Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и динамика комплексов ДНК с растворителем

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структура и динамика комплексов ДНК с растворителем"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

Беглов Дмитрий Борисович

УДК 647.963.3

СТРУКТУРА И Д ИНАМИКА КОМПЛЕКСОВ ДНК О РАСТВОРИТЕЛЕМ 03.00.02 "Биофгаика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Долгопрудный - 1991

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики АН СССР.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук,

профессор ' М.А.Мокульский

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Иванов В.И. доктор физико-математических наук Полтев В.И.

Ведущая организация;

Институт молекулярной биологии АН СССР.

Защита состоится " '"_1991 г. в_час.

на заседании специализированного Совета К 063.91.10 при Московском физико-техническом институте по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский пер., 9, МФТИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан "_" _1991 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат физико-математических

наук В.Б.Киреев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. ДНК, будучи сильно заряженным полимером, не может существовать без водно-ионного окружения. При этом •конкретной конформации ДНК как в кристаллическом состоянии, так и в растворе соответствует специфическая, стабилизирующая данную конформацию структура ионно-гидратной оболочки, изменения которой сопровождаются конформационными переходами. Структура ДНК во многих случаях успешно определяется в результате рентгеноструктурных исследований волокон и кристаллов олигонуклеотидов, однако сведения о структуре связанного растворителя и противоиг-ов в большинстве случаев фрагментарны. Моделирование структуры связанных про-тивоионов вблизи ДНК может давать дополнительную информацию об адекватности конкретной рентгеноструктурной модели. Значительный интерес представляют также данные о распределении противоионов вокруг ДНК в растворе. Сведения о структуре ДНК и влиянии на нее водно-ионного окружения важны для понимания особенностей функционирования и взаимодействия ДНК с другими биологичэски важными молекулами.

Цель диссертационной работы состояла в определении влияния водно-ионного окружения на структуру ДНК на примере B-D перехода и четырехспиральной G4-формы, в исследовании особенностей B-Z перехода в рамках теории полиэлектролитов, а также в определении структуры комплексов ДНК с ионом Na+ и молекулами воды на примере натриевой соли poly(dA):poly(dT).

Научная новизна и практическая ценность работы. На основе исследования стерической доступности атомных группировок, а также в результате моделирования структуры растворителя вблизи Б и D-форм 'ДНК предложено новое объяснение механизма B-D перехода. Моделирование встраивания ионно-гидратного комплекса в различные BHD структуры ДНК позволило оценить адекватность соответствующих рентгеноструктурных моделей.

На основе данных рентгеновской дифракции проведено уточнение структуры ДНК и ионно-гидратного окружения натриевой соли poly (dA) -.poiy(dT), что привело к появлению принципиально новых структурных особенностей. Построена новая модель ионно-гидратных комплексов со стороны негликозидного желобка двойной спирали poly (dA):poly(dT), непротиворечивая стерически и соответствующая рент-геноструктурным данным. Полученная модель позволяет объяснить осо-

- г -

бенности упаковки волокон натриевой соли poly(dA):poly(йт).

Методами квантовой химии на основе дифракционных данных найдено распределение электростатического потенциала вблизи фрагмента структуры четырехспиральной модели од-формы, что в совокупности с молекулярно-динамическими расчетами свидетельствует о притягательности для противоионов аксиального канала внутри структуры ДНК. Такое поведение противоионов интересно с точки зрения стабилизации структуры G4-формы.

В рамках теории полиэлектролитов на основании решения уравнения Пуассона-Больцмана исследована зависимость разности свободной энергии между Du Z формами ДНК в широком диапазоне ионных сил для различных моделей растворителя. Полученные результаты согласуются с наблюдениями В-z перехода в области низких ионных сил.

В процессе работы разработаны модели и алгоритмы,- которые были реализованы в комплексе вычислительных программ, позволяющих оптимизировать структуру ДНК, проводить молекулярно-динамические расчеты с учетом полиэлектролитной природы ДНК, моделировать структуру растворителя вблизи ДНК.

Апробация результатов работы. Результаты работы докладывались на XV конференции молодых ученых МФТИ (Долгопрудный, март 1990), на IV всесоюзном^совещании "Математические методы исследования полимеров и биополимеров" ( Пущино, 1985), на II Всесоюзной конференции "Математические вычислительные методы в биологии. Биомолекулярные системы" (Пущино, 1987), на рабочем совещании по кривизне и изгибам ДНК (Англия, Кембридж, сентябрь 1988), на 19 конгрессе febs (Италия, Рим, июль 1989г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы по теме, трех глав с изложением проделанной работы, приложения и списка цитированной литературы. Материал диссертации изложен на странице машинописного текста, включая иллюстрацию, таблиц и список литературы, насчитывающий наименований.

СОДЕРЖАЖЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации и ее научная новизна, сформулирована цель исследования.

В обзоре, литературы рассмотрены результаты работ, имеющих

непосредственное отношение к диссертационному исследованию. Для дальнейшего изложения важно следующее.

Одним из факторов, приводящих к информационным перестройкам ДНК, является снижение относительной влажности (ОВ) или понижение активности воды в растворе . Конформации ДНК, в которых атомные группировки гидратируются Солее экономно, получают естественнее

преимущество в условиях пониженной ОВ. В работе /1/ предложен механизм, объясняющий стабилизацию А и Z форм ДНК по сравнению с в-формой в терминах экономии гидратации фосфатных групп. Авторы обнаружили, что если в кристаллах ДНК в в-форме, стабильной при высокой влажности, фосфаты гидратированы индивидуально, то в а и Z-формах образуются водные мостики между кислородами соседних вдоль цепи фосфатных групп (одна молекула воды на два фосфата), которые в данных формах ДНК заметно сближены по сравнению с В-формой. Аналогичный подход не применим для объяснения b-d перехода, сопровок-дающегося дополнительным закручиванием двойной спирали. Расстояния между кислородами фосфатов вдоль цепи в D-форме почти такие же, как и в в-форме ДНК, хотя D-конформация, подобно А и z-формам, стабильна при пониженной ОВ. В настоящей работе мы предлагаем новый механизм объяснения B-D перехода в терминах экономии гидратации группировок гликозидного желобка двойной спирали.

Одним из наиболее ярких примеров проявления гидратационных эффектов является структура poly(dA):poly(dT). При всех относительных влажностях это ю-кратная спираль В-типа (В'-ДНК) с периодом 3,2 нм и зауженным гликозидным желобком. Необычная стабильность и особенности структуры poly(dA):poly(dT) связываются с на-^личием в гликозидном желобке двухслойного водного хребта, аналогичного тому, который наблюдался в кристаллах cgcgaattcgcq. Эта точка зрения нашла свое подтверздение в недавних работах /2/, в которых авторы наблюдали в растворе конформационннй переход poly (dA):poly(dT), происходящий как при нагревании, так и при воздействии химических факторов, которые могут способствовать разрушению упомянутого водного хребта. Детальная структура poiy(dA):, poiy(dl) дополнительно исследовалась нами в настоящей работе как сама по себе, так и с точки зрения взаимодействия с противоионами.

Отчетливый эффект влияния противогонов на стабилизацию струк-. туры нуклеиновых кислот наблюдается на примере неканонической че-тырехцепочечной 04-формы (рис.1). Такую структуру могут образовывать G-богатые участки ДНК и РНК. Вместо привычных пар оснований

Рис и. Вид вдоль оси на структуру четырехцепо-чечной форш. Гуанино-вые 0сн0ве.лия за счет неканонического спаривания' ассоциированы в тетрадные агрегаты. Атомы Об гуанинов обращены в аксиальный канал и могут участвовать в комплексооорызовании лротивоионов.

в б4-форме присутствуют плоские агрегаты, образованные четырьмя неканонически связанными гуактовыми основаниями. Интересно, что 04-форму могут принимать фрагменты ДНК, с в-богатой последовательностью, характерной для теломер /3/, роль которых в клетке чрезвычайно важна. Стабильность с4-формы значительно варьируется в зависимости от типа противоионов, что связывается с различными возможностями их комплексоооразования в аксиальном канале ои-спирали. В настоящей работе методом молекулярной динамики нами исследуется поведение противоионов вблизи С4-формы.

Задача нахождения распределения подвижных противоионов вокруг заряженного полигона имеет прямое отношение к рассматриваемой в настоящей работе системе ДНК-противоионы и традиционно решается 'теорией пслиэлектролитов /4/ либо на основании уравнения Пуассо-на-Больцмана, либо методом Монте-Карло. При этом основные трудности возникают в связи■дальнодействуюши^ характером электростатического потенциала. В настоящей работе предложена молекулярно-динами-ческая модель решения этой задачи.

В рамках теории полиэлектролитов авторами.раоотй /14/ предложено объяснение механизма Ъ-Ъ перехода в области низких ионных сил. Однако ото объяснение было подвергнуто критике в работе /15/. Наши результаты разрешают возникшее' противоречие и показывают, что оно связано с недостаточной широтой диапазона ионных сил, для которых производились вычисления в раоотэ /15/.

(. V

с

гу

.¿^ ' -('л* ''л -■"У-^

V..

ъ

" V

в главе i предлагается объяснение механизма b-d перехода, происходящего в условиях водного дефицита. Если предположить, что принцип гидратационной экономии имеет место в случае B-D перехода, то он, очевидно, не имеет отношения к фосфатным группировкам. Мы исследовали эту проблему, исходя из оценок доступности ДНК растворителю, полученных методом Ли и Ричардса, а также из результатов моделирования структуры растворителя вокруг d и в форм.

Для расчета площади доступной поверхности.атомных группировок Ван-дер-Ваальсовы радиусы Ra атомов ДНК были взяты нами из работы Альдена и Кима /6/. Водородные атомы учитывались как явно, так и неявно (за счет увеличения величины Ra), результат <:т этого практически не зависел. Молекула воды описывалась сферой радиуса

Rp=o,i4 нм. Кроме того, в одном случае мы оценивали доступность, ДНК иону Na, который описывался сферой радиуса Rp=0,i нм. Во всех случаях фрагменты ДНК были, самое меньшее, размером в 6 пар оснований, и доступность атомов оценивалась для двух центральных пар оснований в фрагменте. Альден и Ким исследовали только три пары оснований, оценивая доступность атомов средней пары. Однако наши вычисления показали, что в этом случае не удается избежать концевых эффектов. Среди вариантов D-формы Альденом и Кимом была' исследована лишь модель "гладкой" D-формы poly(dAAT):poly(dATT) /6/. В наших рассчетах суммарная доступность в этом случае примерно на 10% меньше из за отсутствия концевых эффектов.

Некоторые выводы об изменениях гидратации ДНК при B-D переходе были получены в результате моделирования оптимального положения водных молекул в желобкзх двойной спирали на основании рентгеновских данных. Чтобы достичь приемлемых длин'водородных связей в этих расчетах мы оптимизировали расстояния между молекулами воды и полярными атомами ДНК.

Мы использовали в качестве модели poly(dAT):poly (dAT) при высокой относительной влажности конформацию классической В-формы ДНК со смешанной последовательностью, обозначенную нами Вз ("гладкая" (smooth) B-форма) наряду со "сморщенной" (wrinkled) в-формой Na-poly(dGC): poiy(dGC) /7/, обозначенной Bw. В наших рассчетах последовательность чередующихся А-Т пар была подставлена в эти структуры. Для D-формы мы использовали дифракционные модели натриевых солей poly(dAT):poly(dAT), а также poly(dAAT):poly(dAAT), обозначенных D и D соответственно.

W S

В табли показаны величины доступности группировок В и D-форм

- b -

ДНК молекулам воды и ионам натрия в случае d—модели. Суммарная доступность нуклеотидной пары уменьшается при b-d переходе, что свидетельствует о том, что D-форма гидратирована оолее экономно. Из таол.2 также видно, что доступность атомов оснований в глико-зидном желооке намного меньше в d-форме, чем в B-форме (для ds-mo-дели эта величина равна нулю). Одновременно доступность группировок негликозидного желоока отличается незначительно. В таол.1 также представлены значения доступности аюмных групп в В^-конформа-ции ДНК. Мы моделировали эту конформацию на основе атомных координат кальциевой соли poly(dA) :poly(<5l). К этим координатам мы адаптировали модель poly(dAT):poly(dAT). Изменения доступности при b-d и b-bh переходах оказались сходными.

Расстояния между' некоторыми полярными атомами BHD ДНК представлены в таол.2. Сравнение расстояний между олизко расположенными полярными атомами (табл.2), которые могут взаимодействовать с одной общей молекулой воды, свидетельствует о том, что полярные атомы как в В так и в D-ДНК гидратированы одинаковым образом. Дополнительный анализ доступности отдельных атомов, с учетом их ориентации по отношению к желоокам двойной спирали, указывает на. то, что уменьшение доступности атомов сахарофосфатного остова при B-D переходе также наблюдается преимущественно со стороны глико-зидного желобка. К примеру доступность 04' сахарного кислорода, который ориентирован в гликозидный желобок, уменьшается в три раза при переходе от Bw к ож-форма.

Первая гидратная оболочка B-формы poly(dAT):poly(dAT) включает две молекулы вода (на пару нуклеотидов), связывающие атомы пуринов N3 или пиримидинов 02 с сахарными кислородами 04' той же самой цепи. Как видно из рис.2а., даже большее число молекул воды можно легко расположить в первой гидратной оболочке гликозидного желоока В- модели ДНК. Вторая гидратная оболочка может здесь включать две или более молекулы воды. В гликозидном желооке Dw-üHK значительно меньше места. Здесь может разместиться водный хребет, состоящий лишь из двух молекул воды на пару нуклеотидов (одна в первом и одна во втором слое) и аналогичный наблюдаемому в А-Т участке кристаллического додекамера d(CGCGAATTCGCG) Таким образом, две гидратные оболочки в гликозидном желобке D^-формы включают оолее чем в два раза меньшее количество молекул воды, чем в случае В-формы.

Равная нулю доступность молекулам воды оснований в гликозид-

V ; x V"

V V" ' ' V V. . .V.-tfW • л

Рис.2b.

A

■ф

- 'S^/'

Рис.2a: Гликозидный желобок Bw-ДНК (справа) и локализованные в нем молекулы воды (слева). Рис.гь: То же для Dw-ДНК.

ном желобке Ра-модели ДНК (табл.1) заставила нас усомниться.в адекватности этой модели. Поскольку мы имеем дело с натриевой солью, мы рассчитали доступность пары оснований молекулам радиуса 0,1 нм, соответствующего размеру иона Na+. Ион натрия может легко взаимодействовать с полярными N3 атомами- аденина и 02 атомами ти-шша точно также, как молекула води в первой гидратной оболочке в Dw-,flHK (рис.2b). Тем не менее, как следует из наших оценок, ок. таэдрическая координационная геометрия, типичная для иона натрия, не может оыть достигнута из-за того, что этот ион, взаимодействуя с атомами N3A и 02Т, недоступен молекулам воды. Все вышеизложенное свидетельствует о том, что Бд-модель нуждается в детальном уточнении, хотя основные параметры спирали, описываемой данной моделью большой отрицательный наклон пары оснований (tilt),'зауженный гликозидный желобок, и.т.д.), по-видимому, правильные.

Таолица 1. Стерическая доступность атомных группировок (в нм2 на тидов)'В и Б-форм ДНК. пару нуклео-

группировка В -ДНК 3 н20 В -ДНК " нго . V -днк Нг0 Б, -днк ' Н20 Б с„-ДНК "н20

алифатический углерод 1,524 1,466 1, ,321 1, 349 1 , ,359 1,438

ароматический углерод ,085 0,178 0, ,078 0, 039 0, ,070 0,151

сахарный кислород 0,065 0,084 0, ,033 о, 002 0, ,054 0,030

кароонильный кислород 0,132 0,092 0, ,094 о, 075 0, ,125 0,052

атом фосфатной группы 1.717 1,685 ' 1, ,833 1. 420 1 , ,254 1,648

азот ароматический 0,119 0,089 0, ,075 . о, 075 0, ,110 0,094

аминогруппа 0,074 0,04в 0, ,099 0, 107 0, ,125 0,017

атомы глик. желоока 0,164 0,178 0, ,008 0, ООО 0, ,061 0,021

ЮА+02Т 0,130 0,078 0, ,006 0, ООО 0, ,057 0,021

атомы негл. желоока 0,678 0,649 0, ,722 0, 674 0, ,711 0,717

сахарофосфат 2,876 2,815 2, ,8Г1 2, 394 2, ,326 2,691

всей пары 3,717 3,642 3, ,531 3, 067 3, ,098 3,429

Таблица 2. Некоторые расстояния между полярными атомами (в нм).

ва-днк атомы АрТ ТрА ви-днк АрТ ТрА Вк-ДНК АрТ ТрА • Ь а АрТ -днк Б^-ДНК ТрА ¿рТ ТрА

фосфатные кислорода

01Р-01Р 02Р-02Р 01Р-02Р & 01Р-02Р »

0,667 0,734 0,752 0,730

,753 ,651 ,758 ,753

,717 ,677

,731 ,750

,723 ,844

,716 ,645

,670 ,762 ,866 ,608

,752 ,726

,819 ,751

,867 ,811

,729 ,775

атомы неглик. желоока 04Т-1*6А * ,431 ,353 ,432 04Т-№А * ,358 ,524 ,341 04Т-04Т # ,670 ,357 ,672 Н6А-Ы6А # ,289 ,486 ,273 М7А-Н6А * .443 .697 .420

.351 .366 .355 .471 .398 .433 .433

,565 ,392 .452 .390 .569 .387 ,648

,294 ,586 ,425 ,688 ,398 ,673 ,310

,512 .295 .430 .344 .498 .283 ,616

,739 .523 .600 .410 .702 ,456 .814

««-направление 5*-3', *-3'-5', $-в одной цепи, »-между цепями.

Во время написания данной раооты в наше распоряжение попали координаты уточненной модели D -ДНК. Анализ доступности атомов этой структуры молекулам воды привел к результатам, которые очень похожи на случай Би-ДНК. Суммарная'доступность пары равна 3,457 нмг, доступность гликозидного желоока 0,026, негликозидного- о,678 нм2. В уточненной модели атомы N3A и 02Т доступны молекулам воды, и может оыть построен полный двуслойный водный хребет. В этом случае наличие водного хребта также подтверждается тем, что если ион натрия оказывается погружен глубоко в гликозидный желобок, для него не удается обеспечить необходимое октаэдрическое окружение. Такая же ситуация наблюдается и в случав Бт-ДНК.

Возможные причины отсутствия B-D перехода у а-о последовательностей, на наш взгляд, следующие: стерические наползания аминогруппы гуанина на атомы оснований в гликозидном желобке D-формы; трудность образования значительной пропеллероооразной закрутки (параметр propeller twist) в G-c паре, имеющёй три водородных связи. Кроме того, B-D переход в этом случае не выгоден из-за возможного нарушения аминогруппой гуанина водного хребта в гликозидном желобке D-формы.

B-D переход не наблюдается в poly(dA):poly(di) и в других полимерах, состоящих из А'Т, либо 1-е пар и не содержащих TpA (ipe) шагов. В этом случае осутствие B-D перехода не столь очевидно, поскольку другие типы стекинга (АрА, трт, ipA, Трс, ipi.CpC) могут оыть включены в D-форму, как это следует из структурного поведения poly(dAAT):poly(dATT) и других полимеров. Заметим в этой связи, что В^-ДНК структуры poly(dA):poly(dI) И poly(dAI):poly(dCT) уже имеют зауженный гликозидный желобок при любой относительной влажности, который стабилизируется водным хребтом (две молекулы воды на пару нуклеотидов), препятствующим конформационным переходам. Как следует из таоли, гидратационная экономия в В^-ДНК уже реализована, и переход Bh-D, если бы он существовал, при уменьшении ОВ не был бы выгоден.

г

На наш взгляд, B-D переход, в отличие от В-А и в-z переходов, сопровождающийся плавным изменением параметров-двойной спирали, /8/.проходит через ряд гидратационно более выгодных конформаций, промежуточных между В и D-формами, что и приводит к его плавности.

Экономия гидратации не единственный фактор, который может стабилизировать данную конформацию ДНК в условиях дефицита воды.. Конформационное равновесие существенно зависит от взаимодействия с

противоионами и от кристаллических упаковочных сил. Можно предположить, что в-D переход оудет оолее выгоден положительно .сверхспи-рализованным ДНК, происутствующим в клетке из-за уменьшения при этом сверхспирального напряжения. Такие переходы в сверхспирализо-ванной ДНК могут также спосооствоать ее изгиоанию.

Другая конформационная возможность для А+Т богатых участков ДНК, аналогичная в-D переходу,- переход в-вн может быть очень важен при взаимодействии ДНК с репрессорами, слегка изменяющими структуру двойной спирали и в других случаях, сопровождающихся изгибанием ДНК.

Глава II посвящена уточнению структура натриевой соли poly (dA):poiy(dT). возможность уточнения появилась в связи с разработкой нами двухпяраметрической статистической модели гибкого сахара. В различных формах ДНК помимо оптимальных С2'-эндо и сз'-эндо встречаются и промежуточные конформации дезоксириоозы. Адекватная модель сахара должна, в связи с этим, допускать плавное изменение геометрии кольца. Изменения торсионных углов фуранозы Ч± могут сыть с хорошей точностью описаны двумя параметрами,- амплитудой и фазой псевдовращения (т .Р) в виде :

Т. = T •oos(P+l44°>(i-2)) (1).

1 т s

Вместе с тем, при конформационных перестройках сахара меняются не только торсионные, но и валентные углы. В нашей раооте вслед за /4/ оптимальная конформация сахара при заданных xm и Р определяется из условия максимума функции правдоподооия, включающей статистические параметры средние значения и стандартные отклонения) для валентных углов и длин связей так, что условие замыкания автоматически соблюдается. Функция правдоподооия применительно к сахару имеет вид :

^ехрИ/2.1 ^ Чф1-ф^)г/С'^+(1С1 ._С2'-1с1 --сг1

Средние и дисперсии для независимых геометрических параметров получены на основе статистики кембриджского банка кристалло-структурных данных по фрагментам нуклеиновых кислот и их составляющих, содержащих сахар. Одного параметра р в оощем случае недостаточно для описания имеющихся конформация Сахаров. Нами рас- • считаны оптимальные значения валентных углов для всей плоскости tm-P и проведена аппроксимация их аналитическими выражениями, взятыми в виде:

,=Ai" (Bi+0l •00S (2 'P~72' i+Di )}' Tm ° ' •

Средние значения и стандартные отклонения валентных углов и связей для имеющихся рибоз и дезоксириооз довольно олизки. л связи с этим предлагаемая нами модель может оыть с достаточным основанием применена как к риоозе, так и к дезоксирибозе. Сахарное кольцо показано на рис.3. Его структура однозначно задается двумя торсионными углами г3, г4, рассчитываемыми в заданной точке ^иР, а также тремя валентными углами, фо, ф3, фд, оптимальные коэффициенты аппроксимации для которых ^дующие:

Ао=111,55 8q=0,00194 Со=-0,00091 DQ=-8,01

А3=105,84 В3 =0,00171 G^-0,00114 1>3=-4,34

А =107,64 В =0,00181 С =-0,00110 D4= 3,42

4 4 4

Оставшиеся три торсионных и два валентных угла являются функциями перечисленных.

Предложенная нами двухпарам&трическая модель описывается простыми виражениями, хорошо согласуется с экспериментальными данными и удобна для практического использования. С ее помощью оыло проведено уточнение рентгеноструктурных моделей poly(dA)¡poly (dT), построешшх ранее с однопараметрическим сахаром.

При уточнении структуры poly(dA):poly(dT) мы пользовались данными рентгеновской дифракции от волокон Са-соли poly(dA):poiy (dT) /ю/ и Na-poiy(dA):poly(dT) /11/. Детали вычислительной процедуры, используемой при определении структуры, изложены в /то/.

Молекула кальциевой соли poiy(dA):poiy(dT) ооладает поворотной симметрией второго порядка (диада, перпендикулярная оси спирали), и в нынешнем варианте уточнения ее структуры прибавился лишь Один параметр i для сахарного кольца. У молекулы Na- poly(dA): poly(йт) диады нет, и здесь уточнение велось с тремя дополнительны™ параметраш: два- для Сахаров poly(dA) и poly(dT) цепей и один .параметр,учитывающий излом А-Т пары. Таким образом, в отличие от прежшх рассчетов /ю/, где вводили единый параметр tilt, задающий наклон пары основания к плоскости, перпендикулярной оси спирали, в нашей работе наклоны аденинов и тиминов для Na-poly (dA) :poiy(dT) варьировались независимо. отличие уточненного варианта Ca-poiy(dA):poly(dT) от прежнего, построенного с однопара-иетрическим сахаром /ю/, является bbclmj незначительным (таол.З). Наклон пара оснований (tilt) к плоскости, перпендикулярной оси опирали, не изменился (-ь°); почти не изменился угол пропеллерооб-эаэного скручивания основания в паре (параметр propeller twiet):

ГО i

Рис.4а

Рис.4Ь

Рис.3. Параметры задающие структуру сахарного кольца.

Рис.4 схематическое расположение молекул в элементарной ячейке в случае натриевой (а) и кальциевой (Ь) солей poiy(dA):poly(dT). Для волокон натриевой соли характерна солее плотная упаковка. lía рис.4а показаны оси а и b ' элементарной ячейки.

19° вместо прежних 20°. Слабо изменилась конформация сахарофосфат-ной цепи: она имеет тот же тип В I. Такая конформация наиболее часто встречается в кристаллах В-подооных олигонуклеотидов и является энергетически выгодной .Все это говорит о том, что однопа-раметрическая сахарная модель является для структуры Са-ро1у((1А.): ро1у(йТ) с ее диадной симметрией вполне адекватной. Можно думать, что когда у молекулы есть диада, некоторая жесткость однопарамет-рического сахара не должна служить серьезным препятствием при определении структуры ДНК В волокнах. У 11а-ро1у(4А.):ро1у(йТ), помимо неэквивалентности конформация сахарофосфатных цепей, возможны различные наклоны для аденина и тимина, т.е. допустима дополнительная гибкость пары оснований. В этом случае естественно предположить, что правильное определение структуры вероятнее при большей гибкости сахарного кольца. Действительно, изменения, внесенные тремя дополнительными параметрами в структуру На-ро1у(<и):ро1у(ат), оказались более заметными (табл.3).

В случае Са-ро1у(йА):ро1у(йТ) ориентация молекул в элементарной ячейке была определена из паттерсоновского анализа, и нами, кроме внутримолекулярных параметров, варьировалось лишь относительное продольное смещение двух молекул в ячейке йг (вдоль кристаллической оси с (ось, перпендикулярная плоскости рис.4). В случае иа-ро1у(<1А):ро1у(<Л) упаковочных параметров такого типа боль-

Тавлица 4. Значения конформационных параметров (в градусах) уточненных моделей Са- и Иа-ро1у(с1А):ро1у(1Т). В скооках прежнио значения /ю/. 2-структура с наклоненным тимином. 3-структура с наклоненным аденином.

Параметр 1.са-соль 2.Иа- соль З.На- -соль

■ АрА ТрТ АрА ТрТ

Конформация остова

04'-03'-03'-Р 175(174) '74(179) 190(173) 191 221

СЗ' -03' -Р-05' -101 (-102) -105 (-105) -112(-92) -113 -148

03'-Р-05'-С5' -51(-50) -50(-54) -47(-66) -46 -46

Р-05'-05'-04' 186(183) 194(180) 162(189)' 161 145

05'-С5'-С4'-СЗ' 43(41) ЗЬ(49) 52(54) 51 37

04'-С1'-N9-C4 -113(-112) -107 (-114) - -131 -

04'-C1'-N1-C2 -113 (-112 ) - -121 (-124 ) - -110

Конформация сахара

Р ■ 147(149) 174(141 ) 131 (129) 128 146

тга 36(38) 33(38) 50(38) 45 54

ше. Расположение осей молекул в плоскости аЪ ячейки оыло определено ранее из соответствующей проекции синтеза Паттерсона, но молекула 1 (рис.4а) может Оыть подвергнута как продольным сдвигам, так и азимутальным вращениям вокруг своей оси. Однако стерически приемлемые межмолекулярные контакты для структур В-типа, олизких к Ca-poly(dA):poly(dI), возможны лишь в достаточно узкой О0ЛЙСТИ взаимного положения двух молекул в ячейке, одна из псевдодиад молекулы 1 (рис.4а) должна проходить волизи основания ячейки (взаимный сдвиг йгф,г нм) под малым углом i 5° к реору ь. оптимизацию структуры проводили из нескольких стартовых точек волизи указанных в таол.з значений параметров. Уточненная структура Na-poiy(dA): poly(dT) показана на рис.5Ъ. Наклоны оснований к плоскости, перпендикулярной оси спирали, разные: -13° для тимина и 0° для аде-нина (неопределенность в наклонах ~ э°). отметим, что средний наклон олизок к -ь°, т.е. совпадает с полученным ранее, когда предполагалось, что он одинаков для оооих оснований. Среднее значение неплохо сохранялось и для промежуточных вариантов оптимизированной структуры. Propeller twist в структуре, изоораженной на рис.5Ь, стал меньше: 14° против прежних 19°. 'Гимины, как и прежде, сильнее

Рис.5 Уточненные структуры На-ро1у(йА): ро1у(<1Т): а -С наклоненным аденином, ь -с наклоненным тимином.

а ъ

сдвинуты вдоль псевдодиады, чем аденины: 0,14 и 0,08 нм от оси спирали соответственно. Изменения углов сахарофосфатного остова видны из таолицы 3. Все параметры неплохо согласуются со'структурой А:Т участка кристаллического додекамера сосоааттсосс. так же, как и в кальция вой, в натриевой соли ро1у(&А):ро1у(йТ) реализуете! В1 конформацкя сахаро-фосфатной цепи.'

Для данной структуры На-ро1у(йА) :ро1у((И?) (с. наклоненным тимином) н-фактор равен о,гз, К"=о,гь. для прежней модели /ю/ й=о,2б, П"=о,гэ т.е. произошло значимое улучшение согласия с данными рентгеновской дифракции. Согласно статистическому тесту Гамильтона, предпочтительность новой модели соответствует уровню-достоверности 99,5%. Кроме того, уменьшились как внутримолекулярные перекрывания атомов, так и наползания друг на друга атомов соседних, молекул в элементарной ячейке. Таким образом, учет изломе А-Т пары оснований, наряду с Солее гаоким двупараметрическим сахаром, заметно улучшают согласие модели со всей совокупностью рент-геноструктурных данных.

• ДЕухпаракэтрическое представление хорошо описывает сахарное кольцо во множество известных кристаллических структур (см. вышек

Можно думать, что оно достаточно для решения полинуклеотидных структур методом рентгеновской дифракции в волокнах в самом оощем случае. Дальнейшее увеличение гибкости сахарного кольца вряд ли следует считать оправданным, т.к. видимое улучшение согласия.с экспериментом, естественное при увеличении количества варьируемых параметров, будет отражать скорее систематические ошибки метода, чем улучшение структуры.

Данные рентгеновской дифракции от волокон' с разрешением о,з нм слабо чувствительны к замене аденина на тимин. Поэтому, хотя существование излома как такового не вызывало сомнений, интересно было бы получить структуру Na-poiy(dA):poiy; ), в которой

именно аденин имеет существенный tilt. Такая структура была нами найдена. Основные конформационные параметры для нее приведены в табл.4. Наклон оснований (tilt) в этом случае -17° для аденина и 4° для тимина. Средний наклон по прежнему -6°.

Близость значений R-факторов для обеих структур (R=o,23; R"= 0,26 в случае наклоненного талина и R=o,22, R"=o,27 в случае наклоненного аденина) свидетельствует о невозможности выбрать из них наиболее предпочтительную на этапе рентгеноструктурного уточнения. С другой стороны есть все основания приписывать наличие гетероном-ности цепей в случае Na-poly(dA):poly(dl) именно влиянию ионов Ва, поскольку в случае Ca-poly(dA):poly(dT) гетерономность отсутствует. Расположение молекул в ячейке для натриевой и кальциевой солей poiy(dA):poly(dT) показано на рис.4. В случае кальциевой соли молекулы упакованы менее плотно и в промежутках между ними как раз и локализованы ионы Са При упаковке молекул в случае натриевой соли ионы На+ долшы углубляться в желобки .двойной спирали,что может как раз и быть причиной плотной упаковки.

Наиболее предпочтительное положение иона Ка+ в гликозидном желобке poiy(dA):poly(dT), когда этот ион взаимодействует через водные мостики с N3 аденина и 02 тимина, может быть реализована как в случае структуры с наклоненным аденином, так и в противоположном случае. Вообще следует'отметить, что полярные атомы в гликозидном желобке poiy(dA):poiy(dl) расположены почти диадно симметрично. Для негликозидного желобка poly(dA):poly(dl), наоборот, характерна заведомая асимметрия. Данные рентгеновской дифракции poly(dA):poiy(dT) свидетельствуют о спиральном расположении ионов Na+ (в отличие от случая Са+) в негликоздном желобке. Нашей целью как раз и было- оценить предпочтительность одной из структур (с

Рис.7. Комплекс иона Иа+ с дву мя соседними ет-атомами адени-нов в структуре ро1у(ОА):ро1у ((И) с существенным наклоном

Вид на негликозидный желооок ро1у(<Ы) :ро1у (<31). Обозначены полярные атомы, которые.могут взаимодействовать ионом Ыа+.

■ X

наклоненным аденином либо тимином) с точки зрения возможности упорядоченной спиральной локализации ионов на+ в негликозидном желобке ро1у(&А) :ро1у (<1Т).

Как известно, для иона натрия характерно октаэдрическое координационное окружение, которое должно сохраняться при связывании На+ в негликозидном желобке. Полярные атомы, с которыми может взаимодействовать ион натрия, показаны на рис.ь. Это фосфатные кислорода 01Р1; и 01 Ра противоположных сахарофосфатных цепей, а также атомы N7 а аденина и 04Т тимина. Тесная упаковка молекул На-ро1у (йа):ро1у(сИ) в ячейке свидетельствует о том, что ионный ок-таэдрический комплекс должен быть достаточно глубоко "утоплен" в негликозидный желобок, чтобы избежать наползаний на соседние молекулы. Это приводит к тому, что из всех вариантов связывания реалистичными являются лишь те, в которых ион натрия прямо связан с одним из полярных атомов и также прямо или через водный мостик- с другим. Таких пар полярных атомов всего тринадцать. Все эти пары' оыли исследованы с точки зрения комплексообразования с ионом натрия для обеих полученных структур Ма-ро1у(<1А): ро1у(ЛТ). В случае структуры с наклоненным аденином существует лишь один способ связывания иона Иа+: напрямую с "двумя атомами N7 А из соседних пар оснований (рис.7). Каждый ион натрия связан также водными мостиками с двумя ближайшими ионами и двумя другими молекулами воды. На месте одной из этих двух молекул при упаковкке в ячейке оказывается

огр-фосфатный кислород соседней молекулы и, таким образом, реализуются межмолекулярные сшивки, которые могут быть причиной тесной упаковки волокон натриевой соли poiy(dA):poiy(dT) в ячейке. Все остальные случаи лиоо не удовлетворяют октаэдрической геометрии комплекса иона ыа+ с атомами ДНК и молекулами воды, лиоо приводят к значительным стерическим наползаниям. Интересно, что для структуры с наклоненным тимином подоорать удовлетворительный способ комплексоооразования ионов Na+ в негликозидном желобке двойной спирали вообще не удается. 3ri- дает нам основание говорить о том, что структура с наклоненным аденином лучше соответствует ситуации тесной упаковки молекул з ячейке и поэтому более реалистична. •

Глава III посвящена разработке молекулярно-динамической модели, позволяющей исследовать полиэлектролитше свойства ДНК. Основные трудности при молекулярно-динамическчл моделировании проти-воионов вокруг ДНК связаны с. корректным учетом электростатических взаимодействий в системе ДНК-противопоны-растворитель. Невозможность учета всех парных взаимодействий между точечными зарядами в системе вынуждает пренебрегать взаимодействиями между зарядами, удаленными на расстояние, превышающее 6-У А? Такое огрубление рассмотрения в некоторых случаях оказывается чрезмерным и приводит к росту со временем кинетической энергии системы, чего не удается избежать уменьшением шага интегрирования. Кроме того, из-за даль-нодействующего характера электростатического потенциала при исследовании полиэлектролитных свойств ДНК методами молекулярной динамики и Монте-Карло важен значительный аксиальный размер ячейки, включающей описываемую систему (70 А°).. При этом девятиангстрем-ное приближение оказывается заведомо неудовлетворительным, и возникает необходимость создания модели, основанной на разумных приближениях .

В нашей модели эти приближения следующие. Элементарная ячейка, в которой помещается исследуемая молекула ДНК периодически транслируется во все.стороны. Электростатические взаимодействия определяются кулоновским потенциалом. Диэлектрические свойства воды задаются диэлектрической проницаемостью, плавно меняющейся от 1 до 78 с увеличением расстояния между зарядами до ¿20 А0. Ван дер ваальсоьо отталкивание- потенциал вида А/г12, где А- такая постоянная, что при расстоянии 2.6 А°между разноименно заряженными (оба до заряда электрона) атомами кулоновское притяжение и

ван-дер-ваальсово отталкивание компенсируются.

При учете электростатических взаимодействия мы использовали следующее приолижение. Пусть множество с одноименных зарядов частиц образует область характерного размера Р, которая удалена от от некоторой частицы q на расстояние 0. Тогда, если Р/скн , где и некоторая величина порядка 1, все множество с можно приближенно считать одной частицей с суммарным зарядом сд= £ gi, помещенным в центр заряда. Наши расчеты показали, что погрешность в определении электростатической силы, действующей на частицу q со стороны множества зарядов с, равна 1Я при я =0.5. Описанное приближение позволяет существенно уменьшить количество учитываемых парных взаимодействий (в 2-50 раз).. В случае периодических граничных условий расстояние "обрезания" электростатических взаимодействий вдоль осей X и у должно сыть равно половине размера ячейки вдоль этих осей, т.е. в нашей модели 33,8 а°. И, наконец, введение периодических граничных условий позволяет решить проблему чувствительности метода к дальним взаимодействиям вдоль оси г. При этом от рассмотрения взаимодействия между частицей а1 и частицей с^надо перейти к рассмотрению взаилодеиствий между а± и множеством с всех образов частицы ск, полученных при трансляции вдоль оси г с периодам, равным размеру ячейки вдоль лтой оси. При этом, если мы ищем силу электростатического взаимодействия, мы получаем сходящийся ряд вида г1=2кИ/ек1),гк1/ | гк113, который может быть затабулиро-ван в координатах г,«^» где г1-расстояние между частицей а± и "ниткой" частиц о, гг- кратчайшее расстояние вдоль оси ъ между а1 и одним из зарядов на "нитке". Полученные таким образом силы, действующие на подвижные частицы, используются в дальнейшем для численного интегрирования уравнений Ньютона с шагом ю-15о. Первые N шагов (и зависит от концентрации соли: при о,1м N=4000, при 1,ом N=9000) в системе искуственно поддерживается постоянная температура (300К). Изменения кинетической эюргии за после дующие 4000 шагов незначительны, что свидетельствует о выходе системы в состояние равновесия. С помощью описанного подхода нами были получены кривые распределения противоионов вокруг ДНК для 0,1 и 1,0 м соли.

С помощью разработанной молекулярно-динамической модели нами исследовалось поведение противоионов вблизи четырехцепочечной од-формы. В описанную ячейку помещалась бд-структура, состоящая из четырех тетрадных комплексов (координаты из /13/, заряды посчиташ. квантовохимпчески методом смю/2). В ячейку добавлены противоионы

(Na+) соль (c=o,5 м) и молекулы воды до плотности 1г/л. В течение первых 4000 шагов в системе поддерживалась постоянная температура (300К). За последующие 4000 шагов энергия системы существенно не увеличивается. На протяжении рассчетов (Ю~12с) один ион натрия постоянно находился в аксиальном канале, совершая там колебательные движения вокруг центра од-структуры. Данные молекулярно- динамического моделирования подтвердили расчеты электростатического потенциала на оси квадруплекса методом сшю/2. Результат расчетов свидетельствует о том, что аксиальный канал с4-формы столь же притягателен для противоионов, как и поверхность фосфатных груш. Наши данные, таким ооразом, могут служить подтверждег ем схемам встраивания противоионов в аксиальном канале, известным из литературы /3/.

В этой же главе описаны результаты численного решения уравнения Пуассона-Больцмана в рамках основной модели теории полиэлектролитов /4,16/. Полученные результаты подтверждают выдвинутое в /14/ объяснение В-z перехода при низких ионных силах.

Основные результаты и выводы

1. На основании расчетов стерической доступности группировок В и D-форм ДНК предложено объяснение Б-D перехода, происходящего при понижении относительной влажности, в терминах экономии гидратации гликозидного желобка двойной спирали. Этот результат подтверждается моделированием структуры растворителя вблизи ДНК, которое использовалось .также для оценки адекватности соответствующих рентгеноструктурных моделей. Предложенное объяснение может быть распространено на структуру poly(dA): poiy(di) и согласуется с необычной стабильностью'этого гомопо-лимера, а также позволяет понять почему лишь ограниченное число последовательностей ДНК может испытывать переход в D-фюрму.

2. О помощью разработанной модели двухпараметрического гибкого сахара произведено уточнение структуры натриевой соли poly (dA):poly(dl) в волокнах. Получены две структуры с изломом пары оснований, одна из которых характеризуется наклоном по отношению к оси спирали тимина (для нее R-фактор равен 0,22), а другая,- наклоном аденина (F-o,23). Улучшение R-фактора по сравнению с прежней структурой Na-poly(dA):poly(dl) (R=o,26) соответствует согласно тесту Гамильтона 99•5 процентному уров-

" ню значимости.

3. Для структуры с наклоненным аденином выявлен предпочтительный способ связывания ионов натрия в негликозидном желобке двойной

спирали, который характеризуется неискаженной октаэдрической координацией иона, упорядоченным спиральным расположением ионов вдоль молекулы, а-также наличием межмолекулярных ионных сшивок, которые могут быть причиной тесной упаковки молекул натриевой соли .poly(dA):poly(dl) в ячейке. Структура с наклоненным тимином менее предпочтительна в этом отношении.

4. Построена молекулярно-динамическая модель, основанная на-эффективном алгоритме расчета электростатических сил и позволяющая исследовать полиэлектролитные свойства ДНК.

5. С помощью молекулярно-динамических расчетов исследовано поведение противоионов около четырехспиральной од-формы нуклеиновых кислот. Выявлена электростатическая предрасположенность .к попаданию противоионов в аксиальный канал од-формы, что согласуется с возможностями их комплексообразования с об-ато-мами гуанина. "

6. В рамках теории полиэлектролитов исследованы возможности B-Z перехода в широком диапазоне ионных сил для различных моделей растворителя.

Приложение к диссертации содержит таблицы координат атомов ■

структур Na-poly(dA): poly (dir), содержащих излом пары оснований.

Основные результаты диссертационной работы изложены в

следующих публикациях:

1. Lipanov A.A., Beglov D.B., Chuprina V.P. DNA В to D transition oan be explained in terms of hydration eoonomy of the minor

groove atoms.// <J. Mol. Biol.-1989.-210, P.399-409.

2. Беглов Д.Б., Липанов A.A., Чуприна В.П. Стерическая доступность ДНК для молекул воды и ионов при B-D переходе.// Биополимеры и Клетка.- 1989.-5, N 4.-с.66-70.

3. Бартенев В.Н., Беглов Д.Б., Каменева Н.Г. Статистический анализ стереохимии фрагментов нуклеиновых кислот.// в сб.: IV Всесоюз-ноо совещание "Математические метода исследования полимеров и биополимеров". Тезисы докладов. Пущлно.-1Э85.- с.66.

4. Беглов Д.Б., Каменева Н.Г., Липанов A.A. Двухпараметрическая статистическая модель гибкого сахара.// в сб.: II Всесоюзная конференция "Математические вычислительные методы в биологии. Биомолекулярные системы". Тезисы докладов. Пущшю.-1987.-с.б2.

5. Беглов Д.Б., Каменева Н.Г., Липанов A.A. Двухпараметрическая статистическая модель гибкой фуранозы.//Биофизика.-1990.-5, Вып.!.-0.137-139.

6. Липанов A.A., Беглов Д.Б., Алексеев Д.Г., Скуратовский И.Я. Излом А-Т пары оснований в Bh-форме поли(dA):поли(dT).//Биополимеры и клетка.- 1989.-5, н 1.-0.16-21.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Saenger W, Hunter W.N., Kennard О.//Nature.-1965.-324, P.3S5-388.

2. Herrera J.E, Chaires J.В.. /Biochemistry.-1989.-28, P.1993-2000.

3. Sundquist W.I., Klug A.//Nature.-1989.-342, P.825-829.

4. Франк-Каменецкий М.Д., Аншелевич E.B., Лукашин. A.B. Полиэлектролитная модель ДНК.//Успехи физических наук.-1937.-151, вып.4.-С. 595-618.

5. AIden С.J., Kim S.H.//J. Mol. Biol.-1979.-132, P.411-434.

6. Arnott S. et al.//J. Mol. Biol.-197^ -88, P.523-533. .

7. Arnott S. et al.//Nuol.Aoids Res.-1983.-11, P.1457-1474.

8. Mahendrasingam A. et al.//Soienoo.-1986.-233, P.195-197.

9. Bartenev V.N., Kameneva N.Q., Lipanov A.A.//Aota Crystallogr.. B.-1987.-43, P.275.

10. Alexeev D.G., Lipanov A.A., Skuratovakii I.Ya.//J. Bioraol. Struot and Dyn.-1987.-4, N 6.-P.989-1012.

11. Arnott S. at al.//Nuol.Aoids Res.-1983.-11, N.12.-P.4141-4155.

12. Журкин B.B., Полтев В.И., Флорентьев В.Л.//Молекулярная биология.-1980.-14, Вып.5-С.1116-1130.

13. Chou С.Н. et al.//Nuol.Aoide Res.-1977.-4, N.7.-P.2407-2419.

14. Frank-Kamenetskii M.D., Lukashin A.V., Anshelevioh Y.Y.// J. 4Biomol. Struot. and Dyn.-1985.-3, N 1.-P.35-42.

15. SoumpaeiB D.M.// J. Biomol. Struot. and Byn.-1988.-6, N 3. . -P.35-42.

16. Lukashin A.Y., Beglov D.B., Franlc-Kamene t ski i И.О.// J. Biomol. Struot. and Dyn.-1991 (in press).

Ротапринт МФТИ ¿¡$.€¿91 Заказ ii0J/¿>S¿ тир.