Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные изменения хроматина гена дрозофилы БТШ-70 при транскрипции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурные изменения хроматина гена дрозофилы БТШ-70 при транскрипции"

АМДШШ МУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ игл. В.А.Енгельгардта

На правах рукописи

НАЧЕВА Геновева Атанасова

УДК 577.214.3

СТРУЮТНШЕ ИЖЕНЕШЯ ХРОМАТИНА. ГЕБА ДРОЗОФИЛЫ " БТШ - 70 ПРИ ТРАНСКРИПЦИИ

03.00.03 - Молекулярная бпологая

Авто-реферат дессертацш на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии АН СССР

Научный руководитель: ... . .....

акадешк АН СССР, доктор химических наук А.Д.Мирзабеков старший научный сотрудник, кавдвдат биологических наук В.Л.Карпов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С.В.Разин кандидат биологических наук А.М.Колчинский

Ведущая организация - Ыежфакуяьтетская проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии, и биоорга-нзческой химии им. А.Н. Белозерского, МГУ.

в .... часов на заседании специализированного совета

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии Ail СССР.

Защита диссертации состоится

при Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу: 117984 г.Москва, В-334, ул. Вавилова, 32,

1988г,

Ученый секретарь специализированного совета • кандидат химических наук

- .»квлчиг»«»**»*^

кмгтя>2а*|

£»"/. .-Л- : '.

''* Актуальность проблемы. Вопрос о структурных изменениях в

с.;1ез£ГП

хвдадаина, транскрибируемом РНК-полнмеразой, является наиболее дис-

^ку^шйшпрл в настоящее время. Сам факт структурных перестроек ни у кого ие вызывает сомнения, однако характер этих изменений до сих пор мало изучен* Как уже давно известно, ДНК.в составе хроматина упакована в сложный нуклеопротеидный комплекс, центральны?.! звеном которого является нуклеосома. Нуклеосома - структура удивительно стабильная в эволюционном смысле, вместе с тем является высокопластичным комплексом, способным модулировать свою конбормацшо, включая в свой состав варианты глстонов, Шб - белки и низкомолекулирше лиганды, изменяя свою структуру в зависимости от степени компактизации хроматина. Такие конфирмационные варианты нуклеосом могут играть значительную роль в матричной активности различных участков генома. Гистоновый октамер, выполняющий на персвый взгляд простую функции сворачивания ДНК, представляет собой чрезвычайно слогашй, многокомпонентный комплекс, структура которого тонко отрегулирована для выполнения целого ряда уункций. Кажущаяся монотонность упаковки ДНК в хроматине в горячих точках транскрипции нарушается, хроматин разворачивается и становится доступным для действия целого ряда ферментов. Нуклеосома в этих районах претерпевает ряд структурных переходов и при сохранении всех основных ее составляющих элементов значительно меняет характер взаимодействия с ДНК. Динамика перехода "нормальной" нуклеосош в "активную" практически не изучена. Сложность изучения таких динамических переходов в нуклеосоме обусловлена их нестабильностью, что выражается в быстром переходе структуры нуклеосом из "активной" формы в "неактивную" после снятия таких стабилизирующих факторов, как, например, торзионный стресс, присутствие молекул ИЖ-полимераза или других негпстоновнх белков.

Цель работы. В настоящей работе была поставлена задача, используя разработанный наш комбинированный метод пришивки гистонов к

ДНК, исследовать характер структурных изменений в хроматине при транскрипции, на примере активированного гена белка теплового . шока (бтш-70 )дрозофилц.

Научная новизна и практическая ценность работа. С целью изучения содернагаш гистонов в хроматине различных участков активированного гена бтш-70. был разработан комбинированный метод пришивки гистонов к ДНК, заключающийся в применении метода гибрвдизацаи с "белковыми тенями" с предварительной фиксацией нативных ядер §ор-мальдещцом. При применении двух разных протоколов пришивки, фиксирующих более узкий или более широкий спектр контактов гистонов с ДНК, были получены экспериментальные результаты, на основании которых ш предполагаем, что хроматин в актпвнотранскрибируешх районах претерпевает ряд структурных переходов, выражающихся в ослаблении контактов ДИК с глобулярной частью гистонов. При этом во вреди транскрипции гастонн остаются связанными с ДНК и в этих взаимодействиях между гиотонами и ДГО могут принимать участие и и - концевые фрагменты гистонов, что существенно облегча.ет движение молекулы НК-полимеразы.

При исследовании домена активирова1Шого гена бтш-70 было показано, что эййект изменения контактов взаимодействия ыекду питонами и ДНК распространяется такке на 3' прилегающую нетранскрибируе-ыую область гет. Обнарукеш два района гена не связанные с гисто-нами - это Б' промоторная область, с которой, как т предполагаем, во время транскрипции связаны регуляторные негистоновне белки и короткий зонд в 3' конце гена, который находится примерно в районе тершнации транскрипции. '-1

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы /169 ссылок/. Работа изложена на 73 страницах шпшгосшсного текста, содержит б рисунков.

- 3 -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ . ■ Характеристика метода гибридизации о "белковыми тонями* с предварительной бикоацией йо»альдегидом

Комбинированный метод пришивки гистои'ов к ДНК был разработан на основе метода гибридизации с "белковыми тенямип/кагрог et пг , 1984/ с предварительной фиксацией кативши ядер форпальдегидом.

. Ядра фиксировали сразу после выделения до полной фиксации гистонов. Другими авторами тоже показано,'что в тех же сашх условиях /1% формальдегид, 18-24 часа инкубации при О*С/, происходи! полная (фиксация нуклеосомной структуры /Feldman ,1973, s^well et 'al, 1984/.

Формальдегидная фиксация не приводит к нарушению структуры хроматина. Показано, что при этом не меняется размер нуклеосомной ДИК и сохраняется луклеосомннй повтор Мельникова и др. ,1980/, Экспериментальным уактом является л то, что пришивка формальдегидом имеет нулевую длину, т.е. к ДИК пришиваются только те белки, которые в момент реакции прямо взаимодействуют? с ней /Solomon and Varshavsky >1985/.

Установлено, что при (Таксации хроматина 1% формальдегидом при О*С за 24 часа образуется одна формальдегидная пришвка на две пара оснований или одна формальдегидная пришивка на 15 амино-кислотшх остатков/ürutlag et al« 1959/. Химия этих пришивок недостаточно хорошо изучена. Известно, что реакция формальдегида с белками, ДНК или РНК приводит к образованию метиленовнх произвол-ннх,. которые дают ковалентше белок-белко^не, белок-ДНК и белок-Ш СШИВ1Ш /Teldman. 1973/.

Далее белки пришивались к ДНК непосредственно в фиксированиях ядрах. Сшивание осуществлялось путем образования альдиминной связи между близлежащими функциональным группами гистонов и альдегидными группами частично апуринизованно'й ДИК, которые возникли

после предварительного метилирования пуриновых оснований диметил-сульфатом Aevina et al,1981; shick et al , 1980/. В основном реакция происходит в месте йонного взаимодействия положительно заряженных имвдазольных групп гистидинов илн £- аминогрупп лизинов с фосфатными группами ДНК, Процесс сопровоадается расщеплением ДНК в месте пришивки и связыванием 5'-концевого фрагмента о молекулой белка, а также существенной фрагментацией ДНК по апуриновым сайтам, не участвующим в пришивке. И фрагментирование ДНК, и пришивка происходят статистически по всей длине ДНК по адениловым и . гуатшловш остаткам.

Чтойд провести дальнейшие процедуры очистки и обогащения пришитого комплекса, было необходимо разрушить формальдегидную фиксацию. Ковалентдая $ормальдегидная пришивка очень стабильна. Пришитые комплексы хотя и не дессоциируют под действием таких детергентов какца - ДДС, саркозинат и в растворах с высокой йонной силой /Brutlag . lS69,¥eldman . 1973» Sewell et al, 1984/, но ОНИ термочувствительны и разрушаются при нагревании /Jackson, 1978/. Используя это свойство,мы расшивали формальдегидную пришивку до полного исчезновения белковых дилеров.

Во время этой процедуры разрушались как белок-белковые,так и белок-ДНК сшивки. Расшивание проводили в растворе высокой концентрации соли, чтобы сохранить нативнув структуру ДНК, необходимую для очистки материала от свободных белков на градиенте Сб01 .

Несмотря на то, что расшивание.формальдегидной пришивки происходит в присутствии достаточно высокой концентраций аминов, мы экспериментально проверили возможность вторичной придгавкн свободных белков к новоапурдндзованноЁ ДНК. В реакционную смесь, во время расшивания, была доставлена меченая радиоактивным фосфором ДНК, с которой заранее были проведены все процедуры формальдегидной йик-. сации, метилирования и апуршшзацин. Дальше, в двух вариантах - с

удалением и без.удаления свободной ДНК фенолом/хлороформом, пробы разделяли двумерным гельэлектрофорезом. Б результате, даже после длительного экспонирования гелей, диагональ, соответствующую пришитым гистонам, внявить не удалось/см. ниже описания двумерного электрофореза/. Этот эксперимент доказывает, что во время расшивания форыальдегвдной пришивки. вторичная артефактная сшивка свободных белков с ДНК не происходит.

После очистки и обогащения пришитне комплексы разделяли в системе двумерного диагонального гельэлектро^ореза / зил et а1, 1980/ /рис.1/. Б первом направлении в денатурирующих условиях разделяются фрагменты свободной ДНК и ДНК, связанной с гистонавд, которые уменьшают ее подвижность. Затем гистоны гидролизуются прямо в геле проназой и проводится электрофорез во втором направлении свободной от белков ДНК. Фрагменты свободной ДНК /которые не удаляются полностью при фенольной экстракции/ двигаются и зз первом и во втором направлении в соответствии только с их размерами и образуют одну диагональ. 1. Фрагменты, которые в первом направлении были связаны с коровнми гистонами, после второго направления дают отдельную диагональ 2. Фрагменты, связанные с молекулой гистона 111, который еще' сильнее уменьшает подвижность ДНК в первом направлении, дают диагональ 3. Таким образом, хотя эти диагонали содержат лишь свободную от белков ДНК, онн являются как бы "белковыми тенями", потому что положение диагоналвй отражает размеры пришитых к ДНК белков.. . .

Бо втором направлений в дорожку наносили маркерную ДНК-5-7мкг того же самого материала, который разделяли на двумерном электрофорезе, но для которого не была проведена процедура удаления свободной ДШ( фенолом/хлороформом. Количество нанесенной маркерной ДНК примерно составляло 2-Ъ% от количества тотальной ДНК, используемой для одного двумерного электрофореза, что соответствует сте-

гистон H1 шч>оьые гнстош пнршсз

о—

О*""

О

О"

Q0

и ДНК

: I-

IJUüi прмтгфя и петомч Н1 iMtm пеллимга и ищущий гкстйяь«

2 3

3. непрмшитвл ДНИ

Рис.1 Схема двумерного диагонального электрофореза сшитых ДНК-гистоновшс комплексов.

Направления электрофореза обозначены стрелками. Фрагменты свободной ДИК, которые в обоих направлениях двигаются в сответствии с их размерами, размещаются на одной .диагонали-3. Фрагменты, которые в первом направлении были связаны с кор-гистонами, после второго направления даит отдельную диагоналъ-2, Фрагменты, связашше с молекулой гисто-на Н1, который еще сильнее уменьшает подвижность Д1Ш в первом направлении, дают дпагональ-1.

- 7 -

пени пришивки гистонов к ДНК суммарного.хроматина.

После двумерного электрофореза ДНК с геля переносили электро-#орвтическл на нейлоновую мембрану нуъопа-н и затем последовательно гибридиэовали с высокомеченными ^Р зовдами,'клонированными в векторе Ы 13, После гибридизации с различными зондам сравнивали и оценивали интенсивность гистоновых диагоналей и маркерной ДНК с помощью одномерного сканирования радиоавтографов в горизонтальном направлении. В этом случае соотношение интенсивности гибридизации пришитой и маркерной ДНК на одном и том ке фильтре будет отражать степени пришивки гистонов для кавдой индивидуальной последовательности ДНК.

Последовательная гибридизация одного и того же фильтра позволяет сравнить содержание гистонов на различных участках хроматина в одном и том же эксперименте после фиксации структуры хроматина непосредственно в ядре.

Процедуры получения пришитого комплекса довольно длителыш. Неизбежно возникает вопрос," не происходит ли па каком-либо этапе фракционирование или перераспределение специфических последовательностей ДНК. Для ответа на поставленный вопрос мн провели следующий эксперимент.

На каждом этапе обработки материала /выделение ядра,удаление свободных белков на градиенте СзС1 и удаление свободной ДНК фенолом 'хлороформом/ ми отбирали аликвоту, содержащую 0,5-1 А2(зо ед. ДНК, проводили одномерный Яа-ДДС гельэлектрофорез в системе Лэммли и ДНК переносит эл^трофоретически на нейлоновую мембрану. Мембрану гибридизовали последовательно с теш же самыми мечеными зондами и сравнивали интенсивность отдельных дорожек мезду собой сканированием. В результате такого эксперимента существенного обогащения или удаления специфических последовательностей, которое могло бн сказаться на интерпретации конечных результатов выявлено не было.

- 8 -

Исследованные районы гена бтш-70

Геш белков теплового шока представляют собой удобную систему для изучения структурных изменений, происходящих в хроматине при транскрипции. При повышении температуры с 25'С до 37*С в эмбрионах дрозофилы, в выделенных тканях, в культуре клеток, происходит инги-бированпе транскрипции большинства генов и быстрая активация нескольких новых генов, кодирующих белей теплового шока. К таким же изменениям могут приводить не только изменения температуры, но и другие неблагоприятные воздействия, например, анаэробные условия, присутствие йонов тяжелых металлов, респираторных ядов и др.Ash-burner and Bonner 1979/.

У дрозофилы при тепловом шоке образуются семь различных белков с молекулярным весом 22000, 23000, 26000, 27000, 6ВД00, 70000 и 84000. Гены, кодирующие зти белки, проклонированы, для них определена нуклеотидная последовательность структурной части и регуля-торных областей.

В нашей работе мы исследовали содержание гистонов в активированном гене, продуцирующим белок теплового шока с молекулярным весом 70000 /бтш-70/.

Ген бтш-70 представлен в гаплоидном геноме пятью копиями, две из них расположены в локусе 87А и имеют противоположную ориентацию, остальные три - в локусе 87С и ориентированы в одну сторону/Hoim-йгеп et al 1979/.

На рисунке 3 показаны участи гена бтш-70 из локуса 87А,которые были использованы в нашей работе:

Участок А/5' бтш-70/,присутствует только в генах локуса 87А. Он располагается на расстоянии 16 п.н. от начала транскрипции /к arch et al, 1Э81/внутри участка, гиперчувствительного к ДНК-азе1 /ии ,1980/ и содеркащего регуляторше последовательности /Pelhaaf

1982/. Участок вырезан по сайтам xha-sal и имеет длину 177 п.н.

Участок Б содержит структурную часть гена длиной в 900 п.н. Эта область между рестриктиыми сайтами Ban 111-Sal имеется во всех пяти генах бпи-70.

Участок Б содержит район в 3* конце гена, находящийся за транскрибируемой областью. Он лежит между рестриктннми сайтами Xho и Sal и тлеет длину около 200 п.н. Участок уникален- содержится только в одном гене локуса 87А.

Участок Г находится между рестриктннми сайтами SalH и1 и имеет длину около 1500 п.н. Содержится только в одном гене локуса 87Л.

Для сравнения исследовали структуру хроматина нетранскриби-руемых районов. При этом использовали плазмвду к15/Колчинский и др. 1982/, содержащую С70 п.н. из вставки II тина рибосомадышх генов дрозофилы, которая повторяется в геноме 35 раз и практически не транскрибируется /1-2 транскрппта на клетку/Tararich and Miller , 1984/.

Содержание гпстонов в кодирующей области гена бтш-70

При гибридизации ДНК двумерных гелей с пробой, содержащей ДИК нетранскрибируемой вставки рибосомального гена, обнаруживается присутствие трех диагоналей - свободной ДНК, ДНК, которая была связана с гистонами кор-нуклеосомы и с гистоном HI /рис.2/. Картина в целом совпадает как в экспериментах с восстановлением боргид-ридом натрия, так и в экспериментах с восстановлением цианборгнд-ридом натрия. Отношение интепсивности диагоналей коровнх гпстонов или гистона HI к интенсивности маркерной ДНК принимается наш за стандарт, соответствующий содержанию гистонов в транскрипциошю неактивном хроматине.

В экспериментах с восстановлением бор,гидридом натрия картина

гибридизации с транскрибируемой областью.гена бтш-70 выявляет существенное уменьшение интенсивности диагоналей коровых гистонов и гистона Ш /рис.2/, по отношению к интенсивности маркерной ДНК. Суммарные данные сканирования всех проведенных экспериментов, представленные на рис.2, указывают на то, что только 25г40$ из всего коли- • чества коровых гистонов и 25-35% от количества гистона Hi /которые присутствуют в нетранскрибируемом хроматине/ сохраняют способность пришиваться к ДНК в боргидрвдном протоколе пришивки.

Эти результаты отличаются от результатов, полученных при применении цианборгидрнда натрия. В этом случае степень пришивки коровых гистонов и гистона III в неактивном районе хроматит и в активном хроматине гена бтш-70 совпадают. Об этом говорит одинаковая интенсивность диагоналЕй коровых гистонов и гистона 111 при гибридизации с нетранскрибируемой рибосоыальной вставкой и с кодирующим районом гена бтш-70 /рис,2/.

Результаты экспериментов указывают на то, что гистоны в актив-нотранскрибируемых районах хроматина сохраняют связь с ДНК и находятся в таком ке количестве, как и в нетранскрибируемых.

Чтобы объяышть различия в результатах, полученных при сшивании белков с ДНК по борищвдному и цианборгидридному протоколу, нужно рассмотреть химические реакции, происходящие во время сшивки. В процессе образования ковалентных аддуктов между альдегидаиш дезо-ксирибоз в апуриновых сайтах метилированной ДНК участвуют в основном имидазольше группы гистидинов и аминогруппы лизинов,Восстановление боргидридом натрия /после длительной процедуры апуриниза-ции метилированной ДНК, во вреди которой происходит образование ковалентных аддуктов /дает сшивки с многократным преимуществом гистидинов над лизинами /Ebralidse et al ,1988/. Этот факт объясняется тем, что равновесие в реакции образования оснований Иис$а с лизино-виш остатками сдвивдто в сторону исходных соединений, а в реакции

NqBHa

-11 Пробы

Промотор «тш-ТО

NoBH3CN

-5С0 -350

-150

/

Активный * роматин

• .л?

X'- / /

Неантивный хроматин

/

5

1 2 3

Данные онанировании

МоВН4 NaEHjCM

kop H1 % HOP HI %

too 100 неантивный хроматин 100 100

25-А0 20-35 активный хроматин 100 100

5-10 5 промотор 5-10 5

VHi-пришитвч ДНИ

2-ДНН пришитая н к носовым гистон*«

, ДИН пришит«* н З'гистону HI

¿-мярк'рн«* ДНН

Рис.2 Двумерный электрофорез спитых ДНК-гистоновых комплексов

/слева - по йоргидрпддаму протоколу, справа - по щтшгбор-гидридному протоколу/,выделенных из клеток дрозофилы,подвергнутых тепловоз шоку. ДНК перенесена на нейлоновую мембрану Нуbond-ми последовательно гибридизована с высокоме-ченныш зоццагли, содерз'ащими 5',-промоторную область гена бтш-70 и нетранскрибируемую вставку типа II рибосомалышх генов. На верхней правой фотографии ухсазано положите при электрофорезе во 2м направлении однонитевых фрагментов ДНК длиной 150 , 350 и GOO нуклеотидов. В таблице указаны еда,гарные данные сканирования радиоавтографов.

с имидазолами гистцдшюв равновесие сдвинуто в сторону продуктов реакции. Стабилизация адцуктов восстановлением, если она происходит практически одновременно с их образованием /т.е.в присутствия восстановителя - по цианборгидридаому протоколу/ будет мало влиять на выход сшивок ДНК с белком через гиствдины и многократно увеличивать выход сшивок через лизшш. Краткая инкубация с восстановителем /по боргидридноыу протоколу/ после образования ДНК-гистидино-вых аддуктов и образования-распада ДНК-лизииовых аддуктов фиксирует практически все образовавшиеся в ходе инкубации аддукты первого . типа и небольшое число сохранившихся к моменту восстановления аддуктов второго типа. Тагам образом мошю сказать, что при применении боргидрвда натрия с ДЗШ сшиваются в основном гиствдины, а при применении цианборгндрида натрия - болыиая часть сшивок происходит через лизшш /что соответствует большому преобладанию лизинов над гпстидинами во всех гистонах/.

Этот вывод подтверждается и при изучении наборов нуклеопоптид-

ш контактов при пришивании ио цианборгццридному. и боргццрэдному

протоколу, проведенному в нашей лаборатории. Методика по,пучения

пришитых цуклеопептидов описана в работе Эбралидзе и соавторов

/кЬгаНйее ег а1,1980/, Гистош пришивали к ДНК в ввделешшх НУК-

леосомах или в нативных ядрах по опксашюыу упе боргидридному и ци-

анборгидридноыу протоколу. Исчерпывающий гидролиз микрококковой

нуклеазой приводит к получению из пришитого комплекса белка и сши-

ЧР

того с ним динуклеотвда. После введения Р-метки при помощи кина-зи, проводили исчерпывающий триисшюлиз, и полученные таким образом меченые нуклеопептиды разделяли электрофоретически,- Гель-злектрофо-ретическое картировшше меченых нуклеопептидов является фактически картированием мест пришивки гистонов к ДНК. Сравнение полученных нуклеопеитидтк "карт" выявляет существенные различия в наборах контактов пептидов при применении боргидридной и цианборгидридной

фиксации. При этом нуклеопептидные "карты", полученные при пришивке по цнанборгидридному протоколу, содержат и те пептиды, которые входят в нуклеопепиурше "карты", полученные по боргидридному протоколу.

Поскольку гистидиновые остатки содеркатся в глобулярных районах гистонов кор-частиц и гистона Н1, из полученных результатов следует, что боргвдрид натрия фиксирует только взаимодействия глобулярных частей гистонов с ДНК, а. цианборгидрид натрия фиксирует взаимодействия на всем протяжении молекул гистонов с ДНК. Эксперименты по каадому из протоколов сшпзки с последующим ограничешшм протеолизом подтверждают этот вывод коллчествено. Посла пришивки проводился ограниченный трипсинолиз, при котором расщепляются ы-н С-концц гистонов/виш et а1, 1984/ или вместо трипсина использовался клостршалн, который расщепляет белки по аргининам и отделяет ТОЛЬКО К- КОНЦЫ ГИСТОНОВ /Ьдаи1а-КеГ1гаЪоп et а1 ,1986/. ПОТОМ проводилось йодирование в денатурирующих условиях, чтобы избежать влияния суперструктуры. Йодированно проводили по тирозина:,I, располагающимся в глобулярных фрагментах гистонов. После определения удельной радиоактивности, непришиш белки тщательно удалялись переосадцеппем ДНК, а следовательно н сшитых ДНК-гистоновшс комплексов, цетавлоном / Нактшшс и др., 1977/ и снова определялась удельная радиоактивность утке депротеинизированного препарата. Таким образом было показано, что при получении сшитого комплекса с использованием боргадрида натрия, 90% сшивок являются трипсин резистентными и осуществляется через центральные участки гистонов. Наоборот, при сшивании по цпанборгйдридному протоколу 605? из всех сшивок являются трипсин резистентными и 40% трипсин чувствительными, т.е. 60% из всех сшивок осуществляется через глобулярные участки гистонов, а 40$ , в основном, через N-концы /поскольку результаты по трипсиновому и клострипаиновоцу гидролизу совпадают/.

В свете изложения результатов можно сделать вывод о том, что в активно транскрибируемом хроматине ЛНК-гистоновые сшивки регистрируют изменение взаимодействий с ДНК по крайней мере, глобулярных участков гистонов, что однако не сопровождается их полным удалением. Полученные результаты свидетельствуют о том, что сшивки через гистидиш, располагающиеся в глобулярных областях гистонов, затруднены, но вместе с тем часть лизинов оказывается от ДНК на расстоянии, достаточном для возникновения химических сшивок.

Мы предполагаем, что взаимодействие гистонов с ДНК в активно транскрибируемом хроматине тлеет особенности, не зависящие от целостности суперструктуры и эти особенности устойчивые. К таким выводам приводит следующий эксперимент.

На ядрах, полученных из клеток дрозофилы, подвергнутых тепловому шоку, проводилась пришивка гистонов к ДНК по боргидридновд и циаиборищридному протоколу. Дцра подвергались мягкому гидролизу микрококковой нуклеазой и фракционировались по методу, предложенному Гарардом /Davis et al , 1983/, следствием чего являлось образование трех фракций, sl, s2 и Р, различающихся по содержанию активно-транскрибируемых последовательностях. Дот-гибридизация с клонированными зондами гена бгш-70 показала, что фракция sl,первая, которая вытекает из обработанных ядер, пятикратно обогащена кодирующими последовательностями гена бтш-70. Фракция s2 содержит в основном транскрипционно неактивный хроматин /в нашем случае в ней содержатся транскрипционно неактивные последовательности рибосомальной вставки II типа/. Далее для материала, полученного из франций sl и S2, проводилось пептидное картирЪвание участков контактов гистонов •с ДНК по описанной раньше методике. Сравнение пептидных "карт" ■йракцим sl и s2,полученных и по боргидридному , и по цианборгидрдд-«юму протоколу показало наличие ярко выраженных различий в контактах гистонов с ДПК во фракции, цбогащеинои активными последователь-

ностями, по сравнению с неактивно!!. На основе этих результатов мы можем предполагать /поскольку фракция э1 лишь обогащена активными последовательности!®!/, что существуют различия во взаимодействии гистонов с ДНК в нуклеосомах активного хроматина по. сравнению с неактивным. Контакты пептидшх "карт" фракции 51 и Э2 отличаются даже в тех случаях, когда пришивка проводилась после довольно глубокого гидролиза микрококковой нуклеазой, не сохраняющего суперструктуры. Поэтому мы считаем, что наблюдаемые наш особенности контактов в активных нуклеосомах не связаны с суперструктурой хроматина.

Мы пока не можем сказать с точностью в чем именно выражаются наблюдаемые наш изменения в контактах между гистонаш и ДНК в составе нуклеосом активно транскрибируемых районов хроматина. С одной стороны, это связано с потерей возможности гистидинов.из глобулярных районов гистонов пришиваться к ДНК, поскольку мы наблюдаем 3-4 кратное уменьшение степени пришивки гистонов к ДНК в кодирующей области гена бтш-70. С другой стороны, гистоны остаются связанными с ДНК за счет других функциональных групп.

¡¿ы' полагаем, что в этих взаимодействиях могут участвовать и н-концевые участки гистонов. Как уже было упомянуто раньше, при ■ пришивке гистонов по [щанборгидридному протоколу, 40$ из всех сшивок осуществляется через лизинн, находящиеся в н-концах гистонов. Кроме того нужно отметить, что при цианборгидрндной фиксации гистонов, сравнение пептидных "карт" показывает, что саше сильные контакты, характерные для фракции э2, ослабевают во фракции з1. С другой стороны при той яе самой пришивке саше сильные нуклеопеп-тидные контакты, которые находились в трипсин-чувствительных районах гистонов,отсутствуют в трипсин-резистентных районах.

Роль ы-концов гистонов в структуре хроматина пока недостаточно изучена. Считается, в основном, что они участвуют в компактиза-

ции хроматина на более высоком уровне. Однако эксперименты Грюпс-тайна и соавторов /shus^er et al . 1986/ показывают, что n-концы гистонов Н2А. и Е2В имеют определаш!ую с^ушсционольную роль.

При рассмотрении возможной роди к-концевых фрагментов гистонов в рамках предложения о сохранении их контактов с ДНК во время транскрипции, нельзя не упомянуть о роли ацетилирования. С одной стороны, каяется, что процесс ацетилйровакия мог бы препятствовать предполагаемому наш взаимодействию к- концов гистонов с ДНК. В литературе существует мнение о связи процесса "ацртил1роваяия с процессами транскрипции. Однако при этом не все лизиновые остатки и-концов гистонов ацетилируются в одинаковой степени. Так, например, в гистоне Н4 ацетилируются 2 или 3 лизиновнх остатка / Imai е+. ai , 198G/. Остальные неацетилпровашше. лизиш могли бы взаимодействовать и удерживать гистоны связазаше с ДНК во время транскрипции гена.

Мы считаем, что глобулярные районы гистонов токе участвуют в. ДНК-гистоновых взаимодействиях в активных нуклеосомах, однако за счет других функциональных групп, по сравнению с неактивным состоянием, Шесте с тем роль и- концов гистонов в таких взаимодействиях исключить нельзя.

В настоящее время мы не можем сказать точно участвует ли РНК -полимераза в наблюдаемых изменениях в нуклеосомах активного гена бтп-70. При тепловом шоке культуры клеток происходит полная активация всех пяти копий гена бтш-70 и синтез РНК идет на очень высоком уровне /ciimor and Li3', 1985/. В работе Джилмора и Лиса был проведен сравнительный анализ плотности посадки молекул РНК-поли-меразы на различных участках домена, активно транскрибируемого гена бтш-70. Было показано, что максимальная плотность соответствует приблизительно 10-20 молекулам на 1 т.п.«., т.е. 2-3 молекулы поли-меразы на «уклеосому. Возможно такля плотная посадка молекул РЖ-

полимеразы может приводить к изменения.! контактов гистонов с ДНК. Временная дезорганизация структуры нуклеосом, вероятно, совершенно необходима для работы РНК-полимеразы.

Кроме того, ослабление контактов коровых гистонов и гистона Н1 с ДНК наблюдается только на активно транскрибируемых генах, например, генах бтш дрозофилы Дагроу et а1 , 1984/ и рибосоманышх генах /Джербашян и др., 1988/. В то же время, структура хроматина генов транскрибируемых, но с более низкой интенсивностью, шло отличается от структуры хроматина неактивных генов /Студитскнй и др., 1988/. Возможно, временная потеря определенных ДНК-гистоновых контактов, индуцируемых прохождением молекул РНК-полимеразы, быстро восстанавливается, если на смену одной молекулы не приходит другая молекула РНК-полимеразы, не давая, таким образом, реконструироваться нормальной нуклеосомной структуре.

Мы не можем утверждать с полной уверенностью, что сала молекула РНК-полимеразы приводит к потере определенных контактов гистонов с ДНК в составе нуклеосом и потере способности гистонов пришиваться к ДНК,' что мы и' наблюдаем в экспериментах с применением боргидрида натрия. Кроме того, сниженный уровень пришивки гистонов, который мы обнаруживаем в удаленном от зоны транскрипции районе, на 3» прилегающем конце гена бтш-70 /рис.3, зонд Г/, дает возможность предполагать определенную перестройку в нуклеосомах по всему домену еще до посадки молекул РНК-полимеразы.

Содержаше гистонов в 5' области гена бтш-70

При гибридизации сшитых ДНК-белковых комплексов, полеченных из клеток, подвергнутых тепловому шоку, с пробой, содержащей 5' концевую область гена бти-70, кроме диагонали свободной ДНК проявляется слабая .диагональ гастоков кор-частиц в области, где драг-

--4-X CD О

z

- 18 -

ï g " Я h R 30-35

1 I- s ; 1* ¿ s m ГЧ « Ó M 9 S

f • ....... «

4'' y- p > К \ ^

•

4 1

г

с

TT

3 f-

ш a o-

_ X2JZO Z XXI/)

H о m X CQ О

z

1

Ï ïi

5ML î 8 g? S 5 Í

«t u> «

i JL X.

e £o-

O O О .С D CÛ (Л CDX1Л

CE

ч T г

< w »

/

r T'

% % V

\

я è

s я

8 8

Рис.З Двумерный электрофорез сшитых ДНК-гистоновых кошяексов/сле-ва-пршивка по цианборгидридному протоколу, справа-пришивка по боргидридному протоколу,полученных из клеток дрозофилы, подвергнутых тепловому шоку. ДНК после двумерного диагонального гель-электрофореза переносили на нейлоновую мембрану Hybond-Jf и последовательно гибридизовали с высокомечеными

Р-зондшли А, Б, В и Г. В середине показана рестриктная карта гена бтш-70 из локуса 87А. Участки гена, с которыми проводилась последовательно гибридизация сшитых ДНК-гистоновых комплексов, разделенхшх на двумерном диагональном гель-элект-ро§орезе:

A. 5'-промоторная зона гена

Б. Участок кодирующей области гена. Весь кодирующий район обозначен чернил прямоугольником, а направление транскрипции указано стрелкой.

B. Короткий участок, находящийся за районом транскрипции в 3* концевой области.

Г. Район, находящийся удаленно от кодирующей области в 3' концевой области.

На схеме представлены суммарные данные сканирования радиоавтографов.

менты ДНК имеют размер более 250-300 нуклеотидов /рис.2 и рис.3/. Картина гибридизации идентична как в случаях с использованием бор-гидрида натрия, так и цианборгидрида натрия.

Получение данные указывают на отсутствие гистонов в 5» регуля-торной области, а слабая гибридизация в верхней части диагонали коровых гистонов объясняется, вероятно, гибридизацией пробы длиной 177п.н. с длинными фрагментами ДНК, в состав которых входят соседние участки, покрытые гнстонами.

Эти результаты подтверждаются данными Удварди и Шедла /bdvar-dy and schedi > 1984/, которые так же предполагают, что этот район гена бтш-70 свободен от нуклеосом. Аналогичные результаты подучены Карповым и соавторами при применении метода гибридизации с "белковыми тенями" /кагроv et al , 1984/.

Свободное от гистонов состояние 5' регуляторной области гена дтш-70, видимо является необходимым условием для посадки юлекул РНК-полимеразы и резкой активизации rem, которая имеет место при тепловом шоке. Известно, что нуклеосомы препятствуют инициации транскрипции /Knezetlc and buse , 1986/. Это неудивительно, по- : скольку РНК-полииераза дате в оптимальных условиях предпочтительно связывается с участками ДНК, не содержащими нуклеосомы /Williamson and Pelaenfeld , 1978/. Кроме того, убедительно продемонстрировано, что ДНК в составе нуклеосомного кора, содержащая промотор для данной полимеразы, ею не транскрибируется ЛогсЬ et al , 1987/.

Причиной отсутствия гистонов в районе 5» концевой, области гена бтш-70 может служить измененная конйортация ДНК, препятствующая образовании нуклеосом. Такие изменения в структуре ДНК обнаруживаются в этой области по появлению гиперчувствителышх к нуклеазе s I участков в районе коротких прямых повторов, которые могут образовывать петлеобразные структуры /шce et al , 1983/.

С другой стороны можно предположить, что посадке гистонового октамера на ДНК в этом 'районе, препятствуют молекулы РНК-полимеразы или регулято.рше белки. Присутствие таких белков в 5' прилежащей области гена бтш-70 показано в работе Ду /Wu , 1984/. Один из этих белков связан с областью ТАТА-бокса как при активной транскрипции гена, так и в неактивном состоянии. Другой белок обнаруживается в более далекой области только при активации гена.

При помощи ультрафиалетовой пришивки в комбинации с методом гибридизации с "белковыми тенями" недавно был обнаружен негистоно-вый белок, связашшй с промоторной областью гена бтш-70, который выявляется только в активном состоянии rem /Беликов и др., 1988/.

- 21 -

Содержание гистонов в З'ковдевой области гена бтш-70

В активных генах бтш-70 гибридизация с 3' концевой последовательностью В, находящейся между сайтами Xho и sal, длиной около 200 п.н. /рис.3/, демонстрирует сильно заниженную способность гистонов пришиваться к ДНК. Используемые наш два способа пришивки выявляют идентичную картину - в этом участке хроматина к ДНК пришивается всего 20-25$ из всех гистонов нуклеосоиясго кора, по отношению к пришивке в неактивном хроматине и 15-20$ гистона HI. Эти данные / и особенно данные по пришивке с использованием циан-боргвдрида/ указывают на уменьшенное содержание гистонов в этом районе- гена бтш-70.

Используя метод "mm on" в нашей лаборатории было показано, что участок В содержит в 20 раз меньше транскриптов , по сравнению с участком Б /кодирующая область/ /Преображенская и др., 1988/. Однако, низкое содержание транскриптов в области, соответствующей зовду В, может быть сильно занижено, поскольку этот район содержит последовательности' ДНК, функция которых заключается в терминировании синтеза РНК. По этой же причине образующиеся транскрип-тн могут избирательно быстро деградировать, как это происходит с 3'- концевой частью предшественника мРНК. .

Сильно уменьшенное содержание гистонов в этой области, может быть, связано и с присутствием специфических белковых комплексов, которые участвуют в терминации транскрипции и вытесняют нуклеосо-мы, как это происходит в 5' концевой области. Нельзя исключить и вероятность того, что ДНК имеет особую структуру, запрещающую сборку нуклеосом на этих последовательностях. Но, к сожалению, это пока очень слабо исследованный район хроматина гена бтш-70.

Картина гибридизации со следующим, еще более удаленным от кодирующей области к 3' концу, зондом Г /рис.3/ обнаруживает на-

личие гистонов в этом участке. При использовании пришивки с последующим восстановлением боргмдридом, наблюдается понижение степени пришивки как коровых гистонов, так и гистона HI. Только 30-40;« коровых гистонов и 30-35$ гистона HI обладают способностью пришиваться к ДНК в этой области /рис.3/. И наоборот, все 100% гистонов пришиваются к ДНК при применении цианборгмдридной пришивки. Результаты говорят о сохранении контактов с ДНК всех гистонов, но, видимо, их взаимодействия в составе нуклеосом с ДНК отличны от таковых.в • неактивных районах хроматина, что и приводит к сильному уменьшению уровня пришивки с помощью боргидрида натрия.

При исследовании чувствительности к ДНК-азе I /udvardy and Schedl , 1984/ И К микрококковой куклоазе Деел and Elgin , 1982/, тоже было показано, что структурные изменения в хроматине транскрибируемых генов распространяются далеко за пределами кодирующей области rem.

О том, с чем связаны изменения ДНК-гистоновых взаимодействий в нуклеосомах, в удаленном от кодирующей области З'концевого района гена бтш-70 можно только предполагать. С одной стороны, уменьшение уровня пришивки гистонов в учАстке хроматина, соответствующему зонду Г, может быть связано с потенциальной готовностью всего домена к транскрипции.Весь домен находится не в виде компактизованной ЗОнм дибриллы, а тлеет более разрыхленную структуру, чем и можно объяснить потерта определенных контактов мезду гистона!,ш и ДНК в нуклеосо ме. Потеря части контактов глобулярных областей гистонов с ДНК наблюдается как для гистонов нуклеосомного кора, так и /немного в большей степени/для гистона HI. Можно предположить, что уменьшение степени пришивки гистона HI и изменения контактов гистонов кор-частиц с ДНК, связано и с изменением торзнонного напряжения в петле, которое произошло после быстрой активации гена.

С другой стороны, этот район, в определенной степени, транс-

крибируътся. По данным Колчииекого /Преображенская а др., 1988/ зонд Г содержит транскрипты, составляющие 10% от количества траис-криптов кодирующей области. По нельзя исключить, что их количество значительно больше, только они короткокивущие и быстро подвергаются деградации. Таким образом, монно предположить и прямое участие молекул РНК-полимеразы в наблюдаемых изменениях контактов гистонов нуклеосошого кора и гястона III с ДНК. Однако, пока нет данных, свидетельствующих в пользу того или иного предположения.

ВЫВОДЫ

1. Для определения содержания гистонов и изучения структурных переходов хроматина в различных участках гена белка теплового шо-ка-70, был предложен комбинированный метод пришивки: фиксация выделенных ядер формальдегидом с последующей локализацией гистонов на ДНК при помощи гибридизации с "белковыми тенями".

2. Показано, что в активных и неактивных участках хроматина не наблвдается существенных различий в контактах неструктурированных концевых областях гистонов с ДНК, в то время как взаимодействия меяду глобулярными областями гистонов и ДНК существенно ослабевают в транскрибируемых районах хроматина, по сравнению с нетранс-крибируемыми.

3. При исследовании домена активированного гена бтп-70 было обнаружено, что эффект изменешш взаимодействий мевду глобулярными участками гистонов с ДНК, распространяется и на 3' прилегающую некодирующую область гена.

4. Подтверждено отсутствие гистонов на ДНК в 5'промоторной области активированного гена бтш-70, а такке обнаружен аналогичный эффект в узкой 3* области гена, прилегающей к предполагаемому участку тершнации транскрипции.

По материалам диссертации опубликование следующие работы:

J. S.G. Bavykin, V.M. Studitsky, G. A.ffacheva, A.B.Mirzabekov, L. Srebreva, T.Banchev, J.Zlat.anova, R.Tganev. tlew immmochemical method of detection of proteins interacting with ША during replication. - In abstracts of International symposium "Phisico-ohemistiy of ЕЙА and molecular mechanisms of genome functioning", Tbilisi, 1987, p.40.

2. O.V.Preobrazhenskaya, V.T'.Karpov, S.V.Belikov, G,A.Hachera, A.Tl.Mirzabekov. Dinamtc aspects of chromatin structure. - In abstracts of I8~th ГЕ^З Meeting, Ljubljana, 1987, p.290,

3. S.V.Belikov, D.O.Guschin, K.K.Ebralidze, G.A.Wacbeva, V.b.Kar-pov, O.T.Preobranhenskaya, A.D.Mirzabekov. Rearrangements in chromatin structure during transcription. - In abstracts of 6~th USSR-Italy symposium "Macromolecules in functioning cell", Leningrad, 1988, p.98.

4. Начева Г.А., Карпов В.JI., Преображенская О.В., Мирзабеков А.Д. Структурные перестройки хроматина гена бтш-70 при транскрипции. - Мол._ биология, 1988, в печати.

5. Гущин Д.Ю.'ч Еачевв Г.А., Преображенская О.В., Карпов В.Л., Эб-ралвдзе К.К., Кирэабеков А.Д. Изменения в наборе ДНК связывающихся участков гистонов при транскрипции. - Докл. АН CCCF, 1988, в печати.

ЗакЛй4бр.Тир.1ии.Тип.В/0"Знанив".