Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура транскрипционно-активного хроматина. Сохранение нуклеосомной организации генов белка теплового шока (бтш 70) при умеренной транскрипции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура транскрипционно-активного хроматина. Сохранение нуклеосомной организации генов белка теплового шока (бтш 70) при умеренной транскрипции"

'. О: АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ -им. В.А•ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

' СТУДИТС1Ш Василий Михайлович

УДК 576.315.42

СТРУКТУРА ТРМСКРИПЦИОННО-А1(ИВНОГО ХРОМАТИНА. СОХРАНЕНИЙ НУКЛЕОСОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОВ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА (бтш 70) ПРИ УМЕРЕННОЙ ТРАНСКРИПЦИИ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат'

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологическйх йаук

Москва - 1988

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организация хромосом Института молекулярной биологии им.В.А.Знгельгардта АН СССР

Научный руководитель;

академик АН СССР, доктор химических наук ' А.Д. МИРЗАЕЕКОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук C.B. РАЗИН

доктор биологических наук A.A. ШрЙТИС

Ведущая организация: Межфакультетская проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н. Белозерского , МГУ

Защита диссертации состоится " ■-->¿—1' 1988 г. ее,

в / z часов на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Эн-гельгардта АН СССР по адресу: .117984, Москва,ул.Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта АН СССР.

Автореферат разослан '^у " 1988 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

- ондля характеристика работы

Актуальность проблемы. Открытие субъединичной организации хроматина (1973-74 гг.)'позволяет анализировать структурные и функциональные аспекте пространственной организации ДНК внутри ядра с качественно новых позиций. Данные о том, что все последовательности ДНК генома эукариот имеют нуклзосошгуга организацию (Ьасу, 1975), а также о фундаментальном сходстве нуклеосом-ной структуры во всех трех царствах' эукариот (ВаууМп, 1985) ставят вопрос о том, как осуществляются основные процессы метаболизма ДИК (репликация, транскрипция, рекомбинация и репарация) в условиях организованной нуклеопротеидной структуры.В последние годы значительное количество работ посвящоно вопросам взаимодействия нуклеосом и аппарата транскрипции. Большинство данных, полученных к настоящему времени, свидетельствует о сохранении нуклеосом на умеренно-транскрибируемых генах. Это ставит вопрос о существовании модификаций в структуре нуклеосом транскрибируемого хроматина, обеспечивающих проходпение РНК-по-лимеразы. Имеющиеся в литературе данные по этому вопросу весьма противоречивы (от полного "разворачивания" нуклеосом до полного сохранения ими компактности в активном хроматине). Это связано прежде всего с использованием не вполне адекватных методов анализа структуры, нуклеосом, приводящих к ее нарушению в процессе исследования. В связи с этим весьма актуальной задачей кажется разработка более прямых методов, позволяющих анализировать нуклеопротеидную организацию транскрибируемых генов в условиях, Золее приближенных к ситуации в клетке. Применение таких подходов позволило бы приблизиться к пониманию структурных основ функционирования и регуляции активности генома эукариот.

Цель работа. В настоящей работе, была Доставлена задача,

включаюцая сравнеш!е структуры нуклеосоы, расположенных на угле— ренно-транскрибируемих генах (в качестве модели использовали частично активированный ген белка теплового шока - бтш 70) и неактивных в транскрипции участках генома, используя комбинацию -разработанных ранее методов анализа первичной организации (расположения гистонов на KHK) нуклеосоы (shiok, 1980) и метода гибридизации с "белковыми теняш" (Karpov, 1984). Кроме того, необходимо было сопоставить полученные данные с результатами более традиционных методов фракционирования хроматина. ■

Научная новизна и практическая ценность работы. В нашей работе впервые был применен метод, позволяющий анализировать структуру нуклеосом, расположенных на различных участках генома, после сшивки гистонов с ДНК непосредственно в ядрах. Использование этого метода позволило показать, что первичная организация нуклеосом, расположенных на транскрибируемых генах и на неактивных в транскрипции участках генома, не отличается и сходна со структурой нуклеосом суммарного препарата. В то же время показано, что фракционные характеристики транскрибируемого и конденсированного хроматина существенно отличаются, но эти отличия обусловлены не изменениями в структуре нуклеосом, а нарушением наднуклеосомной организации транскрибируемых генов. Общая компактность нуклеосом из транскрибируемого хроматина также сохраняется, по данным двумерного электрофореза нуклеосом. Показано, что нуклеосош, расположенные на транскрибируемы?: и неактивных в транскрипции участках генома, несколько отличаются по электрофоретическои подеилшости и длине ДНК, что может объясняться различиями в модификации гистонов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 16 Конференции 5ЕБ0 (Москва, 1984), У Биохимическом съезда (Ки-

гв, 1986), 14 Международном Биохимическом конгрессе (Прага, Ю88), йа молодежном конкурсе (Москва, 1987) и на конкурсе Ин- -зтитута молекулярной биологии АН СССР (Москва, 1988).

Публикации.' По материалам диссертации опубликовано 4 пе-гатннх работы. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех слав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов и списка цитированной литературы (266 ссылок). Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, содер-шт 12 рисунков. • . ^

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Исследование структуры хроматина активных и неактивных в транскрипции участков генома методами фракционирования .

В качестве модели утлеренно-траяс:фибвруемого гена в работе использовали частично активированный ген белка теплового шока с молекулярной массой 70 кД (бтш 70), который представлен в геноме Дрозофилы пятью копиями. Ранее в работах нашей лаборатории было показано, что во время теплового шока наблюдается "полная" активация транскрипции этого гена, во время которой с кодирующей части гена практически полностью удаляются гистоны (Кагроу, 1984). В нашей работе исследовали ген бтш 70-, транскрибируемый существенно менее интенсивно. Хотя во Ьремя дехорионизации эмбрионов Дрозофилы транскрипция гена также значительно активируется, ее интенсивность остается в 4-6 раз ниже, чем у полностью активированного гена. При этом на кодаруюцей части гена значительно уменьшается содержание гистона КГ, тогда как осталь-

ныв гистоны сохраняются (Karpov, 1984).

Подтверждение сохранности нуклеосом на частично активированном гене бтш 70 было получено методом фракционирования ядер,/ обработанных микрококковой нуклеазой (рис. I). Выбор метода фракционирования обусловлен тем, что у активных генов при такой обработке обнаруживается вильное' нарушение нуклеосомного повтора (Garrard, 1984), одной из причин которого может быть изменение структуры нуклеосом, расположенных на этих генах.После фракционирования -ген бтш 70 обогащен в 2-3 раза в Si-фракции и в 5-6 раз в Р-фракции (рис. IB). Количественные оценки были получены с использованием дот-гибридизации. Таким образом, 50-90/? хроматина гена бтш 70 находится в Р-фракции,и именно в этой фракции наблюдается наиболее значительное нарушение нуклеосомного повтора у этого гена, • ;

Заметим, что нарушения повтора не наблюдается в Р-фракции .. как суммарного гидролизата (рис. IA), так-и хроматина нетранс- N крибируемой рибосомальной вставки (рис. 1С), что подтверждает прямую связь этого явления с транскрипционной активностью исследуемого участка хроматина. •' .,

В то 1хо время скорость расщепления гена бтш 70 и нетранс-крибируемой рибосомальной вставки микрококковой нуклеазой существенно не отличается, хотя полностью активированный ген бтш 70 •'

t j

гидролнзуется значительно быстрее неактивного хроматина (-Karpov,; 1984). Эти данные подтверждают результаты предварительных исследований, в которых доказывается сохранение нуклеосом при транскрипции частично активированного гена бтш 70. Таким образом,нарушение нуклеосомного повтора умеренно-транскрибируемых генов нельзя объяснить удалением гастонов.

В дальнейшем проводили исследование факторов, вызывающих

12 3 4 5 6 78 9 10 11 12

А

•мi м

л.'.и_489

.220 190 г 14 7

1 2 3 4 5 6 7 8 .9 10 1п2м

, мп в и ц

У ] Ы

Фi! ч

12 34 56 789 10 11 12

С V

i ' ■ 1 ■ ' : . э .489 ^ - 1-331 .-220

§я яг а -190

4 « -147

Рис. I. Фракционирование ядер. обработанных микрококковой нуклеазой. Ядра, выделенные из дехорионизованных эмбрионов Дрозофилы, инкубировали с микрококковой нуклеазой 10, 20, 40 мин. Затем ДНК либо прямо экстрагнррвали из ядер (дороя-ки 1-3), либо проводили фракционировать на (4-6), вг-(7-9) и Р- (10-12) фракции. Выделенную ДНК анализировали электрофоретически в блоке 7$ НААГ в денатурирущих условиях. Показаны окраска бромистым этидиом (Л), последовательная гибридизация с кодирующей частью гена бтш 70 (В) и нетранскрлбируемой рибосомалыюй вставкой (С) Дрозофилы. Цифры справа указывают длину одноцепочечных маркерных фрагментов ДНК (1/1).

нарушение нуклеосомного повтора в фракции активного хроматина. Оказалось, что после лизиса ядер в условиях низкой ионной силы и проведения фракционирования (рис. 2, фракция супернатанта -51+Б2, фракция осадка - Р) хроматин гена бтш 70 теряет все характерные особенности активного хроматина. Не наблюдается ни обогащения Р-фракцин активным геном, ни нарушения нуклеосомного повтора гена-Бил 70 в этой фракции (рис. 2В). Очевидно,-лизис ядер в условиях низкой ионной силы существенно меняет характеристики активного хроматина. •

2. Структурные особенности нуклеосом умеренно-гранскшбируемого гена бтш 70 ■

Для сравнения общей конформацпи нуклеосом из активных и неактивных в транскрипции участков хроматина проводили двумерный ДНП-ДНК электрофорез гидролизата хроматина без гистона Ш. В первом направлении проводили разделение нуклеосом, а во втором - свободной ДНК, для определения ее длины. Электрофорети-ческая подвижность нуклеосом отр&чает их компактность. На рис.3 приведены картины нуклеосомной области после такого разделения. Гибридизация полученной картины с геном бтш 70 (рис. ЗВ) показывает характерную форму нуклеосомной области ("горб").

Для прямого анализа отличий от суммарной картины и от "неактивных" нуклеосом та же мембрана била прогибридизована с меченой ДНК полного рибосоыного повтора (транскрибируется 20% копий) (рис. ЗС) не транскрибируемой рибосоыкой вставкой (рис.'З ) соответственно. На мембранах присутствовали маркеры, позволяющие прямо совмещать полученные картины. Схема (рис. ЗЕ) показывает, что общая подвигшость нуклеосом гена бтш 70 в первом на-

I ') 3 М 4 5 6

А

1.

4

I " -14 5

■ I

. ■ л

В

i 2 3 м 4 ,5 .6

45». . да». *?;

$ -3-'

йя

л 2 3 м 4 5 6

! I

ы

i

-145

-145

Рис. 2. Фракционирование хроматина, содержащего гиотон Н1.поело обработки микрококковой нуклеазой. Хроматин, выделенный из дехо-рионизованных эмбрионов Дрозофилы, инкубировали с микрококковой нуклеазой 10, 20, 40 глин. Затем проводили фракционирование на супернатант (дорожки 1-3) и осадок (4-6).Выделенную ДНК анализировали электрофоретически в блоке 7% Й1АГ в денатурирующих условиях. Показаны окраска бромистым этпдием (А), последовательная гибридизация с кодирующей частью гена бтш 70 (В) и нетранскриби-руемой рибосомальной вставкой (С)- Дрозофилы. Цифры справа указывают положение ДНК минимальных нуклеооом. Ы - набор маркерных ■ фрагментов ДНК, полученных из ядер Дрозофилы, обработанных ДНКа-зой I..

Рис, 3. Анализ минимальных нуклеосом метопом двумерного ДНП-ДНК электрофореза после "мягкого" удаления гиотона HI. Из хроматина дезорионизованных эмбрионов Дрозофилы удаляли гистон HI в присутствии 150 i.'M NaCl. Затем инкубировали хроматин с микрококковой нуклеазой в течение 40 мин. Гидролизат анализировали методом двумерного ДНИ-ДНК электрофореза. DT указывает позицию динуклео-сом, момо - мононуклеосом. Показаны окраска бромистым этидием (А), последовательная гибридизация с кодирующей частью гена бтш 70 (В), с полным рибосомальным повтором (С), с нетранскрибируе-мой рибосомальной вставкой (D) Дрозофилы и схема нуклеосомной области (Е). X - пятна неизвестного происхождения, обнаруживаемые только при гибридизации с зондами, содержащими рибосомаль-mie гены.

правлении электрофореза существенно не отличается от подвижности суммарных и "неактивных" нуклеосом, что позволяет исключить сильную декомпактиззцию (разворачивание). Напротив, существует области,'где эти нуклеосомы имеют ту же подвижность, что и "неактивные" нуклеосомы"(область "горба"), что, видимо, свидетельствует о несколько измененной конформашш таких нуклеосом.

Кроме перечисленных особенностей нуклеосом гена бтш 70 отметим, что пятна на электрофорезе, соответствующие "активным" нуклеосомам и "неактивным"'нуклеосомам рибосомальной вставки, практически не перекрываются, что говорит об отсутствии "неактивных" нуклеосом на гене бтш 70. В сочетании с данными по фракционированию хроматина (рис. I) и данными о полном отсутствии гистона III (Кагрслг, 1984) это говорит о транскрипции (хотя и слабой) всех копий гена бтш 70.

3. Метод исследования первичной организации минимальных нуклеосом. расположенных на различных участках генома

Общая схема методического подхода, использованного для локализации участков взаимодействия гистонов с нуклеосомной ДНК, показана на рис. 4. Взаимодействующие с ДНК лдзиновые и гисти-диновые остатки белков ковалентно пришиваются к апуриновым участкам на ДНК, образованным в мягких условиях-, обеспечиващих сохранение нативной нуклеопротеидной структуры; В результате этого в ДНК вводится одноцепочечный разрыв в месте сшивки, и молекула белка оказывается ковалентно связанной с 5 -концевым одно-цепочечным фрагментом ДНК. Задача локализации гистонов на ДНК сводится к определению с помощью диагонального .двумерного гель-

ю

шшааса поскоитышисш гддаоааа ' гагоюз ш ят юиассавго ер»

6 ■-— — - ■■■-------- 3*

с? с?"'

гамсааз о

/.^адеагз дамгпл т&я&исэ

Г

он®

\

О /ИУХЛООТЦЛк/ 140 -100 •во

д;Кд

О • 45

Рис. 4. Общая схема анализа сшитых ДНК-гистоновнх комплексов

методом двумерного электрофореза. Н - молекула гистона.

электрофореза длины 5'-концевых фрагментов ДНК, сшитых с каждым из гистонов. Так, была установлена последовательность расположения гистонов на ДНК нуклеосомы, полученных из различных организмов (Shick, 1980; Bavykin, 1985), которая хорошо согласуется с данными, полученными методом рентгеиоструктурного анализа (Klug, 1984; Maudrianakis, 1985).

Для определения расположения гистонов на ДНК нуклеосом, расположенных на различных участках генома, нами было разработано два методических подхода. Один способ заключается в проведении сшивки гистонов с-ДНК в составе выделенных нуклеосом. Сшитые с пистонами фрагменты ДНК затем разделяли методом двумерного идентифицирующего -электрофореза. Фрагменты ДНК злектрофоре-тически переносили из геля на нейлоновую мембрану, после чего проводили последовательную гибридизацию мембраны с мечеными клонированным! пробами ДНК из различных участков генома.

Основным возможным артефактом этого подхода являются вероятные изменения структуры нуклеосом во время их выделения, особенно ввиду предполагаемой лабильности "активных" нуклеосом. Для того, чтобы избежать этого, была специально разработана следующая экспериментальная схема:

1. Гистоны сшивали с ДНК непосредственно в ядре.

2. После удаления гистона HI сшитый хроматин гидролизовали микрококковой нуклеазой и выделяли нуклеосомы.

3. Сшитые с кадцым гистоном 5 -концевые фрагменты ДНК нуклеосом разделяли при помощи двумерного гель-электрофореза на соответствующие гистонам отдельные диагонали с характерным набором пятен. . ' t

4i ДНК переносили из геля на нейлоновый фильтр и последовательно гибридизовали- с различными клонированными пробами, что

позволяет установить первичную организацию нуклеосом на этак последовательностях ДНК.

Наиболее серьезным предполагаемым артефактом во время выделения минимальных нуклеосом является возможность фракционирования материала, что может привести к анализу непредставительной субпопуляции нуклеосом. Выделение хроматина из сшитых ядер особенно затруднено, поскольку они лнзируются значительно хуже нативных. Для преодоления этих затруднений использовали слабую обработку хроматина ультразвуком. После такой обработки 'сшитых ядер после лизиса в низкой ионной силе выход хроматина близок н количественному. Данные электрофореза нуклеосом и ДНК (рис.5) показывают отсутствие дополнительных дубнуклеосомалышх продуктов и внутринуклеосомшх разрывов ДНК, что свидетельствует о хорошей сохранности нуклеосомной структуры. После лизиса сшитых ядер не происходит также фракционирования активного хроматина в осадок (рис. 2).

4. Расположение гистонов на ДНК нуклеосом из активных и неактивных в транскрипции ?Гчастков генома

Первоначальные попытки получить двумерную диагональную картину для сшитых в ядрах нуклеосом не привели к успеху, поскольку при гидролизе хроматина без HI микрококковой нуклеазой в условиях, когда нуклеосомы суммарного препарата имели длину ДНК 145 н, у нуклеосом гена бтш 70 около 50$ ДНК имела длину 155 н. Препарат таких нуклеосом после разделения на двумерном электрофорезё дает картину, на которой все пятна, соответствующие фрагментам ДНК разной длины, удвоены, что значительно за-

1 2 3 4 5 6

( •}(—« v.

ооо

| оооо \

:_153 145

Рис. 5. Электройоретический анализ нуклеосом л нуклеосомной ДНК. лолученных из сшитых ядер. Из хроматина дезорионизованных эмбрионов Дрозофилы удаляли гистон Ш. и инкубировали его с микрококковой нуклеазой О, 5, 10, 20, 40, 80 мин (дорожки 1-6 соответственно) . Нуклеосомы анализировали методом ДНН-электрофореэа в блоке 5% ЯААГ (А), а выделенную ДНК - электрофоретически в блоке 1% ПААГ в денатурирущих условиях (В). Цифры справа указывают длину одноцепочечных фрагментов ДНК.

трудняет интерпретацию данных (не показано). Для исследования этого явления ДНК гидролизата хроматина без HI (супернатанта) в различных точках кинетики гидролиза микрококковой нуклеазой разделяли с помощью денатурирующего электрофореза (рис. 6) и после перекоса гибридизовали с меченым зондом бтш 70 (рис. 6В). Действительно, в точке 6 гидролиза, которую использовали раное для препаративного получения нуклеосом, длина ДНК у нуклеосом гена бтш 70 все еще 145 и 155 н, тогда как длина ДНК суммарных нуклеосом I45Î2 н (рис. 6А). На более ранних этапах гидролиза также видно, что укорочение ДНК нуклеосом гена бтш 70 протекает замедленно (точки 4 и 5).

Для получения нуклеосом гена бтш 70 с длиной ДНК только 145 н проводили более глубокий, чем ранее, гидролиз микрококковой нуклеазой.

На рис. 7 и 8 приводятся картины двумерных диагональных элеитрофорезов сшитых ДНК-гистоновых комплексов, выделенных из нуклеосом, после последовательной гибридизации с пробами из активных (бтш 70) и неактивных (нетранскрибируемая рибосомаЗгь-ная вставка) в транскрипции участков генома.

Гибридизация с рибосомальной нетранскрибируемой вставкой (рис. 7В, 8В) дает.картину, сходную с результатами, полученными на суммарном препарате нуклеосом ранее (SMck, 1980; Bavykin, 1985). Разрешаются три диагонали: гистона НЗ, гистона 114-, и общая диагональ гистонов Н2А, Н2В. Диагонали гистонов Н2А, Н2В не удается разделить, поскольку электрофоретическая подвижность этих гистонов различается незначительно. На каждой диагонали-виден характерный набор пятен, соответствующий местам сшивки гистонов с ДНК нуклеосом, расположенных в ядре на ДНК нетранскрибируемой рибосомальной вставки. Более диффузный характер пя-

1 2 3 4 5 6 7

А

155 145

Д Е а

ад "И »-•' 'Ш

а» ?

' 'Ч

1 .: ■

I } Ф'Ш

155 145

Рис. 6. Детальный анализ кинетики •расщепления хроматина, не содержащего гиотон Н1, миюоококковой нуклеазой. Из хроматина дехорионпзованных эмбрионов Дрозофилы удаляли гистон Н1, и хроматин инкубировати с микрококковой нуклеазой 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, ВО мин (дорояки 1-7 соответственно). Выделенную из су~ пернатанта ДНК анализировали злектрофоретически в блоке 1% ПААГ в денатурирующих условиях. Показаны окраска бромистым зтидием (А) и гибридизация с кодирующей частью гена бтш 70 (В) Дрозофилы. Цифры справа указывают длину одноцепочечных фрагментов ДНК.

ОМА

Рис. 7., Двумерный электрофореткчэский анализ ДНК-гистоковых комплексов. полученных после сшивки в рортава нуклеосом. Ыитщальнш нуклеосомы, выделенные из дехорионизованных эмбрионов Дрозофилы, сшивали диметалсульфатом. Затем выделяли сшитые ДНК-гистоновые комплексы и проводили электрофоретическое разделения в 1-м на- ' правлении. После расщепления гистонов проназой проводили разде- , ление ДНК в денатурирувдих условиях во П-м направлении и перенос фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану. Мембрану последовательно гибридизовали с зондами из кодирувдей части гена бтш 70 (А) и с нетранскрибируемой рибосомальной вставкой (В) Дрозофилы. Тонки,«! линиями указано положение в геле и цифрами - длина фрагментов ДНК, сшитых с различными гистонами. Слева вверху на врезке показана более короткая экспозиция.

ОМА

\Н 2 А, . Ч.

НЗ

■л

¿4

■ '\Н 4

* ч

\

\

\

\

ч

\

Рис, 8, Двумерный эдектройоретнческпй анализ днк-гистоновурс комплексов, полученных из нуклеосом после сшивки в составе ядер. Проводили сшивку дкметилсулвфатом в составе ядер дехо-рионизованных эмбрионов Дрозофилы. Затем выделяли нуклеосо-ми, изолировали сшитые ДНК-гистоновыо комплексы и анализировали их методом двумерного электрофореза. Остальные обозначения те ке, что и на рис. 7.

тен (в вертикальном направлении) на диагонали гистона НЗ объясняется, ввдимо, модификациями методики получения нуклеооом,введенными для получения более представительной популяции нуклеосом (см. разд. 3). Однако общин характер картины хорошо согласуется с данными, полученными методом прямого концевого мечения ДНК. Картина "первичной организаций" нуклеосоы отчетливо видна, по крайней мере в диапазоне длин ДЕК 60-150 нуклеотидов. Картины двумерного электрофореза, полученные после сшивки гистонов с ДНК в составе выделенных нуклеосом (рис. 7) или в составе ядер (рис. 8), существенно не различаются.

5. Изменения структуры, ¡хроматина при транскрипции

Представление об измененной структуре нуклеосом в транс-крипционно-активном хроматине возникло после открытия предпочтительной чувствительности транскрибируемых генов к ДНКазе I (Yfeintraub, 1976) и демонстрации роли белков HMG 14,17>как факторов, обеспечивающих создание "открытой" структуры активного хроматина путем дестабилизации расположенных там нуклеосом (Weiвbroad, 1982). В дальнейшем роль этих белков в создании активного хроматина' была существенно пересмотрена, и в настоящее время основным фактором, определяющим повышенную чувствительность транскрибируемых генов к нуклеазам, считается изменение нзднуклеосомной организации активного хроматина (Elgin, 1985), связанное в первую очередь с уменьшением содержания гистона HI iKarpov, 1984), Другим фактором, нарушающим нуклеосомную структуру, считали ацетилирование гистонов в нуклеосомах активного хроматина (Doeneeke, 1982), Однако недавно показано, что даже при значительной степени ацетилирования гистонов нуклеосомы со-

храняют свою структуру (Auaio, 1986). Данные о сохранении эле-ктрофоретической подвижности нуклеосом активного хроматина (рис. 3 и Varahavsky, 1986) также свидетельствуют против существования на транскрибируемых генах "развернутых" нуклеосом, обнаруженных на рибосомных генах P.polycephalum (Allfrey, 1983). Существование "развернутых" нуклеосом не подтверждается и данны- . ми двумерного электрофореза сшитых комплексов (рис. 7, 8), поскольку талое нарушение структуры нуклеосом предполагает существенное изменение контактов гистонов с ДИК (Allfrey, 1983), которого мы не наблюдали.

В качестве доказательства нарушенной структуры нуклеосом в активном хроматине приводятся также данные о нарушении нукле-осомного повтора транскрибируемых генов (Cohen, 1985; Roae,

1984), причем хроматин гена бтш 70 также обладает этими характеристиками (рис« I). Наши данные о том, что лпзис ядер в условиях ipi3Kofi ионной силы элиминирует эти особенности активного хроматина (рис. 2), позволяют предположить другую основу этого явления. Известно, что при такой обработке нарушается ассоциация транскрибируемых генов с "ядерным матриксом" (Raain,

1985). Именно такая ассоциация (а не изменение структуры нуклеосом), видимо, и является причиной изменения отмеченных характеристик активного хроматина.

Таким образом, результаты, полученные в нашей работе, и литературные данные позволяют предположив следующую последовательность структурных переходов в хроматине при активации транскрипции. Нетрздскрибнруемые участки генома тлеют высококомпактнуп наднуклеосомную организацию, стабилибировакную гистоном HI. При активации транскрипции существенно нарушается структура надяук-леосоыного уровня организации хроматина, что связало с уыеаьше-

наем содержания гистона Н1. При этом, видимо, не происходит существенных перестроек в структуре нуклеосом (сохраняется их общая компактность и первичная организация). Следует отметить, что нуклеосомы должны претерпевать существенные изменения непосредственно в месте прохождения РНК-полимеразы во врем обратимого удаления гистонов или транскрипции через нуклеосомы (конкретный механизм еще не известен). Однако в незанятых молекулами РНК-полимеразы участках активного хроматина снова происходит обратная посадка гистонов на ДНК и восстановление нуклео-сомной структуры. Наконец, при дальнейшей интенсификации транскрипции, когда число молекул РНК-полимеразы на гене приближается к количеству нуклеосом, происходит удаление гистонов с'ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что основные особенности структуры хроматина транскрибируемого гена бтш 70, выявляемые при фракционировании , обусловлены ассоциацией гена с "ядерным матриксом", а 'не изменениями в структуре нуклеосом.

2. С использованием методов фракционирования хроматина и анализа структуры нуклеосом методом двумерного ДНН-ДНК-электро-фореза показано сохранение основных характеристик нуклеосом, расположенных в кодирущей части транскрибируемого гена бтш 70.

3. Показано, что после гидролиза микрококковой нуклеазой нуклеосомы транскрибируемого гена бтш 70 имеют большую длину ДНК, чем нуклеосомы суммарного препарата или нуклеосомы из конденсированного хроматина. Это может объяснять предпочтительную ассоциацию с "активными" нуклеосомами белков нма 14,17.

4. Разработан метод определения "первичной организации"

(расположения пистонов на ДНК) нуклеосом, расположенных .на различных участках генома,

5. О применением этого метода показано, что структура нуклеосом, расположенных на транскрибируемых генах и на неактивных в транскрипции участках генома, существенно не различается.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы.-

1. Студятский В.М., Белявский A.B., Мельникова А.Ф., Мирзабе-ков А.Д. Структура минимальных нуклеосом, расположенных на транскрибируемых участках генома. - Мол.биология, IS88.T.22, вып. 3, с. 706-717.

2. Мирзабеков А.Д., Карпов В,Л., Преображенская О.В., Барыкин С.Г., Збралидзе К.К., Белявский A.B., Студитский B.U. Динамика структуры нуклеосом и хроматина при транскрипции. - 8-й двусторонний симпозиум СССР-Франция "Молекулярная биология , белков и нуклеиновых кислот", 1986, Москва, с. 31.

3. Studitcky V.M., Belyavsky A.Y«, Melnikova А.У., Mirzabekov A.D. The structure of nuoleosomal oore partióles within transcribed and repressed gene regions. - Huol. Acida Rea., 1988, in press.

4..Studitaky V.M., Belyavsky A.V. , Mirzabekov A.D. The structure of nuoleosomes in active chromatin. - In abstracta of 14-th International oongress of Biochemistry, 1988, Prague, v. 5, p. 90.