствами (лекарственная устойчивость, вирулентность). Это, в конечном результате, оказывает существенное влияние на течение и исход инфекционного процесса у ожоговых больных. Выявить такую тенденцию в самом начале инфекционного прогресса и

предупредить . ее развитие возможно при изучении структуры популяций возбудителей микст-инфекций. Однако, в'литературе мы не обнаружили работ, посвященных этому вопросу. До настоящего времени не изучалось также взаимное влияние ассоциантов-возбудителей, характер и динамика изменения их популяций по конкретным признакам на протяжении инфекционного процесса в организме при смешанных инфекциях и влияние на этот процесс иммунного статуса организма. Вместе с тем, это может обеспечить возможность расшифровки механизмов формирования госпитальных штаммов условно-патогенных микроорганизмов.

Следует также учитывать, что развитие инфекционного процесса в ране, значительно усугубляет иммунологическую недостаточность и еще больше снижает эффективность лечебных мероприятий (И.И. Колкер, 1981; К.Г. Мэйхол, 1990). Поэтому в терапевтической практике больных с ожоговой травмой, наряду с антибактериальным лечением, особое значение приобретает коррекция иммунологического статуса организма с помощью различных биологически активных веществ, повышающих защитные силы организма.

Таким образом, смешанные инфекции ожоговых ран являются одной из актуальных проблем инфекционной патологии человека, для решения которой необходим комплексный подход, включающий изучение клинически значимых биологических свойств этиологических агентов и поиск рациональных путей печения мшсст-инфекций.

Цель исследование. Изучить на уровне популяций взаимодействие микробов-ассоциантов - возбудителей мшест-ипфекций на их биологические признаки in vitro и in vivo в зависимости от уровня иммунологической защиты и разработать способы повышения антиинфекционной резистентности организма при смешанной инфекции ожоговой травмы в эксперименте.

Основные задачи исследовании. 1} Изучить структуру популяций по биологическим свойствам клинических штаммов микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, выделенных от больных со смешанными инфекциями при ожоговых травмах.

2) Определить взаимное влияние возбудителей на изменение структуры микробных популяций в условиях одновременного их культивирования in vitro и in vivo в динамике экспериментальной смешанной инфекции на фоне ожоговой травмы.

3) Изучить изменения в структуре популяции возбудителен в динамике экспериментальной смешанной инфекции ожоговой

травмы после применения иммуномодуляторов (тактивин, пуклеинат натрия, терридеказа) и стабилизатора клеточных мембран - лилокаина.

4) Определить возможную зависимость динамики и характера изменений структуры популяции возбудителей смешанных инфекций от уровня иммунной защиты организма и влияние этих изменений на течение и исход инфекционного процесса.

5) Оценить эффективность указанных иммуномодуляторов на течение и исход смешанной инфекции ожоговой травмы в эксперименте.

6) Разработать в эксперименте способы коррекции иммунологической защиты организма с помощью иммуномодуляторов в зависимости от уровня иммунного статуса организма.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В результате проведенных комплексных исследований установлены механизмы формирования госпитальных штаммов, связанные с изменением структуры популяций в динамике инфекционного процесса, обусловленные уровнем антиинфекционной защиты организма и взаимным влиянием возбудителей-ассоциантов микст-инфекций:

- впервые изучена динамика изменения свойств возбудителен микст-инфекций ожоговой травмы на уровне популяций ассоциантов, участвующих в инфекционном процессе;

- установлены разнонаправленные изменения в структуре популяций возбудителей микст-инфекций по клинически значимым биологическим признакам в зависимости от уровня иммунного статуса организма и характера взаимоотношений возбудителей-ассоциаптов микст-инфекций;

- показано, что высокая антагонистическая активность клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa in vivo по отношению к Staphylococcus aureus и Escherichia coli обеспечивает псевдомонадам преимущества для размножения в ране с увеличением при этом их потенциальной патогенности;

- впервые экспериментально установлено наличие выраженного синергизма между P.aeruginosa и грибами Candida spp. in vitro и in vivo, что обеспечивает им длительное сосуществование во внешней среде и значительно повышает тяжесть инфекционного процесса у животных с ожоговой травмой;

выявлена высокая частота и широкий диапазон антилизощшной активности у P.aeruginosa, Candida spp., E.coli и отсутствие этого признака у S.aureus, выделенных от больных с

микст-инфекциями ожоговых ран. Для Р.аегидшоэа установлена прямая коррелятивная связь между антилизоцимной активностью и другими факторами вирулентности, что может служить маркером для определения потенциальной патогенности Р.аегицшоха;

- установлена возможность изменения свойств возбудителей мшсст-ннфекций в ходе инфекционного процесса в сторону снижения в составе популяций особей с признаками вирулентности и множественной лекарственной устойчивости путем повышения иммунного статуса организма с помощью иммуномодуляторов, что обеспечивает выраженный терапевтический эффект и предотвращает возможность формирования культур с признаками госпитальных штаммов.

Практические значимость. I) Установлена высокая частота распределения клинически значимых признаков вирулентности и лекарственной устойчивости у Р.аегарпоБа, Б-аити, Е.соИ и С.аШсапз, выделенных от больных со смешанными инфекциями ожоговых травм, что необходимо учитывать при разработке лечебно-профилактических мероприятий в клинических условиях.

2) Смешанная инфекция ожоговой травмы при изученных комбинациях ассоциантов приводит к существенному повышению тяжести инфекционного процесса. Наиболее неблагоприятное течение инфекционного процесса вызывает ассоциация Р.аеги^пова с С.аШсапз.

3) При иммунодефицитом состоянии животных с ожоговой травмой и микст-инфекцией наблюдаются изменения в структуре популяций возбудителей, способствующие формированию культур с признаками госпитальных штаммов.

4) Показана выраженная терапевтическая активность нуклеината натрия и тактивина при лечении экспериментальной микст-инфекции ожоговой травмы. Наибольший терапевтический эффект отмечен после применения комбинации нуклеината натрия с лндокаином, обеспечивающая 100% выживаемость животных.

5) Полученные результаты могут послужить основанием для разработки мероприятий с целью повышения эффективности лечения больных с микст-инфекциями ожоговых ран в клинических условиях и предупреждения формирования госпитальных штаммов.

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

методические рекомендации для практических медицинских работников "Актуальные вопросы профилактики

внутрибольничных инфекций" (утверждены Курским областным отделом здравоохранения 20.07.96);

методические рекомендации "Способ повышения иммунологической защиты организма при смешанной инфекции ожоговой травмы (утверждены Курским областным отделом здравоохранения 16.08.96).

Результаты работы используются в практической работе областной и городской больниц гор. Курска, учебных курсах и научно-исследовательской работе Курского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту. 1) Популяции штаммов возбудителей, выделенные от больных с микст-инфекциями ожоговых травм, обладают выраженной гетерогенностью по признакам лекарственной устойчивости и вирулентности.

2) При смешанном культивировании in vitro и при экспериментальной микст-инфекции in vivo между возбудителями -ассоци антами проявляются различные типы взаимодействия. Псевдомонады обладают высокой антагонистической активностью по отношению к стафилококкам и килечным палочкам. В ассоциации псевдомонад с грибами Candida spp. проявляется выраженный синергизм, что значительно повышает тяжесть течения инфекционного процесса у животных с ожоговой травмой.

3) Изменения в структуре популяций возбудителей микст-инфекций ожоговых травм находятся в прямой зависимости от уровня инфекционной защиты организма и характера взаимоотношений между ассоци антами.

4) Применение с целью лечения экспериментальной микст-инфекции ожоговой травмы тактивина, нуклеината натрия и, особенно, нуклеината натрия с лидокаином, способствует восстановлению иммунного статуса животных с микст-инфекцией на фоне ожоговой травмы и значительно увеличивает их выживаемость.

Апробациа работы. Основные положения диссертационной работы доложены на итоговых научных конференциях Курского медицинского университета (1992 - 1995 г.г.), Юбилейной конференции, посвященной 60-летию КГМУ "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины" (Курск, 1995), I Международном конгрессе по иммунореабшштации (Дагомыс, 1994), XII Российской научной конференции " Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск. 1995), Международной

конференции "Иммунодиагностика и иммунотерапия" (Витебск, 1995).

Публикации. Основные положения диссертационной работы отражены в 16 научных работах. Подана заявка на изобретение (получена приоритетная справка N 95-116072 от 22.09.95), зарегистрировано 3 рационализаторских предложений и 7 внедрений.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 238 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 таблицами, В рисунками и 4 графиками. Состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания объектов, материалов и методов (глава II), результатов собственных исследований (главы III, IV), обсуждения полученных результатов (глава V), выводов и библиографического указателя, включающего 388 отечественных и 165 зарубежных источников (всего 553).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект, материалы и методы исследовании. В работе изучено 170 штаммов синегнойной палочки, 110 штаммов стафилококка, 40 штаммов грибов рода Кандида и 20 штаммов кишечной палочки, выделенных от больных со смешанными инфекциями ожоговых ран в областной и городской больницах гор. Курска в период с 1989 по 1995 г.г.

Эксперименты выполнены на мышах линии СВА и крысах Вистар.

Для изучения структуры популяций микроорганизмов по признакам лекарственной устойчивости получали изолированные колонии путем рассева 0,1 мл суточной бульонной культуры исследуемых штаммов на чашке с мясо - пептонньш агаром, после чего петлей пересевали 100 изолированных колоний на чашки с мясо - пептонньш агаром с различными концентрациями антибиотиков (от 25 до 400 мкг/мл) и на чашку с МПА без антибиотиков (контроль). При сравнении популяций микроорганизмов учитывали процент колоний, выросших на чашках с антибиотиками в максимальных концентрациях. При этом использовали антибиотики, к которым изучаемые микроорганизмы обладают природной чувствительностью: для псевдомонад - карбенициллин, стрептомицин, канамицин, полимиксин М и гентамицин; чувствительность кишечных палочек изучали по отношению к карбенициллину, стрептомицину, эритромицину и тетрациклину;

стафилококка - по отношению к бензилпенициллину, стрептомицину, тетрациклину и карбенициллину; грибов Candida spp. - по отношению к леворину и нистатину.

Популяцию микробов - ассоциантов из ожоговой раны получали путем отпечатков с помощью стерильных бархатных штампов размером 1x1 см2 на поверхность агаризованных элективных питательных сред: среда, содержащая N цетилпиридинийхлорид (ЦПХ) служила для псевдомонад; среда Сабуро с генгамицином - для трибов рода Кандида; молочно -солевой агар служил для выделения стафилококка; среда Эндо - для кишечных палочек. Из полученных посевов отбирали по 100 колоний с последующим изучением структуры популяций по отношению к выше указанным антибиотикам.

Структуру популяций по признакам гемолитической активности изучали путем пересева 100 изолированных колоний со сред первичного посева на чатпки с кровяным агаром, по протеолитической активности (для псевдомонад) - на чашках Петри со свернутой лошадиной сывороткой, по признаку антилизоцимной активности по методу О.В. Бухарина (1985) в модификации JI.C. Зыковой и O.E. Челпаченко (1994).

Процесс фагоцитоза микроорганизмов полиморфноядерными лейкоцитами периферической крови изучали в соответствии с общепринятой методикой с вычислением относительного содержания активных фагоцитов и количества фагоцитируемых микроорганизмов в расчете на один фагоцит. Кровь у животных брали из супраорбитальной вены. С целью определения завершенности фагоцитоза применяли методику З.Е. Матусис и С.И. Пылаевой (1972) в модификации, предложенной на нашей кафедре. Показатель завершенности фагоцитоза (% погибших микроорганизмов) определяли исходя из пропорции числа выросших колоний в контроле и после 2-часовой инкубации в термостате.

Активность бактерицидных систем лейкоцитов изучали по наличию лизосомальных катионных белков в цитоплазме лейкоцитов периферической крови в мазках, окрашенных бронфеноловым синим по методике, предложенной М.Г. Шубич (1974). После микроскопии мазков определяли средний гистохимический показатель (СГП), т.е. отношение количества лейкоцитов, окрашивающихся с разной интенсивностью, к общему числу подсчитанных нейтрофилов (100).

Оценку резервной функции фагоцитов проводили по реакции восстановления нитросинего тетразолия (HCT - тест), предложенной

М.Е. Виксман и А.Н. Маянским (1979) в нашей модификации (удост. КГМУ N 1109-94 от 18.05.94). Реакция основана на учете внутриклеточных отложений диформазана - нерастворимой формы восстановленного нитросинего тетразолия. Показателем фагоцитарного резерва нейтрофилов (ФРН) служила разность между показателем стимулированного и спонтанного НСТ - теста.

С целью более детального изучения динамики микробной обсемененности внутренних органов использовали метод определения "бактерийного индекса" селезенки, разработанный В Л. Троицким. Показателем селезеночного индекса являлась рассчетная величина из числа выросших колоний и веса органа в мг после посева от нескольких животных.

Наличие специфических антител к синегнойным бактериям и их титр в исследуемых сыворотках изучали в РИГА с применением эритроцитарного диагностикума, полученного из лаборатории ожоговых инфекций - ИЭМ АМН им. Н.Ф. Гамалея. Реакцию ставили в аппарате Токкачи по общепринятой методике.

Неспецифическое ингибирование активности антител М, которое обусловлено находящимся в сыворотке кровн естественным ингибирующим фактором (ЕИФ), определяли с помощью реакции ингибирования агглютинации (РИА). Перед постановкой реакции в исследуемой сыворотке и тест - сыворотке определяли наличие антител класса М по их способности инактивироваться в присутствии 2-меркаптоэтанола. Показателем РИА считали индекс ингибирования (ИИ) - отношение суммарного титра контрольного ряда (тест-сыворотки) к суммарному титру опытного ряда. РИА считали положительной, если ИИ был равен 1,2 и более ( Н.В. Журавлева, 1985).

Ожог Ш-В степени площадью около 30% поверхности -ела получали под легким эфирным наркозом на дешшлированном участке кожи спины животного с помощью устройства, поддерживающего температуру обжигающей поверхности на уровне 100°С, при экспозиции 8 сек (В.В. Минухин и соавт., 1986).

В статистической обработке результатов исследования использовали критерии Стьюдента, X2, Вилкоксона - Манна - Уитни (Е.В. Гублер, 1978). Корреляционный анализ некоторых данных проводили на электронно-вычислительной машине "Искра - 226" с вычислением коэффициента корреляции и его ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ

Всего изучено 340 штаммов микроорганизмов, выделенных от больных с ожоговой травмой, осложненной микст-инфекцией. По видовому составу это были: 170 штаммов Pseudomonas aeruginosa, 110 штаммов Staphylococcus (80 - S.aureus и 30 - S.epidermidis), 40 штаммов дрожжеподобных грибов рода Candida (30 - C.albicans, 5 -C.tropicalis, 5 - C.krusei)n 20 штаммов Escherichia coli.

Определение видовой принадлежности культур проводили по общепринятым методика с изучением морфологических, ферментативных, антигенных и других свойств.

Основным участником изученных нами ассоциаций возбудителей микст - инфекций, была P.aeruginosa, что согласуется с данными литературы о высокой высеваемостп в стационарах от больных с ожогами синегнойных бактерий (Р.И. Муразян и соавт., 1984).

Успех антибиотикотерапии при любой инфекции определяется, прежде всего, чувствительностью возбудителей к применяемым препаратам. Трудности при лечении смешанных инфекций у ожоговых больных объясняются высокой естественной резистентностью возбудителей ко многим антибиотикам, применяемым в клинике, и неодинаковым спектром чувствительности к ним отдельных видов, участников ассоциаций.

Это подтверждается и нашими исследованиями. Изученные нами штаммы всех видов обладали множественной резистентностью. Но при этом, у синегнойных бактерий сохранилась высокая чувствительность к гентамицину (97,1%), к полимшссину М (93,5%) и карбеяициллину (71,8%). Штаммы стафилококка были наиболее чувствительны к стрептомицину и тетрациклину (72,1%), в то время как к харбешщиллину сохранили чувствительность только 49,5% штаммов, а к бензшшенициллину - 45,0%. Грибы Candida spp. были более чувствительными к леворину (87,5%) по сравнению с нистатином (80,0). Кишечные палочки сохранили одинаковую чувствительность (60,0%) к стрептомицину, карбенициллину и тетрациклину, к эритромицину чувствительными были всего лишь 25% штаммов (табл. 1).

Одним из основных факторов, определяющих возникновение и тяжесть инфекционного процесса, является патогенность возбудителя, представляющая собой сумму различных

Таблица 1

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ О МИКСТ-ИНФЕКЦИЯМИ.

Виды микроорганизмов Всего штаммов Из них чувствительных к антибиотикам, 7.

Стрептомицин Кана-мицин Карбе-ницилин Гента-мицин Поли-микс.М Бензил пениц. Тетрациклин Леворин Нистатин Эритромицин

P.aeruginosa 170 12,4 21,8 71,8 97,1 93,5 «I и м м 11

Staphylococcus 110 72,1 it 49,5 И и ' 45,0 72,1 и и II

Candida spp. 40 II и и If к н «1 87,5 80,0 II

E.coli 20 60,0 и 60,0 1* >1 и 60,0 и II 25,0

ПРИМЕЧАНИЕ: " - исследования не проводились.

биологических признаков, обеспечивающих ему способность к проникновению и размножению в организме хозяина. Изучению этих признаков и динамики их изменения в ходе инфекционного процесса, в том числе и на популяционном уровне, и была посвящена основная часть настоящей работы. А поскольку объектом исследования были смешанные инфекции, учитывалось также взаимное влияние ассоциантов на проявление признаков вирулентности.

В настоящее время в Клинической микробиологии активно обсуждаются условия развития и механизмы бактериальной персисгенции (О.В. Бухарин, 1994; Л.С. Зыкова, 1994), которые обеспечивают длительное выживание возбудителя в организме хозяина. Особого внимания заслуживают факторы, секретируемые микробной клеткой и блокирующие механизмы естественной защиты, в связи с чем нарушается иммунный гомеостаз организма и создаются условия для персистенции возбудителя.

В связи с этим, в последние годы большое внимание уделяется изучению антилизоцимной активности микроорганизмов. Особенно важным, в связи с рассматриваемой нами проблемой, представляется выявление связи между способностью ira активировать лизоцим хозяина и вирулентностью микроорганизм ов.

В доступной нам литературе мы не обнаружили сведений о корреляции антилизоцимной активности условно-патогенных микробов с их вирулентностью.

С учетом этого, у всех участников ассоциаций, выделенных от больных, было изучено распространение признака антилизоцимной активности. Установлено, что из 170 штаммов P.aeruginosa 150 (88,2%) обладали антилизоцимной активностью, а из 110 штаммов Staphylococcus - только 2 (1,8%); 95,0% штаммов дрожжеподобных грибов и 80,0% штаммов E.coli также проявляли антилизоцимную активность.

Такая значительная степень распространения "маркера антилизоцимности" у бактерий и грибов, выделенных из очагов воспаления, по видимому, имеет свою биологическую целесообразность.

Представляют интерес впервые полученные нами данные о корреляции антилизоцимной активности псевдомонад с другими признаками их патогенносга. Этими исследованиями установлено наличие выраженной прямой связи между антилизоцимньш действием и проявлением гемолитических и протеолитических свойств (r=0,892 ± 0,090 и 0,795 ± 0,094 соответственно).

Таким образом, полученные нами данные о высокой антилизоцимной активности клинических изолятов условно-патогенных микроорганизмов и ее тесной корреляционной связи с другими факторами вирулентности на примере псевдомонад позволяют высказать предположение о том, что признак антилизоцимной активности может служить одним из дополнительных тестов для характеристики вирулентности микробных культур.

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ АССОЦИАНТОВ-ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКСГ-ИНФЕКЦИЙ ОЖОГОВЫХ РАН IN VITRO И IN VIVO

По данным литературы (Р.И. Муразян и соавт., 1984; R. Cohen и соавт., 1983), у больных с гнойно-воспалительными процессами, особенно при продолжительном пребывании их в ожоговых стационарах, нередко наблюдается смена возбудителей. При этом вместо выделявшихся в начальном периоде стафилококков, кишечных палочек и других видов микроорганизмов обнаруживаются синегнойные бактерии сначала в ассоциациях, а затем нередко, и в монокультуре.

Механизм этих процессов можно объяснить на основании полученных нами результатов, указывающих на высокую антагонистическую активность синегнойных бактерий по отношению к стафилококкам и кишечным палочкам. Эти данные получены при использовании метода определения антагонизма по Frederig (1948). Важно также подчеркнуть, что золотистые стафилококки обладали статистически достоверно меньшей чувствительностью (Р<0,05) к антагонистическому действию псевдомонад по сравнению с эпидермальными стафилококками.

Антагонизм псевдомонад в отношении кишечных палочек был менее выраженным по сравнению со стафилококками. Но достоверной разницы между чувствительностью кишечных палочек и золотистых стафилококков к ниогщнам псевдомонад не обнаружено (Р>0,05).

В литературе высказывается мнение (Е.Б. Брусина, МЛ. Лившиц, 1985), о том, что перекрестное инфицирование в стационарах имеет однонаправленный характер, т.е. к стафилококковой инфекции присоединяется синегнойная. Обратного процесса авторы не наблюдали. В наших опытах in vitro и in vivo подтвердился однонаправленный характер антагонистических взаимоотношений между синегнойными

б ¡истериями и стафилококками, а также кишечными палочками. Ни один из испытанных 110 штаммов стафилококка и 20 штаммов кишечной палочки не задерживал роста псевдомонад. На этом фоне результаты наших исследований позволяют считать, что антагонистическая активность синегнойных палочек лежит в основе механизма их способности вытеснять из раны стафилококки и кишечные палочки н на поздних сроках пребывания больных в стационаре высеваться в монокультуре.

Заслуживают внимания впервые полученные нами данные по изучению антагонистического действия псевдомонад по отношению к дрожжеподобным грибам рода Кандида. Результаты исследования позволили установить, что ни один из 170 изученных штаммов синегнойных палочек не обладал антагонистической активностью по отношению к грибам. При этом важно подчеркнуть, что и дрожкеподобные грибы, в свою очередь, не только не задерживали рост псевдомояад, а, наоборот, усиливали их размножение. Это проявлялось в усилении роста псевдомонад вокруг колоний грибов Кандида при совместном их культивировании (метод "кормилок"). Отсюда допустимо предположение, что синергизм данных микроорганизмов является одной из причин того, что в последнее время, по данным литературы, все чаще стали обнаруживаться ассоциации возбудителей смешанных инфекций ожоговых ран с участием дрожжеподобных грибов.

Высокая антагонистическая активность синегнойных бактерий по отношению к стафилококкам и кишечным палочкам и синергизм их с дрожжеподобньши грибами проявляется и при совместном культивировании in vitro. В специально поставленном эксперименте установлено, что при совместном культивировании культур еянегнойной палочки + стафилококка, синегнойной + кишечной палочек схшегнонной палочки + грибы рода Кандида сроки окончания высеваемостн у разных видов культур существенно отличались. Так, в этих условиях стафилококк на 20, а кишечная палочка на 25 сутки исследования пз ассоциаций не высевались, в то время как высеваемосггь псевдомонад сохранялась на достаточно высоком уровне (4x10s п 3x105 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл соответственно) - трафик 1,2.

Жизнеспособность ассоциация из псевдомонад и грибов наблюдалась до 60 суток включительно. Максимальное количество КОЕ после высева обеих культур наблюдалось на 30 сутки исследования (8x107 в 1 мл - псевдомонады и 5x107 в 1 мл - грибы). Отмечался интересный факт: в количестве жизнеспособных клеток

ГРАФИК 1.

аЯИБАЕМОСТЬ СИНЕГНОЙКОЙ ПАЛОЧКИ И СТАФИЛОКОККА В АССОЦИАЦИИ IN VITRO.

КОЕ/М

2 -

; Ч..........................

о Г I • I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 СУТКИ

О 4 8 12 16 20

ПРИМЕЧАНИЕ: 1 - СИНЕГНОЙНАЯ ПАЛОЧКА, 2 - СТАФИЛОКОКК.

ГРАФИК 2.

ВЫЖИВАЕМОСТЬ СИНЕГНОЙНОЙ И КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧЕК В АССОЦИАЦИИ IN VITRO.'

ПРИМЕЧАНИЕ: 1 - СИНЕГНОЙНАЯ ПАЛОЧКА, 2 - КИШЕЧНАЯ ПАЛОЧКА.

двух культур наблюдались достоверные отличия с превалированием псевдомонад на всем протяжении исследования. Однако, высеваемость как синегнойных бактерий^ так и грибов, прекратилась почти одновременно. В виде единичных колоний обнаруживался рост на 60 сутки грибов, а на 70 - псевдомопад (график 3).

Л Л ГРАФИК 3.

ВЫЖИВАЕМОСТЬ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ К ГРИБОВ РОДА КАНДИДА В

АССОЦИАЦИИ IN VITRO.

mt/нй

oL-j_i_i_I_i_i ■ I ■ . i 1.......Г", , I СУТКИ

0 20 40 60 so

ПРИМЕЧАНИЕ: 1 - СИНЕГНОЙНАЯ ПАЛОЧКА, 2 - ГРИБЫ.

Полуденные данные по выживаемости представителей разных ассоциаций in vitro, были подтверждены и в опытах in vivo. Установлено, что при заражении ожоговой раны одинаковыми дозами стафилококка и синегнойной палочки, синегнойной и кишечной палочек, синегнойной палочки и грибов, уже на 7 сутки исследования отмечено изменение соотношения КОЕ стафилококка (350 на 1см2) и синегнойной палочки (650 на 1 см2); кишечной палочки (400 на 1 см2) и синегнойной (600 на 1см2). На 12 сутки (для стафилококка) и на 14 сутки (для кишечной палочки) при высеве из раны вырастали только единичные колонии стафилококка и

кишечной палочки при достаточно высокой высеваеыости псевдомонад (150 КОЕ/см2).

В тех же условиях количественные отличия жизнеспособных синегнойных палочек и грибов были незначительными. Тем не менее, на всем протяжении эксперимента отмечалось превалирование псевдомонад (800 КОЕ/см2 и 600 КОЕ/см2 соответственно на 14 сутки наблюдения). Высеваемость грибов из раны прекратилась на 22 сутки, в то время как высеваемость псевдомонад еще была на уровне 150 КОЕ/см2.

Особого внимания заслуживает динамика раневого процесса после заражения ассоциацией синегнойной палочки и грибов. Состояние ожоговой раны у этих животных на протяжении всего срока наблюдения (22-е сутки включительно) усугублялось. По истечении этого срока не наблюдалось даже признаков заживления. В то же время, заживление раны, инфицированной ассоциацией стафилококк + синегнойная палочка заканчивалось на 20-21 су псы, а ассоциацией кишечная + синегнойная палочки - на 18-19 сутки.

В итоге можно заключить, что антагонистическая активность псевдомонад обеспечивает им конкурентноспособность в ассоциациях со стафилококками и кишечными палочками в ране. Что касается ассоциации псевдомонады + грибы рода Кандида, то полученные впервые нами данные, позволяют предположить, что грибы не только влияют на размножение синегнойных бактерий, но, очевидно, имеет место взаимное влияние ассоциантов, проявляющееся в повышении их вирулентности, что и отражается на клиническом состоянии ожоговой раны.

СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКСГ-ИНФЕКЦИЙ ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ СВОЙСТВАМ

В настоящее время в литературе широко обсуждается вопрос о значении неоднородности (гетерогенности) микробных популяций по биологическим признакам в возникновении и распространении госпитальных инфекций (В.Д. Беляков и соавт., 1976; А.П. Кра-сильншсов, 1985). При этом наибольшее значение придается гетерогенности популяций по признакам вирулентности и лекарственной устойчивости. Неоднородность популяций по этим и другим признакам создает возможность селекции наиболее приспособленных особей при переходе возбудителя из внешней среды в организм и в обратном направлении, что увеличивает шансы для сохранения вида в меняющихся условиях (В.Д. Беляков и соавт., 1985).

Эти механизмы, по-видимому, играют существенную роль при формировании госпитальных штаммов различных видое условно-патогенных микроорганизмов.

Такое предположение подтверждают полученные нами результаты после изучения гетерогенности микробных популяций участников ассоциаций по признакам лекарственной устойчивости, гемолитической, протеолитической и антилизоцимной активности.

Полностью разделяя мнение А.П. Красильникова и A.A. Адарчешсо (1985), мы используем термин "популяция" для обозначения совокупности особей (вариантов), относящихся к одному штамму.

Установлено,что популяции свежевыделенных от больных штаммов всех изученных видов микроорганизмов, состоят из особей, которые отличаются по степени чувствительности к антибиотикам, антилизоцимной активности, способности продуцировать гемолизин и протеазы.

Так, в популяциях псевдомонад обнаруживалось до 80,0 ± 2,7 особей, устойчивых к карбеницшшину, до 79,0 ± 2,2 - к стрептомицину, 80,0 ± 2,5 особей были устойчивыми к канамшщну и 5,0 ± 0,01 - к полимиксину М. Гетерогенными по чувствительности к антибиотикам оказались популяции и других изученных видов микроорганизмов.

Такая гетерогенность популяций обнаруживается как у штаммов, выделенных от больных, так и у культур, полученных в эксперименте после заражения ожоговой раны. Отсюда, при наличии такой неоднородности микробных популяций, создается возможность селекции штаммов с определенными свойствами в результате воздействия различных лечебных препаратов, в частности, антибиотиков (по признакам лекарственной устойчивости) и взаимодействия с организмом больных с ослабленной антиинфекционной защитой (по признакам вирулентности), т.е., формирования штаммов с множественной лекарственной устойчивостью и высокой вирулентностью.

Таким образом, на основании результатов изучения биологических свойств микробов-возбудителей смешанных инфекций ожоговых травм, мы считаем возможным рекомендовать при разработке тактики лечебных мероприятий учитывать н такие свойства, как антилизоцимная активность, высокая антагонистическая активность псевдомонад по отношению к стафилококкам и кишечным палочкам, синергизм псевдомонад с грибами рода Кандида и выраженная гетерогенность микробных

популяций по признакам лекарственной устойчивости и вирулентности.

СОСТОЯНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ, ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА И

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ СМЕШАННЫХ ИНФЕКЦИЯХ ОЖОГОВОЙ ТРАВМЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Как следует из анализа литературы, смешанные инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, чаще всего развиваются на фоне сниженной антиинфекционной защиты организма, в частности, у больных с ожоговой травмой. Кроме того, развитие инфекционного процесса значительно увеличивает уже имеющийся у больного иммунодефицит (И.И. Колкер, С.М. Буль, 1981; В.П. Венцель, 1990).

В этих условиях лечебные мероприятия, направленные на подавление возбудителя, по видимому, не всегда могут обеспечить положительный результат. Очевидно поэтому в комплексное лечение таких больных должны быть включены мероприятия, способствующие повышению их антиинфекционной защиты, так как полное очищение макроорганизма от возбудителя можно достичь только при активном участии его защитных механизмов.

В связи с этим, мы попытались установить возможность повышения антиинфекционной защиты организма у экспериментальных животных с микст-инфекцией на фоне ожоговой травмы с помощью иммуномодуляторов.

В доступной литературе отсутствуют сведения о применении иммуномодуляторов для лечения микст-инфекций ожоговых травм. Вместе с тем, при других нозологических формах, сопровождающихся наличием иммунодефицита, широко применяются в качестве иммуностимуляторов тактивин (Р.В. Петров, 1980; В.Я. Арион, 1984 и др.), нуклеинат натрия (В.М. Земсков, 1973; А.М. Земсков и соавт. и др.).В последние годы появились сообщения об иммуностимулирующем эффекте микробной протеазы - терридеказы (Г.Ф. Карпенко, 1986; Л.Г. Прокопенко и соавт., 1994), а также о выраженном стабилизирующем действии лидокаина на клеточные мембраны (О.Г. Грек и соавт., 1988; В.И. Шарапов и соавт., 1990) и его иммуномодулирующих свойствах (И.Н. Ласкова, 1995).

Установлено (Г.П. Козинец и соавт., 1983; Р.И. Лифшиц и соавт., 1983), что нрн ожогах происходит нарушение упорядоченности расположения липидов в клеточных мембранах за счет активации фосфолипазы Аг. Лидокаин ингибирует фосфолипазу Аг (В.И. Шарапов и соавт., 1990), что приводит к стабилизации клеточных мембран и восстановлению их функции.

Эти данные послужили основанием для использования в наших экспериментах тактивiraa, нуклеината натрия, терридеказы и лидокаина для повышения неспецифической резистентности при смешанных инфекциях на фоне ожоговой травмы.

В качестве критериев оценки функциональной активности системы антиинфекционной защиты организма мы использовали показатели фагоцитоза и гуморального иммунитета, поскольку в литературе имеются сведения о том, что при ожоговой травме в значительной степени нарушаются функции фагоцитоза и антителообразования (И.И. Колкер, 1980; A.B. Bjomson, 1984). Считают, что именно эти факторы являются наиболее значимыми в ликвидации местного гнойно-воспалительного процесса в ране.

Исследования проводили на мышах линии СВА и Крысах Вистар, которые были разделены на серии и группы (от 20 до 25 животных в каждой) в зависимости от условий опыта и схемы введения иммуностимуляторов:

I серия - ежедневное (1раз в сутки) орошение ожоговой травмы терридеказой в течение 2 дней после инфицирования ожоговой травмы;

II серия - ежедневное введение тактивина в течение 2 дней, начиная с первого дня, после воспроизведения ожога и его инфицирования.

III серия - ежедневное введение в течение двух дней нуклеината натрия, начиная с первого дня после воспроизведения ожога и его инфицирования.

IV серия - ежедневное введение в течение 2 дней нуклеината натрия + лидокаина, начиная с первого дня после воспроизведения ожога и его инфицирования.

В качестве контрольных были следующие группы животных:

- интактные, которые по тем же схемам вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия;

- животные, у которых воспроизводили только ожог;

- животные с ожоговой травмой и микст-инфекцией.

В каждую контрольную группу входило не менее 20 животных.

Терридеказу растворяли на изотоническом растворе хлорида натрия и в дозе 2ПЕ на животного в объеме 0,3 мл орошали

ожоговую рану. Тактивин по 0.3 мкг/кг в объеме 0,1 мл вводили подкожно. Раствор нуклеината натрия на стерильном изотоническом растворе хлорида натрия в дозе 12 мг на мышь в объеме 0,1 мл вводили внутримышечно; раствор нуклеината натрия на лидокаине в дозе 8 мг на мышь в объеме 0,1 мл вводили внутримышечно (лидокаина в 0,1 мл раствора содержалось 10 мкг/кг).

Ожоговую поверхность орошали смесью живых культур, полученных от больных, через сутки после воспроизведения ожога. Для создания моделей микст-инфекции были взяты наиболее часто встречающиеся варианты ассоциаций микробов-возбудителей смешанных инфекций у ожоговых больных, изученные нами в предыдущей главе работы: синегнойная палочка + стафилококк, синегнойная палочка + грибы рода Кандида, синегнойная палочка + кишечная палочка.

Наблюдения за животными проводили в течение 22 суток, ежедневно учитывая количество павших животных. Информацию об особенностях действия стимуляторов на фагоцитарную функцию и бактерицидные системы нейтрофилов получали после взятия крови у животных из супраорбнтальной вены на 3, 7 и 14 сутки с момента инфицирования. В эти же сроки убивали по 3 мыши для определения селезеночного индекса.

Динамику изменения структуры популяций определяли по результатам изучения признаков вирулентности и лекарственной устойчивости у 100 колоний каждого ассоцианта в те же сроки исследования.

Полученные нами экспериментальные данные согласуются с данными литературы о развитии иммунодефицита при ожоговой травме. У животных с ожоговой травмой все исследуемис показатели фагоцитоза (фагоцитарная активность, интенсивность и завершенность фагоцитоза, фагоцитарный резерв нейтрофилов -ФРН и продукция катнонных белков по среднему гистохимическому показателю - СГП) были статистпчесхи достоверно ниже (Р<0,05), чем у интактных животных. Значительное снижение этих невысоких показателей наблюдали у животных после воспроизведения у них смешанной инфекции на фоне ожоговой травмы (Р<0,01), особенно инфицированных ассоциацией Р.аега^по5а + С.аИлапБ. Такие низкие уровни изучаемых показателей у нелеченных животных находятся в прямой связи с нарастанием в структуре популяций микробов - возбудителей смешанных инфекций вирулентных и резистентных к антибиотикам особей (табл. 2). Есть основания предположить, что указанные изменения свойств возбудителей и

MJil irUTi/li vn Wli •/ 1\4 I 1Л A AW iMiWVAW4 JA

МИКСТ-ИНФЕКЦИЙ ОЖОГОВЫХ ТРАВМ.

Признак % КОЛОНИЙ В ПОПУЛЯЦИЯХ СТРУКТУР

P.aeruginosa С.albicans S.aureus E.coli

Показатели в разные сроки исследования (сутки) М ± ш (п=25)

3 п 14 3 7 14 3 7 14 3 7 14

Устойчивость к: Кароенициллину т ±9f;§ ±fl?;8х II II II т ±7E;g х т т Л:2

Стрептомицину 79,0 ± 2,2 80,0 ± 1,9 96,0 X ± 1,6 II II Н 81,0 ± 2|б 81,0 ± 1,9 84,0 ± 3,2 68,0 ± 2|4 68,0 ± 1,9 69,0 + 3,1

Канамицину 80,0 ± 2,5 82,0 ± 2,1 96,0 X ± 2,3 II II К II II II II II II

Пслиыиксину М 5,0 ± 0,1 5,0 ± 0,3 10,0 X ± 0,3 II II II М II II II II • 1

Еензилпенициллину «1 11 II • 1 II 50,0 ± 2,4 65,0 ± 1,2 75,0 X ± 3,1 II II II

Тетрациклину ft II II II И и 82,0 ± 2,2 82,0 ± 1,3 83,0 i 2,0 45,0 ± 1,8 45,0 ± l)2 46,2 ± 2,5

Эритромицину II II и II м н II «1 II 68,0 ± 2)l 72,0 ± 2, А 83,0 X ± 2'7

Леворину II «1 70,0 ± 2,1 70,0 ± 1,8 73,0 ± 1,6 М II II II II И

Нистатину II II II 75,0 ± 1,9 75,0 ± 1,3 77,0 ± 1,Q II II II II II М

Гемолиз 85,0 ± i;z 92,0 ± 1*5 100,0 X ± 0,01 55,0 ± 2*2 60,0 ± 2', 4 75,0 X ± 2,4 84,0 ± 1|4 90,0 ± 1,5 100,0 X ± Q'OI 70,0 ± 2,8 70,0 ± 1,9 75,0 ± 1,1

Протеслиз 85,0 ± 1,3 92,0 ± 1,7 100,0 X ± 0,01 II II и н II II II II II

А/лизсцкмная активность 60,0 ± 1,8 65,0 ± 1,3 80,0 X ± 0,9 85,0 ± 90,0 ± 1',1 97,0 X ± 1,3 0 0 . 0 65,0 ± 1,9 65,0 ± 1,7 70,0 ± 1^6

ПРИМЕЧАНИЕ: достоверность различий с данными полученными на 3 день исследования - Х=Р<0,05. " - исследования не проводились.

состояния организма обусловили повышение тяжести течения микст - инфекции и низкий процент выживаемости животных. Выживаемость животных только с ожогом составила 83%. В группе животных с ожогом, инфицированным ассоциацией P.aeruginosa +S.aureus и P.aeruginosa + E.coli - 50%, а инфицированным -1 P.aeruginosa + C.albicans, выжило всего лишь 40% животных.

Параллельное изучение эффективности тактивина, нуклеината натрия (НН) и терридеказы на одной модели позволило выявить некоторые особенности каждого препарата. Установлено, что после введения тактивина и НН животным со смешанной инфекцией на фоне ожоговой травмы, наблюдалось повышение изучаемых показателей. Однако уровень этих изменений был неодинаковым в зависимости от применяемого препарата. Тактивин оказывал более выраженный стимулирующий эффект на показатели фагоцитоза, а НН - на ангателообразование.

Однако статистически значимых отличий в стимулирующем эффекте между тактивином и НН обнаружить не удалось. Показатели фагоцитоза (активность, интенсивность,

завершенность), функциональный резерв нейтрофилов, активность неферментных катионных белков были статистически достоверно выше у животных, получавших тактивин и НН, по сравнению с животными контрольной группы (микст - инфекция на фоне ожоговой травмы) - Р<0,01.

Стимулирующий эффект на антителообразование был выше у НН, чем у тактивина. Однако несмотря на незначительные расхождения, статистически достоверный стимулирующий эффект на антителообразование по сравнению с контрольной группой животных отмечался как после применения НН, так и после применения тактивина (Р<0,01). Это согласуется с даннь~ш литературы о том, что стимулирующая активность тактивина и НН наиболее отчетливо проявляется в условиях значительно сниженной иммунореактивности (В.А. Арион, 1982; A.M. Земсков и соавт., 1993 и др.).

Следует отметить, что выживаемость животных в этих группах зависела не только от применяемого препарата, но и от варианта ассоциации микробов - возбудителей смешанной инфекции. В группе животных с ожогом, орошаемым ассоциацией P.aeruginosa + S.aureus, выживаемость составила 92% как после применения тактивина так и после НН; ассоциацией P.aeruginosa + E.coli -выжило 96% животных после применения тактивина и 92% - после НН; а ассоциацией P.aeruginosa + C.albicans - выжило 88% и 84% животных соответственно.

Нами не обнаружена стимулирующая активность на все изучаемые показатели у животных с ожогом и микст - инфекцией изученных ассоциаций, получавших терридеказу. Это не согласуется с данными литературы, где имеются сведения о том, что в экспериментальных условиях после парентерального применения терридеказы отмечался выраженный иммуностимулирующий эффект. Возможно, это связано с тем, что мы применяли терридеказу только наружно (орошение раны).

Таким образом, обобщая полученные результаты, можно констатировать, что наиболее выраженный эффект на показатели фагоцитарного процесса, антителогенез и выживаемость животных оказывают тактивин и нуклеинат натрия. Причем, уровень повышения отдельных показателей после применения тактивина и нуклеината натрия был неодинаковым, что является, по-видимому, результатом различий в механизмах их действия. Наиболее выраженный стимулирующий эффект на антителогенез был зарегистрирован после применения нуклеината натрия, поэтому в следующей серии опытов мы попытались применить НН в сочетании с лидокаином. При этом мы допускали возможность не только безболезненного парентерального введения НН в организм животного, но и возможность их синерщцного действия и, соответственно, повышения терапевтического эффекта за счет мембраяотропного действия лидокаина. В этих опытах доза НН была уменьшена на 1/3, т.е. до 8 мг/мышь и препарат растворяли в 0,1 мл лидокаина.

В результате оказалось, что уровни всех изучаемых показателей во все сроки исследования были статистически достоверно выше (Р<0,05), чем при применении тактивина и НН в отдельности.

В частности показатели фагоцитарного процесса (активность, интенсивность, завершенность), ФРН во всех группах животных, получавших НН с лидокаином, были статистически достоверно выше по сравнению с применением отдельных препаратов во все сроки исследования и даже превышали уровень этих показателей у интактных животных (рис. 1).

Особого внимания заслуживают впервые полученные нами результаты, свидетельствующие о выраженном стимулирующем эффекте НН с лидокаином не только на показатели фагоцитоза, но и на антителогенез, даже утех животных с ожогом, где орошение раны производили ассоциацией P.aeruginosa + С. albicans. Уже на 7 сутки у таких животных обнаруживались катионные белки, в то время как в этой же группе животных после применения препаратов в

РИС. 1.

ПОКАЗАТЕЛИ ФАГОЦИТОЗА У ЖИВОТНЫХ С МИКСТ-ИНФЕКЦИЕЙ В УСЛОВИЯХ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ КН С ЛИДОКАИНОЫ.

НН

ИНТАКТНЬЕ ТАКТИВИН НН

У 90 г

3 7 14

ИНТЕН- П СИВ- О

НОСТЬ К !

А 0 3 А

ЗАВЕР- Т 00

ШЕН- Е 60

НОСТЬ Л 40

3 7 14

3 7 14 3 7 14

Е 20 Й о

+ ЛИДОКАИН Р<0,05

1+

Р<0,05

г*

3 7 14 Р<0,05

гЬ

СУТКИ

СУТКИ

3 7 14 3 7 14 3 7 14 3 7 14 ПРИМЕЧАНИЕ: ДОСТОВЕРНОСТЬ РАЗЛИЧИЙ ОТНОСИТЕЛЬНО ПРИМЕНЕНИЯ ТАКТИВЙНА И НН ОТДЕЛЬНО.

отдельности, они даже на 14 сутки исследования наблюдались только в виде пылевидных отложений. Кроме того, у всех животных, получавших нуклеинат натрия с лидокаином, уже на 7 сутки исследования отмечали относительно высокие показатели антителообразования, статистически достоверно превышающие показатели, полученные при применении тактивина и пуклеината натрия в отдельности (табл. 3).

Таким образом, при сочетанном применении даже в уменьшенной дозе нуклеината НН с лидокаином, стимулирующий эффект по изучаемым показателям статистически достоверно усиливается и превышает их уровни не только при раздельном применении тактивина и нуклеината натрия в тех же условиях, но и на интактных (здоровых) животных.

Особого внимания заслуживают полученные нами результата изучения структуры популяций возбудителей микст-инфекций ожоговых рал. После введения животным НН с лидокаином, в популяциях всех возбудителей отмечалась элиминация особей с признаками патогешюсти и резистентности к антибактериальным препаратам (Р<0,01) - табл. 4. Следовательно, при сочетанном применении нуклеината натрия с лидокаином для лечения смешанной инфекции у животных с ожоговой травмой наблюдается сннергидный эффект. Это обеспечивает 100% выживаемость всех взятых в опыт животных даже при уменьшенной дозировке нуклеината натрия. Не менее важным является факт, установленный на основании изучения структуры популяции возбудителей, что применение такого сочетания препаратов обеспечивает не только хороший лечебный эффект, по и предупреждает формирование госпитальных штаммов.

Таблица 3

РЕЗУЛЬТАТЫ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ НН С ЛИДОКАИНОМ У ЖИВОТНЫХ С ОЖОГОМ И МИКСТ-ИНФЕКЦИЕЙ

Изучаемые показатели ГРУППЫ ЖИВОТНЫХ,

Интактные ПОЛУЧАВШИХ:

Тактивин НН НН+Лидокаин

Показатели в разные сроки исследования (сутки) М ± т (п=25)

3 7 14 3 п 14 3 7 14 3 7 14

Выживаемость в 7.7. 100,0 88,0 84,0 100,0 X

Селезеночный индекс (синегнойных палочек на орган) II II II II 4*104 5*10® М 5*104 6*103 II 5*103 отдельные колонии

Фагоцитарный резерв нейтроф. в % 28,0 ± 2,2 30,0 ± 2,7 29,0 ± 2,3 15,0 ± 2,8 13,0 ±3,1 17,0 ± 3,5 14,0 ± 1,5 12,0 ± 2,1 17,0 ± 2,8 20,0 ± 1,1 19,0 ± 1,2 27,0 X ± 1,6

Средний гистохимический показатель (кат. белки) 0,12 ±0,01 0,09 ±0,03 0,12 ±0,01 - - Пылев. отложения - - Пылев. отложения - 0,12 ±0,02 0,16 ± 0,01

Естеств. ингиби-рующий фактор(ИИ) 1,1 ± 0,1 1,0 ±0,01 1,0 ±0,02 1,6 ± 1,1 1,7 ± 0,9 1,1 ± 0,8 1,5 ± 0,9 1,7 ± 0,8 1,1 ± 0,6 1,3 ± 0,9 ±0,01 1,0 X ±0,01

Средне-геометрич. титр агглютининов II II II II 19,9 ± 1,2 79,4 ± 1,3 II 79,4 "± 1,6 93,2 ± 2,4 II 93,3 ± 2,1 316,2 X ± 5,4

ПРИМЕЧАНИЕ: достоверность различий относительно применения тактивина и НН отдельно: Х=Р<0,05.

" - исследования не проводились

Таблица 4

ДИНАМИКА СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКСТ-ИНФЕКЦИЙ У ЖИВОТНЫХ, ЛЕЧЕННЫХ НН С ЛИДОКАИНОМ (ПОСЕВЫ С ПОВЕРХНОСТИ ОЖОГОВОЙ РАНЫ)

Признак % ОСОБЕЙ В ПОПУЛЯЦИЯХ (ИЗ 100 КОЛОНИЙ)

от нелеченных (ожог + микст -инфекция) от леченных НН + лидокаин X2 Р

I 2 3 4 5

Показатели в разные сроки исследования (сутки)

2 7 14 3 7 14

Устойчивость к: Попул; ЗЦИЯ 3зеис!ог юпаэ аегщ? .поэа

Карбеницилину 80,0 82,0 95,0 80,0 75,0 70,0 12,9 <0,01

Стрептомицину 79,0 80,0 96,0 79,0 75,0 72,0 13,4 <0,01

Канамицину 80,0 82,0 96,0 80,0 75,0 72,0 13,3 <0,01

Полимиксину М 5,0 5,0 10,0 5,0 5,0 5,0 0,01 >0,05

Гемолиз 85,0 92,0 100,0 В0,0 75,0 60,0 17,5 <0,01

Протеолиз 85,0 92,0 100,0 80,0 75,0 60,0 17,5 <0,01

А/лизоцим экт. 60,0 65,0 30,0 60,0 50,0 40,0 17,4 <0,01

Устойчивость к: По1 туляц та Саге Ис5а з1Ыса;

Леворину 70,0 70,0 73,0 70,0 70,0 60,0 9,7 <0,01

Нистатину 75.0 _ 75,0 77,0 75,0 75,0 60,0 9,8 <0,01

Гемолиз | 55,0 60,0 75,0 55,0 50,0 40,0 23,2 <0,01

А/лизоцим активн. ос г. ии , и 90,0 100,0 85,0 80,0 75,0 12,3 <0,01

Продолжение таблицы 4-

I 2 о 4 5

Признак Показатели в разные сроки исследования (сутки)

3 7 | 14 3 г» / 14

Устойчивость к: Попу л; при Б1арЬу ососс аи: -виз

Карбеницилину 51,0 55,0 76,0 51,0 50,0 50,0 13,2 <0,01

Стрептомицину 81,0 81,0 84,0 81,0 81,0 81,0

Пенициллину 50,0 65,0 75,0 50,0 50,0 50,0 12,7 <0,01

Тетрациклину 82,0 82,0 83,0 82,0 82,0 82,0

Гемолиз 84,0 90,0 100,0 84,0 70,0 60,0 17,5 <0,01

А/лизоцик акт. 0 0 0 0 0 0

Устойчивость к: Пот г/лит 1я Ебс! чегю и а со Л

Карбеницшшину 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0

Стрептомицину 68,0 68,0 69,0 68,0 68,0 68,0

Тетрациклину 45,0 45,0 46,0 45,0 45,0 45,0

Эритромицину 58,0 72,0 88,0 68,0 68,0 68,0 13,7 <0,01

Гемолиз 70,0 70,0 75,0 70,0 50,0 30,0 21,1 <0,01

А/диаоцим активн. Б5,0 65,0 70,0 65,0 50,0 30,0 17,6 <0,01

ПРИМЕЧАНИЕ: достоверность различий с данными контрольной группы (нелеченные животные с ожегом и микст-инфекцией).

выводы

1. В. этиологической структуре смешанных инфекций у больных с ожоговой травмой, превалируют следующие виды возбудителей: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli н дрожжеподобные грибы рода Candida, обнаруживаемые в ране в различных сочетаниях.

2. Популяции клинических штаммов возбудителей характеризуются выраженной гетерогенностью (неоднородностью) особей по признакам лекарственной устойчивости и свойствам, определяющим их потенциальную патогенность. В клинических условиях, в результате антибиотикотерашга и пассажей таких гетерогенных штаммов через организм больных с иммунодефицитом, может происходить селекция вариантов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью и повышенной вирулентностью. Это, в свою очередь, является базой для формирования госпитальных штаммов условно-патогенных видов микроорганизмов.

3. Выявлена значительная степень распространения признака антилизоцимной активности у возбудителей микст-инфекций ожоговых ран. Частота проявления этого признака находится в следующей последовательности: C.albicans - 95,0%, P.aeruginosa -88,2%, E.coli - 80,0% и почти полное его отсутствие у S.aureus (1,8%). Для P.aeruginosa установлена сильная корреляционная связь между антилизоцимной активностью и другими признаками их потенциальной патогенно сги - гемолитическими и протеолитическими свойствами (r=0,892 ± 0,090 и 0,795 ± 0,094 соответственно).

4. В условиях смешанного культивирования in vitro все изученные клинические штаммы P.aeruginosa проявляли антагонистическую активность в наибольшей степени по отношению к S.epidermidis, а затем - к S.aureus и E.coli. Установлен однонаправленный характер антагонизма между участниками ассоциаций. Стафилококки и кишечные палочки не обладали антагонистической активностью по отношению к синегнойной палочке.

5. Высокая антагонистическая активность P.aeruginosa in vivo проявлялась только при инфицировании ожоговой раны ассоциациями P.aeruginosa + S.aureus и P.aeruginosa + E.coli.

6. Для ассоциаций P.aeruginosa + C.albicans типично взаимное усиление размножения и повышение вирулентности в условиях in vitro и in vivo.

7. У животных с ожоговой травмой на фоне сформировавшегося в результате ожога иммунодефицита, отмечено резкое снижение показателей функции фагоцитарной системы и антителогенеза после присоединения смешанной инфекции, что проявляется в возрастании тяжести инфекционного процесса. (Максимально - у животных после инфицирования ожоговой раны ассоциацией Р.аеги^поза + С.аИмсапэ).

8. У нелеченных животных на фоне низких показателей антиинфекционной защиты в популяциях микробов - возбудителей смешанных инфекций наблюдалось параллельное нарастание вариантов с повышенной вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью. Отмеченные сдвиги в популяциях возбудителей обусловили повышение тяжести течения микст-инфекций и снижение выживаемости животных в группах, инфицированных ассоциациями: Р.аещщюза + Б.аигеш и Р.аеп^шоБа +Е.соИ - до 50%, а Р.аегияшоБа + С.а1Ысап5 - до 40%.

9. Применение в тех же условиях (на фоне ожоговой травмы и микст-инфекции) тактивина и нуклеината натрия способствует восстановлению функции системы фагоцитоза, антителогенеза и повышает выживаемость животных до 82,0 - 92,0%.

10. Комбинированное применение нуклеината натрия с лидокаином обеспечивает более выраженный протективньш эффект по сравнению только с нуклеинатом натрия и тактивином. Выживаемость животных, леченных такой комбинацией препаратов, достигала 100% при всех вариантах сочетаний возбудителей микст-инфекций.

11. В результате применения тактивина, нуклеината натрия и, особенно, нуклеината натрия с лидокаином, наблюдалась выраженная элиминация из состава популяций возбудителей мг'ст-инфекций вариантов с признаками высокой вирулентности и резистентности к антибиотикам. Применение указанных препаратов может не только способствовать повышению эффективности терапии, но и предупредить формирование высоко вирулентных госпитальных штаммов условно-патогенных микроорганизмов.

12. Экспериментально обоснована возможность применения иммуномодуляторов, в частности тактивина, нуклеината натрия и нуклеината натрия с лидокаином, в целях повышения эффективности лечения микст-инфекций ожоговых ран и предупреждения формирования госпитальных штаммов возбудителей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Условия, влияющие на структуру популяций микроорганизмов по признакам лекарственной устойчивости в процессе экспериментальной инфекции. (Соавт. Вельский В.В., Закарян J1.M., Бредихин В.Ф.).- Тез. докл. Всес. конф. "Акт. пробл. бакг. инфенкций", М., 1991 4.1 .-С.56-57.

2. Изменение структуры популяций синегнойной палочки по биологическим признакам в условиях ассоциации со стафилококком. (Соавт. Вельский В.В., Прадиуман Кумар Синх) .-Депонир.- ВИНИТИ 06.07.93, N1862 - В93.

3. Структура популяций синегнойной палочки при ассоциации со стафилококками и эшерихиями. (Соавт. Вельский В.В., Прадиуман Кумар Синх).- Жури, микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1994.- N6.- С.37-38.

4. Изменчивость популяции Pseudomonas aeruginosa в условиях ассоциации ее со стафилококком // Сб. науч. трудов "Совр. вопросы дерматовенеролог".- Курск.- 1994.- С.75-76.

5. Изучение факторов неспецифического иммунитета при травме у мышей, осложненной инфекцией. (Соавт. Бровина Я.И., Блинков Ю.Ю.).- Мат. итог, паучн. конф.: "Актуальные проблемы медицины и фармации".- Курск.- 1995.- С.9.

6. Влияние терридеказы на цикличность изменений состояния иммунной системы при ожоговой травме. (Соавт. Блинков Ю.А., Бровина Л.И., Блинков Ю.Ю.) .- Матер. II Междун. конф. "Циклические процессы в природе и обществе".- Ставрополь.- 1994.-С.25-26.

7. Interferon inductors as immunorehabilitation means in bacterial infections and Burns. (Belsky V.V., Zalearían L.M., Khovrina M.P. et al.) .- International journal of immunorehabilitation.- Dagomis.- 1994, Number 1 - Supplement, 5.- P.55 .

8. Иммуномодулирующие свойства терридеказы при микст-инфекции у животных с ожоговой травмой. (Соавт. Вельский В.В.) .-Депонир. ВИНИТИ 25.10.94, N2408 - В94 .

9. Изменение структуры популяций синегнойных палочек в условиях микробных ассоциаций со стафилококками. (Соавт. Прадиуман Кумар Синх) .- Мат. итоговой науч. конф. ст. и молодых учен. "Актуальные проблемы медицины и фармации".-Курск,- 1995.-С.42-43.

10. Восстановление нарушенной антиинфекционной резистентности организма после ожоговой травмы в сочетании со

стафилококковой инфекцией под действием вазодилятаторов и протеазы. (Соавт. Вельский В.В., Закарян Л.М., Ховрина М.П. и др.) .- Мат.конф. морфол., иммунол. и клиницистов Черноземья "Морфогенез и регенерация".- Курск.-1995.- С.93-95 .

11. Связь циклических процессов в органах иммунной системы с репаративным остеогенезом. (Соавт. Блинков Ю.А., Бровина Я.И., Блинков Ю.Ю.) .- Мат. II Междун. конф. "Циклические процессы в природе и обществе".- Ставрополь.-1994, вып.З.- С.86.

12. Протекгавное действие некоторых вазодилятаторов при ожоговой травме, инфицированной стафилококком и синегнойной палочкой. (Соавт. Вельский В.В., Закарян Л.М., Ховрина М.П. и др.) .- Мат. XII Росс. науч. конф. "Факторы клеточного и гуморального им-та при различных физиологич. и патологич. состояниях".-Челябинск.- 1995.- С. 18.

13. Коррекция иммунного ответа при ожоговой травме с микст-инфекцией в эксперименте // Мат. XII Росс, научн. конф. "Факторы клеточного и гуморального им-та при различных физиолог, и патологич. состояниях".- Челябинск.-1995.- С.119.

14. Экспериментальное обоснование применения тактивина и терридеказы для коррекции иммунодефицитного состояния при ожоговой травме, осложненной микст-инфекцией. (Соавт. Вельский В.В., Блинков Ю.А.).- Маг. Юбилейной конф., посвящ. 60-летию КГМУ.- Курск.- 1995,- С.86.-90.

15. Изменение структуры популяций возбудителей микст-инфекций в условиях иммуностимуляции и иммуносупрессии. (Соавт. Вельский В.В., Блинов Н.П.).- Мат. Международной конф. "Иммунодиагностика и иммунотерапия".- Витебск.- 1995.- С.272-274.

16. Коррекция вторичного иммунодефицита при смешан: ой инфекции ожоговой травмы. (Соавт. Вельский В.В.) .- Депонир. ВИНИТИ от 25.10.95 И2846-В95 .