Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Статистические и индивидуальные свойства клонированных мононуклеосомных ДНК из хроматина клеток человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Статистические и индивидуальные свойства клонированных мононуклеосомных ДНК из хроматина клеток человека"

российская академия наук институт молекулярной биологии им. в.а. энгельгардта

На правах рукописи УДК: 577. 21

АЗИЗОВ Мехман Мамедали Оглы

СТАТИСТИЧЕСКИЕ И ИШЩВЯДУАЛЬШЕ СВОЙСТВА КЛОНИРОВАННЫХ МОНОНУКЛЕОСОМНЫХ ДНК ИЗ ХРОМАТИНА КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

03.00.03. - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - Т9Э2 г.

Работа выполнена во временном научном коллект:ше "Экспрессия эухариотиче ских генов" Института.молекулярной бшвогки им. В.А. Энгельгардта РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук С.А. НЕДОСПАСОВ.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОШОНЕНТЫ:

. доктор биологических наук Д.Б. КРАМЕРОВ, кандидат биологических наук С.Г. БАБЖИК.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Биологический факультет МГУ км.

специализированного совета Д.002.79.01. при Институте молекулярной бгалогак им. В.¿.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, уд. Вавилова, д.32.

С дассертациеЗ можно ознакомиться в библиотеке Института Молекулярной Биологии ин. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан «^«ßnjUiw, 1992 г.

К.В. Ломоносова

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук А.Ы. Крицы!

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ггций

"АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕШ: Одной из основных задач молекулярной адлогии является установление механизмов реализации генетической ^формации у высших организмов. Многие аспекты действия этих зханизмов связаны со структурной организацией ДНК в хромосомах и роматине.

Большая часть нуклеотидных последовательностей генома высших ходит в структуру универсальных суб'единиц хроматина - нуклеосом. а последние годы наметился прогресс в понимании динамической рганизации хроматина и взаимосвязи структуры хромосом и хроматина ,с онтролем экспрессии генов. В частности, получен убедительный ответ а вопрос 15-летний давности о том, может. ли иметь функциональный шел специфическое расположение нуклеосом - элементарных су<5' единиц труктуры хромосом - вдоль кодирующих и некодирупдих оследовательностей ДНК генома (Grunstein et al. 1990).

Парадоксально, что хотя уже имеется - неиало данных о ункциональной роли неслучайного расположения нуклеосом, механизмы х специфического позиционирования на ДНК до конца не. поняты. Более ото, до сих пор не ясно, определяется ли специфичность, главным бразом, за.счет участков, входящих в состав нуклеосомы, или за счет егментов ДНК, оставшихся вне нуклеосомы (возшжно, за счет ¡ополнительных контактов с другими белками).

Настоящая работа как раз и посвящена одному конкретному аспекту 1ТОй проблеш - получению усредненных структурных характеристик юнонуклеосомной ДНК, как возможного подхода к исследованию гаханизма позиционирования нуклеосом. Полученная информация могла бы гаюке способствовать лучшему пониманию организации ДНК в нуклеосоме.

Методология работы была ранее подробно описана Недоспасовдм и ¡оавторами . (Nedospasov et ai., 1989). Идея молекулярного слокироваяия нуклеосошой ДНК была впервые использована в ранней )аботе лаборатории Г.П. Георгиева (Чувпило и др. 1982), а затем «зависимо была успешно применена в' ряде зарубежных исследований

[Bock et al. , 1984; Sat'chvell et. al., 1986; Ambrose et al., 1990).

Источником нуклеосом в настоящей работе являлся хроматин из 1' Асцитов периферической крови человека, а также минихромосома sv40 i л.;асоглсскгл модельная система для клеточного хроматина,-на которой

к моменту начала работы ухе были получены обширные экспериментальные данные). Индивидуальные и усредненные характеристик« нуклеосошых ДНК сравнивались с результатами независимого анализа (satchweii et. ai., 1986), которое представляет собой единственное имеющееся в литературе систематическое исследование свойств нуклеосомной ДНК, причем "сырые" экспериментальные данные были предоставлены нам авторама в виде компьютерных файлов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: Настоящая работа является частью исследований, проводимых в ВНК "Экспрессия эукариотических генов" в ражах ГОТО "Геноы человека" в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта.

Конхретныш задачами работы являлось:

- создание клонотеки мононуклеосомшй ДНК человека

- определение нуклеоткдных последовательностей представительной выборки мононуклеосомной ДНК человека

- получение усредненных характеристик последовательностей кононукле о сопкой 2JiK человека и их сравнение с данными других исследовании

- экспериментальная проверка гипотезы Крозорса (shrader ana crothers, IS89), о.том что "случайные" природные нуклеосоыные ДНК слабо различаются по способности образовывать нуклессокз in vitro.

- характеристика полученной коллекции субклонов ДНК геноаа человека поиском гоыологий по базам данных расшифрованных последовательностей, а также по молекулярной гибридизации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСЖАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ: В настоящей работе впервые клонированы и изучены ыонояукдеосомние ДНК из хроматика клеток человека, а также дополнены ранее полученные данные на минихромосоие svio. На основании сравнительного компьютерного анализа уточнены некоторые общие характеристики ДНК в нуклеосомах.

При помоци кошвтерной обработки различных выборок расшифрованных последовательностей мононуклеосоыной ДНК подтверждены обнаруженные ранее (satchwaii et. ai., isae) общие закономерности, которые состоят в периодическом чередовании аа/тт и некоторых других дикуклеотидов с периодом около 10 нуклеотидов. С другой стороны,

выявлены систематические отличия в нуклеосомных ДНК из клеточного хроматина и из вирусной минихромосомы в центральных областях нуклеосом. Интересно, что несмотря на существенные отличия в методике приготовления мононуклеосом и присутствия в наших препаратах хроматина гистона HI, главные усредненные характеристики минимальных нуклеосом совпадают. С другой стороны, расшифровка

ДОПОЛНИТелЬНОЙ ВЫборКИ МОНОНУКЛеоСОМНЫХ ДНК ИЗ МКНИХрОМОСОМЫ SV40,

приготовленных в условиях частичного удаления гистона HI, подтвердила усредненные данные 1984 г. и вновь подчеркнула отличия результатов для центральной области нуклеосомы для клеточного и вирусного хроматина.

При помощи метода сравнительной количественной реконструкции индивидуальных мононуклеосомных ДНК в нуклеосош подтверждена, в целом, гипотеза Шредера и Крозерса о слабом вкладе нуклеотидной последовательности в энергетику образования нуклеосом. С другой стороны, экспериментальные данные по реконструкции некоторых мононуклеосомных ДНК из минихромосомы sv4o ставят под сомнение недавние результаты Вина и соавт. (Ambrose et ai. 1990) относительно закономерностей распределения нуклеосом вдоль ДКК минихромосомы и способствуют построению правильной модели, основанной на экспериментальных данных по молекулярному клонированию.

Проведен анализ коллекции мононуклеосомных ДНК человека с помощью поиска гомология по Сазам данных нуклеотидных последовательностей, а таете прямой гибридизацией некоторых индивидуальных нуклеосомных ДНК с сую,гарной ДНК человека. В результате охарактеризована коллекция коротких молекулярных зондов стандартной длины, которые могут быть применены для различных дальнейших работ по структурной организации хроматина и молекулярной организации генома человека.

В некоторых экспериментах, наряду с диссертантом, принимали участие С.А. Недоспасов, А.Н. Шахов, A.B. Ульянов, Д.В. Купраш и И.М. Гавин.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ. Материалы диссертации были долокены на 2 конференциях:

1. Советско-французском симпозиуме "Организация и экспрессия оукагмотического и прокариотического генома" (Киев, 1990).

2. 1'осетско-германском симпозиуме "Нуклеиново-белковое узнавание:

структурные и фармакологические аспекты" (Ленинград, 1991).

Основное содержание диссертации отражено в 3 печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБ'ЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из обзора литература и экспериментальной части, включающей новые методические разработки, а также собственные результаты и их обсуждение; заключения; выводов и списка цитируемой литературы.

Работа содержит страниц машинописного текста, рисунков, таблица. Библиография включает наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Получение клонотек мононузслеосомной ДНК.

На первом этапе работы получали мононуклеосомну» ДНК человека гомогенного размера. Для этого из лейкоцитов периферической крови выделяли клеточные ядра, гидролизовали их микрококковой нуклеазой, затем растворимый нуклеосоыный хроматин обрабатывали экзонуклеазой их (exo XXI), очищали ДНК и обрабатывали ее si нуклеазой для устранения одноцепочечных концевых фрагментов, образованных действием ехо ш. Хотя примененный протокол не является оптимальным для получения ДНК минимальных мононуклеосом, он отличался относительной простотой и давал разумный выход искомых фрагментов мононуклеосомной длины. Далее, для получения гомогенной фракции ыононуклеосомной ДНК с размером 145+5 пн, применяли фракционирование по размеру ДНК в агарозных или полиакриламидных гелях.

Следующим этапом работы было клонирование мононуклеосомной ДНК в плазмидных векторах (Рис. I). Клонировании проводили в вектор pgeik с помощью синтетических saiGi линкеров (длиной 8 нуклеотидов -ÜGGTCGACC ). Выбор вектора определялся применением на последующей этапе универсальной нетодики секвенирования (см. нике). Кроме того, созыестно с Д.В. Купрашом и A.B. Ульяновым была приготовлена новая клонотека мононуклеосомной ДНК из минихромосом SV40. в этом случае выбор saiGi сайта для клонирования был особенно удачным, так как ДНК sv4o ке имеет участков расщепления этой рестриктазой.

Рисунок I (см. стр. 5). Экспериментальный дизайн работы (получение и анализ оонотеки мононуклеосомной ДНК человека).

хроматин человека

частичным гидролиз МК нуклеазой

гидролиз эндонуклеазой SalGI, дефосфорилирование

обработка ЕхоШ очистка ДНК, присоединение SalGI линкеров, гидролиз SalGI

лигирование

клонотека мононуклеосомной ДНК человека

реконструкция in vitro

компьютерный анализ

2. Отработка простой методики секвенировання.

Методика была отработана в ходе работы по секвенировани» гена -зшмфотоксина (тот-р) кролика (Шахов и др. 1989, зьакь<™ еь ах. аээо). Она состоит в упрощенной схеме приготовления суперспиральной плазгодной ДНК (Карпычев И. Канд. дисс. 1990) и проведении реакций секвенировання по Сэнтеру по протоколу, оптимизированному для отечественных условий (см. Краев, 1990, 1991), но на препаратах денатурированной ДНК. В качестве затравок использовались 2 синтетических олигонуклеотида:

22£ь - 5 '-стсастатас&засассс-з' и 226ь - 5'-ттйссгсасастагасдатас-з'

которые были гомологичны участкам плазмидного вектора рент/4 по обе стороны от полиюшера (Рис. 2), точно также, как это делалось при приготовлении мовонуклеосомной ДНК для реконструкции методом ПЦР (см. кике). На первоначальном этапе синтетические олигонуклеотвды были любезно предоставлены В.Н. Добрыниным (Инст. Биоорган. Химки им. Шемякина), а в последующем заказывались у коммерчески организаций.

-Kpnl-

vtaggtcacactaiacaxtacaccgaartcg?.gctccg3acccggggatccrctagitgtcgacc клошфэ--5аcl- -snal- -xbal-

-SaJI- -spfcl-

ваиная шшонуювосоыная ДНК 1 ggtccacctgcaggcatgcaagcttccggtctccctatactgag

-1 -Psz I- -ffin— ---5'

dill 225L

Рисунок 2. Схема полилинкера (раимз/4) и положения универсальных вектор-специфических олиго- нухлеотвдных затравок для секвенировання и для лолимеразной цепкой реакции (ПЦР).

3. Характеристика представительной выборки индивидуальных мононуклеосомшх ДНК человека и минихромосокы ЗУ4 0.

В ходе раоота были секвенированы вставки различной длины из Солее, чем 100 модануклеосомшх клонов, из которых около 70 клонов

длиной 145 ± 5 п.н. (Рис. 3) были отобраны для дальнейшего анализа с помощью различных компьютерных методов и по реконструкции (см. ниже). Существенно, что компьютерный анализ проводился параллельно получению экспериментальных данных и решение о прекращении накопления первичных данных было основано на том, что увеличение выборки уже не приводило к количественному улучшению усредненных свойств мононуклеосошой ДНК (см. ниже).

Последовательности нуклеотвдов мононуклеосомных клонов из генома человека, изученных в настоящей работе, приведены вместе с некоторыми их характеристиками в Таблице I диссертации и в силу громоздкости не могли быть помещены в автореферат.

4. Статистический анализ нуклеосомных ДНК*, сходства и отличия между различными наборами секвенированныг нуклеосомных ДНК.

Число клонов Воя компьютерная обработка

экспериментальных данных проводилась совместно с A.B. Ульяновым с использованием программ,

разработанных A.B. Ульяновым и P.A. Абагяном.

Приготовление рабочих выборок проводили непосредственно из

первичных данных секвенирования с помощью программ, написанных A.B. Ульяновым для настоящей работы. Поскольку имелось в виду сравнивать -различные выборки (в том числе, полученные в работе других авторов и предоставленных нам в виде текстовых файлов), то первичные

последовательности готовились для выборок одинаковым способом, в частности, в большинстве, случаев они as 125 135 ms 155 165 i?5 симметризо в а л ись относит е л ь но длина вставки, пя ' предполагаемого центра вращательной

Рисунок 3. Распределение симметрии нуклеосоиной ДНК. секвенкрованных моконукле-осомпых ДНК по длинам.

Число клонов

В настоящей работе анализировались следующие выборки:

а. 69 последовательностей мононуклеосомной ДНК из хроматина клеток человека (настоящая работа).

б. 177 последовательностей мононуклеосом из хроматина цыпленка, лишенного гистона Н5 (ЭагсЬуеН et а!. 1985).

в. 55 последовательностей мононуклеосомной ДНК из шнихромосок ЗУ4о, полученных з условиях частичного удаления гистона Н1 (настоящая работа).

г. 116 последовательностей, полученных в 1984 гг. С.А. Недоспасовым, В.В. Кушнировыа и А.Н. Шаховым на основании секвенировання мононуклеосом из минихромосом Э740, содержащих гистон Н1.

5. Частотный анализ.

Размер нуклеоссмной ДНК был выбран равным ровно 145 нуклеотвдов, поэтому последовательности были сначала выровнены по центрам (с таким расчетом, чтоб ось симметрии нуклеосомной ДНК проходила иеиду 72-ым и 73-ти нуклеотвдом), а потом, соответственно, удлиннены или укорочены до 145 нуклеотедов. Весь анализ проводился на симметризованных последовательностях, таким образом, левые и правые "половинки" нуклеосомной ДНК были записаны друг под другом (для правой половины последовательности - комплементарная цепь) и рассматривались как независимые последовательности (тем самым, число строк в расчетных выборках, по сравнению с исходны.',ш, удвоилось). Обоснование правомочности такого подхода выходит за рамки настоящей работы, но оно содержится -в независимом исследовании Абагяна, Ульянова и Недоспасова на 2 независимых выборках нуклеосомных ДНК (данные подготавливаются к печати).

Нами было исследовано поведение всех 10 возможных динуклзогид-шх пар, но для дальнейшего анализа были отобраны только две: аа/тт и ее, которые имели наиболее яркие ..характеристики. Считается, что наличие аа/тт характеризует взаимодействие ДНК с белком по малой бороздке, а сс - по большой. На основании анализа распределения частот динуклеотидов /рис. 4) можно сделать вывод о том, что такая периодичность уверенно выявляется, несмотря на то, что последовательности не "выравнивались" друг относительно друга, а точность определения положения нуклеосокы не превышает +2 нуклестидов.

6. Получение усредненных характеристик последовательностей мононуклеосомкой ДНК человека и их сравнение с данными других исследований.

На рисунке 4 представлены распределения частоты встречаемости динуклеотвдов аа/от для 4 выборок нуклеосомных ДНК. две из которых были известны к моменту начала диссертационной работы, а две других - получены в ходе этой работы. На этом рисунке представлены данные по всем четырем выборкам, а также по "об'единенной" выборке нуклеосом SV40. Как видно из рисунка 4, обе выборки клеточного хроматина (из лейкоцитов человека и эритроцитов цыпленка - левая верхняя и левая центральная диаграммы) показывают удивительное сходство в частотах встречаемости нукпеотвдов в определенных положениях ДНК, отсчитанных от оси симметрии. Обращают на себя внимание 5 периодических пика на концевых участках (с периодом около 10-10.5 нуклеогидов), глубокий провал на расстоянии 20-22 нуклеотидов от оси симметрии и смена фазы на противоположную в центральной области (так что на диаде расположен пик АА/ТТ). Последнее обстоятельство как будто противоречит твердо установленному факту, что в районе оси симметрии нуклеосомы гистоновый октамер взаимодействует с ДНК по большой бороздке, и следуя "правилам Траверса" (Travers, Х989) в центре должен наблюдаться минимум для АА/ТТ и максимум для gc динуклеотида. Таким образом, этот парадокс, который по-видимому отражает изменение хода или шага двойной спирали ДНК в центральной области нуклеосомы, воспроизведен в независимом исследовании и должен учитываться при построении модели нуклеосомы с высоким разрешениен.

С другой стороны, обе выборки SV40 (правая верхняя и правая центральная диаграммы) схожи между собой (хотя в одном случае из минихромосом был частично или полностью удален гистон HI, что могло способствоать перераспределению нуклеосом). При этом они достоверно отличаются от "клеточного" хроматина в центральной области. В случае "вирусных" мононуклеосом в центре симметрии располагается пик встречаемости АА/ТТ, и таким образом периодичности находятся в противофазе с "клеточными" выборками (для наглядности диаграмма для усредненной выборки svîo помещена также в левов нижнем углу под соответствующими диаграммами для двух "клеточных" выборок). Наша

-ia *еэ -«o i* -л> -яв -» - «мала/«*-«*/«ы>

-«> >«ú -w -w

Рисунок 4 (см. стр. 10). Сравнение периодичности появления АА/ТТ динуклеотидов в различных выборках нуклеосомной ДНК.

интерпретация полученных сравнительных данных приведена в заключительной части.

Следует подчеркнуть, что в работе лаборатории Траверса (satchveii et ai. 19S6) сообщалось, что целый ряд динуклеотидов имеет характеристические модуляции с периодом около 10 нуклеотидов. Тщательный анализ "сырых" данных лаборатории Траверса показал, что в действительности только аа/тт и gc динуклеотады имеют статистически достоверные модуляции (Абагян, Ульянов а Недоспасов, данные подготавливается к печати).

С точки зрения величины амплитуд найденных модуляций, выборка мононуклеосомных ДНК, охарактеризованная в этой работе, была сравнимой с такозой для динуклеотидов аа/тт в выборке лаборатории Траверса, но была заметно ниже для динуклеотида ас. Причины' этого расхождения до конца не поняты.

6. Сравнительная реконструкция нуклеосом из индивидуальных мононуклеосомных ДНК.

Условия реконструкции были отработаны совместно с И.М. Гавинкм. Для реконструкции наш разработана усовершенствованная методика, схема который представлена на ркс. 7. Она основана на работе Д.В. Купраша и С.А. Недоспасова (19Э2) по изучению изгибания ДНК в местах связывания транскрипционных Факторов. Вставки индивидуальных клонов амплифкцировали с помощью лолкмеразлоЯ цепной реакции (ПЦР)(saiki et. ai., 1988), используя в качестве затравок универсальные вектор-епецифическиз олкгонуклеотиды, фланкирувдий полилинкер (те ке олигонуклеотиды, l 225 и l 22s, которые использовались при секвенированшО- ПНР проводили в присутствии меченных нуклеотидтрифссфатсв, что позволяло получить меченные ДНК гомогенной длины, соответствующие размеру клонированной нуклеосомной ДНК, но удлиненные на суммарный размер полилинкера и двух олигонуклеотидов-затравок. После обработки рестриктазой по сайту клонирования (в нашем случае - saici) и si нуклеазой. которая удаляет одноцепочечные концы, образуются фрагменты меченной ДНК длиной около 150 п.п., которые идеально подходят для реконструкции нуклеосом.

Клонированная Клонированная искусственная

мононуклеосомная ДНК реперная ДНК

ПЦР с меченными дНТФ

Реконструкция

нуклеосом

Анализ в нуклеопротеиновом геле

Нуклеосома ДНК

Количественный анализ по радиоактивности

Рисунок 5 (см. стр.12). Схема получение меченных мононуклеосомных

ДНК для реконструкции при помощи ПНР.

Поскольку параллельно проводился анализ клонированных мононуклеосом из минихромосомы SV4 0, то были проведены сравнительные опыты по реконструкции на фрагментах, амплифицирозанных от универсальных • плазмидных затравок и от Будо-специфических олигонуклеотвдов на матрице вирусной ДНК (и соответствующих тем же положениям нуклеосом на матрице вирусной ДНК). Была показана воспроизводимость результатов - реконструкции, на основании эффективности которой вычислялись энергетические характеристики нуклеосом. Хотя мы не обнаружили заметных изменений в эффективности реконструкции от небольшой вариации в длине мононуклеосомной ДНК за счет концевых участков, во всех экспериментах дополнительные концевые фрагменты ДНК удалялись, как это описано выкв.

Поскольку реконструкция нуклеосом не относится к разряду легко воспроизводим« процедур, во всех опытах по реконструкции в качестве внутренних контролем использовались аналогично приготовленные клонированные репэрные последовательностями (искусственные нуклеосомнке ДНК), детально изученные в лаборатории Крозерса.

В частности, использовались 2 клонированные последовательности: "tg" - содеркадая в своем составе (tcggtgttagagcctctaa)5 и "tr-5" -содержащая (tcggaagacttgtcaactgt)s. Первая последовательность является "идеальной" кононуклеосомной ДНК к по своим реконструкционики свойствам (сродству к гистоновому октамеру в стандартных условиях) значительно превосходит все природные, в том числе "сильные" нуклеосомн (Shrader and Crothers, 1989).

После реконструкции комплекс ДНК с пистонами (реконструированная нуклеосома) хорошо отделялся от свободной меченной ДНК при низкоионном электрофорезе в 8* полиаярилаыздном геле. Гель высушивался и подвергался количественному анализу по радиоактивности, который был проведен тремя различными методами. Результаты прямого анализа радиоактивности с помощь» установки ambis приведены в Таблице. Эффективность реконструкции определялась долей кзченной ДНК, переведшей из свободного состояния в комплекс с гистонами.

Из Таблицы, в частности, видно, что пр1фодше нуклеосомкые ДНК

по реконструкционному свойству значительно уступают "идеальной" нуклеосоыы "тс, и некоторые из них реконструируется значительно эффективнее чем "тл-б" (в первую очередь, клон 23 и 3, а также 7, 22 , 29 , 31 ), с другой стороны, клоны 5, 6, II и некоторые другие содержат последовательности с "еще меньшим, чем у "гн-5" сродством к гистонам. Интересно, что природная нуклеосомная ДНК 23 обладающая наибольшим сродством к гистонам, имеет несколько А/Т содержащих триплетов, встречающихся через 10 - II нуклеотидов, что напоминает одно из свойств "идеальной" нуклеосомной ДНК "тс.

На основании десятков положительных экспериментов (в которых соотношения между эффективностью образования нуклеосом те и тя-5 колебалась в пределах 10-15) точность количественной реконструкции оценена нами в 20%. На основании данных по количественной реконструкции, эффективность которой нормализовалась к таковой для реперной нуклеосомы те, и следуя методу, предложенному Крозерсоы. были рассчитаны свободные энергии индивидуальных нуклеосом.

Клон Эффективность Свободная энергия реконструкции (ккал/моль)

27 0.20 1735

18 0.22 1661

1 0 .29 1496

48 0.30 1492

56 0.40 1307

24 0.42 1285

13 0.52 1152

15 0.53 1141

23 0.69 989

3 0.72 959

"ТС 3.57 0

11ТК» 0.29 1504

Таблица. Сравнительные реконструкционные и энергетические характеристики некоторых мононуклеосомных ДНК.

В согласии с данными Крозерса н соавторов мы нашли, что все проанализированные нами природные мононуклеосомные ДНК слабо различаются по способности образовывать нуклеосош з стандартных условиях реконструкции. Тем самым, свободные энергии природных нуклеосом значительно превосходят такоыую для "идеальной" нуклеосош TG. с другой стороны, в наией выборке нашлись последовательности, которые имеют- больнее сродство к гистонам, чем другая, "слабая" реперная последовательность TR-S (Shrader and Crothers, 1989).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Осноеной вопрос, на который долкны были ответить эксперименты выполненные в рамках этой работы, касается тех особенностей ДНК, которые позволяют ей эффективно входить в состав нуклессои in viro и in vitro. Следует иметь в виду, что хотя изолированные из хроматина нуклеосош могут моделировать комплексы, образованные in viro, условия их получения таковы, что гистош, по-вздимому, успевают перераспределиться и занять энергетически наиболее выгодное положение на ДНК, восмэжю, "по соседству" с исходным. В этом смысле представляется корректным сравнение их с нухлеоссмаки, образованными in vitro, в условиях, которые прдполег&чт достижение термодинамического равновесия.

Обнаруженные периодические вариации во встречаемости некоторых дикухлзотидоз (которые впервые были замечены в работах лаборатории Траверса) свидетельствую? в пользу того, что по крайней мере один "сигнал" к зффекткзкоцу с^раЕОБЕК.пз нуклеосош (так называемое "вращательное лозициснирозаниз") находится ВНУТРИ нуклеосомной ДНК. Второй вид сигнала - трансляционный - таюте нокет происходить из внутренней последовательности нуклеосомной ДНК, за счет изменекий в информации ДНК в центральной области нуклеосош. Эти изменения (которые для простоты можно считать изломами) будут предпочтительно происходить на определенных, склонных к изломам последовательностях.

Тот неожиданный факт, что две группы нуклеосомных последовательностей ("клеточные" и "вирусные" выборки) достоверно отличаются в районе оси симметрии, мы интерпретируем з соответствии с представлениями, сформулированными Крозерсом - если в клеточном хроматине на концевых участках нуклеосом имеатся последовательности,

удовлетворяющие "правилам Траверса", то образующаяся на них нуклеосома достаточна стабильна уже за счет только этих участков. Наооборот, последовательности ДНК бу4о, которые кодируют белки во всех возможных рамках и находятся под специфическим селективным "давлением", не позволявдим им менять последовательности нуклеогидов в пользу более прочной структуры хроматина, это свойство не реализуется. В этом смысле, нуклеосомы зу4о - более слабые и проявляют меньшую избирательность к позиционированию на ДНК (это подтверждается независимыми экспериментальными данными), . что, по-видимому, позволяет им легче перемещаться вдоль ДНК в ходе таких процессов как транскрипция и репликация. "Суммарные" нуклеосомы из клеточного хроматина в своем большинстве соответствуют некодирующим участкам генома, которые лишены этого селективного давления и могут эволюционировать в направлении более стабильной структуры хроматина.

Что касается распределения нуклеосом вдоль ДНК минихромосомы о, то мы предполагаем, что специфическое их расположение в регуляторной области (в частности, образование безнуклеосомного участка) определяется "внешними" по отношению к нуклеосоме силами, скорее всего за счет высокоаффинных взаимодействий других белков, которые косвенно влияют на расположение нуклеосом. Наши данные свидетельствуют против представлений Вина и соавторов, о том, что некоторые участки генома зу40 имеют особенно большое сродство к нуклеосомам и поэтому некоторые "сильные" позиции отражаются в результатах молекулярного клонирования мононуклеосомной ДНК.

ВЫВОДЫ:

1. Получена и охарактеризована клонотека, мононуклеосомной • ДНК человека в плазьшдном векторе, которая может быть использована для дальнейших работ по изучению хроматина и молекулярной организации генома.

2. Изучены статистические свойства секвенированных ДНК мононуклеосом и подтверждены общие закономерности, главные из которых - модуляции частот встречаемости аа/тт динуклеотидов по длине нуклеосомы с периодом около 10 нуклеотидов - качественно согласуются с

результатами Кембриджской группы и, в частности, подтверждают измененную конфорыацию ДНК в районе диады.

3. Получены дополнительные данные по статистическим свойствам мононуклеосомной ДНК из ¡шнихромосомы sv4о, которые, во-первых, согласуются с данными проведенного ранее независимого исследования, во-вторых, выявляют достоверные отличия меиду клеточным и вирусным хроматином в свойствах ДНК в районе оси симметрии нуклеосомы, и в-третьих, показывают, что удаление гистона HI из хроматина не изменяет обнаруженных свойств ДНК минимальных мононуклеосом.

4. Впервые проведено систематическое исследование реконструкции случайного набора нукпеосомных ДНК и получены их индивидуальные энергетические характеристики. В целом, подтверждены выводы Крозерса и сотрудников полученные на. нескольких искусственных и природных нуклеоссыных послодовательностях.

5. Данные по реконструкции мононуклеосом на последовательностях из регуляторных участков минихромосомы s 74 о не согласуются с опубликованвыеми данными Екна и сотрудников об организации нуклеосом на минихромосоме и .предполагают другую интерпретацию результатов молекулярного клонирования.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Азизов'М.М., Ульянов A.B., Купрап Д.В., Иахов А.Н., Гавин ИЛ.!., Недоспасов С. А. Получение и характеристики клонотеки мононуклеоссмпой ДНК из хроматина клеток человека и ее использование для изучение сродства нузслеосошой ДНК к гистонам. Доклады Академии Наук СССР т. 322, п2, с. 415-420 (1992).

2. Недоспасов С.А., Азизов M. М., Купраш Д.В., Шахов А.Н., Гавин й.М., Абагян P.A., Ульянов A.B. Особенности нуклеотидных последовательностей клонированных мононуклеосомных ДНК и анализ реконструкции нуклеосом. Материалы советско - германского симпозиума "Нуклеиново-белковое узнавание. Структурные и фармакологические аспекты". Ленинград, 1991.

Методика "двухцепочечного" секвенирования ДНК от вектор -специфических затравок отработана и опубликована в работе:

3. Shakhov A.N., Xuprash D.V., Azizor M.M., Jongeneel C.V.,

Nedospasov s.A. Structural analysis of the rabbit TNF locus, containing the genes encoding TNF-/3 ( lymphotoxin ) and TNF-a (tumor necrosis factor ). Gene, 1990, 95, 2, 215 - 222.