Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные особенности "линкерных" белков хроматина HMGB1 и H1

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные особенности "линкерных" белков хроматина HMGB1 и H1"

На правах рукописи

СТАРКОВА Татьяна Юрьевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ «ЛИНКЕРНЫХ» БЕЛКОВ ХРОМАТИНА НМСВ1 И Н1

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О МАП 2015

005569155

Санкт-Петербург 2015

005569155

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук

Научные руководители: Томилнн Алексей Николаевич член-корр. РАН зав. лаборатории молекулярной биологии стволовых клеток ФГБУН «Институт цитологии РАН», г. Санкт-Петербург

Чихиржина Елена Всеволодовна

кандидат биологических наук, доцент старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии стволовых клеток ФГБУН «Институт цитологии РАН», г. Санкт-Петербург

Официальные оппоненты Паткнн Евгений Львович

доктор биологических наук, профессор зав. лаборатории молекулярной цитогенетики развития млекопитающих Отдела Молекулярной генетики ФГБУН «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург

Конев Александр Юрьевич

кандидат биологических наук

старший научный сотрудник лаборатории генетики эукариот

Отдел молекулярной и радиационной биофизики

ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ КИ, г. Гатчина, Ленинградской обл.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Защита состоится «19 июня» 2015 года в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д .4 Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс института (812) 297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института цитологии РАН www.cytspb.rssi.ru

Реферат разослан «_ »2015г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хроматин эукариотических клеток представляет собой сложный высоко динамичный ДНК-белковый комплекс, структурная организация и функционирование которого напрямую связаны с взаимодействием между его структурными элементами: ДНК и белками. При этом регуляция ДНК-белкового и белок-белкового взаимодействия до конца не изучена. С одной стороны, она может включать изменение характера связывания между молекулами путем изменения заряда взаимодействующих участков, например, с помощью введения клеточной системой посттрансляционных модификаций в белках. С другой — включать структурно-адаптивные механизмы, когда, в зависимости от объекта связывания, биологические макромолекулы, в частности белки, для перехода в функционально-активное состояние способны изменять свою пространственную структуру.

Данная работа посвящена исследованию механизмов взаимодействия негистонового хромосомного белка HMGB1 с ДНК и взаимодействующими с ним белковыми молекулами, в частности гистоном Н1.

Белок HMGB1 относится к большому семейству белков HMG (от англ. High Mobility Group). Отличительной особенностью всех белков HMGB группы является наличие в их структуре одного и более ДНК-связывающего «HMGB-домена» — структурного элемента размером порядка 80 аминокислотных остатка, обладающего высокой консервативностью как аминокислотной последовательности, так и пространственной организации. Белок HMGBI и схожий с ним HMGB2 относятся к группе двухдоменных белков. Основным отличием в их структуре является длина С-концевого фрагмента; в связи с этим, эти два белка очень часто исследуются в тандеме, в предположении, что взаимодействие HMGB-доменов белков с ДНК носит схожий характер. Однако длина С-концевого участка молекул HMGB1 и I1MGB2 может оказывать влияние на их пространственную укладку. В литературе предполагается возможность формирования двух типов пространственной укладки молекулы HMGB1: в свернутом (при взаимодействии С-концевого участка белка с ДНК-связывающими доменами) и развернутом состоянии (при нарушении данного взаимодействия, например, изменением заряда контактирующих областей белка), между которыми существует динамическое равновесие. При этом активное для связывания с ДНК и белковыми молекулами состояние соотносят именно с развернутой конформацией. Таким образом, структура белков 1IMGB1 и HMGB2 может являться определяющей при связывании с ДНК и другими белками хроматина.

Общепринятым считается, что белки НМСВ1 и НМОВ2 принимают участие, как в структурной организации хроматина, так и в регуляции основных генетических процессов, в частности, транскрипции, репликации, рекомбинации и репарации ДНК. В связи с тем, что НМОВ1 и гистон Н1 взаимодействуют с ДНК на линкерном участке в непосредственной близости друг от друга, в последнее время в литературе активно обсуждается формирование Н1-НМОВ1 структурно-регуляторного комплекса. При этом детальные механизмы взаимодействия данных «линкерных» белков НМОВ1 и Н1 с ДНК и между собой до конца не изучены. Они могут включать как изменение заряда полипептидной цепи белковых молекул посредством посттрансляционных модификаций, так и изменение структуры НМОВ1, НМОВ2 и III при взаимодействии с ДНК и между собой.

Цель работы, анализ структурных характеристик белка НМОВ1 в свободном состоянии и в составе комплексов с ДНК и с гистоном III, выявление посттрансляционных модификаций «линкерных» белков хроматина НМОВ1, 11МОВ2 и гистона Н1.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Определить вторичную структуру полноразмерного природного белка НМОВ1 в условиях эксперимента и охарактеризовать ее термодинамическую стабильность

2. Провести сравнительный анализ вторичной структуры белка НМОВ1 в свободном состоянии и при взаимодействии с ДНК и гистоном III

3. Определить влияние НМСВ1 на структурные и термодинамические параметры ДНК при взаимодействии

4. Провести сравнительный анализ посттрансляционных модификаций негистоновых белков хроматина НМОВ1 и НМСВ2

5. Охарактеризовать посттрансляционные модификации подтипов линкерного гистона Н1 Материал и методы исследования:

Негистоновый хромосомный белок ИМ О В! и линкерами гистон Н1

Белки экстрагировали из зобной железы теленка 5%-ной хлорной кислотой с последующим осаждением охлажденным подкисленным ацетоном при -20 'С. Белок 1ШОВ1 осаждали 5 объемами ацетона, а гистон Н1 - тремя. Дальнейшая очистка белков была проведена в системе ИРЬС. Идентификацию и чистоту выделенных препаратов проводили методом денатурирующего гель-электрофореза по методу Лэммли [1].

Плазмидная ДНК pUC/9

Плазмидную ДНК выделяли из трансформированных ранее плазмидой pUC19 бактериальных клеток НВ101 методом щелочного лизиса [2]. Высокомолекулярная ДНК тимуса теленка

Использовали коммерческий препарат ДНК тимуса теленка Sigma (Type II) без дополнительной очистки. Спектрометрия кругового дихроизма

Спектры кругового дихроизма ДНК-белковых и белковых комплексов в УФ диапазоне регистрировали на приборах Mark V (Jobin Yvon, Франция) и Jasco J-518 (Япония) соответственно. Калибровку осуществляли с помощью D-10-камфорсульфоновой кислоты. Использовали цилиндрические кварцевые кюветы с длиной оптического пути L 0,5 см и 1 см в диапазоне от 195 до 320 нм с шагом в 1 нм. На каждой длине волны проводили усреднение сигнала КД по 1000 измерениям, с константой интегрирования 1 с. Сглаживание спектров производили по методу Савитского-Голея с рамкой сглаживания 15 точек. Анализ данных проводили с помощью пакета Origin 8,1. Для анализа спектров КД белков в свободном состоянии и в комплексе с ДНК использовали программы CDNN, KiD и эмпирическую формулу [3]. Спектрофотометрическое плавление

Спектры поглощения в УФ диапазоне регистрировали на двулучевом сканирующем спектрофотометре Specord-M40 («Karl Zeiss», Германия), оснащенном Пельтье-приставкой TSE1 для плавления. Термостатирование холодного спая элемента Пельтье осуществляли при помощи водяного термостата ТЖ-ТС-01 (Россия) с внешним контуром. Измерения проводили в кварцевых прямоугольных кюветах с L = 1 см. Двухмерный гель-электрофорез

Для разделения подфракций гистона III использовали методику двухмерного электрофореза, адаптированную Ковальским с соавт. [4]. В качестве первого направления использовали электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в системе уксусная кислота/мочевина. Разделение белков во втором направлении осуществляли в ПЛАГ в присутствии ДДС-Na с использованием двухступенчатой системы. Документирование полученной электрофореграммы осуществляли при помощи гель-документирующей системы GeI-Imager-2 МАЛДИ масс-спектрометрия

Подготовка образцов: Ферментативный гидролиз белкового препарата трипсином проводили непосредственно в геле в течение 4 ч при 37 °С. Гидролиз останавливали с помощью 0,5 % ТФУ в 10 %-ном растворе водного ацетонитрила. Надгелевый раствор

использовали для получения МАЛДИ масс- спектров на Varian 902-MS MALDI масс-спектрометре со сверхпроводящим магнитом 9,4 Тесла, оснащенным УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-3000 m/z.

Обработку полученных масс-спектров проводили с помощью программных пакетов ProteinProspector и Mascot, находящихся в свободном доступе в сети интернет (http://prospector.ucsf.edu/prosr)ector/cgi-bin/msfonn.cgi?fonn=msdigest; httn://www.matrixscience.com/cgi/search form.pl?FORMVER=2&SEARCH=SOI Научная новизна работы. В работе впервые показано, что HMGB1 способен изменять свою структуру в зависимости от мишени связывания. В процессе взаимодействия HMGB1 с высокомолекулярной ДНК тимуса теленка происходит увеличение на 20 % содержания аминокислотных остатков, находящихся в а-спиральной конформации, в то время как связывание HMGB1 с плазмидной ДНК pUC19 проходит без изменений вторичной структуры белка. Взаимодействие белка HMGB1 с гистоном HI приводит к изменениям вторичной структуры как минимум одного из белков. В работе впервые выявлены сайты следующих посттрансляционных модификаций белка HMGB1: АсК50, АсК59, АсК65, АсК68, АсК81, АсК86-88, АсК90, АсК162, MetR70 или MetR73, MetK76, MetK154, MetK157, MetK167, MetK171 (вместо метилирования MetK167 и MetK171 возможно диметилирование в одном из этих двух положений); сайты фосфорилирования в положениях РТ51 или PS53, РТ77 или PY78, PY155. Подтверждено наличие сайта ацетилирования HMGB1 в положении К81, оказывающего влияние на пространственную укладку белковой молекулы. Впервые показано, что положение посттрансляционных модификаций белков HMGB1 и HMGB2 различно. Большая часть найденных в белках модификаций идентичны, в то время как модификации АсК57, АсК76, АсК85, АсК152, АсК154, MetK82, PY78 характерны только для белка HMGB2. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные существенны для понимания как роли негистонового хромосомного белка HMGB1 в структурной организации хроматина, так и его участия в регуляторных клеточных процессах. Новые знания о структурных особенностях белка HMGB1 в комплексе с ДНК и с линкерным гистоном HI могут быть полезны при создании фармакологических подходов при разработке новых терапевтических средств. Это связано с тем, что HMGB-доменные белки могут выступать как посредники при переносе в ядро клетки [5-7] широко используемого в клинической практике противоопухолевого препарата цисплатина. Полученные данные могут быть использованы при подготовке специалистов в области молекулярной биологии и биофизики.

Обоснованность и достоверность основных результатов и выводов работы обеспечивается использованием современного оборудования, отработанных методик выделения биологического материала, методов обработки и анализа данных, высокой воспроизводимостью полученных результатов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на международных и российских научных конференциях: 13-ая и 12-ая Международные Пущинские школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008; 2009); European Biophysics Congress (Италия, 2009); IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009); V, VII Saint-Petersburg Young Scientists Conference «Modem problems of polymer science» (Санкт-Петербург, 2009; 2011); XVI и XVII Всероссийские симпозиумы "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2010; 2014); II Конференция молодых ученых Института цитологии РАН (2010); XV Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформации молекул (Петрозаводск, 2010); III Конференция "Современные проблемы молекулярной биофизики" (Санкт-Петербург, 2011); XXIV Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва. 2012); FEBS (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 18 печатных работ: 7 статей в рецензируемых журналах (из них 3 в изданиях Web of Science и 5 — Scopus), в том числе 5 — в журналах, рекомендованных ВАК для размещения материалов кандидатских диссертаций, и 11 тезисов докладов. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Негистоновый хромосомный белок HMGB1 способен изменять свою вторичную структуру при связывании как с ДНК, так и с гистоном HI.

2. Посттрансляционные модификации негистоновых хромосомных белков HMGBI и IIMGB2 различны. Большая часть найденных в белках модификаций идентичны, в то время как модификации ЛсК57, АсК76, ЛсК85, АсК152, ЛсК154, MetK82, PY78 характерны только для белка IIMGB2.

3. Среди посттрансляционных модификаций гистона HI доминируют модификации положительно заряженных остатков лизина в различных положениях, что приводит к уменьшению положительного заряда полипептидной цепи белковых молекул и может оказывать влияние на связывание гистона HI и HMGB1 между собой и с ДНК. Личный вклад автора. Большинство экспериментальных данных получено автором лично. Автор принимала участие в постановке и решении задач, обработке и обсуждении

полученных результатов. Масс-спектры белков HMGB1, IIMGB2 и Н1 получены на базе Научно-исследовательского комплекса «Нанобио» ФГАОУ ВО СПбПУ с участием н.с. Артамоновой Т.О. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями. Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 204 ссылки. Диссертация изложена на 125 страницах с 47 рисунками и 8 таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование вторичной структуры и термодинамической стабильности полноразмерного природного белка HMGB1 в свободном состоянии

Исследование вторичной структуры и термодинамической стабильности белка HMGB1 в свободном состоянии проводили методом кругового дихроизма в УФ диапазоне. Спектр КД белка HMGB1 (рис.1) при температуре 20 °С в растворе 3 мМ NaCl представляет собой две перекрывающиеся отрицательные полосы с максимумами в области 205 и 222 нм, вызванные электронными переходами л—»л* и п—*л* в пептидной связи. Образующийся при перекрывании полос профиль спектра КД характерен для полипептидов, находящихся частично в a-спиральной конформации [8]. Степень а-спиральности белка HMGB1 в данных условиях может быть оценена как 25 ± 5 %, где погрешность определяется оценкой дисперсии величины КД на длине волны 222 нм [AI-А4, А7].

Кривая плавления f IIMGB1, построенная на основе зависимости КД HMGB1 от температуры на 222 нм, представлена на вставке рисунка 1, А. Согласно полученным нами данным, температура плавления молекулы HMGB1 составляет (42,0 ±0,5) "С, ширина интервала плавления - порядка 20 °С.

Длина мины, им Длина ВОЛНЫ, ИМ

Рисунок 1. А: Спектры КД к кривые плавления Г и <Шс1Т НМОВ1 в 0.25 мМ ЭДТА. Б: Зависимость оптической плотности раствора НМСВ1 от длины волны. * отмечены спектры, соответствующие пробам после тепловой денатурации. I — 20 мкг/мл, 2 —25 мкг/мл, 3— 30 мкг/мл, 4 — 40 мкг/мл, 5 — 60 мкг/мл.

Увеличение оптической плотности раствора НМОВ1 после термической денатурации в области отсутствия полос собственного поглощения (300 нм) (рис.1, Б) свидетельствует о возникновении в системе рассеяния. Причиной появления рассеяния в процессе термического разворачивания белковой молекулы, вероятно, является формирование белковых агрегатов вследствие хаотичных межбелковых взаимодействий [9]. По все видимости, именно агрегация 11МОВ1 при высоких температурах является причиной того, что в условиях эксперимента конформационный переход НМвВ! из нативного в неупорядоченное состояние является необратимым (рис.1, А). В дальнейшем, чтобы исключить вклад белок-белковых взаимодействий в спектр поглощения ДНК-белкового комплекса, при исследовании термодинамических характеристик мы ограничились областью концентраций НМОВ1, не превышающих 20 мкг/мл. При такой концентрации не происходят структурные изменения белка, которые могут быть зафиксированы в наших условиях, и нет рассеяния в системе. Таким образом, при СНМОВ1 < 20 мкг/мл на 260 нм мы сможем разделить вклады ДНК и белка в кривую плавления комплекса и проследить за изменением термодинамических характеристик ДНК при связывании с НМОВ1.

Анализ вторичной структуры белка НМСВ1 при взаимодействии с ДНК

Как было отмечено выше, спектр КД свободного НМОВ! (рис.2, А, кривая 2) представляет собой две перекрывающиеся отрицательные полосы с максимумами в области 205 и 222 нм; профиль спектра характерен для белков, находящихся частично в а-спиральной конформации. Степень а-спиральности белка НМОВ1 в данных условиях

может быть оценена как 30 ± 5 %, где погрешность определяется дисперсии величины КД на длине волны 222 нм [А1-А4, А7].

Б

А

оценкой

210 2MI ¿'>и

Длина волны, нм

pl'í'19. ('= 60 мкг/мл f—-у

г 0.4

Y)J //1/6«/, ( 3t}MK.:'.u.,

21ÍI 225 240 255 270 285 .Í0U Длина типы. им

Рисунок 2. Спектры КД комплексов НМОВ1 с ДНК. А: Спектры кругового дихроизма комплексов НМОВ 1 с высокомолекулярной ДНК тимуса теленка в 15 мМ КаС1. На дорожках представлены: 1 - ДНК, Сднк = 60 мкг/мл; 2 - НМвВ I. СНмов1 " 48 мкг/мл; 3-17 ДНК-белковые комплексы от г = 0,05 до г = 0,8 с шагом 0,05. Б: Спектры кругового дихроизма комплексов 11МОВI с плазмидной ДНК р1_1С 19.

Спектр КД ДНК, как в случае высокомолекулярной ДНК тимуса теленка (рис.2, А, кривая 1), так и в случае плазмидной ДНК р!_1С19 (рис.2, Б), представлен двумя интенсивными 275(+)/245(-) нм и двумя малоинтенсивными 220(+)/210(-) нм полосами разного знака. Образующийся профиль спектра КД характерен для ДНК в В-форме.

< <1

0,8

в ДНК тимуса теленка в комплексен HMGB1 • pl !С 19 в комплексе с НMOB I

L..

т - , ...fif.

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0.7 0,8

г (W/W)

о 0

0,52

л

7 П4К

У. Ö.44

= 0.4Ü

С.

- 0.32

CJ

0.28

«

0.24

о 0 Ч)

Ч

A JIMGBI и KOMtttet.cc с вышкижжкулярной ДНК • НМОШвсво&зяоксоатнаш = HMGBlBKnlíB«cccplC19

0.0 0.1 02 0.3 0.4 0,5 0,6 0,7 0.8 0.9 r(WWl

Рисунок 3. А: Зависимость ДА270 от г (W/W). Сднк теленка = 60 мкг/мл, Срисч9 = 60 мкг/мл. Длина оптического пути составляла 0,5 см. Концентрация ДНК в растворе поддерживалась постоянной. ДНК-белковые комплексы приготавливались прямым смешением. Б: Зависимость доли аминокислотных остатков, находящихся в a-спиральной конформации, от весового соотношения г белок/ДНК в растворе.

Одновременное присутствие в растворе ДНК и белка HMGB1 приводит к увеличению интенсивности белковой полосы в интервале 200- 240 нм и изменению КД

ДНК в области 275 нм. В связи с тем, что регистрируемые изменения в структуре ДНК при связывании с 11MGB1 в области 275 нм не превышают 10% (рис.3, Л), при оценке а-спиральности белка в комплексе с ДНК на длине волны 222 нм ими можно пренебречь в силу близости КД ДНК к нулю.

В связи с совпадением зависимости доли а-спиральных участков в молекуле HMGB1 в комплексе с pUC19 с аналогичной зависимостью для белка в свободном состоянии можно сделать вывод об отсутствии регистрируемых структурных изменений HMGB1 в данной системе. Зависимость а-спиральности HMGB1 от г в комплексе с высокомолекулярной ДНК тимуса теленка демонстрирует достаточно быстрое падение до уровня -35 % при увеличении г от 0 до 0,3, после чего асимптотически приближается к величине около 30 %, соответствующей степени а-спиральности свободного белка в данных условиях. Величина а-спиральности белка полностью в связанном состоянии получена путём экстраполяции зависимости а(г) к нулевым значениям г и оценена как -54 % [A3].

Анализ вторичной структуры белка HMGB1 при взаимодействии с ДНК

При исследовании вторичной структуры HMGB1 в комплексе с линкерным гистоном HI количественную оценку провести крайне сложно, поскольку спектры КД HMGB1 н III (рис. 4) обусловлены вкладом хромофоров одного типа. В данном случае регистрируемые изменения в структуре белков при комплексообразовании мы не можем соотнести с конкретным белком. Однако мы можем провести качественно сравнительный анализ вклада общего числа хромофоров в спектр КД комплекса при отсутствии взаимодействия (теоретическая кривая, полученная путем суммирования спектров исходных компонентов) (рис.4, кривая 3) с реальным спектром КД комплекса HMGB1 -HI. Показано, что теоретическая и экспериментальная кривые (при молярном соотношении белков HMGB1/H1 1:1,15) в области 220-230 нм различимы в пределах погрешности. Данное обстоятельство свидетельствует об изменении в структуре как минимум одного из белков.

Длина волны, им

Рисунок 4. Спектры КД НМвВ!, Н1 и НМСВ1-Н1 комплекса в 3 мМ ЫаС1.

! - спектр КД Н1 в свободном состоянии, 2 - спектр КД НМОВ1 в свободном состоянии, 3 -алгебраическая сумма спектров КД белков в свободном состоянии, 4 - экспериментальная зависимость эллиптичности комплекса НМСВI с Н1 от длины волны.

Согласно данным динамического светорассеяния [А 16], гидродинамические радиусы НМСВ1 и Н1 в свободных состояниях составляют 5,8 нм и 3 нм соответственно. В водном растворе при молярном соотношении белков 1:1 формируется комплекс ЫМвВ 1-1II с гидродинамическим радиусом 9,1 нм. Согласно полученным данным, одна молекула ИМвВ! взаимодействует с одной молекулой Н1 с образованием комплекса по типу гетеродимера.

Исследование термостабильности ДНК в комплексе с НМСВ1

Конформационный переход из нативного в денатурированное состояние ДНК, как в свободном состоянии, так и при взаимодействии с НМОВ1, регистрировали при 260 нм методом термической денатурации. Показано, что дифференциальная кривая плавления ДНК ёШТ в свободном состоянии характеризуется наличием одного максимума Т',„ = (45,0 ± 0,5) °С (рис.5, кривая 1), что соответствует температуре плавления свободной ДНК в растворе.

Особенностью дифференциальной кривой плавления ДНК-белкового комплекса является наличие двух максимумов [А5, А6]. Положение первого максимума на оси температуры совпадает с областью плавления ДНК в свободном состоянии Т',„ = (45,0 ± 0,5) °С и соответствует плавлению участков макромолекулы, не связанных с белком. Второй максимум в области Т"т = (62,0 ± 0,5) °С соотносится с плавлением участков ДНК, связанных с белком [А7].

Т—»* I-•-1-■-1-■-1->-г-

30 35 40 45 50 55

Температура, °С

60 65

Рисунок 5. Кривая плавления Г комплекса и ее первая производная с$17с1Т комплексов ДНК-НМСВ1 от температуры. Концентрация ДНК в пробе составляет 30 мкг/мл. Длина оптического пути I см. I - ДНК; 2 -г = 0,15; 3 -г =0,5.

Перераспределение интенсивности пиков характеризует уменьшение количества свободной ДНК и увеличение ДНК, связанной с белком. Па основе полученных данных мы рассчитали долю пар оснований, вовлечённых в связывание с Н1УЮВ1, размер участка связывания на ДНК, и оценили молярное соотношение И белок/ДПКСВЯ1 в растворе. Согласно проведенным расчетам, размер участка связывания НМОВ1 на ДНК при г = 0,15 составил 13 пар оснований, что неплохо согласуется с литературными данными. Смешение пика, соответствующего плавлению участков ДНК, связанных с НМОВ1, указывает на стабилизацию ДНК в составе комплекса.

Посттрансляционные модификации подтипов линкерного гистона Н1

В водном растворе белка Н1 одновременно присутствуют 7 близких по аминокислотному составу подтипов. В связи с этим первоначально подтипы Н1 разделяли методом двухмерного гель-электрофореза. В результате двухмерного гель-электрофореза было получено 9 белковых зон, в пяти из которых (№№ 3-6, 8) методом МАЛДИ масс-спектрометрии были обнаружены подтипы гистона Н1. В двух - белки НМОВ1 (зона № 1) и НМОВ2 (зона № 2). Зоны № 7 и № 9 также были подвергнуты спектральному анализу (результаты не представлены), однако в этом случае четко соотнести их белковую природу с определенным подтипом Н1 не удалось. Выявленные после анализа масс-спектров посттрансляционные модификации гистона III представлены в таблице.

1009080 70 60 50 40 30 20 10-1

Т -

и

I,,

о

500 750 1000

!/

ь

1250 1500 1750 2000 т/г

Рисунок 6. Двухмерный гель-электрофорез НI-обогащенной фракции тимуса теленка.

Рисунок 7. Масс-спектр НI-обогащенной подфракцин. Зона № 3. На спектре отмечены наиболее интенсивные линии.

Таблица. Посттрансляционные модификации гистона Н1 теленка. Жирным шрифтом отмечены модификации, согласующиеся с литературными данными [10].

Подтип гистона Н1 Модификация Сайт модификации

Н1.0 Ацетилирование АсК85; АсК128; АсК137; сК139

Метилирование Ме1К52; МеЖ55; МеЖ82; МеИС102; МеИ<:108; МеШ32; МеШЗб

Фосфорилирование РБ45; РБ46; Рв49; РУ53; 2Р из Т77, Т78, Т84, Б90 и Э92; Р5131; РЭ135; РТ162

Н1.1 Ацетилирование АсК17, 1 Ас из К22, К23 и К24

Метилирование 1 Ме1 из К36, К37; Ме1К55

Фосфорилирование 1Р из 82, 812, Т13, Б14, Б19

Н1.2 Ацетилирование АсК17; АсК.63; 2Ас из К149, К149, К152

Метилирование МеП<46

Фосфорилирован ие Р1 из Т141, Т146 и Т150

Н1.3 Ацетилирование АсК17; АсК64; АсК149; сК150

Метилирование \1etK47; Ме1К153

Фосфорилирование 1Р из Б142, Т143, Т147

Н1.4 Ацетилирование АсК17; АсК147; АсК148

Метилирование Ме1К46; 1Мй из К117, К119; МеШ52

Фосфорилирование 1Р из Т144, Т146, 8150 или Т151

Сравнение белков, выделенных из тимуса теленка, мыши и крысы (данные представлены частично), свидетельствует о высокой межвидовой консервативности характера и положения посттрансляционных модификаций подтипов гистона Н1. Однако внутри одного организма модификации подтипов Н1 различны.

Посттрансляционные модификации гистона Н1.0 расположены, в основном, в глобулярном домене и С-концевом участке белка. Модифицированные области Н1.0 характеризуются высокой степенью фосфорилирования, что приводит к введению дополнительного отрицательного заряда в полипептидной цепи белковой молекулы и может способствовать ослаблению взаимодействия с ДНК.

Глобулярный домен подтипов Hl.l, Н1.2, Н1.3 и Н1.4 гистона Н1 характеризуется наличием нескольких сайтов метилирования, что может приводить к увеличению положительного заряда полипептидной цепи в областях модификаций и, как следствие, увеличения силы его взаимодействия с ДНК [А 17, А18]. N-концевые и С-концевые участки подтипов Н1.1, Н1.2, Н1.3 и Н1.4 гистона Н1 характеризуются наличием сайта ацетилирования в положении К17 и обогащенной посттрансляционными модификациями (в большей степени ацетилированием и фосфорилированием) области, начиная примерно с 140 а.к.о, продолжительностью порядка 15 а.к.о. соответственно (рис. 8).

Ас зо

Met

50

Hl.l HI. Z Н1.3 HI.4

HI. о

MSETAPVAQA ASTATE|PAA AKKTKXPAXA AAPR8KPÍ ЗР Ac

MSEAAPAAPA AAPPAE|APA KKKAAKKPAG VRRKASGí PV At

M5ETAPAAPA APAPVE JTPV KXKAK-tTGAA AGKRKASS E>P Ac

MSETAPAAPA APAPA21IPV KXKARKAAGG AKRKTSGÍPV

Ш

SVSELIVQAV SSSSERS3VS Met

SELITjSiAVAA SKERSGVSLA

MM

VSELITSfAVA ASKEHSSVSL Mot

SELITKAVAA SKESSGl'SLA

££_S_Mb". МП

MTENSTSTPA AKÍKRAKASK KSl|cHPKYSI) ffiVAAIQAEK URAGSSRQSI GKYIgSKYKV |

Hl.l HI.2 H1.3

HI.4 H1.0

no

LAALKX5LAA AGYEVEXNNS A1§KALAAAG YDVEKNESRI AAL|XALAAA GYDVEKKHSR Ac

ALfKALAAAG YCVEKNKSKI

RIKLGLKSLV NXGTIVQTKG TGAAGSFKLK KLGLKSLVSK GILVOTKGTG ASGSFKLIJKK IKLGLKSLVS KGTLVQTKGT GASGSFKINK

KLGLKSLVSK GTLVQTKGTG ASGSFKLNKK

I GEKABSQIKL SIKRLVTIGV LKai|GVGAS GSFRLAK^DS PgRSVAFjDCT

120

KKAESKAXTT AASGEAXPQA KAASGEAKPK

IMet AASGEARPKA

KKEVKKVATP

Hl.l HI.2 H1.3 HI. 4 HI.О

KKAGAAKAKK PAGAAKXPKК

AKKAGAAKAX KPAGAAKKPK

KRAGAAKAKK PAGAAKKPKX Ac P Met PMetAcAc ККААКРКЩАА SfEAPSSJPgA

150 160

AAAXXTVKTP KKPKKPAVSK :

IP, 2Ac

ATGAATPHA S|KTPKKAKK

IP Ac Ac Met

KSTGAATpJI AAKKTPKXAK

IP AcAcPMet

aagtataB5 tkktpkkakk

PAAAAVTKKV AKSPKKAKVT KPAAAAGAKK VSKSPKKVXA

PAAAAGAKKA KSPKKAEATK P

TPVKKAKXKP AAIPKKiKKP KTVXAKP7KA SKPKKTKPVK

Hl.l HI. 2 H1.3 HI. i H1.0

190

PAKAKAVKPK KPKXVKSASK AKPKKAAKSP AKKAPKSPAK PKAXS5AKRT

2CO

ASKAKVTKPK AVKPKAAKPK AXAKAPKAKA AKTVKPKAAK GKKK

210

TPAKPKKAAP KKK VAKAKKVAAK KK SKPKASKPKA ГКАККААРЯК 1 PKISKPKAAK PKKTAAKKK

Рисунок 8. Посттрансляционные модификации линкерного гистона HI. Выделение черным -ацетилирование по лизину (Ас), серым - метилирование (Met), светло-серым - фосфорилирование (Р). Прямоугольником отмечены аминокислотные остатки, входящие в глобулярный домен белков.

Введение клеточной системой в N- и С-концевые домены белков отрицательного заряда может способствовать ослаблению взаимодействия с ДНК данных участков полипептидной цепи белковых молекул.

Согласно литературным данным [11], N- и С- концевые домены гистона HI, стягивая между собой нуклеосомы, принимают непосредственное участие в формировании 30-ти нанометровой фибриллы. Нарушение связывания HI с ДНК в области N- и С-конца, вероятно, приводит к формированию фибриллы с меньшей плотностью упаковки, что в свою очередь может оказывать влияние на доступ к ДНК структурно-регуляторных белков, в частности HMGB1, и транскрипционных факторов.

Сравнительный анализ посттрансляционных модификаций негистоновых белков хроматина HMGB1 и HMGB2

Помимо способности HMGB1 изменять вторичную структуру при связывании с биологическими молекулами одним из механизмов регуляции функциональной активности белка в клетке может быть введение клеточной системой посттрансляционных модификаций. Методом МАЛДИ масс-спектрометрии нами были обнаружены следующие посттрансляционные модификации HMGB1: АсК50, АсК59, АсК65, АсК68, АсК81, АсК86-88, АсК90, АсК162, MetR70 или MetR73, MetK76, MetK154, MetK157, MetK167, MetK171. Вместо метилирования MetK167 и MetK171 возможно диметилирование в одном из этих двух положений. Обнаружены три области фосфорилирования: РТ51 или PS53, РТ77 или PY78, PY155. Здесь и ниже по тексту жирным шрифтом отмечены сайты модификаций, согласующиеся с литературными данными [12]. Для удобства восприятия полученных данных выявленные в работе сайты постгрансляционных модификаций HMGB1 отмечены на аминокислотной последовательности белка (рис.9).

Обнаружены сайты посттрансляционных модификаций HMGB2 в следующих положениях: АсК49 или АсК55, АсК57, АсК59, АсК65, АсК76, АсК85, АсК86, АсК88, АсК89, АсК152, АсК154, MetK82, MetK157, MetK167, MetK172, PT51, PT53, PY78, PY155 (рис. 10). Большая часть найденных в HMGB1 и HMGB2 модификаций идентичны, в то время как модификации АсК57, АсК76, АсК85, AcKI52, АсК154, MetK82, PY78 характерны только для белка HMGB2.

Отсутствие ацетилирования в областях NLS1 и NLS2 (от англ. Nuclear localization sequences) свидетельствует о ядерной локализации исследуемых в работе HMGBI и

HMGB2 [13]. При этом функционирование HMGB1 и HMGB2 напрямую связано с конформацией белковых молекул. Свернутое, неактивное, состояние характеризуется взаимодействием отрицательно заряженного С-концевого участка белковой молекулы с аминокислотными остатками R72, К.81, 1158, R162, К.164, что приводит к его расположению в полости между двумя положительно заряженными ДНК-связывающими доменами и стабилизации белковой молекулы [14].

р5Л-свя »ышж>щий домен MGKGDPKKjPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSKKCSERWK

Ac

н......

70

Ac Ac I Mel

80 Met IP

90

AcAcAc Ac

100

TL.R4-c»ji шванмиии домен

TMSAKEKGKF EDMAKADKAR YERF.MKTY I 1? KGETKKKFK I DPNAPKRPPS

110 120 130 140 150

jAFFLFCSEYR PKIKGEHPGL SIGDVAKKLG EMWNNTAADD KQPYEKKAAK 160

190

200

LKBKYEKDIA

R AG Г.-снязыклютий домен

KEEEED EEDEEDEEEE

210

EDEEDEEEEE DDDDE

Рисунок 9. Посттрансляционные модификации белка HMGBI. Обозначения: Ac — ацетилирование, Met — метилирование, Р — фосфорилирование, dimetyl-диметилирование. Спорные сайты модификаций отмечены знаком «?». Серым выделены аминокислотные остатки, входящие в NLS (от англ. Nuclear localization sequences) и функционально важные области аминокислотной последовательности белка. Прямоугольником отмечены аминокислотные остатки, входящие в А и В HMGB-домены белка.

70 j 80 I

LSDKAR YDifEMKNYVP

1 1

130

Чс Ас Ас /

I 1Ф|

ТЬ{?4-сиячывак>щий домен

140

Ac Ac Р Met

SIGDTAKKLG EMWSEQSAKD KQPYEQKAAK

190 200

NEPEDE EEEEEEEDED EEEEDEDEE

«.тающий домен

Рисунок 10. Посттрансляционные модификации HMGB2. Обозначения: Ас — ацетилирование. Met — метилирование, Р — фосфорилирование. Спорные сайты модификаций отмечены знаком «?».Серым выделены аминокислотные остатки, входящие в NLS (от англ. Nuclear localization sequences) и функционально важные области аминокислотной последовательности белка. Прямоугольником отмечены аминокислотные остатки, входящие в А и В HMGB-домены белка.

Переход в функционально-активное состояние сопровождается нарушением данного взаимодействия, и как следствие, разворачиванием белка HMGB1. Регуляция данного конформационного перехода может включать как структурно-адаптивные механизмы, когда в зависимости от объекта связывания, белок способен изменять свою структуру, так и наличие посттрансляционных модификаций. Согласно полученным нами данным, линкерный участок между ДНК-связывающими доменами белка характеризуется высокой степенью ацетилирования, в том числе и в положении К81 [А 17, Al 8]. Дополнительный отрицательный заряд на данном участке полипептидной цепи белковой молекулы может способствовать нарушению взаимодействия С-концевого участка белка с линкером и переходу HMGBI в активное для связывания с ДНК и белками состояние.

В отличие от HMGB1 в белке HMGB2 в данном положении происходит метилирование остатка лизина К82. Поскольку белок HMGB2 на 10 аминокислотных остатка в С-концевом домене короче своего гомолога, взаимодействие линкера с аминокислотными остатками этого участка белковой молекулы, может быть ослаблено или нарушено изначально. В этом случае, IIMGB2 будет находиться в развернутом, как следствие активном для связывания с биологическими молекулами состоянии.

Согласно литературным данным, взаимодействие белков HMGB1 и HMGB2 с ДНК осуществляется посредством однодоменного (В-доменом) и, в случае АТ-богатых участков ДНК, двухдоменного связывания. В ДНК эукариотических клеток АТ-богатыми последовательностями зачастую характеризуются промоторные области генов [15] примерно на 30 нуклеотидов выше сайта инициации транскрипции [16]. Посадка транскрипционных факторов на ДНК осуществляется путем формирования промежуточного тройного комплекса «фактор транскрипции/НМОВ1/ДНК» [12], при этом за связывание транскрипционных факторов с HMGB1 отвечает A-домен белка. Согласно полученным нами данным, экранирование положительного заряда ДНК-связывающих доменов белков HMGB1 и HMGB2 вследствие ацетилирования аминокислотных остатков лизина в положениях АсК50-К80 может способствовать ослаблению взаимодействия А-домена с ДНК в промоторной области генов, что, в свою очередь, является предпосылкой для связывания с HMGBI фактора транскрипции с образованием промежуточного тройного комплекса. В качестве примера, на рисунках 9 и 10 в области А-домена белков отмечена полипептидная последовательность, отвечающая за связывание транскрипционного фактора р53.

Анализ расположения модификаций аминокислотной последовательности В-домена белков показал, что большинство сайтов метилирования находятся в области

связывания HMGB1 и IIMGB2 с рецептором конечных продуктов гликозилирования (RAGE), что ограничивает доступ RAGE к сайту связывания белка HMGB1. Это происходит из-за увеличения положительного заряда В-домена при метилировании, что, вероятно, приводит к более сильному взаимодействию HMGB белков с ДНК.

При сравнении белков, выделенных из тимуса теленка и крысы, нами было показано, что характер и положение посттрансляционных модификаций в HMGB1 и HMGB2 отличаются высокой межвидовой консервативностью [А17, А18].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди выявленных в работе модификаций подтипов гистонов H1.I-H1.4 доминируют модификации положительно заряженных остатков лизина в области N- и С-концевых участках. Появление дополнительного отрицательного заряда в процессе ацетилирования вне ДНК-связывающего глобулярного домена белка, может привести к нарушению связывания Н1 с ДНК и способствовать формированию фибриллы с меньшей плотностью упаковки. Уменьшение степени компактизации ДНК оказывает непосредственное влияние на доступ к ДНК структурно-регуляторных белков, в частности I IMGB1, и транскрипционных факторов.

Согласно полученным нами данным, функционирование негистонового хромосомного белка HMGBI опосредовано наличием как минимум двух видов регуляции: введением клеточной системой посттрансляционных модификаций и наличием структурно-адаптивного механизма белка к объекту связывания (рис. 11).

Рисунок 11. Модель функционирования HMGB I в ядре клетки.

Белок HMGB1, используемый в работе, характеризуется отсутствием ацетилирования в NLS областях полипептидной цепи, что свидетельствует о его ядерной локализации в клетке.

Связывание HMGB1 с ДНК в межнуклеосомной области может происходить за счет вытеснения гистона Н1, поскольку взаимодействие N- и С-концевых доменов Н1 ослаблено вследствие ацетилирования и фосфорилирования в данных областях белковой молекулы. При этом возможно образование промежуточного HMGB1-H1 комплекса по типу гетеродимера.

А-домен белка характеризуется наличием сайтов ацетилирования, что вследствие экранировки положительного заряда данной области белка, способствует ослаблению взаимодействия домена с ДНК и формированию промежуточного регуляторного комплекса «TF/HMGBl/ДНК». При этом функционально-значимые для выполнения внеклеточных функций участки В-домена белка, в частности, область связывания RAGE рецептора, сильно метилированы. Внесение дополнительного положительного заряда в данный участок полипептидной цепи белка в этом случае способствует увеличению силы связывания В-домена белка с ДНК, и как следствие, уменьшения вероятности связывания HMGB1 с RAGE рецептором.

Хромосомный белок HMGB1 способен по-разному изменять свою вторичную структуру при связывании с биологическими молекулами. В процессе взаимодействия HMGB1 с высокомолекулярной ДНК тимуса теленка происходит увеличение на 20% содержания аминокислотных остатков, находящихся в а-спиральной конформации, в то время как связывание HMGB1 с плазмидной ДНК pUC19 проходит без изменений вторичной структуры белка. Взаимодействие белка HMGB1 с гистоном Н1 так же приводит к изменениям вторичной структуры как минимум одного из белков.

ВЫВОДЫ

1. Белок НМОВ1 способен изменять свою вторичную структуру в зависимости от объекта связывания.

а) В процессе взаимодействия НМОВ1 с высокомолекулярной ДНК тимуса теленка происходит увеличение на 20 % содержания аминокислотных остатков, находящихся в а-спиральной конформацин, в то время как связывание ПМСВ1 с плазмидной ДНК риС19 проходит без изменений вторичной структуры белка.

б) Взаимодействие белка НМСВ1 с гистоном Ш приводит к изменениям вторичной структуры как минимум одного из белков.

2. Несмотря на деформацию двойной спирали в месте связывания НМСВ1, взаимодействие данного белка с ДНК приводит к увеличению термостабильности двойной спирали ДНК, что выражается в увеличении ее температуры плавления в составе комплекса на 20 "С.

3. Большая часть найденных в белках НМОВ1 и НМОВ2 модификаций идентичны, вто время как модификации АсК57, АсК76, АсК85, АсК152, АсК154, Ме1К82, РУ78 характерны только для белка НМОВ2.

4. Основная часть найденных посттрансляционных модификаций белков НМОВ1 и Н\ЮВ2 располагается в области А-домена, линкерного участка между двумя ИМвВ-доменами и ЯАОЕ-связывающей последовательности белка, что может оказывать влияние на связывание с белками факторов транскрипции, на пространственную укладку белковой молекулы и выполнение белками внеядерных функций соответственно.

5. Глобулярный домен и С-концевой участок белка Н1.0 характеризуются высокой степенью фосфорилирования и метилирования, что может оказывать влияние на связывание белка с ДНК.

6. Среди выявленных в работе подтипов гистонов Н1.1-Н1.4 доминируют модификации положительно заряженных остатков лизина в области Г*1- и С-концевых участков, что приводит к уменьшению положительного заряда полипептидной цепи вне ДНК-связывающего глобулярного домена белка.

7. Характер и расположение посттрансляционных модификаций белка НМСВ1 и гистона Н1отличаюся высокой межвидовой консервативностью.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

А1. Поляничко A.M., Родионова (Старкова) Т.Ю., Чихиржина Е.В., Воробьев В.И. 2008. Структуризация белка HMGB1 в ответ на связывание с ДНК. Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем», № 4 А: 38-41 http://www.ksu.ru/sdms/4b_2008.pdf

А2. Родионова (Старкова) Т.Ю., Чихиржина Е.В., Воробьев В.И., Поляничко A.M. 2009. Изменение вторичной структуры белка HMGB1 при связывании с ДНК. Журнал структурной химии. 50(5): 1014-1020.

A3. Родионова (Старкова) Т.Ю., Чихиржина Е.В., Курилов Р.В., Скворцова Е.В., Поляничко A.M. 2010. Изменение вторичной структуры HMGB-домена при связывании с ДНК. Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». № 8, А: 14-19 http://www.ksu.ru/sdms/sdms_8_2010.pdf

А4. Поляничко A.M., Родионова (Старкова) Т. Ю., Воробьев В.П., Чихиржина Е.В. 2011. Конформационные особенности ядерного белка HMGB1 и специфика его взаимодействия с ДНК. Цитология. 53 (1): 55-60.

А5. Чихиржина Е.В., Старкова Т.Ю., Костылева Е.И., Чихиржина Г.И., Воробьев В.И., Поляничко A.M. 2011. Взаимодействие ДНК со спермий-специфическими гистонами семейства HI. Цитология. 53(10): 70-75.

А6. Chikhirzhina Е., Starkova Т., Kostyleva Е., Polyanichko А. 2012. Spectroscopic Study of the Interaction of DNA with the Linker Histone HI from Starfish Sperm Reveals Mechanisms of the Formation of Supercondensed Sperm Chromatin. Spectroscopy: An International Journal. 27 (5-6): 433-440. doi: 10.1155/2012/250489

A7. Chikhirzhina E., Starkova (Rodionova) T, Polyanichko A. 2014. Interaction between Chromosomal Protein HMGB1 and DNA Studied by DNA-Melting Analysis. Journal of Spectroscopy. ID 387138 http://dx.doi.Org/I0.l 155/2014/387138

Тезисы докладов

A8. Родионова (Старкова) Т.Ю., Поляничко A.M., Воробьёв В.И. 2008. Структурная организация комплексов ДНК с белком HMGB1 в растворах различных ионных сил. XIV Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул. 15-21 июня 2008 г., Челябинск. Сборник тезисов, 138.

А9. Rodionova (Starkova) T.U., Polianitchko A.M., Chikhirzhina E.V., Vorob'ev V.I. 2009. Structural changes of HMGB1 chromosomal protein upon binding to DNA. European

Biophysics Congress Genoa. July 11-15, Genoa, Italy. 2009. European Biophysics Journal 38 (Suppl 1): S44.

A10. Родионова (Старкова) Т.Ю., Курилов P.B., Скворцова Е.В., Поляничко A.M. 2009. Взаимодействие негистонового хромосомного белка HMGB1 с высокомолекулярной и плазмидной ДНК. 13-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». 28 сентября - 2 октября 2009 г, Пущино, Россия. Сборник тезисов,41.

АН. Родионова (Старкова) Т.Ю., Скворцова Е.В., Поляничко A.M. 2010. Особенности взаимодействия негистонового белка хроматина HMGB1 с плазмидной и высокомолекулярной ДНК. Тезисы докладов XV симпозиума по межмолекулярному взаимодействию и конформации макромолекул. Петрозаводск, 14-18 июня 2010 г., 176. А12. Родионова (Старкова) Т.Ю., Поляничко A.M., Чихиржина Е.В., Воробьев В.И. 2010. Конформационные особенности ядерного белка HMGBI и специфика его взаимодействия с ДНК. Тезисы докладов и сообщений II конференции молодых ученых Института цитологии РАН. Цитология. 52(6): 503

А13. Srarkova (Rodionova) T.J., Chikhirzhina E.V., Polyanichko A.M. 2011. Thermodinamical and structural properties of HMGBI chromosomal protein. Two mechanisms of DNA-HMGB1 interaction. 7th Saint-Petersburg Young Scientists Conference "Modem problems of polymer science", October 17-20, 2011. Abstract Book: 44.

A14. Родионова (Старкова) Т.Ю., Чихиржина E.B., Поляничко A.M. 2011. Изменение структуры хромосомного белка HMGB1 как основа многообразия выполняемых им функций. V Всероссийский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г. Сборник тезисов: 380. (ISBN 978-5-9274-0475-9).

А15. Старкова (Родионова) Т.Ю., Поляничко A.M., Костылева Е.И., Чихиржина Е.В.

2012. Механизм структурной адаптации негистонового хромосомного белка HMGB1 к участку связывания на ДНК. IV Съезд биофизиков России. Нижний Новгород, 20-26 августа 2012. Сборник тезисов. 1: 279.

А16. Starkova (Rodionova) T., Mikhailov N., Kostyleva E., Chikhirzhina E., Polyanichko A.

2013. Interaction between linker histone HI and non-histonc protein HMGBI in vitro. FEBS Journal. 280 (Suppl. 1): 129.

A17. Sitnikova A., Starkova (Rodionova) T., Artamonova T., Karpenko V., Polyanichko A., Chikhirzhina E., Kostyleva E., Tomilin A. 2013. Application of mass spectrometry to the characterization of post-translational modifications of chromosomal proteins. FEBS Journal. 280 (Suppl. 1): 131.

Al8. Старкова (Родионова) Т.Ю., Бабич A.B., Костылева Е.И., Скворцова Е.В., Поляничко A.M., Чихиржииа Е.В., Томилии А.Н. 2014. Исследование посттрансляционных модификаций ядерных белков хроматина HI и HMGB1/2 методами МАЛДИ- и электроспрей- масс-спектрометрии. Тезисы докладов и сообщений XVH Всероссийского симпозиума «Структура и функции клеточного ядра». Цитология. 56(9): 682

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Laemmli U.K. 1970. Nature. 227(5259): 680-685; 2. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C. и др. 1990. Наука. СО РАН. 248С.; 3. Morrow J. А., Segall М. L., Lund-Katz S„ Phillips M. С., Knapp М., Rupp В., Weisgraber К.Н. 2000. Biochem. 39(38): 11657-11666; 4. Kowalski A., Pafyga J. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. 117-136; 5. Bruhn S.L., Phil P.M., Eissigman J.M., Houseman D.E., Lippard S.J. 1993. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 2307-2311; 6. Park S„ Lippard S.J. 2011. Biochem. 50: 2567-2574; 7. Park S„ Lippard S.J. 2012. Biochem. 51: 6728-6737; 8. Greenfield N„ Fasman G. D. 1969. Biochem. 8: 4108-4116. 9. Knapp S., Muller S., Digilio G. et al. 2004. Biochem. 43: 11992-11997; lO.Wisniewski J.R., Zougman A., Krüger S., Mann M. 2007. Mol. Cell. Proteomics. 6: 72-87. 11. Jerzmanowski A. The linker histones. In: Chomatin Struture and Dynamics: State-of-the-Art / Eds. Zlatanova J.,and Leuba S.H . UK.: Elsevier, 2004,- P. 75-102. 12. Stros M. 2010. Biochim. Biophys. Acta. 1799: 101-113. 13. Kang R„ Zhang Q., Zeh H.J., Lotze M„ Tang D. 2013. Clin. Cancer Res. 19(15): 4046-4057. 14. Watson M„ Stott K„ Thomas J.O. 2007. J. Mol. Biol. 374: 1286-1297; 15. Smale S.T., Kadonaga J.T. 2003. Annu Rev. Biochem. 72: 449 479; 16. Barrett L.W., Fletcher S., Wilton S.D. 2013. SpringerBriefs in Biochem. and Mol. Biol. 57 p.

Подписано в печать 29.04.2015. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 1 ЗОбОЬ.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Типографии Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 552-77-17; 550-40-14