Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и функциональные свойства полинуклеотидных ингибиторов вирусной репродукции (алкилированных нуклеиновых кислот, антисмысловых РНК и рибозима).

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура и функциональные свойства полинуклеотидных ингибиторов вирусной репродукции (алкилированных нуклеиновых кислот, антисмысловых РНК и рибозима)."

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМЫ НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ М0ЛЕКУЛЯРН01 Б10Л0Г1I I ГЕНЕТИКИ

на правах рукопису УДК 577.214.3-677.113.4 577.218

578.242-578.828-616 578.280

ШВЕД Анатол1й-Давидович

СТРУКТУРА I ФУНКЦЮНДЛШ ВЛАСГИВОСП ПОЛIНУКЛЕОТИДНИХ 1НГИБ1Т0Р1В В1РУСН01 РЕПР0ДУКЦ11 (аяк1лованих нуклеТнових кислот., антисенсових РНК та рибовим1в).

03.00,03 - молекулярна 61олог1я

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацП на здобуття наунового ступени» доктора 61олог1чних наук

Р Г Б ОД 21 ДПР 1997

К И I В - 1396

Дисертац1ао е рукопис

Роботу виконано в 1нститут1 молекулярной б1олог11 1 генетики Нац1онально1 Академ!I Наук Укра1ни

0ф1ц1йн1 опоненти:

доктор б1олог1чних наук,

член-кор. HAH Укра1ни Скрипаль 1.Г.

доктор б!олог1чних наук,

професор Малюта С.С.

доктор б1олог1чних наук,

професор Радавський Ю.Л.

„Пров1дна орган!зац1я: Ки5вська медична академ!я

л1слядипломно1 осв!ти

Захист в!дбудеться "fy1996 на вас!данн1 спед1ал1вовано1 вчено! ради д 01.86.01 в вахисту докторських дисертац1й в 1нституП молекулярно! б1ологП i генетики HAH Укра1ни ва адресою: 252143, м.Ки!в, вул.Забодотного, 160.

3 дисертац1ею мохна овнайомитися у б1бл!отец! ¡нституту молекулярно! С1ологП 1 генетики HAH УкраКни

Автореферат роз 1 слано "¿И ЛМС&гъ^удущ р.

Вчений секретар спец1ал18овано! вчено! ради кандидат б1олог1чних наук, старший науковий сп1вроб!тник I ~ Л.Л.Лукаш

Актуальн!сть проблем». Багатор1чн1 досл!дження б1олог1ч-них властивостей пол1нуклеотид1в, як природних, так i штучно синтезованих, внявши широкий спектр Ix б1олог1чно! активности в р1зних модельних системах, позитивних результат1в було до-сягнуто також при кл1н1чнмх випробуваннях х1м1чно модиф1кова-них пол!нуклеотид!в (Chandra Р., 1979).

Обнад!йливим виявилося застосування екзогенних пол!нукле-отид1в в р1шенн1 проблеми пошук1в селективних против1русних агент1в (Pitha Р., 1973>. Роввиток роб1т в цьому напрямку сти-мулювали результаты досл1длень, як1 показали здатн1сть пол1-нуклеотид!в до 1ндукцП !нтерферону та прямого пригн1чення в1-рус-специф!чних фермент1в нуклеинового синтезу, до того ж вони д!яли як 1муноадыованти, оск1льки були вдатн! сутгево п!двищу-вати onip орган1зму в!русним 1нфекц1ям (Pitha Р., 1980).

3 в1дкритгям механ!зму антисенсово? регуляцП експресП ген1в та катал!тичних властивостей у певних РНК, названих ри-бозимами, стало можливим створення молекулярних конструкц1й для внутр1кл!тинного б!осинтеау антисенсових РНК (асРНК) та (або) рибозим1в, эдатних блокувати експрес!» конкретного ге-ну-м1шен1. Протягом останнього десятир!ччя з'явилися !иформа-ц!йн1 та методичн! умови для розробки геннотерапевтичних систем, в основу яких покладено сгворення внутр!кл1тинного проти-в1русного 1мун1тету за допомогою асРНК i рибозим!в (Baltimore 0., 1988; Altman S., 1993). Приймаючи участь у виконанн! прог-рами Нац1онального Ком1тету боротьби 18 СН1Д, ми також спряму-вали сво! аусилля на надання екстракорпоральним гемопоетичним кл!тинам людини 1мун1тету проти В1Л на основ! асРНК.

Подана робота в!дображае результати тривалих пошук1в в обраному напрямку, як! не могли уникнути впливу деяких його еволюц1йних вм1н, тому викладений в дисертацП матер1ал в1доб-ражае як вiдомоетi, одержан! емп!ричним шляхом початкового пе-

р1оду досл1джень, так 1 дан! б!льш ц1леспрямованих i детально сплановаяих експеримент!в останнього часу.

Мета та газдания досл1джень. Метою представлено! роботи було вивчення против1русио'1 активност1 нукле!нових кислот та продукт!в üx xiwi4Ho'í мадиф1кацП, антисенсових РНК та рибози-

MÍB.

В1дшв1дн0 до поставлено! мети було сформульовано так1 эадач1, вир!шення яких вд!йснювали 1з вастосуванням ряду ори-г!налышх експериментальних п1дход1в та широкого спектру су-часних метод!в молекулярно! б1ологП, в1русологП та генетич-HO'i 1нженерП:

1) вивчити npoTiiBipycHí властивост! нуклеЗнових кислот pleiioro походження та продукт!в Ix модиф1кац11 т1офосфам!дом;

2) досл!дити структуру, 4»i3HKo-xiMi4Hl властивост1 та 6i-олог!чну активн!сть алк1лованих нуклеЗнових кислот;

3) створити еукар1отичну векторну конструкц!ю для приручения релродукцП В1Л за допомогою антисенсових РНК проти клю-чових ген!в В1Л tat 1 rev.

4) створити молекулярно-структурн1 основи рибозимно! конструкцП, спрямовано! проти ключових ген!в В1Л tat 1 rev. .

Наумова новизна. Виявлено 1нгиб1торну д!ю ряду нукле'1но-вих кислот, проти деяких ДНК- та РНК-геномних BipyciB в експе-риментах In vitro, in ovo та in vivo. Х1м1чна модиф1кац1я дос-л1джуваиих препаратiв пол1функц1онально» алк!луючою спсшукою т1офосфам!дом (ИоТЕФ) п1дсилювала 1х противiрусну активн!сть. Покааачо, ¡до алк!лован1 нукле!нов! кислоти не впливають на i мунокоыпетентну систему тварин 1 не ыають в1дчутних мутаген-них потенЩй та 1нтерфероногенних властивостей.

Дойл1дхено ф18ико-х1м1«ш1 властивост! алк1лованих ДНК pi8Horo походження. Вперше методом електронно! м!кроскоп11 по-

казано вначн1 структур^ ем1ни молекул ДНК п1д д!ею т!офосфам-ду - утворення вшитк1в, ипильок, ровркв1в га глибоко! депол1-мер1задП пол!нуклеотид1в. Анал1з показав, що ц! зм!ни супро-воджуються зростанням вм1сту в ДНК етилен1м!нних груп в проце-ci алк1лування т1офосфам1дом. Кого руйн!вна д1я на нукле1нов1 кислоти приэводила до втрати 1нфекц1йност1 ряду BipyclB, що дало змогу запропонувати новий метод одерзкання 1нэктивованих в1русних вакцин, захищений авторським св!доцтвом.

На основх адено-асоц!йованого Bipycy людини створено век-торну конструкцию, здатну 1ндукувати в юйтинах синтез асРНК проти ключових ген1в В1Л. Для побудови конструкцП використано позбавлений енхансера власний промотор L.TR В1Л, п!д контролем я кого зд!йснюеться транскришДя асРНК у в!дпов1дь на 1нтервея-цШ збуднкка в кл1тину 1 появу в н1й вiрусного б!лку tat, здатного багатократно п!дсилювати актив«1сть створено! транс-крипц1йно! одиницЬ Трансфекц1я створено! антисенсово! конс-трукцП в гемопоетичн1 кл1тини людини забезпечувала пригн1чен-ня репродукщ1 В1Л, що було п1дтверджено тестами на в1русний антиген р24 та наявн!сть 1нфекЩиного Bipycy. Гемопоетичн1 кл!тини людини, трансф1кован! створекою кокструкц!ею, на наш погляд, являють собою ун1кальну систему генно! терапП СН1Ду, придатну до кл!н1чних випробувань.

В прсцес! Еивченкя чутливост1 ембр1елальник гемопоетичних кл!тин людини до В1Л-1нфекц11 виявлено зраэки в ознаками зни-жено! чугливос?! до вбуднмка, що е перкою 1.®ос'грац1ею на кл1-тинному piBHl природко! СТ1ЙК0СТ1 до Bipycy 1ндив1д1в, В1Д0МКХ як безсшпгомних носПв Bipycy СН1Ду.

Штучно синтезований рибозим типу "головка молотка" проявив акгивнЮть в тестах in vitro на РНК-субстрат1, що м!стить посл1довнос^ ключових tat- та rev-reiiiB В1Л. Поеднання двох

васоб1в пригнШення експресН ген!в В1Л - асРНК та рибозиму -може стати, на наш погляд, в1дправною точкою для створення насгупного покол!нн'я васоб!в генно! тералП СН1Ду.

Практична ц!нн1сть робота. Виявлене я в гаде знижено"! чутли-вост! ембр1ональних гемопоетичних кл!тин до В1Л вказуе на до-ц1льн!сть скрин1нгу р!зних джерел кровотворення людини (абор-тивних ембр1он1в, кордово! кров1, к1сткового мозку) на чутли-в1сть до цього 8будника. Де мае забезпечити, по-перше, винай-дення досл1дницького об'екту для вивчення мехаШзм!в i факто-р1в природно"! ст1йкост1 i, по-друге, дасть можлив!сть викорис-товувати для трансплантаЩй хворим на СК1Д стойкий до Bipycy кл!тинний матер1ал, додаткове забезпечення якого штучним !му-hîтетом проти В1Л значно п!двищить шанси пациент1в на кл1н!чну реабШтац!ю.

Створена система генной терапП СН1Ду п1сля завершения доклШчних тест1в може бути використана в клШц! для випро-бування у хворих на СН1Д.

Розроблений cnocioö !нактивацП BipyciB не пов'язаний з сугтевою зм!ною технолог1чних регламент1в виробкицтва вакцин-них препарат!в, отже може бути впроваджений в виробничу практику, оск1льки не вимагае суттевих матер!альних витрат 1 не створюе значних орган1аад1йно-техн1чних проблем.

Апробад1я робота. Maтер1али дисертацП допов1далися на IV М1жнародному симпозиум! соц!ал!стичних Kpa'ih "Antiviral Substances" (Сегед, Угорщина, 1980), на V М!жнародному симпозиум! соц!ал!стичних KpaïH "Antiviral Substances" (Рига,

1982), на Симпозиум! з б!оф!зики нукле!нових кислот 1 нуклеоп-роге'1д1в (ТаШн, 1981), на Всесоюзн1й науково-лрактичн!й кон-ференцП "Профилактика природиоочаговых инфекций" (Ставрополь,

1983), на VII1-й Всесоюзна нарад! "Теория и практика исполь-

зования иммунитета сельскохозяйственных культур к вирусным болезням" (В1льнюс, 1984), на Всесоюзн1й конференц11 з генетики соматичних кл1тин (Москва, 1986), на V Укра!нському б!ох!м!ч-ному з'5зд1 (1вано-Франк1вськ, 1987), на М1жнародно1й конфе-ренц1'1 "VII-th Symposium on Antiviral Substances", (Варна, 1987), на Перш1й нац!ональн1й науково-практичн1й конференц!ï 8 проблем В1Л/СН1Д в м!жнародною участю (Ки1в, 1995), на Треть-ому Укра!нському зЧзд! гематолоПв 1 трансфуз!олог!в (Суми, 1995), на М1жнародн1й конференцП "the 3-rd Internatatlonal Conference on AIDS in Asia and the Pacific" (Chiang Mai, Tai-ланд, 1995).

Публ1кацН. Дисертащя в!дображае матер!али 32 наукових публ1кац1й, включаючи 1 авторське св1доцтво СРСР.

Структура та обсяг дисертацЦï. Дисертац1я складаеться а вступу, огляду л1тератури, трьох розд1л!в результат!в досл1д-жень та ïx обговорення, заключения, bkchobkIb та списку л!те-ратури. Роботу викладено на стор1нках машинопису. Бона MicTHTb IS таблиць та —малюнк!в. Список л!тератури включав 442 6i6fliorpa$i4HHX посилань.

Досл1дження виконано з 1н1ц1ативи автора та за його без-посередньою участю в експериментах та анал1в1 результат!в. Ок-рем1 фрагменти роботи з тестування досл!джуваних препарат1в виконано при участ! М.Я.Сп1вака (1нститут м1кроб1олог11 1 в1-русолог i ï НАНУ) - випробування 1нтерфероногенно1 активност!; В.Г.Л1совенко (той же 1нстигут) - анал!а впливу на 1мунокомпе-тентну систему; В.Г.Краева та Л.Ф.Д1денко (той же 1нститут) -випробування на модел! X-Bipycy картопл!; В.Ф.Вабк1на (Укра-'¡нський НД1 экспериментально! ветеринар!!!) - тестування на модел! Bipycy ларингограхе!ту птах!в; T.I.БужиевськоЭ та Ю.М.Александрова Институт молекулярно! б!ологП ! генетики

НАНУ) - випробування мутагенно! активност!; С.Л.Рибалко (Ки-1вський НД1 еп1дем!ологП i 1нфекц1йних хвороб) - допомога в експериментах 1з збудником СШДу.

Основыi положения, где вмносяться на захист.

1. Природн1 нукле'1'HOBi кислоти, здатн! пригн!чувати реп-родукц!ю РНК- та ДНК-геноших Bipycis. Х1м1чна модиф1кац!я нук-ie'iHOBHx кислот т!офосфам1дом Шдсилюе "¿х против1русну ак-тиви!сть.

2Лутлив1сть до В1Л гемопоетичних кл!тин в1д р!вних ос1б кодиваеться в широкому д!апавон! - в!д надзвичайно! чутливост! до майже повно'1 ст1йксют1 до хнфекцП.

HaxepiasM i метода дскуйдаення.

В робот! будо виксрмстано т1офосфашд (ИоТЕФ) N',N",N"'-три (етилен)-трл.?м1д т1офосфорно! кислоти - пол1-функц!ональна алк!луюча сполухз, пох!дяе егилешм1ну (вироб-ництво експериментального аазоду 1нстигуту орган!чно1 xiMi'i АН Латв.РСР); препарата нукле!нових кислот, вид!лених is piamtx дхеред фенолько-детергентним методом. >Лм1чку модиф!кац1ю пре-парат!в зд1йснювали эг1дно Росс (1964). Ф1зико-х1м1чн1 досл1д-женкя вик!дних та алк1ловаши нуклеЗ нових кислот проводили аа методами (Спирин A.C., 1959; Поверенный А.М., 1964; Маптшг J., 1959; Кириченко О.П.. 1976; Klelnschmldt A.K.. 1959; Мазин А.Л., 1075).

Випробування активное?i досл!джуваних препарат!в прово-дилося п1д шифрами:

В - ДНК Blpycy в!сповакцини, ВВ - П алк1аоване пох!дне. Е - ДНК сперми морського 1жака, ЕЕ - И алк1ловане пох1дне. Р - РНК Blpycy грипу, РР - алк1лована РНК Blpycy грипу.

Досл1дження протигрипоэно* актквиост! 1ктактних та алк1-дованих кукле1кових кислот проводили на культурах кл1тин

НЕр-2, в 11-денних курячих ембр!онах та на мишах зг!дно Ильенко (1977). Експерименти з в1русами в!сповакцини та ларинготра-хеЧту птах1в проводили на курячих ембр!онах, в1русом ентериту свиней - на первинних кл1тинах нирки поросяти. Досл1ди а Х-в1-русом картопл! проводили на листях дурману 1 гомфрени, 1муно-ферментний анал!з 8д1йснювали за Бобковим (1983). 0бл1к ре-зультат1в та статистичну обробку далих у в!русолог1чних дос-л1дженнях проводили зг1дно загально прийнятим методам (Практическая вирусология, 1970).

Мутагенез вивчали на мутац1ях резистентност! до 6-меркап-топурину в культур1 ф!бробласт!в китайського хом'ячка sa Вужи-евсько» (1979). Вплив досл!джуваних препарат!в на кл1тинну 1мунну в!дпов!дь оц1нювали за реакц!ею г1перчутливост! спо-в1льненого типу, яку в!дтворювалй за Lagrange (1974).

Для створення антисенсово! векторной конструкцП викорис-тано плавм1ди HIV-CAT, pDL52-91neo та рВНЮ. Вс! процедури а клонування виконували за традиц!йними протоколами (Ман1ат!с, 1984). Етапи клонування та отриман! конструкцП перев1рялися сиквенуванням ДНК за методом Сенгера.

Ембр1ональн! гемопоетичн! кл!тини одержували за методом, розробленим в 1нститут! кр!об1ологП 1 кр!омедицини HAH Украйни (Грищенко, 1991).

Чутлив1сть до В1Л-1нфекц11 оц!нювали методом 1мунофер-ментного визначення р!вню в1рус-специф!чного антигену р24, а також 1нфекц1йного титру В1Л в гемопоетичних кл1тинах, транс-ф1кованих антисенсовою векторном конструкцию pHJV-as-neo методом кальц!й-фосфатно1' прецип!тацП (Graham, 1973).

Дезоксиол!гонуклеотиди, що в1дпов1дають посл1довност! рибозиму, синтевували на ДНК-синтеэатор1 DNA Assembler Special^ (Pharmacia, Швец!я), г!бридизували 1 одержаний дуплекс клону-

вали в транскрипц1йному вектор! pGEM-4Z (Promega). tat-фрагмент В1Л клонували в векторi pGEM-3Z, препаративну транскрип-ц!ю л!неаригованих ДНК-матриць проводили в стандартна безкл1-тинн1й систем! in vitro. Катал1тичн1 властивост! рибозиму вип-робоьували в 10 ыкл канон!чно! реакц1йно! cyMiuii або р!зних П BapiaHTiB. Продукти реакцП виявляли електрофорезом в 6%-му пол!акрилам!дному гел1, активн1сть рибозиму визначали шляхом вим1рювання черенковського випром!нення вир1заних а гелю про-дукт1в реакц11.

Основ«! результата та Yz обговорення 1. Против!русна аихквн1сть нуклеХиових кислот та ix amiлава-нмх пох!дних.

8губна д1я алк!луючих сполук на кл!тини ссавц1в дала пош-товх для 1х застосування в онколог1чм1й практиц!, де вони ви-користовуються 1 по сей день. Експерименти об1цяли ycnix також у використанн! комплекс!в деяких пол!функц1ональннх алк1луючих сполук з нуклеТновими кислотами як нос1ями активного протипух-линного агенту. Такий п1дх!д застосовували 1 вхрусологи в практиц1 пошуку против1русних aacoOiB. Нукле1нов1 кислоти, мо-диф!кован! р1экими х!м!чними агентами забезпечували в!дчутне пригн!чення Bipycnoi репродукцИ в р!зних експериментальних моделях, що вт!лювало оптим1эм 1 над1ю на усп!хи в розв'язанн1 проблеми противipycHOi боротьби. 8 цьому нанрямку i ми спряму-вали своГ вусилля взявши аа основу нуклеинов! кислоти р1вного походження 1 т1офэсфам!д як пол1функц1ональну адк1луючу сполу-ку для 1х модиф!кацП.

1.1. Вмвчення вплкву нуклтнових кислот на репродукц!» РНК-ге-иоыних Bipycia. Ревультати випробуваяь in vitro на мйдед1 в!-русу грипу, наведен! в табл.1, св!дчать, що в культур! кл!-

Таблица!.

Проггш1русна д1я препарат1в в культурах кл1тин НЕр-2, 1нф1ко-ваиих в 1 русом грипу А(Порт ЧалмерсЛ/73.

Досл1джуваний Розведення в!русу та обл1к результат!в

препарат

Шифр Доза Строк 10"1 10~2 10~3 Ю"4 Статистичн! дан!

М(\Х / МЛ Шэс

дення МШ Ь

Р 12 -5 4/4 6/2 7/1 0/8 4,25*1.60 0,87

12 +6 7/0 6/0 6/1 0/8 2,25*1,25 2,24

Р 24 -6 0/8 0/8 0/8 0/8 0 5,08*

24 +6 0/8 0/8 0/8 0/8 0 5,0 *

РР 12 -6 3/5 0/8 3/5 О/б 1,50*1,08 3,0 *

12 +6 4/4 0/8 0/8 0/6 1,00*0,60 3,8 *

РР 24 -6 0/8 0/8 0/8 0/7 0 5,08*

24 +6 0/8 0/8 0/8 0/7 0 5,0 *

Е 12 -6 6/1 7/0 5/2 1/6 4,75*0,80 0,87

12 +6 4/4 6/1 3/5 0/7 3,25*0,76 2,0

Е 24 -6 6/1 4/4 4/4 3/5 5,00*0,50 0,78

24 +6 7/0 3/4 3/3 1/7 3,50*0,76 1.8

ЕЕ 12 -6 6/1 3/5 4/3 0/8 3,25*0,74 1.4

12 +6 4/4 2/5 3/5 2/3 2,75*0,30 2,2

ЕЕ 24 -6 3/5 4/4 4/3 2/5 3,25*0,33 1,8

24 +6 2/6 4/2 0/8 1/5 1,75*0,50 3,3 *

Контроль

в1русу 8/0 8/0 7/1 1/7 6,00*1,2

Контроль Р РР Е ЕЕ

препарату 0/6 0/6 0/6 0/6 0

Прюатка: в чиселънику - к1льк1от> проб1рочних культур э озна-ками 1нфекцН, в знаменнику - к!лък1сть проб 1 рок без овнак 1н-фекцИ; -б, +6 - строк (в годинах) введения препаратов в1днос-но моменту заражения культура.

* - в1дм1нност! м!ж досл1дтш вар1анпт та контролем (беа препарату) спэтистично достов!рн1 за Ь-критер1еи Ст'юдент .

тин НЕр-2, 1нф1кованих в1русом грипу А (Порт Чалмерс)1/73 в роэведенн1 10"1 + 10"4, концентрад1я 24 мкг/мл середовищд препарату Р (1нтактна РНК в!русу грипу) забезпечувала 100Х приг-н!чення гемаглютинуичо! активност! при вс1х 1кф1куючих дозах в1русу як при проф1лактичному (до заражения), так 1 при д!ку-вальному (п1сля заражения) внесенн1 його в культуру. Б!дыз ефективним 1нгиб1тором в!русу виявигся препарат алк1ловало! РНК (препарат РР), який вже в подовинн!й концеитрацП (12мкт/мл) вабезлечував притн!чеяня в!русно! репродукцП в

100Х проб1рочних культур. 1нф!кованих в!русом в розведенн! 10~2 i в 50% - при розведенн1 Ю-1. Препарат гетеролог!чно! ДНК (Е) та II алк1ловане пох1дне (ЕЕ) в екв1валентних концент-рац!ях на ц1й модел! виявилися менш ефективними.

3 18 випробуваних 1л ovo зразк!в нативних та модиф1кова-них нуклеТнових кислот статистично достов1рн1 р!вн! протигри-позно1 активност1 проявили дв1 нативн! РНК 1 одна ДНК та 8 препарат1в алк1лованих нукле'!нових кислот р!зного походження, Активн1сть одного з препарат!в (ЕЕ) на 2,5 log2 перевершувала активн1сть протигрипозного xiMionpenapaTy ремантадину. Показано також, що противiруский ефект алк1лованих нукле'1нових кислот статистично достов!рно леревершував р1вень против i русно'1 активност! алк1луючого агенту т!офосфам1ду. Ця обставина св1д-чить про те, що активнЮть модиф1кованих препарат!в не пов'-язана з можливими залишками в препаратах алк1луючо1 сполуки. Антив1русн1 властивост! притаманн! власне нуклеКнозим кислотам, а х!м!чна модиф1кац1я пол1нуклеотид1в п!дсилювала ix про-тив1русну д!ю.

Випробування ряду препарат!в in vivo проводили на мишах, чутливих до використаного штаму Bipycy грипу. 1нтрана-зальне введения 48 мкг вих1дно! або алк1ловано! РНК за 6 год до заражения забезпечувало виразний проф!лактичний ефект (табл.2): 1ндекс захисту досягав 83,3 X, л1кувальна д!я препа-рат!в була менш вирааною (1ндекс захисту складав БОХ). Щодо активносг! препарат!в гетеролог!чно1 ДНК, го одержан! в ц!й модел! покааники можна розглядати лише як повитивну тевденц!», а не як достовiрнi результата.

На модел! в!русу гастроентериту свиней в культур! кл1тин досл!джуван! препарата зумовлювади зниження титру Bipycy по-р!вняно з конгрольними культурами (без препарат!в), а иайб!лыв

Т а б л и ц я 2.

Актвн1ст препарат!в нативних та алк1лованих нунле1нових кислот в досл!дах на иишах, заражения в 1 русом грипу А(Порт Чал-мерс) 1/73.

Препарат Час введения препарату: до (-) та Шсля (+) 1нфекд. К1ль-к!сть тварин в груп1 Загинуло на 8-й день Притерт Стью-дента 13 Актив-н1сть

Абсолютна к1ль-к1сть Середньо-статисти-чне в1д-хилення (М±ш), 7.

Р -6 год 8 1 12,5±12,5 3,03х 83,33 ++++

Р +6 8 3 37,5±18,3 1,53 50,0 ++

Р 0 '-"- 8 5 62,5*18,3 0,50 10,0 -

РР -6 -"- 8 • 1 12,5±12,5 3,03х 83,33 ++++

РР +6 -"- 8 5 62,5±18,3 0,50 10 -

РР 0 8 3 37,5±18,3 1,53 50,0 ++

Е -6 7 3 42,9±20,2 1,23 42,5 ++

Е +6 -"- 8 5 62,5418,3 0,50 10,0 -

Е 0 8 4 50,0±18,9 1,00 33,3 +

ЕЕ -6 8 2 25,0±1б,37 2,16 66,7 +++

ЕЕ 8 5 62,5+18,3 0,50 10,0 -

ЕЕ 0 8 5 62,5±18,3 0,50 10,0 -

Контроль 8 б 75,0116,37 - - -

Приттка: х-В1дм1нност1 м1ж досл1дш 1 контролем сюатагтно достоз!рн!.

активними в ц1й модел! виявилася алк1лована РНК в!русу грипу (препарат РР), вих1дна ДНК в!русу а1сповакцини та алк1лована ДНК 1з сперми мсрського 5хака, як1 знииували врожай в1русу на 2,5-3,0 1&.

Результат» вивчення д11 НоТЕФ на 1нфекц1йн1сть Х-в1русу картонл1 показали, що черев три години п!сля початку алк!лу-вання 1нфекц1йн1сть в1русу эначно энияувалася 1 склад ала б1ля 97. вих1дно]. Некроэи, спричинен1 алк1лованим в1русом на листях гомфрени, буди др1бн1шими (0,2-0,4 мм в д1аметр1) ва так1 (1,0-1,5 мм) при 1нокуляцП рослин нативним в!русом. Шсля б годин алк!лування в1рус повн1ст» втрачав 1нфекц1йн1 властивос-т1.

Досл1дами э "Змун1аац11" рослин дурману встановлено, шр на листях рослин, 1нокульованих 1нактивованим ХВК (аХВК) одно-

часно 1в заражениям нативним ХВК та га °Л, 48 1 72 години до вараження, черев 6-7 д1б виникали симптоми, схож1 на типов1 ураження досл1джуваниы в1русом, але здавалися меню виразними. 1муноферментним методом в!рус в цих рослинах виявляли через 4 дн! п1сля 1нфекц11. На листях дурману, оброблених аХВК ва 6 1 10 дн1в до 1нф1куванням 1нтактним в1русом, через 6-7 д1б в'яв-лялися др1бн1 жовг! (хлоротичн1) плями, як! п1зн1пе перетворю-валися в локальн! крапков! некрози 0,2-0,3 мм в д1аметр1. Д1 некрози не 8б1льшувалися в д1аметр1 з переб1гоы 1нфекц1йного процесу, не наставало й в1дмиранкя листя. 1муноферментним ана-л1вом в цих экспериментах виявлено також значно нижчий вм1ст 1нфекц1йного в!русу в оброблених аХВК рослинах дурману, н1ж в необроблених листях в контрол!.

Поряд з к1льк!сним вивначенням в1русу в екстрактах в лис-тових пластинок дурману в тих же екстрактах встановлювали на-явн!сть 1нфекц1йних в1русних часток. Результата титрування на листях гомфрени показали, що в листях дурману, оброблених препаратами вих1дно! (ХРНК) або алк1ловано! (аХРНК) РНК ХВК ва 24 год до вараження в!русом, 1нфекц1йний титр був нижчим, н!ж в контрол1, а в листях, заражених через 48 годин п1сля 1нкубац11 в досл1джуваними препаратами РНК, 1нфекц1йний в!рус застосова-ними методами детекщ! не виявлявся (табл.3).

Одержан1 резулътати дозволяють припустити, що нативна 1 модиф!кована т!офосфам1дом РНК ХВК е ефективнними 1дукторами против1русно1 реэистентност!. 1ндукц1я ст1йкост1 була найб1льш виражена на 2-3 день п1сля контакту 1ндикаторних рослин 8 дос-л1джуваними препаратами. 1нкубац1я рослин г 1нактивованим Т1о-ТЕФ в1русом також пригводила до пригн1чення репродукцИ натив-ного ХВК, проте цей ефект був менш виравним 1 проявлявся в 01льи п1вн1 строки (через 7-10 дн1в) п1сля "1мун18ац11". Сут-

ТаблицяЗ.

Залежн1сть пригн1чення розвитсу в!русяих ураженъ в1д строку 1ндукування ст1йкост1 рослия дурману ХРНК та аХРИК

Час п1сля 1ндукування ст1икост! в год. Вид титрування на один лист Титри в!русу

Контроль ХРНК аХРНК

8 24 48 1ФА-тест, (г/мл) 1нфекц!йний • (некрози на лист) 1ФА-тест, (т/мл) 1нфекц!йний (некрози на лист) 1ФА-тест, (т/мл) 1нфекц1йний (некрози на лист) 0,083 52,4 0,086 48,6 0,085 45,0 0,044 21,4 0,075 37,0 0 0 0,027 12,8 0 2,4 0 0

тево, що прояв залишково! 1нфекц!йност1 в препаратах обробле-ного т!офосфам1дом ХВК в1дзначався зм1ною морфологП в1русних уражень - вникали крупн! некрози 1 з'являлися нетипов! - др1б-н1. що св1дчить про появу м1сцево! ст1йкост! до вбуднику.

Под!бн1 ж результати одержано й 1ншими досл1дниками (6!сЬеппап в., 1968), що вивчали 1ндукц1ю ст1йкост1 рослин до в1русних !нфекц!й. Напевне, застосован1 в наших досл!дах нуклеинов! кислоти !ндукували в рослинах против!русну реэистент-н!сть, п1д тиском яко'1 в!дбувалася селекц!я збудника в в1дм!н-ними патогенними властивостями, що проявлялося в вм1н! морфо-логП в1русних уражень.

1.2. Вивчення волхву нукявУновмх кнслох на репродукц!и ДНК-геном нмх з!рус1в. На модел! в!русу в!сповакцини показано, в*) ад-к!ловане пох1дне гомолоПчно! ДНК (препарат ВВ) вабевпечувало достов!рне 1 валехне в1д концентрацИ пригн1чення утворенкя в!спин на хор1он-аланго1сши оболонках (ХАО) курячих еыбр!он1в (мал.1) при введенн1 його в ембрЮни до вараження в!русом. При введенн1 препарату одночасно а заражениям або п1сля нього 1н-тенсивн!сть репродукцП в!русу валишалася на р1вн1 контролю.

- 14 -

Мал.1.Репродукция в1русу в1сло-вакцини в курячих ембрюнах, гнф^новалих через 6 год теля введения препарату ВВ. По в1с1 ординат - к1лък1сть в!спин на ХАО, по в! с! абсцис -концентрации! вар1анти препарату в мкг на ембр!он. К - без препарату, (контроль). Р1вн1 значущост! вгдмгн по в!д-ношенню до контролю: X - Р<0,01; хх - Р<0,001.

К 12 24 48 ДНК 1з сперми морського 1жака (препарат Е) та П х1м1чно модиф!коване пох1дне (препарат ЕЕ) забезпечували пор1внювальн1 р1вн! пригн!чення репродукцП в1русу в!сповакцини, однак в ць-ому випадку не спостер!галося тако! ч!тко! валежност! ефекту в!д концентрацП препарату, як в попередньому досл1д1.

Препарат ЕЕ в концентрацН 100 мкг/мл середовкща проявив виразний ефект пригн!чення також на модел1 герпесв!русу пав1-ан!в, асоц1йованого 8 клХтинами ЛУГ-4. 1муиофлуоресцентним тестом встановлено, що п!сля добового контакту з препаратом к!льк!сть кл1тин, що утримували цитоплазматичний в1русний антиген, зменшувалася принайми! в 2 рази, а культуральне середо-вище, в якому кл1тини перебували протягом 72 год в контакт1 в препаратом ЕЕ, не м1стило в!русу, эдатного трансформувати до-норн! л!мфоцити пав!ана.

Три препарати тваринного походження (дв1 алк1лован1 ДНК 1 одна РНК) достов!рно 1 приблизно р!вною м!рою пригн!чували та-

90

80

70 60

50

«»0

30

го

Г0

х х

X

¿1

1юж репродукц1ю в!русу 1нфекц!йного лари.чготрахеЧту птах!в. Кр1ы виявленого в ц1й модел1 против1русного ефекту х!м!чно мо-диф1кованих нукле!нових кислот, суттевим молша вважати те, що даний штам в1русу ларинготрахеКту птах1в е, напевне, гетеро-"генною популяц!ею, др!бнобляшковий вар1ант яко! б!льш чутливий до !нгибуючо! д1! досл!джуваних препарат1в. Так, при анал!з! морфолог!! в1русних уражень ХАО було в!дм!чено, що при крайШх - разведениях в!русу, коли в ембрЮнах те спостер!галися ознаки 1нфекцП, зам!сть типових для досл1джуваного в1русу др1бних бляшок (мал.2,а) з'являлися суттево крупн!ш! бляшки (мал.2,б).

Эвичайно, складае !нтерес питания про в!рулентн! та !му-ногенн! властивост1 кожного з вар1ант!в. Можливо якийсь !з них став би в пригод! в роэв'язанн! проблеми одержання ефективних вакцинних препарат!в, однак вир!шення цьсго питания потребуе спец!альних досл!джень.

Нал. 2. ДШнки ХАО в курячих ембр1он1в^. 1пф1кованих в1 русом ларинготрахе1ту птх1в (в розведенн! 10 . а - ободонка контрольного ембрШу, 1иф1кованого без введения препарату. Видно багато др1бних бляшок, р1дко - б!лъш крут1. б - ободонка ембрЮну, 1нф1кованого Шсдя введения препарату € ■■.<! повано! ДИК. Видно крупя1 бляшки, др!бн1 бляшки в1дсут1.

- 16 -

Щодо механ!зму против1русно1 д11 випробуваних нами нукле-'1 нов их кислот та "1х алк1лованих пох1дних, то можна стверджува-ти, що в!дм1чен! нами ефекти не пов'язан! э !ндукц!ею !нтерфе-рону, оск1льки досл1дами було доведено в1дсутн!сть у них 1н-терфероногеино! активност! в культурах кл!тин.

Найб1льш в1рог1дн! припущення, на нашу думку, можна пов'-яаати 8 уявленням про едатн1сть екзогенних пол1нуклеотид1в до функц1овального блоку фермент1в нуклеинового синтезу. Ця г1по-тева визнаеться (Р1^а Р., 1980) як найб!льш експериментально обгрунтована: екзогенн! пол1нуклеотиди можуть або конкурувати 8 природною ендогенною матрицею за активн! центри фермент1в, або незворотно зв'язувати фермент без транскрибування ("мертва матрица"). Кр1м того, екзогенн! пол1мери можуть 8в'язуватися з ендогенною матрицею - в!русним геномом або його РНК-транскриптами, надачяи 1м форму, що не вп!знаеться ферментами. Цей ме-хан1ем обговорювався в л1тератур1 в межах в1домо! концепцИ "стратег1чних посл!довностей" (ЗДеЬЫп^ N.,1977), 1 саме в!н, напевне, мав м!сце в моделях, де ми випробували гомолог1чн! пукле!нов1 кислоти (РНК в1русу грипу та ХВК, ДНК в!русу в1спо-вакцини).

1снуе й думка про те (Бае! I., 1980), що б1льш виражене пригн1чення в1русно'1 репродукцП 1 активност! пол!мераз моди-ф!кованими пол1нуклеотвдами пор!вняно г вих1дними пов'язане з 1х п1двищено» ст!йк!стю до д!1 кл1тинних нуклеаз. В наших дос-л1дах алк1лован1 нуклеинов! кислоти також мали п1двищену про-тив1русну активн!сть пор1вняно в вих1дними, 1х вплив на 1муно-компетентну систему тварин мав ту ж тенденц1ю. Отже, одержан! дан!, в1рог!дно, також можна пов'явувати а п!двищеною.ст!йк1с-по модиф!кованих пол!нуклеотид!в до кл!тинних нуклеаз.

2. Структура, ф!зико-ж1м1чн1 властивост! та б!олог!чна актив-н1сть алк!лованих нуклек'нових кислот.

Виявлена нами в р!зних експериментальних моделях против1-русна активн1сть алк1лованих нуклеиювих кислот викликала 1н-терес до IX ф1вико-х1м!чних властивостей, вокрема структурних зм1н молекул як насл!дк1в алк1лування пол1нуклеотид1в. Важли-вим ми вважали також вивчення деяких б1олог1чних властивостей алк!лованих нукле'!нових кислот, а саме, '1х мутагенно! 1 1нтер-фероногешю! д!1 та впливу на 1мунокомпетентну систему орга-н!зму.

2.1. Ф1анно-х1м1чн1 властивост! али1ловаиих иуклеХнових кислот. Структурн! перетворення молекул ДНК в процес1 алк1лування т1офосфам!дом ми проводили, обравши за модель добре вивчений об'ект - фаг X. При електронном!кроскол1чному досл1дженн1 ДНК, вид!лено'1 э оброблених ПоТЕФ фаг!в було виявлено наявн1сть р!зного розм!ру шпильок як калл!док зшитк!в р!зних д1лянок молекул (мал.3,6,в). Ц! явища к!льк!сно зростали 18 зб1льиенням ступеню алк!лування, в!дбувалася також фрагментац1я молекул як результат дволанцогових розрив1в та поява коротких потовщених утворень, як1, напевне, являють собою багаторазово вшит! т!о-фосфам!дом д1лянки молекул ДНК (мал.З.г). За даними електрон-ном!кроскоп!чних вим1рювань, через 48 год д!1 Т1оТЕФ модальна довжина молекул очищено! ДНК фагу X зменшувалася з 17 мкм до 1,5 мкм, а до 96 год в!д початку алк1лування - складала б!ля 1 мкм (мал.4). При електронн1й м!кроскоп11 ряду алк!лованих ДНК, препарованих в денатуруючих умовах, спостер!галися численн! вшитки ы!ж ланцпгами молекул, щр розкрутилися в процес! дена-турац11.

Доел!джешш динвм1ки алк1лування трьох р1зних ДНК показало <м1я.Б) поступове накопичення в них етилен!м1нних гругг в

Ыал.3.Електрота и1нроскоп!я ЛИК фагу Я: а - нашвна ДИК а 1ятакптого фагу; б, в - утзорення шпильок в молекулах пом1рно аик1лованоГ ДНК; г - ДНК 8 виссшш ступеней ам1лування. Шжьшеннв: а, в - 25 ОООх; б - ВО ОООх; г - 37 600К.

, I

/шеи/ 21 22 20 18 16 14 12 10 в 6 4

Й л

0 1/2 1 2 3 4 5 10 24. <13 96 £ /час/

Мал. 4. Заде.>ш1 сгпь довжияи молекул ДНК фазу \ в 1д щривалост! ад-к1муваяня (показано 05Х-ний дов^рчиЯ 1 яте рвал).

Тоет

и и

ю

»

го

30

100

гоо /А«»'

Мал.Б.Дшгш!ка вМсту вгшэнШяяих аруп а аразках ДЯК з прочее! аж1луваяяж 1 -лосося; 2-фаау X; 3 -В.шиЬиНз.

2

12

5

в

б

г

процес! реакцП, а наявн!сть в алк!лованих ДНК с!рки св!дчила про IX належн1сть до НоТЕФ.

Отае. тривал!сть реакцП алк!лування б!льше 24 год позна-чалася на сугтевих поруиеннях структури молекул ДНК, що реест-рувалися р!зними методами, в тому числ! електронно! м1кроско-п11, яка дала не г!льки к1льк!сну характеристику окремих молекул, але й можлив!сть переконатися в!зуально в ступен1 руйну-вання структури пол!нуклеотид1в. 0держан1 дан1 дають уявлення про деяк! ф!зико-х!м!чн! зм!ни, що в!дбувалися в досл!джуваних препаратах нукле!новях кислот п1д впливом алк!лування. 2.2. Иутагенна Д1Я !нтактних га :им!чно моди$1Кованих в1рус1в 1 нуклегноЕих кислот. Пор1вняльн1 випробування на дрозоф1лах показали, що як вих!дн! препарати ДНК, так 1 !х алк!лован! пох!дн! е слабкими мутагенами: частота появи мутац!й при 1х д11 лише в два-три рази перевершувала частоту спонтанних мута-ц1й. Статистично достов!рно! р!зниц! в мутагенной активност! на дрозоф1лах нативно! 1 х!м1чно модиф!ковано'1 ДНК нами не ви-явлено.

Вивчення мутагенно'! дГз нативно] 1 алк1ловано'1 г!офосфа-м!дом РНК в1русу грипу на кл!гини китаиського хом'ячка показало, що обидна препарати РНК виклмсали статистично достов1рне п!двищення к!лькост! резистектних до 6-меркаптопурину колон1й пор1вняно з контролем. Однак п!сля обробки кл!тин РНК частота мутантних колон!й була в 5-6 раз!в вищою. н!ж у контроле а п!сля обробки алк!лованою РНК - лише удв!ч1-утрич1. В1дм!ни в мутагенн!й д!1 нативно! 1 алк1ловано! РНК статистично досто-в!рн1. Мутагенна активн1сть герпесв!рус1в також достов1рно знижувалася п1сля х!м1чно! 1нактивацП т!офосфам!дом.

Одержан! в!домоет! могли б застерегти медичних прац!вни-клв в!д використання живих в!русних вакцин у певного. контин-

генту населения, особливо репродуктивного в1ку, коли виб!р падав би на 1ни1 засоби !мунозахисту або, принаймн1, використан-ня 1нактивовапих вакцин.

2.3. Вплив нуклеЬ'нових кислот та Хх алк1лованих пох!дних на 1мунокомпетентну систему тварнн. 3 метою розширення уявлень про можлив! механ!зми против!русно! дП досл1джуваних препара-т!в, ми досл1дили вплив деяких препарат!в нуклеТнових кислот та IX алк!лованих пох1дних на 1мунокомпетентну систему орга-н!эму тварин за тестом на реакц!ю г!перчутливост1 спов!льнено-го типу (ГСТ).

Встановлено (табл.4), що жоден з використаних в досл1дах препарат1в не спричиняв !мунодепресивно1 дП. В б1льшост! ви-падк1в вони або п1дсилювали реакщю 1мунно1 в1дпов1д1, або не мали на не'1 суттевого вплиьу. 1муностимулююча активн!сть ДНК практично завжди прочвлялася при дП на аферентну ланку реак-ц11 ГСТ, тобто при введена препарат1в за 5 д1б до !н'екцП сенсибШзуючо! дози еритроцит!в барана, а вплив модиф!кованих ДНК був виражений дето сильнее, н!ж вих!дних. Препарата рибо-нуклеЗново! природи на шптинну 1мунну в!дпов!дь в наших дос-л1дах впливу не мали.

1нтерфероногенна акгивн!сть досл!джуваних препарат!в вип-робовувапася в культур! кл!тин. Показано, що нукле!нов! кисло-ти та 1х алк!лован1 пох1дн1 в концентрац1ях, здатних пригн!чу-вати в!руси, не !ндукували у використаних культурах кл!тин по-м!тних к!лькостей !нтерферону. Болып того, пол!рибонуклеотид-ний !ндуктор !нтерферону пол1(1):пол!(Ц) п!сля х!м!чно! моди-ф!кац!1 втрачав !ндукторну власгив!сть. Так, ягадо концектрац!я 50 мкг/мл вих!дного препарату пол!(1):пол!(Ц) 8абезпечувала 1ндукц!ю антив1русно! активност! культуральноТ р!дини при роз-веденн! 1:64, то при використанн! Пе к концентрац!1 продукту

Таблица 4.

Вплив препаратов нашвних 1 иодиф!кованих пукле!нових кислот на реакц1ю ГСТ у мишей.

1н'екований матер!ал Реакц!я ГСТ мм

А Б

натив-ний модиф!-кований

(X + т) Р (X + т) Р

1 2 3 4 5 6

да аДИ 0,60 + 0,0857 0,53 + 0,0330 >0,05 >0,05 0,52 + 0.0400 0,48 + 0.0273 >0,05 >0,05

ДИ2 аДИ2 0,68 + 0,0600 0,70 + 0,0514 <0.01" <0,01" 0,52 + 0.0163 0,55 + 0.0502 >0,05 >0,05

Об 006 0,60 + 0,0261 0,62 + 0,0751 <0,05" >0,05 0,48 + 0.0477 0,52 + 0.0310 >0,05 >0,05

ш аД7 0,68 + 0,060 0,67 + 0,061 <0,01" <0,05" 0,48 + 0,0400 0,60 + 0,0632 >0.05 >0,05

даз адиз 0,67 + 0,0306 0,68 + 0,0400 <0,01" <0,01" 0,5 + 0,0363 0,65 + 0,0342 >0,05. <0.01*

02 002 0,61 + 0,0305 0,8 +"0,0456 >0,05 <0,01" Нема в!дс н эмостей м

03 003 0,48 + 0,0249 0,51 + 0,0277 >0,05 >0,05 II »1 «, 1«

м аД4 0,46 + 0,0217 0,46 + 0,0160 >0,05 >0,05 II II и II

Е ЕЕ 0,5 + 0,0452 0,54 + 0,1770 >0,05 >0,05 II II II II

в ВВ 0,53 + 0,0491 0,5 +0,0413 >0,05 >0,05 II II II и

Контро, (ф!вро- [Ь зчин) 0,5. + 0,0296 - 0,5 + 0,0296 -

П р и м 1 т к а. А - препарата вводили за 5 д1б до сен-сиб1л1зуто1 доза еритрощт1в; В - препарат вводили одно-часно 8 сеиси01д1 аукиою дозою. * - в1дм1нност1 достов1рн1.

х!м1чно1 модиф!кацП цього препарату аналог1чний ефект культу-ралько! р!дини спостер1гався при розведенн1 1:4, тобто титр 1нтерферону в цьому раз1 буь на 4 1одг нижчим.

Ц1 досл!дження п!дтвердили дан! !ншх автор!в про непри-четн!сть 1нтерферону до механ!вму против!русно! д!1 екеогенних

природних i синтетичних пол!нуклеотид1в та продукт!в ix х1м!ч-но'1 модиф1кацП i дозволило зробити висновок, що в механ1зм1 антив1русно! д11 досл!джуваних нами препарат!в 1ндукц1я !нтер-ферону такая пом1тно5 рол! не виконуе.

2.4. Роз робка способу 1накгивац1д в1русинх препарат!в аа допо-мого» т1офосфам!ду. Результат)! вивчення алк!луючо1 д1'1 пох1д-них етилен!м!ну як в наших досл!дженнях, так i за далими 1нших - автор!в (Лавлес А.,1970; Singer В.,1975) показали, що насл!дки тако'1 дП на бакгерП, в1руси, фаги насамперед обуыовлен! руй-н!вним впливом на нукле!нов! кислоти, що навело нас на думку про MonuHBicTb використання алк!луючих властивостей Т1оТЕФ для одержання 1нактивованих в!русних вакцин. Експерименти на моделях Bipycy грипу штаму А/В1кпюр1я /35/72/50 та його вар!анту £/1-В1ктор1я i repnecBipyclB I Та II тип1в стали основою роз-робки способу одержання в1русних антиген1в.

Досл1дження показали, що 1на1:тивован1 за розробленим способом repneceipycH при пасахах на культурах ф1бробласт!в куря-чих ембр!.он!в 1 внутр!ЕНьомозковому зараженн! мишей були не !нфекц!йними 1 стимулювали утворення достатнього р!вню специ-ф1чних в!рус-нейтрал18уючих антит1л. В реакцП нейтрал!8ац!1 сироватки тварин, !мун!зованих 1нактивованими герпесв1русами, забезпечували !ндекс нейтрал!зац1! 2,5-3,0 lg (табл.5), тобто

Таблицяб.

Пор1вняльна активист герпетчиих вакцин, 1накливованих формад1ном т т!офосфам1дои.

N досл!ду Тип, штам Bipycy 1ндекс нейтрал!сацП при способах 1нактивацП (ш

Формал1ном ТВД5о/1.0 мл Пофосфам1дом ТЦД50/1.О мл

1 Л2 2,5 2,5

2 УС 2,25 2,25

3 Л2 2,0 2,0

УС 2.5 3,0

4 Л2 3,0 3,0

Т а 6 л и ц я 6.

Р1вепь антигемаглютн1н1в в сироватках мишей, 1мун1зованих жи-вими та 1нактивованит вакцинами Bipycy spuny А/В1кпюр1я /35/72/50 пв Його вар!анту 2/1-В1ктор1я

Матер!ал для iMyHisauií Р!вень антигемаглютин!н!в до BlpyciB

А/В i ктор i я/35/72/50 2/l-BiKTopifl

Звосютна величина титру Значения в 10g2 Зворотна величина титру Значения в log2

A/BiKTopifl/35/ /75/50 живий А/В1ктор1я/35/ /75/50 убитий 2/l-BiKTopifl живий 2/1-В1ктор!я убитии 60 91 147 84 5,92±0,38 6,25±0,30 7,17±0,25 6,37±0,27 64 80 138 112 5,97±0,26 6,32±0,36 7,10±0,39 6,79±025

не в1др1знялися в1д вакцин, 1нактивованих формал1ном за вироб-ничим регламентом.

1нактивац1я ва розроблюваним способом Bipycy грипу, за-безпечувала повну втрату його 1нфскц1йност1, а випробування сироваток кров! 1мун1вованих тварин в реакцП гальмування ге-маглютинацП показало (табл.6), що 1муногенн1сть Bipycy грипу в результат! !нактивац!1 суттево не зм!нювалася. При електрон-ном1кроскоп1чному анал!з1 в!р1они 8 !нактивованих зразк1в за структурой також не в1др!знялися в!д вих!дних.

Такид! чином, cnoci6 1нактивацП в запропонованому режим! забезпечував повну 1нактивац1ю в!рус!в грипу i герпесу I та II тип!в при збереженн! 1муногенних властивостей. З.Досл!доэння npoTKBipyciioi акхивност! антнсенсових РНК та ри-бовиму.

Геннотералевтичний п!дх!д до л!кування СН1Ду спираеться на введену в 1688 роц! Балт!мором концепц!ю "внутр!кл1тинноК 1мун1зацП", д1ючим 1нструментоы яко! слугуватимуть антисенсов! РНК та рибозими. Для досягнення стало! реконституцП 1мун-

но! системи хворих на СН1Д було запропоновано використання сговбурових пемопоетичних кл1тин, трансдукованих генетичними конструкц!ями, здатними створювати сган внутр!кл!тинного 1му-н1тету проти В1Л. Стовбуров! кл!тини дають початок вс!м р!зно-видам кл1тин кров!, мозковим макрофагам i кл!тинам м!крогл!'1, тому трансфуз!я генетично зм!нених стовбурових кл1тин може за-безпечити сталу репопуляц1ю вс!х кл!тин 1мунно"1 системи хворого !мун!эованими проти BIJI полередниками кровотворення. Нижче викладено дан! s випробування створено"! нами системи генно! терапП СН1Ду з використанням внутр!кл!тинно 1мун1зованих ге-мопоетичних кл!тин ембр1ону людини.

3.1. Створення та випробування ангисенсово! векторной коне-трукцП проти вбуднина СН1Ду. Виб1р мшен! в геном! BIJI для антисенсового впливу проводили у в!дпов!дност1 !з стратег!ею, що вироблена за роки досз1ду використання асРНК для пригн!чен-ня репродукцП BipyciB. 3 урахуванням даних анал!зу молекуляр-но-генетичних основ реал!зацП геному В1Л-1 ми вир!шили обрати за м!шень■ д!лянку 1-го екзону TatNRev, який найб1льше в1дпов1-дае поставлен!й мет! оск!льки кодуе важлив! для репродукцП в!русу регуляторн! б1лки та ключов! генетичн! сигнали, а його посл!довн!сть високо консервативна серед багатьох проанал!эо-ваних 1золят1в В1Л.

Наступним кроком у створен*«! анти-В1Л векторно! конструк-Ui'i був виб!р промотору, вдагного направляти синтез асРНК у в!дпов!дь на проникнення вбудника в кл1тину. Це можливо, якщо синтез асРНК спрямовуватиметься промотором В1Л, який !ндуку-еться ранн1ми продуктами в1русного геному, а саме трансактиватором Tat. Виходячи з цих м!ркувань, ми використали вл/*сну транскрипц!йну систему В1Л, видаливши а не! посл!довност! ен-хансеру та негативних регулятор!в транскрипцП, 8 яких перш!

можуть впливати на нижче розташован! генн кл!тини, останн1 -ускладюоють експрес1ю ген!в п!д контролем LTR BIJI i обумовлю-ють Ix эалежи1сть в!д умов кл1тини-ха8я1на.

Шляхом реконструкцП LTR було створено новий сайт рест-рикцП Bam HI mí* енхансером та Sp-1 еле'ментами промотору В1Л-1. Для цього був синтезований ол1гонуклеотидний праймер, комплементарний Sp-1 транскрипд1йним сигналам, який mícthb та-кож посл!довн1сть сайту рестрикцП Bam HI на 5'-к1нц1. Другий праймер був комплементарний 1)5-област1 LTR В1Л-1 нижче TAR-елементу та сайту рестрикцП Hind III. 3 продукту пол!ме-разно! ампл!ф1кацП ДНК довжиною 215 п.н. було вид1лено BamHI-Hind III фрагмент довжиною 165 п.н., очищено в пол1акрилам1д-ному гел1, та клоновано в пол1л!нкер плазм!ди pUC19. Сиквенс клонованого фрагменту показав, що його посл1довн1сть в1дпов1-дае транскрипц!йн1й одиниц1 В1Л з ТАТА-боксом, основними еле-ментами 1н1ц1ац11 транскрипцП SP-1, та TAR-елементом (мал.6).

У вибор! еукар!отичного вектору ми зупинилися на аде-но-асоц1йованому Blpycl (ААВ) людини, переваги 1 приваблив! властивост1 якого (повна нешк1длив1сть для людини. достатня векторна емк1сть, адатн1сть до 1нтеграцП в певний локус 19-1 хромосоми та 1н.) широко висв1тлен! в публ!кац1ях останнього десятир1ччя.

Створена антисенсова конструкц!я pHIV-as-neo представлена на мал.7. Основою молекулярного вектору е геном ААВ, в який на м!сце генiв структурних б1лк1в клоновано селективний ген. пеог та В1Л-антисенсовий ген. ТранскршпЦя асРНК в ule! нонструкцП 8д1йснювться власним промотором В1Л-1, а наявн1сть TAR-елементу дозволяв багатократне п1двищення транскрипцП у в1дпов!дь на пояйу в KXlTHHi В1Л-специф1чного регуляторного б1лку Tat. Таким чином, в створен1й конструкцП вт!лено 1дею вворотного

эв'явку м1ж в1русною 1нтервенц1ею 1 функциональною активн!стю спрямовано! проти В1Л антисенсовоИ кокструкцП (мал.8).

Випробувашш чутливост! 1нтактних гемопоетичних кл1тин ембр1онально! печ!нки людини до В1Л-1нфекц11 показали, що 8 25 досл1джених аразк1в кл1тин в р1эних ембр1он!в лише у двох (вразки 7 та 10) синтез антигену р24 (мал.9,а) та титри 1нфек-ц1иного в!русу (мал.9,6) були сп1вставимими о цши показникамн в!русно! репродукцП в стандартн1й культур1 кл1тин МТ-4, що традицШо вшсористовуеться в експеряментах по ввд1лешю та титрувашш В1Л. Р1вн1 репродукцП В1Л в кл! тинах 1'нших двох

. пар

ШшШ_ ШгаПП

Нал. 6. Транскрипц! йна одипиця олвореного ттсеисового гену. 165-иуклеоищннй фрагмент - беаенкансерний промотор Ш? В1Л-1 в сайтами ав'язувтт транскрипцШшх фжюр!з БР-1, ТЛГА-бок-сом № ТАИ-елеменгяом промотору ВЫ; +1 - сдадг щшсхрипцИ; 38б-иуилеотвда!а фрагмент - посл1дова1<ш> геному В1Л, клонова-яа в аитсенсовШ ор!ентцИ з1дпосно промотору В1Л.

(1

6

Ни 1-1550

/|Уи!|~7?й

Нал.7.Схема вектору рНП-аз-пео, що експресуе проти-В1Л асРИК.

зразк1в (11 та 12) дамть можлив1сть стверджувати про 1х вира-дену ст1йх1сть до цього збуднику, В культурах кл1тин в решти ембр!онадышх вразк!в 1нфекц1йн1 показники були досить високи-ми - часом на 2 1дг Ш50 перевершували титр В1Л в кл1тинах МТ-4 (мал.9,б, вразки 2 та 6).

3 л1тератури в1домо (В.Наупев, 1996), що 5-102 1иф1кова-них В1Л людей, стають нос!ями збуднику без вменшення к1яькост1 Т4+ л1мфоцит1в 1 роввитку 1мунодеф1циту, тобто не хвор1ють на СН1Д. Приблизно у 102 1нф1кованих ос1б процео розвивавться в драматичною ивидк1спо, у решти хворих переб1г 1нфекц11 вважа-еться типовим. Наа1 дан1 на кл1тинному р!вн1 Шдтверджують 1с-нування прнродних механ1вм1в ст1йкост! до В1Л-1нфекц11.

Несприйнятлив1сть до В1Л-1нфекц11 валишаеться нев'ясова-нш проблемою, до яко! лише ледь вивначилися Шдходи експери-

Беэснхансегннй

Мал. 8. Схема регуляцП транскрипцИ асРНК в кж1тин! в эалеж-ност1 в1д експресН регуляторних ген!в В1Л. Верхня частна малинку в1дображае схему траиснрипцИ антсенсового гену, нижля - геному пров!русу.

ментального пошуку. Тому е вс! п1дстави спод!ватися, що вияв-лення 8 будь-якого джерела орган1зму людини гемопоетичних кл1-тин в овнаками внилено! чутливост1 до В1Л, матиме неабкяке Бначення як для вир1шення досл1дницьких вавдань, так 1 для практично! медицини. В першому випадку так1 кл1тини дали б вмогу виявлення кл1тинних фактор!в 1 механ18м1в стримування 1нфекц11. В кл1н!ц1 к трансфувП ст!йких до В1Л стовбурових

Титр антигену р24 X 103

6.4 •

4.8

з.;

1.6

а)

8 9 10 11 12 13

1н$екц1йниЯ титр В1Я, ¿Г /050/мл

б)

6 10 11 12 13

Нал.9.Репродукц1я В1Л-1 в гемопоетчних кл1 тинах ембр1оналъно! печ!нки людиии: 1-12 - номери культур в р1вних ембр1онов; 13 -клИтини лШ1 Ш-4. Для 1жстрац11' наведено типов! дан1.

гемопоетичних кл1тин могли б сприяти реконституцП 1мунно1 сиотеми орган1вму 1, в такий спос1б, значною м1рою полегшити долю хворкх на СН1Д, а додаткове забеэпечення таких кл1тин итучним внутр1кл1тинним 1мун1тетом проти В1Л суттево п1двищу-ватиме шачси хворих на видужання або, принаймн1, в1ддалення фатального к!нця.

- 31 -

Дат досл1джень против1русно'1 активност! антксенсово! конструкц!1 представлено на мал.10, ав!дки видно, що в популя-ц1'1 кл1тин, трансф1кованих створеною нами конструкцию pHIV-as-neo та культивованих в присуткост1 селективного анти-б!отику (графж А, крива с) спостер1галося достов!рне (р<0,01) зменшення продукцП як антигену р24, так 1 1нфекц1йного титру В1Л пор1вняно з контрольною, не трансф1кованою, культурою (графж А, крива а).

В кл!тинах, трансфИсованих векторною плазм!дою pDL52-91neo, яка лесе посл1довност! Rep-бíлкy ААВ, але не мае антисенсового фрагменту, при культивуванн! з антиб1отшсом G418 також в1дбувалося достов1рне (р<0,01) пригн1чення репродукцП В1Л (мал.10, граф!к А, крива Ь). Ефект пригн!че.чня репл1кац11 Blpycy в даному досл1д1 (контроль вектору) може бути аумовле-ний д!ею саме /?ер-б1лку ААВ. В контрольних досл1дах, де в кл1-тини трансф!кували плазм!ду, що м1стила лише к1нцев! повтори ААВ (тобто не здатну синтезувати Rep-б!лок ААВ), псм!тного впливу на В1Л-1нфекц1ю не в1дбувалося. Це опосередковано п1дт~ верджуе дан! л1тератури (Antony В.,1991; Sczakiel G.,1992; 1994) про здатн1сть ААВ-специф1чного Rep-б!лку пригн1чувати репродукц!ю В1Л.

Кр1м антисенсового та Rep-сбумовленого механ1зм1в пригн!-чення рспл1кацП В1Л, як1 вабезпечуе створена антисенсова конструкц1я, можна спод1ватися також 1 на додатковий вплив на В1Л а боку TAR-елементу, що вгадуеться в л1тератур1 як вико-навча ланка механ1зму блоку репл1кацП В1Л п1д назвою TAR-decoy (B.Sullenger,1990).

В трансф1кованих кл1тинах, в раз1 культивування бэз селективного антибЮтику G-418, пом!тного пригн1чення в1русно! репродукцП не в!дбувалося (мал.10,В). Це зумовлено тим, ер

Ыал.10. Впвив amuceacoBoï векпараоХ конструкцИ на репоодук-Щю ß/Л в геиопоептних кл1втах. А - в npucymuocml omublons-КУ 0-418; В - без анпи61стжу. а - не трансф1кован1кл1тни;

Ь - ¡Шпини, трансф1кован1 векторной консшрущ1ею pDL62-91neo: с - KBlmmu, трансф1кован1 аилисенсовою векторной KOHcmviail&o pHlV-as-neo.

лише 3-5Z популяцП 1нф!кованих кл1тин забезпечен1 антисенсо-вим внутр1кл1тинним 1мун1тетом. Б1льша частина кл1тин популяцП не трансф!кована, 1 у в1дсутност1 антиметабол1ту эбер1гае нормальний р1вень життеэдатност!, а в!дтак i ввичайну чутли-в!сть до В1Л-1нфекц11. В умовах селективного тиску кл1тини, що несуть в соб! антисенсову конструкц!ю разом 8 геном ст1йкост1 до антиб1отику. залишаються жигтездатними, але репродукц1я В1Л в них ваблокована асРНК, тод1 як у решти кл1тин нормальний поди припиняеться.

Враховуючи досягнут1 позитивн1 результати по пригн1ченню in vitro решг1кац!1 В1Л в гемопоетичних кл!тинах людини, що несуть в соб1 антисенсов1 векторн! конструкцП, б п!дстава оч1кувати, що при трансфузП хворому на СН1Д вони в!зьмуть на себе фун'кцП 1мунного вахисту орган!зму, а по Mipi заповнення такими кл1тинами кров'яного русла кров рецип1ента буде посту-пово 8в1льнятися в1д вбудника. Можна припустити також, що про-тягом такого, контрольованого, 1нфекц1йного процесу в орган1з-м1 в1дбуватиметься нароб1тка против1русних антит1л, що сприя-тиме формуванню власного 1мунного захисту. Ягацо передбачуван1 ефекти матимуть м!сце в органisMi пац1ента, можна спод1ватися, що трансплантац1я ст1йких до В1Л гемопоетичних кл1тин продов-жить .йому жигтя або хоча б полегшить страждання. Шдтвердити (або спростувати) висловлен1 вище припущення можуть результата клШчних випробувань створено! системи генно! терапП СШДу.

Таким чином, ровробка молекулярно! векторно! конструкцП для створення штучного внутр1кл1тинного 1мун1тету проти В1Л досягла поставлено! мети: в грансф!кован1й нею популяцП кл1-тин спостер1галося суттеве пригн1чення репродукцП збудника СШДу. Досягнут1 результати даоть право стверджувати, шр на основ! гемопоетичних кл!тин людини створено систему генно! те-

panll СН1Ду, яка п!сдя завершения докл!нхчних тесПв може бути

передана на клШчн! випробування у хворих на СН1Д.

3.2. Створения та випробування анхи-В1Л ркбознмно'х конструкцН.

Нами було побудовано рибозим (мал.11). що в1дпов1дае мо-дел1 "головка молотка" 1 специф1чний до д1лянки першого екс-пресуючого екзону tat-РНК (точка розщеплення в!дпов1дае пози-ц11 5376 п.о. посл!довност1 В1Л-1 изоляту ВН10). Виб1р модел1 зумовлено малими розм1рами рибовш1в цього типу 1 найб!льш широким 5х випробуванням в р1эних експериментальних системах.

П1дчас випробування нам не вдалося виявити катал!тичну активн!сть вконструйованого нами рибозиму в реагаЦйних умовах, характерних для рибозтйв цього типу: 50 мМ трис-HCl pH 8.0, 20 мМ MgCl2, температура 45-50°С, тривал1сть реакц11 60 хв, при екв!молярному сп1вв1дношенн! РНК-субстрату 1 рибозиму.

I 2 з

САЙТ Р03Р13АННЯ (5376 III ü EJU8 ) РНК-СУБСТРйТ у

5' -CUGAflGGCAGUC ÀGACUCAUC.. .-3' jjCUUCCGUCfl UCUGAGÜuCg _G л ^ Ал

с 5 А. А сл

A Чс «U i

AU S

GC Л GC I ^fil/" Gjjpp-5'

РИБСЗИН

jat-PHK-субстрат 396 и.о.

290 и.о. -продукт (280 и.о.)

_220 и.о.

_У-продукт (130 и.о.)

Мал. 11. А - фрагмент tat-PHK 6Ш сайту розщепления-та посл1-

дозн!ст рибозимно}' РНК. , ____

Б - елетрофорез в денааурутому бХ-му ПААГ tat-PHK ma продук-mlB ïï розщеплення: • 1 - 1нкубаЩя tat-PHK бе а рибозиму; £ -1нкубац!я tat-PHK в рибозшом при додавали! 125 M кал1ю ацетату; 3 - те х при додаваин1 200 ш кал! я ацетату 1 2 мМ спер-Шдину. Лраворуч наведено положения маркерних фрагмвнпйв. РНК-субстрату та продукта peamiî.

Продукта реакцП не виявлялися в цих умовах 1 при суттевому зб!льшенн! тривалост! !нкубац1! (2 год при 50°С або 14 год при 34°С). В!дсутн!сть катал!тично! активност! рибозиму, поряд з !ншим, могла бути обумовлена ! тим, що посл!довн!сть д!лянок рибозиму, комплементарних субстрати!й РНК, - в сум! вона скла-дала 16 н.о. - була занадто короткою для п!дтримки комплементарно! структури при п!двищених температурах. Однак, н! при 34°С, н! при 20°С нам не вдалося виявити катал1тично! активност! рибозиму в канон1чних р°акц1йних умовах.

Додавання в реакц1йну сумш мсновалентккх катиохПв (кал!ю хлориду, кал!ю ацетату) в ф!з!олог!чних концентрац!ях (100-300 мМ) призводило до актив1зацП катал!тично! здатност! рибозиму, 1 при 8-кратному надлишку рибозимно! РНК по в!дноаенню до РНК-субстрату ефективн!сть реакцП складала б1ля 10% (мал.12, дор!жка 2). Додавання сперм!дину в концентрац!ях 1-5 мМ при тих же умовах призводило до аналог!чного результату. Сп1льне додавання в реакц!йну сум1ш моновалентних кат!он!в 1 сперм!ди-ну зб!льшувало вдв!ч! еффективн!сть реакцП (мал.12, дср!жка 3). При цьсму б1ля 202 вих!дно! субстратно! 1а1-РНК переходило в продукти реакцП - 5*-фрагмент роен!ром 280 н.о. 1 3'"фрагмент розм1ром 116 н.о.

Таким чином, зкснструйований нами рибозим проявляв ката-л1тичну активн!сть при ф1з1олог1чних умовах (рН, 1онна сила, температура, присутн!сть пол!ам!н!в), ! хоча ефективн!сть реакцП була пор!вняно невелико», в подан!й робот! зроблено значний крок по створенню рибозиму, який спрямований проти т!-е! ж м1шен! в геном! В1Л, що й антисенсова РНК. Виявлена ката-л!тична акгивн!сть рибозиму проти субстрату-м!шен! 1п уНгс-дав Шдстави спод!ваткся на усп!шну реал1аац!ю в недалекому майбутньому поеднання в одн!й векторн!й конструкц!1 двох 1нс-

трумент1в Соротьби з В1Л-1нфекц1ею - антисенсових РНК та рибо-8им1в, що, за 1снуючих уявлень, повинно позбавити. збудника СН1Ду можливост! репродукцП i продовження 1нфекц1йного проце-су.

висновкм

1.Алк1лован1 т1офосфам!дом нукле'шов! кислоти пригн!чують репродукц!» РНК- та ДНК-геномних BipyciB.

2.В процес! алк!лування ДНК в1дбуваеться накопичення етилен!м1нних груп, утворення м!жниткових 8шитк1в та фрагмен-тац1я пол!нуклеотид1в.

3.Алк1лован1 нуклеинов! кислоти за мутагенною активн1стю поступаються вих1дним препаратам, не впливають негативно на 1мунокомпетентну систему тварин i не едатн! до 1ндукц11 1нтер-ферону.

4.Денатуруюча д1я т1офосфам!ду на нукле!нов! кислоти за-безпечуе одержання 1нактивованих в!русних вакцин, як! при висок! й 1муногенност1 позбавлен1 мутагенних властивостей, прита-манних живим в1русним препаратам.

5.На основ! адено-асоЩйованого Bipycy людини збудовано векторну конструкц!ю для створення внутр!кл!тинного 1мун1тету за допомогою антисенсових РНК проти ген1в В1Л tat i rev. Трансфекц!я антисенсово! конструкцП в ембр!ональн1 гемопое-тичн! кл1тини людини 8абе8печуе Ix ст1йк!сть проти вбудника СШДу в експериментах In vitro.

6.Встановлено, що гемопоетичн! кд!тини 8 б1льшост1 ембр1-он1в людини високо чутдив1 до В1Л, Виявлен1 в робот1 врааки кл1тин is вниженоо чутлив1стю до В1Л на кд1тинному р!вн1 п!дт-верджують 1снування природно! ст1йкост1 до цього збудника, проявом яко! в в1доые явище безсимптомного нос1йства Blpyca СН1Ду.

7.Синте80ваний 1 клонований рибозим типу "головка молотка" специф1чно розщеплюе in vitro tat/rev-мРНК-транскрипти В1Л, що уможливлюе його використання як додатковий зас!б внут-р!кл1тинного 1мун1тету проти В1Л при створенн! нового покол1н-ня систем генно! терапИ СН1Ду.

OcHOBHi роботи, надрукован1 за темою дисертацП :

1. А.Д.Швед. Метод електронноК MiKpocKoniï у в!русолог!чних досл1дженнях // М1кроб1олог1чний журнал. - 1976. - 38, N 5. - с.659-664.

2. Швед А.Д., Соломко А.П.. Потопальский А.И., Ивасивка C.B., Гршценко A.M., Александров Ю.H., Ткачук З.Ю., Цегельский

A.A., Крылова Э.Л., Ткачук Л.В., Семерникова Л.И. Структурно-функциональные особенности модифицированных нуклеиновых кислот // Молекулярная биология. - 1980. - Вып.26. -с.64-78.

3. Т.И.Бужиевская,Л.Л.Лукаш, В.С.Мельниченко, А.Д.Швед. Индукция генных мутаций в клетках млекопитающих под действием РНК вируса гриппа // Докл.АН УССР. Сер.Б. - 1981. - N 9. -с. 65-68.

4. А.Д.Швед. Антивирусные свойства полинуклеотидов, не связанные с индукцией интерферона // Микробиол.журн. - 1982. -44, N 3. - С.75-85.

5. A.V.Kozlov, O.E.Kitam, A.I.Potopalsky, A.D.Shved, Y.P.Piryatlnski, M.V.Kurik, O.V.Veselovsky. Structural changes in DNA upon alkylation with thiophosphamide // studla biophyslca. - 1982. - v.87, N 2/3. - P. 97-98.

6. Швед А.Д., Бабкин В.Ф., Потопальский А.И., Мельниченко

B.C.. Краснова Е.Ф. Ингибирование химически модифицирован' ными нуклеиновыми кислотами репродукции вируса инфекционно-

го даринготрахеита птиц // Вопросы вирусол. - 1982. - N 3.

- с.117-119.

7. Потопальский А.И., Спивак Н.Я., Швед А.Д., Мельниченко B.C., Краснова Е.Ф.. Активность некоторых химиопрепаратов в отношении вируса трансмиссивного гастроэнтерита и энтерита свиней // Микробиол.журн. - 1983. - 45, N 5. - с.75-78.

8. Т.ЬВужиевьска, Л.Л.Лукаш, А.Д.Швед, 1.В.Вав1л1на, B.C. Мельниченко. Мугагенний ефект Нативно! 1 модиф!ковано! РНК вирусу грипу // ДАН УРСР. Сер.Б. - 1985. - N 7. - с.58-60.

9. Е.Л.Рубашевский, Л,Л,Лукаш, А.Д.Швед, B.C. Мельниченко, Л.Т.Тыльванчук, Т.И.Бужиевская. Мутагенная активность на-тивного и ¡¡¡¡активированного вируса простого герпеса // Биологические науки. - 1988. - N 9. - с.83-87

Ю.!Явед А.Д., Спивак Н.Я.. ОнишукФ.Д., Потопальский А.И., Жаркова Л.Д., Краснова Е.Ф., Мельниченко B.C., Семерникова Л.И., Тыльванчук Л.Т., Лисовенко В.Г., Федоров А.И., Бабкин В.Ф. Изучение антивирусной активности экзогенных нуклеиновых кислот и их химически модифицированных производных // В сб.: Макромолекулы клеток и вирусов. - Киев, Наукова думка.

- 1986. - с.47-60.

11.Швед А.Д., Золотухин С.Б., Мацука Г.Х. Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии // Биополимеры и клетка. - 1987. - 3, N1. - с.3-17.

12.Швед А.Д., Решетник Е.Ю., Золотухин С.Б. Антисмысловые РНК как регуляторы экспрессии вирусных генов // Республик.межведомств, сб. "Вирусы и вирусные заболевания". Изд. "Здо-ров'я", К. - 1990. - Вып.18. - с.56-58.

13.Решетняк Е.Ю., Золотухин С.Б., Швед А.Д. Использование аде-но-ассоциированного вируса в качестве эукарютического ьек-тора // Республйк.межведомств.сб."Вирусы и вирусные заболе-

- 39 -

вания". Изд. "Здоров'я", К. - 1990. - Вып.18. - с.54-56.

14.Кухаренко А.П., Швед А.Д. Регудяторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома // Биополимеры и клетка. - 1994. - 10, N 5. - с.5-30.

15.Сухорада Е.М., Лугаш Л.Л., Подольская C.B., Швед А.Д., Сми-кодуб А.И. Способ получения и культивирования эмбриональных гепатоцитов человека. Биополимеры и клэтка. - 1995. - 11, N 1. - с.92-94.

16.Швед А.Д., Кухаренко А.П., Когут Г.И. Научно-практическое использование гемопоэтических клеток кордовой крови // Биополимеры и клетка. - 1995. - 11, N 2. - с.5-14.

17.Бурьяновский Л.Н., Швед А.Д. Специфическая деструкция tat-PHK ВИЧ-1 in vitro с помощью каталитически активного полирибонуклеотида, рибозима // Биополимеры и клетка, -1996. - 12, N 3. - с.20-23.

18.Кухаренко О.П., Швед А.Д., Рибалко С.Л., Лукаш Л.Л., К1таы O.E.. Сухорада О.М., Рубан Т.П., Грицак Т.Ф., 1ванська Н.В. Створення модельho'ï векторной конструкцП, що експресуе антисенсов! РНК проти В1Л-1, для внутр!шньокл1тинно1 1мун1за-цП гемопоетичних кл1тин // 1нфекц1йн1 хвороби. - 1996. -N 3. - с.22-25.

19.Швед А.Д., Потспальский А.И., Ткачук Л.В. Структурно-функциональные изменения алкилироваиной тиофосфамидом ДНК фага X // Fourth International Symposium of Socialist Countries on "Antiviral Substances". - Szeged, Hungary. - June, 23-25, 1980. - P.28.

20.О.Э.Китам. А.В.Козлов, Ю.П.Пирятинский, А.И.Потопальский, А.Д.Швед. Исследования структуры ДНК при алкилировании тиофосфамидом // Симпозиум по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов. Tes.докл. - Таллин, 1681. 31.

21.A.D.Shved, A.I.Potopalsky, N.Y.Splvak, A. I.Fedorov, V.F.Babkln, V.S.Melnlchenko, E.F.Krasnova, L.D.Zharkova, L.I.Semernikova. The study of antiviral properties of exogeneous chemically modified nucleic acids // V-th International Symposium of Socialist Countries "Antiviral Substances". - Riga, September 6-8, 1982. - P.37.

22.Майский В.Г., Швед А.Д., Солдатова Ю.В., Зацепин В.И. Действие тиофосфамида и модифицированных им ДНК на микробы чумы и псевдотуберкудеза // Профилактика природноочаговых инфекций. Тез.докл.Всесоюзной научно-практической конфер. - 6-8 декабря 1983г. - с.311-313.

23.Л.И.Семерникова, Л.Ф.Диденко, А.Д.Швед, В.Г.Краев, О.Э.Ки-там. Задержка репродукции Х-вируса картофеля с помощью инактивированного гомологичного вируса // Тез.докл. VII 1-го Всесоювн.совещания "Теория и практика использования иммунитета сельскохозяйственных культур к вирусным болезням. -Вильнюс, май, 1984. - С.23-24.

24.А.Д.Швед, С.Б.Золотухин, О.Э.Китам, Е.Ю.Решетняк, Г.Х.Мацу-ка. Антисмысловые РНК как инструмент регуляции экспрессии генов // VII-th International Symposium of the Socialist Countries on Antiviral Substances. Abstracts. - Varna, Bulgaria. - October 12-14, 1987. P.46.

25.Мацука Г.Х., Швед А.Д., Золотух1н С.Б. Антисенсов! РНК -регулятори генно! експресП // V Укра!нський 61ох1м1чний 8'1эд. Tea. доп., ч.1. - 1ваноФранк!вськ, вересень 1987р. -с.105.

2б.0.Ф.Сенюк, О.А.Слатв1нська, В.В.Ромашко, Л.Л.Лукаш, Г.С.Ло-Синцева, А.Д.Швед, I.А.Вотякова. Досл!дження 1муногенност! ембр1ональних кл!тин печ!нки, що використовуються в якост! трансфувата при 1муногематолог!чних недугах // Трет1й Укра-

Инський з'1зд гемаголог1в 1 трансфуз!олог1в. Тези допов1-дей. - 23-25 травня 1995р., м.Суми. - Ки1в, 1995р. -с.54-55.

27.Г.И.Когут, П.М.Перехрестенко, А.Д.Швед. К вопросу об использовании пуповинной крови в медицинской практике // Тре-т1й Укра1нський в'1зд гематолог1в 1 трансфуз!олог1в. Тези допов1дей. - 23-25 травня 1995р., м.Суми. - КиЗв, 1995р. -с.91.

28.Рубашевский Е.Л., Лукаш Л.Л., Швед А.Д., Мельниченко B.C., Тыльванчук Л.Т., Лысенко Е.Ф., Вавилина И.В., . Булиевская Т.И. Индукция генных мутаций вирусом простого герпеса в клетках млекопитающих // Всесоюзная конференция по генетике соматических клеток. Тез.докл. - Москва, 19-22 октября, 1986. - с.76.

29.Shved A., Kukharenko A., Lukash L., Ivanska N.. Rybalko S. Inhibition of HIV replication with antisense RNA in human fetal liver hemopoietic cells transfected with adeno-associated virus vector // The 3-rd Internat. Confer.on AIDS in Asia and the Pacific, Chiang Mai, Thailand, 17-21 Sept., 1995. Abstr.PA601.

ЗО.О.Кухаренко, Л.Лукаш, H. 1ванська, О.Сухорада, 6. Жеребцова, Т.Рубан, С.Подольська, С.Рибалко, Т.Грицак, Е.Максименок, Н.Ченцова, А.Швед. Конструювання еукар1отичного вектора на ochobI ААВ, який зд!йснюе синтез у кл!тин! антнсенсових РНК проти В1Л // Зб1рник тез Першо! нац. наук.-прпкт. конфер. з проблем В1Л/СН1Д э м1жнародною участю. Ки1в, 24-26 с1чня 1995р.. с.61-62.

31.Н.1ванська, О.Сухорада, Л.Лукаш, Т.Рубан, С.Подольська, С.Рибалко, Т.Грицак, Е.Максименок, Н.Ченцова, А.Швед. Чут-лив!сть ембр!ональних кл!тин людинн до В1Л-1нфекц11 //

Зб1рник тез Першо'1 нац. наук.-практ. конфер. з проблем В1Л/ СН1Д э м!жнарод.участю. Ки1в, 24-26 с!чня 1995р., с.56-57. 32.А.с. СССР N 222882 (у сп1вавторств1 8 Красновою К.Ф., К1тамом O.E., Федоровим А.I. та 1н.) ДСП.

Швед А.Д. Структура и функциональные свойства полинуклеотидных ингибиторов вирусной репродукции (алкилированных нуклеиновых кислот, антисмысловых РНК и рибозима).

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, Киев, 1996.

Защищается 32 научные работи, содержащие материалы экспериментальных исследований антивирусних свойств нуклеиновых кислот, антисмысловой РНК и рибозима. На моделях ДНК- и РНК-геномных вирусов показана антивирусная активность ряда нуклеиновых кислот, а их алкилированные производные более еф-фективно ингибировали репродукцию вирусов. Эндогенный синтез антисмысловых РНК обеспечивал существенное угнетение репродукции ВИЧ-1 в культурах гемопоэтических клеток человека. Синтезирован и клонирован рибозим, способный специфически разрезать in vitro tai-PHK ВИЧ-1.

Ключевые слова: алкилированные нуклеиновые кислоты, антисмысловая РНК, рибозим, ВИЧ-1.

Shved A.D. Structure and functional properties of polynucleotide inhibitors of virus reproduction (alkylated nucleic acids, antisense RNAs and ribozyme).

Doctor of Sciences Dissertation, specialization 03.00.03 -Molecular Biology, Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1996.

The materials of 32 scientific publications on the experimental research of antiviral action of nucleic acids and their chemically modified derivatives, antisense RNA and ribozyme on the models of RNA and DNA containing viruses are defended. The antivirus properties of nucleic acids isolated from various sources were revealed, but their alkylated derivatives inhibited virus reproduction more efficiently. The endogeneous synthesis of antisense RNA provided essential inhibition of HIV-1 replication in human hematopoietic cell cultures. The ribozyme capable to cleave specifically HIV-1 tat RNA in vitro was synthetised and cloned.

Key words: alkylated nucleic acids, antisense RNA, ribozyme, HIV-1.