Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование стабильности ДНК и ее комплексообразования с остаточными примесными белками с целью создания эффективных методов выделения

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование стабильности ДНК и ее комплексообразования с остаточными примесными белками с целью создания эффективных методов выделения"

4 О С'

ереванский ордена твдового красного шамши государственный университет

Форма 3.3 На правах рукописи

ЕГОРОВА Валентина Петровна

исследование стабильности днк и ее комплексообразованш

с остаточными пшштт белками с целью создания

ЭФФЕКТИВНЫХ МЕТОДОВ ВЦЦЕЛЕНИЯ 03.00.04 ~ Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических каук •

Ереван - 1991

Работа выполнена в Институте биоорганической химии АН БССР

Научные руководители:

академик АН БССР, доктор химических наук, профессор А.А.АХЙ5М

доктор биологических наук Д.О. ЛАНДО

Официальные оппоненты:

. член-корреспондент АН Республики Армения, доктор биологических наук, профессор С.С.ОГАНЕСЯН

доктор биологических наук Л.В.КАРАБАШЯН

199Гг.

Ведущая организация: Институт цитологии АН СССР

Защита диссертации состоится " * в /У^часов на заседании специализированного^ совета Н 055.08.01 по присуждению учёной степени кандидата биологических наук при Ереванском государственном университете (375049, г.Ереван, ул.Мравяна, I, биологический факультет ЕГУ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ереванского государственного университета. ,

Автореферат разослан "__/£_". Ф^МАЛ^ 1991г.

Ученый секретарь специализированного Совета К 055.08.01 Г кандидат биологических наук ;

Л.Г.АНАНЯН'

м на изобретение № 4140037 и № 4138620, СССР).

Разработан способ получения сорбента гвдроксиапатита, приме-емого для очистки и анализа ДНК, сочетающего высокую сорбцион-d ёмкость и высокую скорость протекания растворителя (авторское идетельство 1503875, СССР). Способ внедрен на заводе "Красный шк" (Ленинград).

Разработан метод осаждения ДНК в фосфатном буфере в десятки з более быстрый по сравнении с существующими, что значительно легчает использование гвдроксиапатита.

Положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Высокоэффективные способы выделения и очистки ДНК, для злизации которых требуется доступное сырьё и реактивы, а также эстейшее оборудование.

2. Способ получения сорбента гидроксиапатита, сочетающего bî* сую сорбционную ёмкость с высокой скоростью протекания раствори-

1я.

3. Способ осаздения ДНК в фосфатном буфере.

4. Результаты исследования взаимодействия ЛДО с остаточными тесными белками и условий разрушения комплекса ДНК-белок.

5. Результаты исследования прогонирования ДНК в присутствии >пропилового спирта и влияния этого протонирования на разность «Зильностей AT- и ÇC-nap оснований ДНК.

6. Методы анализа качества препаратов ДНК.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, ¡х глав (первая посвящена обзору литературы), выводов и списка 'ературы из 152 наименований. Работа изложена на 138 страницах,. ючая 4 таблицы и 29 рисунков.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть на-ых работ, получено одно авторское свидетельство и два положи-ьных"решения на заявки на изобретения.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались 6-ой Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров В8г. - Харьков), на 7-ой Всесоюзной конференции "Поверхностно-ивные вещества и сырьё для их производства" (1988г. - Шебекн-; на 4-ом Советско-Чехословацком совещании "Динамика и актив-гь биологических макромолекул: лазерный и компьютерный экспе-энг" (1988г. - Ереван), на 7-ом Всесоюзном симпозиуме "Конфор-ионные изменения биополимеров в растворах" (1990г. - Тбилиси).

Глава I. Литературный обзор.

В литературном обзоре рассматриваются различные способы деления ДНК из органов млекопитающих, методы получения сорбен гидроксиапатита и его применение для ввделения, очистки, фраки нирования и анализа нуклеиновых кислот. Завершает главу поста новка задач диссертации.

Глава 2. Материалы и методы.

Получение гидроксиапатита. Из растворов 0,4М СаС^ и 0,4 (100 мл) делают две суспензии путём взаимного перено из одного раствора в другой по 0,5 мл. Эти суспензии сливают помощи многоканального перистальтического насоса со скоростью мл/мин при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке в с кане объёмом 400 мл. Через 15 минут шланги перебрасывают в чи тые растворы 0,45М Ма^НРО^ и 0,5М СаС^ (600 мл). Сливание пр должают ещё 15 минут в прежнем режиме. Затем суспензию перено в стакан объёмом 2 л, скорость сливания увеличивают в 2 раза, перемешивание начинают проводить при помощи механической меша ки. Такое сливание продолжают 30 минут. В результате получают похожие на ежей прочные агрегаты кристаллов брушита размером <•150 микрон. Объём брушита 300 мл. Брушит дважды промывают в тиллированной воде путём декантации.

Осадок брушита ресуспендируют в 500 мл 1,5М раствора К^Н и при медленном перемешивании нагревают до кипения за сорок ы нут. Затем нагрев прекращают и суспензии дают остыть до 70°С, после чего её четыре раза промывают дистиллированной водой и нят при 4°С в 0,01М натрий-фосфатном буфере (рН 6,8).

Далее рассматриваются способы определения характеристик роксиапатита: скорости протекания растворителя, адсорбционной кости, степени обратимости сорбции, концентрации элюции ДНК ф фатным буфером. Выводятся необходимые для расчетов формулы.

Еыделение ДНК из селезёнки крупных млекопитающих. Селезё сразу после убоя животного пропитывают холодной водой в течен 20-60 минут и замораживают сухим льдом. Далее материал можно -нить в морозильнике при -30°С до трёх месяцев. Перед выделени селезёнку разрубают на мелкие куски и пропускают через мясору Взвешивают 100 г фарша. Добавляют 600 мл стандартного солевог раствора (: 0,15ММаС1 + 0,015М цитрат натрия, рН 7,2) и могенизируют 2 минуты при помощи размельчителя тканей РГ-1 пр

- б -

3С. Гомогенат фильтруют через пластмассовую сетку с ячейками гзмером 2 мм и центрифугируют (2500 об/мин, 10 минут, 0°С). Оса-ж ресуспендируют при помощи гомогенизатора РГ-1 в 600 мл $£С I минуты, 0°С), суспензию фильтруют через 2-4 слоя Марли и опять жтрифугйруют в прежнем режиме. Осадок ресуспендируют 10 секунд эи помощи РГ-1 в 600 мл , переносят в стакан объёмом I л и >бавляют 120 мл 17% додецилсульфата натрия. Смесь нагревают до ) С и добавляют 200 мл 5М NaCI. Перемешивание продолжают 10 ми-гт, и затем раствор охлаждают до 5°С. Добавляют 500 мл 5М NaCI. весь фильтруют через два слоя марли, а затем центрифугируют 2500 об/мин, 30 минут, 0°С). Надосадочную жидкость фильтруют че-!3 грубый стеклянный фильтр с размером пор 300 + 500 микрон. Из >лученных 1350 мл раствора ДНК осаждают путём добавления одного ¡ъёма этанола. Осадок последовательно промывают в 60% изопропа->ле, в 70% изопропаноле, а затем - в 80% изопропаноле. После :ого проводят две промывки в изопропиловом спирте.

Выход ДНК, полученной таким способом, составляет 600-830 мг К на 100 г селезёнки, содержание белка, определённое по методу >ури, 0,7 * 2%, гиперхромизм - 40%, содержание FHK 2,2 + 2,6%, >лекулярная масса 1,5*10^ * 3,4-10^ дальтон.

Ввделение ДНК из органов крупных млекопитающих. Орган живот->го сразу после убоя помещают в стандартный солевой раствор со >дом (0°С) и транспортируют в специальном теплоизолированном итейнере. Орган пропускают через мясорубку. Фарш помещают в ци-идр вертикального пресса, на выходе которого имеется решётка с ¡аметром отверстий 5-10 мм. Под прессом размещают цилиндрический юуд с жидким азотом. Фарш медленно продавливают через пресс и !, попадая в жидкий азот, замерзает в виде гранул. Затем грану; помещают, в морозильник (-30°С). Вместо жидкого азота для замо-

живания фарша можно использовать смесь "дмэтиловый эфир - сухой Д".

Перед.выделением фарш быстро оттаивают и гомогенизируют при мощи гомогенизатора, изготовленного на базе электромотора АЕП-3 щностью 600 вт. Гомогенизацию проводят при напряжении 120+180 В.

После гомогенизации 560 г фарша в течение 4 минут и разведе-и гомогената в 3,4 л £SC полученную суспензию фильтруют через астмассовую сетку с размером ячеек 2 мм и затем центрифугируют ентрифуга К-70, 2500 об/мин, 0°С, 10 минут). Осадок гомогенизи* ют 2 минуты в том же режиме, разводят в 3,4 л SSC , фильтруют

через 2-4 слоя марли и повторно центрифугируют. Затем опять осадо) ресуспендируют.в том же объёме, переливают суспензию в титановый цилиндрический сосуд, помещённый в рубашку с водой, и добавляют 660 мл Y!% раствора додецилсульфата натрия. Воду в рубашке нагревают до 60 * 65°С и добавляют 1,2 л нагретого до.той же температуры 5М раствора NaCI. Через 10 минут начинают охлаждение до 5°С. Смесь переливают в сосуд объёмом 8 л и добавляют 2,8 л 5М NaCI и перемешивают. Далее проводят центрифугирование (К-70, 2500 об/мин, 0°С, 30 минут). Надосадочную жидкость сливают и фильтруют через два слоя нейлона и ДНК осаждают путём добавления 2,7 литра изопро-пилового спирта или 5 литров этилового. Осадок промывают в 60% изопропиловом спирте, затем - в 70%, в 80% и, наконец, в изопропа-ноле;.

Выход ДНК, полученной таким способом, составляет 80-95$, содержание белка, определённое по методу Лоури, 0,7 * 2%, содержание ШК - 2,2 + 2,655, молекулярная масса (1,4 + 3,5) -Ю7 дальтон.

Особо чистая ДНК. В исследованиях, проводимых в данной работе, используется особо чистая ДНК, по характеристикам соответствующая марке " urtra pure " фирш " Sigma и. Содержание белка в этой ДНК менее 0,1$, FHK Молекулярная масса - (0,9-2,5) х

х К)' дальтон.

Характеристики образцов ДНК и способы их определения. В данной работе качество образцов ДНК оценивают по молекулярной массе; содержанию белка; содержанию FHK; гиперхроиному эффекту; отношениям ©ко/^и0 » о№гъо * где ~ оптическая плотность при указанной длине волны (в нанометрах); значению при концент-

рации ДНК I мг/мл; размеру агрегатов, образованных макромолекулам! ДНК с остаточными примесными белками; по концентрации эдюции с гидроксиапатита.

Остановимся на некоторых методах анализа.

Нами было установлено, что чувствительности метода Лоури и соавторов (1951г.) недостаточно для определения содержания белковых примесей в образцах ДНК высокой чистоты. Поэтому мы модифицировали его, что позволило при той же концентрации белка в раствор« усилить цветную реакцию в 5 раз. Для этого использовались следующие растворы (сохранены обозначения Лоури и соавторов): раствор А: IMNa2C03 + 0,54М NaOH; раствор В: 0.02М Си$04 + 0.04Ы цитрат натрия; раствор С: 45 мл раствора А + 5 мл раствора В. Измерение проводят путём добавления к 2,9 мл раствора белка 0,1 мл 17% раствора додецилсульфата натрия, 0,6 мл раствора С и 0,3 мл реактива Фоли-

а. При низком содержании белка в образцах ДНК (менее 0,5%) доде-алсульфат натрия не вводится.

Концентрация раствора ДНК в обоих случаях I мг/мл (по общему зсу образца). Процентное содержание белка определяют по формуле Су/З)^)'ЮО^ - 0,30%, где - концентрация белка в концен-рированном растворе ДНК в мг/мл, определённая по калибровочной зивой; ©г£0 - оптическая плотность раствора ДНК, полученного пу-зм разбавления в 20 раз раствора концентрацией I мг/мл (по весу) кювете толщиной I см с поправкой на мутность. Отметим, что 20о.е.

соответствует концентрации ДНК I мг/мл, поэтому значение тленно равно относительному содержанию ДНК в образце.

Содержание примеси РНК определялось путём хроматографии на щроксиапатите. При этом в фосфатный буфер мы добавляли 2МИаС1, 'о привело к резкому улучшению разделения ДНК и ШК.

Размеры агрегатов, образованных остаточными примесными белка-[ и макромолекулами ДНК, определялись методом электронной микро-:опии и по светорассеянию. В последнем случае строилась зависнуть (5)) от ^ (А ) для 700 нм, которая аппроксими->валась прямой с угловым коэффициентом, равным П . В работе Ев-жимова, Скуридина, Акименко (1984) на основании данных Фихмаяа :963) была получена формула, связывающая и размеры рассеи-гощих свет частиц (сб ):

(£. (мкм) = -0,562-П + 2,01

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

Выделение ДНК. При изучении литературы по методам выделения очистки ДОК мы обратили внимание на три обстоятельства. I. На .чество конечного продукта очень сильно влияет обработка органа, которого выделяется ДНК, в частности, замораживание его и раз-раживание перед выделением ДНК. 2. Нагревание суспензии ткани в исутствии детергента резко улучшает качество ДНК. 3. В принци-, при выделении ДНК из органов, характеризующихся её высоким со-ржанием, например, молок осетровых, можно вообще обойтись без нтрифугирования, заменив его фильтрацией. Но такая фильтраций ■сбуе? много времени и в случае органов со средним содержанием" К не обеспечивает её достаточной чистоты.

Мы решили использовать все эти приёмы, но в таком варианте, обы они облегчали выделение, но вместе с тем не несли основную грузку в очистке ДНК. В этом случае на данные процедуры затрачи-

вается гораздо меньшее количество времени. Например, высокоскорос! ное центрифугирование можно заменить низкоскоростным, вводя стадш нагревания и фильтрации. Но фильтрацию в этом случае можно проводить на гораздо, более грубых фильтрующих системах, по' сравнению с< случаем полного отсутствия центрифугирования. Вводя при этом процедуру специальной обработки ткани и нагревания, удаётся получить ДНК, не уступающую подавляющему большинству образцов зарубежных фирм, используя только Одну депротеинизацию. Отметим, что в используемых в настоящее время методах, чтобы достигнуть той же чистоты при достаточно высокой производительности, необходимо провести 3 * 12 депротеинизаций.

При разработке первого способа выделения ДНК, описанного в предыдущей главе, мы использовали обнаруженный нами эффект пропитки селезёнки водой перед замораживанием сухим льдом. Это в значительной степени облегчает разрушение клеток ткани при последующей гомогенизации и резко уменьшает количество неразрушенных эритроцитов , что в свою очередь приводит к резкому снижению количества примесей в ДНК.

Однако, первый способ имеет ряд недостатков, которые препятствуют его внедрению в нашей стране. Так, крайне трудоёмким оказалось размельчение больших количеств замороженной ткани. На производстве отсутствуют фильтры для вязких растворов ДОК. Кроме этого способ пригоден только для выделения ЛНК из селезёнки. Поэтому мы разработали ещё одну методику, в которой эти процедуры удаётся заменить на более простые.

Нами было установлено, что быстрое замораживание фарша ткани небольшими порциями в жидком азоте даёт более сильный эффект, чем пропитка водой перед замораживанием. Однако замораживание фарша небольшими порциями оказалось достаточно трудоёмким процессом. Поэтому для замораяиваяия фарша нами было изготовлено специальное приспособление, описанное в предыдущей главе. Поскольку замораживание фарша жидким азотом более эффективный приём, чем пропитка водой и замораживание сухим льдом, можно без снижения качества исключить стадию фильтрации лизата ДНК перед центрифугированием. Если сравнивать данный способ с описанными в литературе и применяемыми для выделения ДНК зарубежными фирмами, то можно заключить, что он обладает рядом преимуществ. Во-первых, выход ДНК увеличивается от 100 * 300 мг на 100 г селезёнки до 600 + 800 мг, время выделения уменьшается в 10 раз, появляется возможность проводить выделение, используя низкоскоростные центрифуги с большим рабочим

бъёмом, которые используются в заводских условиях. Кроме этого, пособ отличается универсальностью. Применяя его, мы выделяли ЛНК з почек, лёгких, сердца, печени быка и свиньи, а также из плацен-ы.

Во всех методах вцделения ЛНК описанных в данной диссертаци-нной работе применялся додецилсульфат натрия (). Однако в ашей стране его выпускают мало и низкого качества, что ограничи-ает возможность применения разработанных способов. Поэтому мы по-ытались найти для него замену.

Прежде всего мы испытали различные бытовые стиральные порош-:и, которые дали крайне плохие результаты по сравнению с сотрясение- белка в образцах более 10%). Из индивидуальных ПАВ ис-:ледованы сульфанол, метаупон, сукцинол ДТ-2, ОП-Ю, а также ал-;илсульфаты, содержащие от II до 18 атомов углерода (Cjj- * Cjg). 1сследования показали, что индивидуальные ПАВ дают значительно гучшие результаты по сравнению со стиральными порошками. Однако, [ри использовании всех их, кроме алкилсульфатов, чистота выделен-юй ДНК значительно ниже, по сравнению с образцами зарубежных эирм, выпускаемых под маркой ™ pure " (содержание белка - не более

W. ^260 /0^.1,8).

Значительно лучшие результаты получены при использовании ал-:илсульфатов, которые отличаются от додецилсульфата натрия (Cjg) шелом углеродных атомов (Cjj + Cjg). Спрос на них значительно ни-се, поскольку биохимические технологии традиционно ориентированы голько на Оказалось, что алкилсульфаты Cjg* Cjg характери-

>уются приблизительно одинаковой эффективностью в плане очистки IHK. Следовательно, при выделении ДНК предложенным методом вместо додецилсульфата натрия (С^) можно применять алкилсульфаты Cjg, '14» ^15' ^16* ^Р1*48" ДОёг несколько более сильный эффект, 1ем Cjg. Ухудшение характеристик ДНК в случае Cjj обусловлено тем, iTO падает плотность осадка, и поэтому не весь белок осаждается три центрифугировании. Отрицательный результат при испытании Cj8 :вязан с сильным увеличением вязкости раствора ДНК в его присутст-зии. В результате осаждение скоагулированного белка при центрифугировании также, затрудняется, что ведёт к снижению чистоты ДНК.

Конплексообразовадие ДКК с остаточными примесными белками. Здя разработки эффективных методов выделения и очистки ДНК необходимо исследовать характер её взаимодействия с белками-загрязните-иямн. Поскольку ряд методов очистки ЛНК включает стадию нагревания, необходимо установить, какое влияние оказывают эти белки на

Рис. I. Зависимость^зю от содержания белка в образце, измеренного по модифицированному методу Лоури и соавторов. Точки I и2 соответствуют полиадениловой и полигуанило-вой кислотам; область 3 включает восемь точек, соответствующих особо чистым ДНК

34 30 26 22 Пб*СМ*

Рис. 3. Спектры образцов ДНК. снятые в I0.005М N801; 2 - 0.15М МаС1; 3 -1МКЬ,г%: 4,- 2М ЫаС1; 5 - 0,005М МаС1 + 4М мочевина; 6 - 0,15МИаС1 + 0,1% додецилсульфат натрия.

7 - особо чистая ДНК в 0,005М ЫаС1.

Концентрация ДНК - I ыг/мл.

То 26 гГиб^к1

Рис. 2. I - спектр исходного образца ДНК; 2 - после ■ центрифугирования (I час, 90000дГ ); 3 - осадок, растворенный в 0,005М МаС1. Содержание ДНК в исходном растворе (I) - 0,8 мг/мл и в растворе (3) - 0,7 мг/мл.

Рис. 4. Кривые денатурации: I - осадка в 0,005м ЫаИ: 2 - ДНК в 0.005М МаС1; 3 - дак в 0,005М додецилсуль-фате натрия; 4 - осадка в 0,005Й додецилсульфате натрия.

■абильность двойной спирали.

Из-за загрязнения ДНК белками образуются агрегаты, вызываю-е светорассеяние. Если для высокоочищенных образцов ДНК (содер-ние белка менее 0,5%) не превышает 0,02 * 0,03 o.e. при

нцентрации ДНК I мг/ил, то после выделения по стандартным мето-кам эта величина может превышать 0,3 o.e. (рис. I).

Ультрацентрифугирование (90000, 30 + 60 минут) показывает, э белки распределены между макромолекулами ДНК неравномерно. Модули ДНК, связанные с белком, осаждаются, и светорассеяние над-здочной жидкости падает от 0,2 * 0,4 o.e. до 0,07 o.e. При этом ;овое содержание белка в осадке может превышать 50% по отношению Щ при среднем содержании белка в образце 1,5-4$ (рис. 2).

При увеличении содержания в растворе ионов fitl до 2М свето-'.сеяние практически не изменяется. Вместе с тем, в 2М и 4M моче-ге Я320 становится ниже 0,1 o.e. Это показывает, что белки, свяньте с ДНК, не являются гисгонами и связывание определяется не «образными, а гидрофобными контактами и водородными связями. Агаты также эффективно разрушает додецилсульфат натрия, в присут-ии которого 5)310 резко уменьшается (рис. 3).

Прямое доказательство, что основную часть примесей составляют истоновые белки, получено при электрофорезе осадка в присутст- . додецилсульфата натрия. Выявлено пять полос, соответствующих екулярным массам (45-55)*10^ Д и три полосы - более 75*10^ Д. ктрофорез выявляет также наличие гистонов (менее Ъ% по отноше-к суммарному белку). Выделенный осадок удаётся полностью растворить в .0,005М MaCI + •10 М ЭДТА. Однако, даже при разбавлении раствора до концен-1ии ДНК 0,03->-0,04 мг/мл наблюдается сильное светорассеяние, ко->е, в отличие от суммарной ДНК, не исчезает даже в присутствии ! додецилсульфата натрия.

Плавление высокоочищенной ДНК и выделенного комплекса в 0,00® .CI + 2-10"^ М ЭДТА показывает,, что белковые загрязнения не вли-на термостабильность двойной спирали ДНК (рис. 4). Однако ги- • ромный эффект для осадка падает до 18-20% 34% для исходного зца ДНК без учета теплового расширения раствора). После выч'й-я светорассеяния, вычисленного по формуле Ангстрема, получаем чину гиперхромизма, равную 33%. Гиперхромизм соответствует ис-эй ДНК, если вместо 0,005 MNaCI использовать 0,005М додецил-фат натрия.

Нередко влияние остаточных белков на плавление ДНК проявляет-

ся в уменьшении оптической плотности раствора после завершения плавления на 30-35% при изменении температуры от 67°С до -90°С. 0 нако, светорассеяние при этом практически не изменяется, что сви детельствует об отсутствии образования осадка. При замене NaCI н додецилсульфат натрия обнаруженный эффект исчезает (рис. 4).

Методом электронной микроскопии и по светорассеянию определ ны размеры агрегатов 1000 нм).

Крайне важным является вопрос о количестве белковых примесе в ДНК. Применяя различные методы выделения, мы обнаружили, что ь можем достигнуть чистоты, превышающей 0,3 + 0,4% белковых примес Однако, данные по светорассеянию (мутность растворов особо чистс ДНК примерно такая же, как и в случае полиадениловой и полигуаш ловой кислот, не содержащих белка); по обработке протеазами в nj сутствии f>!DS (содержание белка практически не изменяется); по флуориметрии (флуоресценция концентрированных растворов особо ш той ДО примерно такая же, как и 0,005М NaCI, в котором она рас ворена), позволяют предположить, что цветная реакция в методе До; в данном случае обусловлена главным образом не белками, а самой ДНК. Б литературе также имеются данные, что некоторые нуклеотид] дают цветную реакцию.

Для прямого доказательства мы измерили цветную реакцию пол: адениловой и полигуаниловой кислот и установили, что они соотве ствуют 0,03% и 1,35% белковых примесей. Учитывая, что цитозин и тимин дают слабую цветную реакцию, примерно такую же, как.адени и что QC-содержание ДНК быка ( X ) 'составляет 0,44, можно рассч тать, какому содержанию белковых примесей соответствует цветная акция самой ДНК, по формуле

C4-[x-(ce-ccMi-x)-(cA<T)] 11

где Gg,, Сс, Сд, Ciji - цветная реакция нуклеотидов гуанина,, цитс на, аденина й тимина, выраженная в процентах белковых примесей, количество которых создаёт гаку» же по величине цветную реакцис Из изложенного выше следует: Cq = 1,35%; Cq»Ст.» Сд^ 0,03%. Пс ставляя эти значения в (I), получим значение С = 0,34%.

Величину С можно также определить путём экстраполяции прян на рисунке I к значению 5D31fi= 0,01 o.e. (полагаем, что для ДД без белка при концентрации I мг/мл ^D^ftiO.OI o.e., как и дл! синтетических полинуклеотидов, не содержащих белка). В результ! получаем значение С = 0,35^. ' - . ■ '

Эти результаты показывают, что при определении белковых прибей в ДНК величину, определённую из калибровочной кривой,- сле-эт уменьшать по меньшей мере на 0,30%. Отсюда следует, что по-■теннке нами препараты особо чистой ДНК содержат белковых приме-*менев!0,1%.

Полученная зависимость от содержания белка является уникальной для ДНК органов крупных млекопитающих, и её можно ис-хьзовать для определения содержания белковых примесей. Такой )соб значительно проще, чем метод Лоури и соавторов.

Получение гидроксиапатита и его свойства. При. создании спосо-получения гидроксиапатита, сочетающего высокую сорбционную.ём-:ть и высокую скорость протекания растворителя, были учтены сле-яцие обнаруженные нами особенности кристаллообразования. I) При ¡вании потоков CaCIg и WagHPO^ при быстром перемешивании, ког-отношение Ca/P ¿. I, возникают быстрорастущие прочные кластеры ¡сталлов брушита. 2) Если до начала сливания растворов перенес-~ 1% одного раствора в другой, то скорость роста кластеров уве-[ивается. Кластеры имеют следующую структуру: основной опорный жас образуют несколько крупных кристаллов, а сердцевина запоя-:а мелкими. Очевидно, сорбент, состоящий из частиц такой форны, жен сочетать высокую скорость протекания раствора с высокой ад-бционной ёмкостью. 3) Как отмечалось в пункте I, при Са/Р^ I рость роста кристаллов высокая, однако наряду с ростом перво-ально образовавшихся кластеров начинается возникновение новых ких кристаллов. Поэтому в середине процесса сливания растворов стали увеличивать отношение Са/Р до значений 1,10 * 1,25. В х условиях новых кристаллов не образуется. 4) Для превращения шита в гидроксиапатит мы использовали не стандартную тепловую аботку щелочью, а - 1,ЕМ раствором KgHPO^. Оказалось, что в М KgjHPO^j можно быстро и почти без повреждений превращать в гид-сиапатит все разновидности брушита, в том числе полученную на-

Перечисленные выше особенности получения брушита и гидрокси-гита и легли в основу способа, изложенного в предыдущей главе.

До выполнения данной работы гидроксиапатит в СССР не производя. За валюту покупались марки сорбента, значительно уступаю-предложенному по ряду свойств. На данный способ получения сор-га нами было получено авторское свидетельство и он был внедрён заводе "Красный химик" (г.Ленинград). В таблице I сравниваются «теристики сорбента, выпускаемого "Красным химиком", с продуй-

цией других фирм. Данные, приведенные в таблице I, получены нами на коммерческих образцах гидроксиалатита. Из таблицы I видно, чт продукция "Красного химика" по всем параметрам превосходит гидро сиапатиты зарубежных фирм.

Таблица I

Ёмкость и скорость протекания для гвдрсксиапатита различных фирм в стандартных условиях (диаметр колонки .0,9 см, слой сорбента 7,5 см, высота гидростатического столба 25 см над колонкой)

Фирма

№

в каталоге

Марка

j Скорость ¡ протека-

!(мл?час)

Адсорбционная ёмкость (ыг/мл) ДЛЯ ДНК

Bio-Rad Calbioohem

Calbioohem

Serva Serva

Красный химик

1300520 Bio-Gel, HIP

391947 Past Flow

391948 High Resolution

25515 SC 25514 Beads

30«

12 60*

jh

60 80 150

0,42 0,25

Раствор ДНК не протекает через колонку

0,15

0,2

0,5 .

я Скорость протекания после пяти декантаций.

В работе предложен простой способ очистки ДНК от примесей белка и НЖ при помощи данного гидроксиалатита, основанный на то что сорбент, насыщенный ДНК, сохраняет высокую сорбционную емкое к белкам и МС.

Применение гидроксиалатита для выделения и очистки нуклеине вых кислот, особенно в промышленности, ограничивает то обстоятел ство, что последние можно элюировагь только фосфатным буфером, к торый не смешивается со спиртами. Поэтому становится, невозможным стандартное спиртовое осаждение ДНК. В работах Ахрема, Ландо и И иилиной (1986) был предложен способ осаждения, который заключает ся в снижении рН фосфатного буфера до'3,5, когда его соли становятся растворимыми в спиртах, и последующего осаждения ДНК этане лом или изопропанолом. Отметим, что этот способ значительно мене трудоёмкий, чеы ранее существующие. Однако, его можно применять, когда концентрация фосфатного буфера не превышает 0,ЗЫ. Вместе с тем,' при очистке ДНК на гвдроксиапатите, как правило,' использует

,5М фосфатный буфер. Чтобы применять данный способ, приходилось роводить охлаждение до 0°С, когда часть солей выпадает в осадок, ли разбавление, что уменьшает выход ДНК при дальнейшем осаждении.

Для проведения осаждения непосредственно в 0,5М фосфатном буере необходимо уменьшить рН ещё в большей степени. Однако, в тих условиях может иметь место денатурация ДНК. С целью определе-ия оптимальных условий осаждения мы провели исследование термо-габильности ДНК в кислой среде (рН 4) в присутствии изопропило-ого спирта, который в меньшей степени снижает растворимость фос-атного буфера по сравнению с этанолом.

Результаты этих исследований показали, что в присутствии изо-эопилового спирта облегчается протонирование азотистых оснований Ж, что вызывает снижение температуры плавления и уменьшение раз-эсти термостабильности и АТ-пар при более высоких значениях На основании этих данных предложен следующий способ осаждения

И.

После элюции ДНК с гидроксиапатита 0,5М натрий-фосфатным бугром раствор, содержащий ДНК, титруют до рН 3,2 I5M формиатным гфером (рН 2,5). После этого ШК осаждают половиной объёма изо-зопилового спирта. Осадок промывают в 50% изопропаноле, получен->м из 100% изопропанола путем добавления стандартного солевого атвора (рН 7,2), затем - в 80% изопропаноле и дважды - в изопро-1ловом спирте.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Методами спектрофотометр™, светорассеяния, электронной [кроскопии, электрофореза, ультрацентрифугирования и тепловой де-.турации исследовано взаимодействие остаточных белков-загрязни-лей с ДНК. Показано, что их коиплексообразование обусловлено в новном водородными связями и гидрофобными контактами. Белки-за-язнители распределены между макромолекулами ДНК не случайным об-зом: имеются молекулы ДНК, практически полностью заполненные лком и свободные (5% макромолекул ДИК содержат 80% белка). Мак-молекулы ДНК, взаимодействующие с белком, образуют агрегаты раз-ром /-1000 нм. • г

2. Исследовано влияние различных типов обработки органов на чество выделенной из них ДНК. В результате предложены методы деления высокополимерной ДНК, характеризующиеся крайне низкой удоёмкостью при высоком молекулярном весе и чистоте ДНК.

3. Проведено исследование возможности применения различных

неионных и анионных поверхностно-активных веществ для выделения ЛИК, разработанными методами. Изучен механизм действия поверхнос тно-активных веществ. Показано, что для выделения ДНК целесообра: но применять алкилсульфагы, содержащие 12+16 углеродных атомов, ; также смеси этих алкилсульфатов. Причём, если процедура выделени. включает стадию нагревания до 60*70°С, то гексадецилсульфат натрия более эффективен, чем додецилсульфат. Если стадия нагревания отсутствует, то целесообразнее применять додецилсульфат.

4. Разработан способ получения новой разновидности сорбента гидроксиапатита, сочетающей высокую скорость протекания раствора теля с высокой сорбиионной ёмкостью. Способ внедрен на заводе "Красный химик" (г.Ленинград). При использовании данного сорбент: разработаны новые способы очистки и анализа ДНК.

5. Методом тепловой денатурации проведено исследование термостабильности ДНК в кислой среде, содержащей соли фосфатного бу фера и изопропиловый спирт. Показано, что изопропиловый спирт зн; чительно облегчает протонирование ДНК. В результате существенное уменьшение разности термостабильностей AT- и GC-nap происходит п более высоких pH, чем при отсутствии изопропилового спирта. На о< новании этого исследования разработан простой способ спиртового осаждения ДНК после хроматографии на гидроксиапатите значительно более быстрый и менее трудоёмкий по сравнению с традиционно используемыми.

' б. Для определения содержания белковых примесей в особо чис той ДНК разработан^ модификация метода Лоури, характеризующаяся значительно более высокой чувствительностью. Показано, что в осо бо чистых препаратах ДНК существенный вклад в цветную реакцию да азотистые основания. Бри сопоставлении 'результатов метода Лоури > данными по светорассеянию и флуоресценции определена величина цв^ ной реакции.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Ахрем-A.A., Егорова В.П., Ландо Д.Ю., Крот В.И., Лука З.А. Исследование комплексообразования ДНК с остаточными примесными

• белками // Тезисы докладов 6-ой Всесоюзной конференции по спе ктроскопии биополимеров. - ларьков, 1988. - С. 26-27.

2. Егорова В.П., -Арутюнян.С.Г., Ландо Д.Ю. Исследование термоста бильности ДНК в. кислой среде в присутствии изопропилового спи та // Тезисы докладов- 4-го Советско-Чехословацкого совещания

Динамика и активность биологических макромолекул: лазерный и :омпьютерный эксперимент". - Ереван, 1988. - С. 76. хрем A.A., Егорова В.П., Ландо Д.О., Крот В.И., Лука З.А., рутюнян С.Г. Комплексообразование ДНК с не'гистоновыми примес-ыми белками // Тезисы докладов 4-го Советско-Чехословацкого овещания "Динамика и активность биологических макромолекул: азерный и компьютерный эксперимент". - Ереван, 1988. - С. 7778.

горова.В.П., Ландо Д.Ю., Панаева С.А., Поборцева Л.А., Земен- . ов Д.И. О возможности применения различных анионных ПАВ для зделения ДНК // Тезисы докладов 7-ой Всесоюзной конференции Ловерхностно-активные вещества и сырье для их производства". -гбекино, 1983. - С. 303.

ерем A.A., Егорова В.П., Егоров A.C., Крот В.И., Ландо Д.Ю., /ка З.А. Исследование взаимодействия ДНК с примесными белка-1 // Биополимеры и клетка. - 1989. - Т. 5, № 5. - С. 44-48. ерем A.A., Егорова В.П., Ландо Д.Ю., Панаева С.А., Поборце-i Л.А., Земенков Д.И. Исследование возможности применения раз-гагах поверхностно-активных веществ для выделения ДНК // Вес: АН БССР, сер. х1м. навук. - 1989. - № 5. - С. 104-106. тение о выдаче авторского свидетельства по заявке № 4140037, 'У^ С 07 Н 21/00. Способ выделения ДНК из селезёнки крупного ' гатого скота // Егорова В.П., Ландо Д.Ю., Шпаковский А.Г. ССР).

шение о выдаче авторского свидетельства по заявке № 4138620, И^ С 07 Н 21/00. Способ выделения дезоксирибснуклеиновой кис-"' ты из органов животных // Егорова В.П., Ландо Д.Ю., Шпаков-ий А.Г., Брунс A.A., Велика В.В. '(СССР), с. 1503875 СССР, МКИ4 В 013 20/00. Способ получения оксиапа-га // Ахрем A.A., Горская J1.H., Дрожденюк А.П., Егорова В.П., лнин Б.И., Ландо Д.Ю., Сакодынский К.И., Соколов A.A., Шумили-Т.А. (СССР).