Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Старение и омоложение побегов при микроклональном размножении на примере Hedera helix L. и Coriandrum sativum L.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Старение и омоложение побегов при микроклональном размножении на примере Hedera helix L. и Coriandrum sativum L."

93

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ИМ. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ПОПОВИЧ ЕЛЕНА АНТОНОВНА

Старение и омоложение побегов при микроклональном размножении

на примере Hederá helix L. И Car i andruit sativum L.

( 03.00.12 - физиология растений)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в' Отделе' биологии клетки и биотехнологии Ордена Трудового Красного Знамени Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР. *

Научный руководитель - кандидат биологических наук-

Н.В.Катаева

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

А.П.Еркаков -- кандидат биологических наук Э.Л.Миляева

Ведущая организация - Главный ботанический сад РАН

Защита диссертации состоится в- /0 час. на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К 002.45.01 при Институте физаногии растений им. К.А.Тиыирязева РАН по адресу: Москва 127276 ул.Ботаническая,35.

Автореферат разослан

1992 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

Ученый секретарь

Специализированного

совета, к.б.н. Л.И.Сергеева.

- 3 -ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы. Проблема старения клонов вегетативно размножаемых растений является одной из фундаментальных оСщэбнологических проблем. Сам феномен клонового старения неоднократно описан (Knight, 1795; Benedict, 1915; МОЛШД.1933; Sax,1962). однэко, не СуЩвСТВувТ единой точки зрения на возможные причины этого явления. Понимание природы клонового старения затруднено тем, что в естественных условиях крайне сложно разделить возрастные изменения, свойственные самим тканям и клеткам растения, и изменения, обусловленные неадекватностью условиям внешней среда. Неблагоприятные для роста условия или накопление вирусной и другой инфекции часто называют причиной вырождения и гибели клоеов.

Основным вопросом проблемы клонового старення является феномен старения меристемы. Одно из существующих положений гласит, что недифференцированные активно делящиеся ткани, какими являются активные меристемы, не успевают накапливать какие-либо возрастные изменения, то есть меристема не стареет (КазарянДЭбЭ; Ефейкин.1970).

Другая точка зрения на вопрос старения меристемы заключается в том, что возрастные изменения растений является следствием накопления возрастных изменений их меристемами (schaffaiitzki, 1959; Тринклер.1982).

Система клонирования растений в условиях in vitro позволяет получать клоны растений, свободных от патогенов, и культивировать их в контролируемых условиях, благоприятных для роста и развития. Культивирование в условиях in vitro позволяет исключить ряд причин возможного вырождения клонов растений, что делает клоны растений in vitro крайне интересной экспериментальной системой, позволяющей глубже понять ^природу клонового старения.

В настоящее время о возрастных изменениях "клонов растений in vitro известно немного, причем данные довольно противоречивы. Наряду с сообщениями об интенсивном омоложении зрелых растений при культивировании in vitro, увеличивается количество данных о быстром созревании ювенпльных растений, размноженных этим методом.

Изучение возрастных изменений, происходящих при длительном клонировании in vitro, является очень важным и представляет огромный практический интерес в условиях активного развития биотехнологий мшфоклонального размножения растений.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований являлось изучение возрастных изменений клонов побегов многолетавго поликарпическо-

го растения H.hsrü* и однолетнего растения с.sativum при длительном культивировании in vitro.

Для решшзацЕк це.ш исследований в работе были поставлены следующие задача:

- получить путем шкрочеренкования клоеы побегов шпоща из меристем ювенильнкх и зрелых побегов;

- изучить влияние регуляторов роста, трофических факторов и физических услозий культивирования in vitro <в той числе света разного качества) на возрастное состояние исходно ввенильных и зрелых побегов Н.helix;

- определить, факторы, поддерживающие исходную возрастную фазу побегов -плица и способствуйте ее изменению;

- исследовать активность корфогенетических процессов изолированных меристем побегов н. hei ix при длительном культивировании;

- получить клоны побегов кориандра и изучить их поведение {особенности морфогенеза и изменение ' возрастной фазы побегов) в течение длительного периода культивирования.

Научная новизна. Впервые изучены возрастные изменения клонов побегов в системэ микроклонального размножения двух жизненных форм: многолетнего древесного поликарпического растения hsde.-a heii« l. и однолетнего монокарпического Coriandrum sativum L. ПрОДЗМОНСТрИРОВЭН феномвЕ старения клонов с.sativum в условиях длительного культивирования in vitro.

Изучены условия поддержания исходного возрастного состояния ювенильпых и условия омоложения зрелых побегов H.hsiix. Показана роль цитокининов и гиббередловой кислоты в процессе изменения возрастного состояния побегов плица in vitro.

Практическое значение. Разработаны метода микроклонального размножения кориандра и ювенильных и зрелых растений шпоща. Показана значи-телыйя способность побегов шшца к реювенилизации при длительном субкультивировании на питательных средах с цитокишшами, что имеет большое практическое значение при определении оптимальной длительности мш-фор а змножзния.

Наблддаемое онтогенетическое старение побегов кориандра при длительном культивировании показало необходимость обновления культур при микроклона льнем размнокении.

Публикации.По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлялись

на Школе по физиологии растений (ПущиноДЭЭО), на Всесоюзном съезде

общества физиологов растений <Мшск,1Э91>, а также ежегодно докладывались на заседаниях Аспирантской комиссии и Ученого семинара Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР АН СССР.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и приложения. Содэркит 158 страниц машинописного текста, 30 рисунков, 22 таблицы. Список литературы включает 254 наименования, из них 222 ссылки на иностранных'авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДи. Характеристика объектов исследования. 3 качестве объектов исследования были выбраны два вида растений, обладающие существенными морфо-физиологическими различиями в ювенильной и зрелой возрастных фазах: плщ обыкновенный и кориандр посевной. Плиц - многолетнее поликарпи-ческое растение, ювевильный период которого длится до 10 лет, при определенных условиях ювенильное состояние побегов может длиться неопределенно долго. Кориандр - однолетнее растение с коротким жизненным циклом" (около • 6 месяцев). Ювенильная фаза кориандра соответствует вегетативному периоду развития, а зрелая 'репродуктивному. В связи с большими различиями в морфологии и физиологии ювенильных и зрелых побегов плица и кориандра оценка возрастного состояния проводилась с учетом фенотипа побегов (формы листа и стебля, филлотаксиса, наличия пигмента и-соцветий, а также способности к ризогенезу и активности роста. Морфологические и физиологические характеристики побегов разных возрастных фаз н.heiix и с.sativum представлены в таблице I. Возрастное состояние клона оценивалось по возрастному состоянию большинства побегов клона (более 50%). .

Побеги ювенильных и реювенильных клонов н. hei ix перед использованием в экспериментах имели ввенильные морфологические признаки. Введение растений з культуру. Для выполнения поставленных задач в культуру вводились апикальные и пазушные меристемы с 2-3 парами листовых црзмордай ювенкльшх И зрелых побегов Hederá helix. ЭКСПЛВНТЫ стерилизовали 30 сек 70% раствором этанола, в зависимости от возраста почек 10-15 мин 0,1% раствором диацида (0,66 г/л цитилпиридинхло-рида + 0,33 г/л этанолмеркурхлорида) и промывали 30 минут стерильной дистилированной водой с добавлением аскорбиновой кислоты 10 кг/л. Таким образом было получено 15 ювенильных и 7 зрелых клонов плюща.

Культура побегов coriandrum sativuo была получена из семкн. Семена стерилизовали 20 мин 0,1% раствором диацида и промывали сте-

рилъкой дистиллированной водой в течение 30 минут.

Таблица I.

Характеристик? побегов н.пеи* и с.sativum различных возрастных фаз Б УСЛОВИЯХ in vitro.

Признака возрастные фззн тэазштия плаща

ивенильная переходная зрелая

лист 5-лопзстной от 3-лопастизгс дс цельного ЦЗЛЬННЁ

фаллотаксис спиральное 172 спиральное 1/2 спиральное 2/5

антсцааковая окраска есть есть нет

ризогекез активный слабей слабый

рост активный 1 активный j слабый i

Пригнала возрастные шазы развития кориандра

Езенильная переходная зрелая

стебель укороченные ночцоузлзгя удлиненные МЭЯЦОУЗЛЕл УДЗШЕЙЕЗПгО мокдп^эетя

лист й*ааду п&ристый д яйцевидными LJH ООНОБ&ННЖ зшшазиднымн кэдрэзашю-Еубчзтыми листочками на даикном черев-кв пешсткй с яйцо-видяан шшсто-надрезавшгёа листочканк на-даикнсад черенке -дз ззда-тр.щда -пористо-оассзчен-с штезнцд'дкми целквккз дояькаьа, зздлшй: на прсдолгсватом по кваа 1тиро1со планчатом влагалище

соцвэтиэ нет нет зонтик |на дазном цве-тспосо

Условии культивирования. В состав всех культуральных срэд входили минеральные соли по прописи Т.Мурасиге и Ф.Схуга (мигазн^да, зкоад .1962) с добавлением тиамина-ны , пиридоксина-нс1 и никотиновой кислоты по 1мг/л, 32 сахарозы и 0,7% агара (основная срзда).

В завксимосга от задач и условий экспериментов для шшца основную среду модифицировали: а) для нультизнрованЕя в первые 6 месяцев в среду добавляли о мг/л Сензиламинопурика (ВАЛ), затем концентрацию БАЛ сникали до I кг/л; перед использованием в экспериментах побеги 2 пассана культив1дзоЕали на среде без гормонов; б) использовали различные концензззации и сочетания рэгулятороз роста (БАЛ, недолил-

уксусная (ПУК), нндолилмасляная (МГЛК) и гиббереллсвая (ГК^), збсци-зовал (АБК), триисздбензойная (ТМБК), 2-хлорэтакфосфоновач (зтрел) кислоты и уникадагол (УК); в) изменяли содержание азота, калия, фосфора, и сахарозы.

Для кориандра к основной среде добавляли: I) I мг/л киаетина (среда I); 2) I мг/л кинетина и 0,2 от/л КУК (среда 2). В ходе куль-тивасования две субкультуры на среде I чередовались с тремя субкультурами на средэ 2.

Основной режим культивирования побегов бшь температура 25°С^1°С. осеощзнность 5000 лк, фотогориод 16 часов к относительная влажность 70%. В основном режиме культивировались побеги шшща на питательных средах со стимуляторами роста, и различными сочетаниями регуляторов роста. Кулиивирозание на средах с ингибиторами роста проводили в основном режиме при 20oCÎI°C. В ряде опытов с изменением физических факторов культивирование проводили при температуре 16°0 к 20°С, освещенности 15000 лк и 30000 лк и фотопериоде 10 часов. Благодаря замене крышек из алюминэвой фольги на крышки из двойного слоя фильтровальной бумаги внутри сосудов для культивирования побегов достигалась относительная влажность 70%. в эксперименте по влиянию спектрального состава света на возрастное состояние побегов н.helix культивирование проведали в камерах с люминесцентнши лампами красного и синего света при одинаковой интенсивности освещения 2000 лк и 20°С-1°С. Длительность субкультивирования составляла 4 недели.

Побеги кориандра культивировали в основном режиме при температуре 20°С±1°С. Длительность пассажа 20 дней.

Эксперименты по влиянию трофических факторов среды на возрастное состояние проводили в соответствии с планом дробного факторного эксперимента ДФЭ'25/8. Статистическая обработка результатов и расчеты проводились в соответствии со схемой регрессионного анализа по В.Н.Максимову (1980).

В эксперимзнте пс длительному культивированию апексов побегов н.helix использовали вэрхуппш юввнильных и решенлльных побегов н.helix размером 2-3 мм. В результате эксперимента оценивали степень морфогенетической активности апекса: длину и количество узлов основного побега, количество вновь образующихся пазушных и адвентивных побегов, активность роста и морфологические признают побегов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

На основной среде с 5 мг/л ВАЛ из меристем ювенильных побегов развивались побеги с 3-5 листочками и характерными пвенильными при-

знакам: 5-лопастными листьями и очередным дисторасположэниом (спиральным 1/2), иногда ыаблждзлась антошановая окраска стеблей. Меристемы зрели побегов в течение первых двух пассажей давали начало медленно растувда побегам с мелкими цельшми овальными листочками. • расположенными спирально (2/5), без антсциановой окраски, что характерно для зрелого возрастного состояния (табл.1).

Таблица 2.

Изменение возрастного состояния зрелых лобегоЕ плода

в течение первых■субкультивирований.

возрастное состояние побегов N пассана количество побегов, %

3 4 * ¡ 6

ювевильнсе 3,3* - 45,0 65 „.0 90,0

переходное 23,3 25,0 20,0 10,G

зрелое 50,0 25,0 5,0 -

некрозы 17,0 5,0 10,0 _ -

*у части побегов определение возрастного состояния было затруднено.

Однако уке в 4-м субкультизирсзанш скорость роста зрелых побегов увеличилась, а цельные листочки постепенно сменялись 3-лопастны-ми (признак переходной фазы) и затем 5-лопастными, расположенными поочередно (1/2) (признаки ювенильной фазы). Н концу 6 пзссака культивирования на питательной среде с 5 мг/л БАЛ исходно зрелые побеги приобрели морфологические признаки ЮЕенильннх побегов (табл.2). Влияние различных экзогенных факторов культивирования на возрастное состояние побегов Hederá helix L. ДЛЯ ИЗУЧвНИЯ ЗЛИЯНИЯ раЗЛИЧНЫХ СТЕ-муляторов роста гормональной природа на возрастное состояние был проведен ряд экспериментов по длительному культивированию побегов плща на питательных средах с одним из регуляторов роста:БАП, ИУК, ИМК и ГКд.

Культивирование на среде с I мг/л БАП привело к формированию побегов с ювенильными морфологическими признаками: 5-лопастной лист и листорасполакание 1/2. При увеличении концентрации БАП до 5 мг/л изрезанность листьев усиливалась, количество лопастей могло достигать 8 и более. Формирование адвентивных корней на этих побегах не наблюдалось (рис.1 а,б). В ходе длительного культивирования активность пролиферации побегов снииалась (уменьшалось количество образующихся пазушных и адвентивных побегов), что сильнее ' проявлялось у ювенильных побегов (рис.2 а). При перенесении на безгормональнув среду побеги укоренялись и удлинялись уке в первой субкультуре. Следует отметить, что посла культивирования на среде с БАП реювешльные

Рис.1. Побега плюща обыкновенного, на питательных средах с одним из стимуляторов роста: а -5 мг/л БАП; б -I от/л БАЛ; в -I от/л ИМК; г -I мг/л ГК3; д -ОД мг/л АБК.

побеги укоренялись быстрее, чем ювенильные (рис.2 б). Эти наблюдения позволяют говорить о наличии физиологических различий между ювениль-зыми и реювенильнЕМИ побегами плюща.

Побеги, образующиеся на средах'с ауксинемп (10 мг/л ИУК, I mi'/л ММК), до появления корней формировали листья с плохо зкрагешзыми лопастями, в некоторых случаях цельные, что соответствует морфологии зрелых и переходных побегов. Наличие актоциановой окраски стеблей и филлотаксис 1/2 позволило характеризовать возрастное состояние побегов как переходное (табл.1). По море укоренения скорость роста побегов увеличивалась 2 они формировали 5-лопастше листья, т.е. приобретали ювенилъный фенотип (рис.1 в, 2 б).

При культивировании на питательной среде с I мг/л ГК3 происходило округление лопастей и удлинение листовых пластинок, удлинение черешков и междоузлий стебля. Постепенно листовая пластинка становилась цельной (признак зрелого побега). Так как листорасположение оставалось 1/2, а у 502 наблюдалась антоццановая окраска стебля, возрастное состояшэ клонов побегоз мокво определить'как переходное (табл.1, рис.1 г). Однако в 6-7 пассажах резко увеличилось количество укореняющихся побегов. Цельные листья постепенно стали заменяться на 3-лопастнке, а затем и Б-лопастнае. К концу 7 нассака 52% ювенклъных и 92% реювенильшх побегоЕ имели ювенильые морфологические признаки, характеризовались актившм ростом и ризогенззом. Интересно, что колгчество укореняющихся реюзенильных побегов было гораздо выше числа укоренившихся ювенильных побегав. Начиная с 10-го пассажа количество укореняющихся побегов начало снижаться, и в 17-м пассаже укоренялось только 20» ректенидьянх (рис.2 в).К' окончанию эксперимента (17</пассаж) только 30% ювенЕЛЬннх и 20% укореняющихся реквенкльных побегов плюща сохранили ювзнильные признаки. Остальные побеги имели признаки переходной возрастной фазы.

Результаты данных экспериментов показали, что формирование побегов с признаками ювенильного возрастного состояния было связано с введением в питательную среду БАЛ или происходило в процессе развития корней. Добавление к питательной среде - ГК3 способствовало развитию побегов переходной фазы.

Следующим этапом работы стал поиск факторов, способствующих переходу ювенильных побегов в зрелую фазу развития. С этой целью была проведена серия экспериментов по культивированию побегов плаща на питательных средах с одним из ингибиторов роста: АБК, ТИБК (ингибитор базипетального транспорта ауксинов), УК (ингибитор биосинтеза

о

о «

Q

£ и

«а

IßP BQ 50

20

.um (cu)

m so £0f fOr -

Щ.

* г S * s -s Г S g ,0 ,S f'} ,S JJ nociaM0

3P.

( 1 д i /7 ¿ т к b <о i: г.г fi 7" tS~ Jt _

: ' UMK (8) ■

i

a

O! Л

"V §

■i OÙ'

-sa\

SU': . iO:

s s

Mb •■

! 1 Z i J! S f T s 3 ""t> !< лг & /•/ ,'i л' naccOficc. áíi- / •

"Г

iff / ,-----

M ■ /

2o\ f

i 9

i г s 4 s (. t- s S ю и lï м л7

¿ s s- г 7~ ¿ f íO // /г' Jy /s Mпакозхл '

:

3 • S

/ S J 4 S- i T i S <U i< rj. ts -fv ff -V /?

■pujotMej

— !\KniLitnbiú peen ---/со. моррслогия.

j. Pu е. P.. Цгженен1/& Juüpipúpifjuojo¿ui?e его-», nbu¿//a.£o£

,t *■?/"> /Го >пА ft.JÏLöf'jri nhtr ПЛЛЬУПГ/АгУ/Т>4п L/t//i jJ л

L

bpeaQJL Сp¿ljM/V¡/¿¿M¿t ¿s^LU^'JíSLm^bZJdJl 'J

- 12 -

гиббереллиноз) и этрел (этиленпродуцент).

Добавление в питательную среду ТИБК и УК вызывало торможение роста и снижение способности к ризогенезу у исследуемых побегов. После перенесения побегов через 3'пассана на среду без регуляторов роста они активно укоренялись, росли . и имели ювенильные морфологические признаки.

Введяние в сроду 0,1 мг/л ASK вызывало у побегов с первых пассажей культивирования снижение скорости роста и появление нэкрозоз листьев. Образующиеся на этой среде побеги имели листья с плохо выраженными лопастяки, очередное листорасположение л антециановую окраску стеблей, характерные для побегов переходной фазы. При культивировании на этой среде у побегов наблюдались признаки физиологического старения: тормокекие апикального роста и развитие апикальных некрозов, отсутствие каких-либо морфогенетпчаских процессов, пожелтение и опадение листьев (рис.1 д).

Культизированиэ побегов плаща ка питательной среде с 0,1 мл/л этрела привело к формированию побегов с ювбнильшми морфологическими признаками. У основания побегов формировался обильный рыхлый быстро нвкротизируицай каллус, иногда в каллусе дифференцировались зачатки корней. Но в процессе культивирования на этой среде наблюдалось пожелтение к некроз листьев и развитие апикальных некрозов Уже в 4-м пассаже некротизировало 40% ювенильшх и 50% реювенилыш: побегов.

Таким образом, введение в питательную среду ТИЕК и УК не влияло на возрастное состояние побегов, а АБК и этрел вызывала физиологическое старение и некроз побегов без перехода к зрелой фазе развития.

Согласно нашим данным развитие побегов с ювенильными признаками сильно коррелировало с укоренением. Поэтому с целью поиска условий развития зрелых побегов мы провели серию экспериментов по культивированию побегов пляща на средах, содержащих препятствующие укоренению сочетания регуляторов роста: ИМК:АБК (1:2; 1:5 рМ); ШйЬГКд (1:1; 1:2 /иМ); ГКд:ЕАП (1:1; 1:2 мМ); ГКд-.АБК (1:1; 1:2 рМ); ТИБК-. ВАЛ (1,0=0,1 мг/л); УК:БАП "(0,1:0,1 мг/л).

При культивировании на средах содержащих ТИБК и ЕАП или УК и Кап исследуемые побеги сохраняли признаки ювекильных.

При культивировании на средах с остальными сочетаниями регуляторов роста формировались побеги переходной возрастной фазы. Листорасположение всегда оставалось очередным 1/2, большинство побегов имело антоциановув окраску стеблей, что соответствует швзеильной

возрастной фазе. Листья в процессе культивирования на этих средах приобретали З-лопастнуи или цельную овальную форыу (признак переходной и зрелой возрастной фазы). На всех средах, содержавших АБК, рост побегов был менее активным.

г,- --- •--

Рис.3. Побег шгица переходной фазы разштия, формирующийся на среде с ГК, и АБК.

Наиболее устойчиво побеги в переходной фазе поддерживались на питательной среде с ГКг. и АБК. Рост и ризогенсз были менее активны, чем у побегов на среде только с ГКд. В случаях укоренения корневая система была слабо развитой. Исследуемые побеги имели в основном цельные листья (рис.3).

Итоги этой большой серии экспериментов представлены схематично на рисунке 4.

Рис.4. С-хема влиянии фитогоркояов на изменение возрастного

■ СОСТОЯНИЯ ПООвГОВ Hederá helix.

юзенильная фзза БАЛ ИУК ювеетльная фаза развития 1

БАЛ ИУК

У1 ИУК

БАЛ

переходная-фаза 1К*+АЖ pa3EIirañ АЕК

развития I

| АБК СоН.

гкг

зрелая фаза развития

АБК

С2Н4

•4'

фкзиолбплескоэ старение

При изучении влияния трофических факторов на возрастное состояние культивируемых in vitro побегов плпца не было обнаружено условий, способствунщх переходу побегов в зрелую фазу. Все побега имели ювенильные морфологические признаки. Анализ результатов показал, что увеличение концентрации сахарозы в среде для- ювеиилышх и К-содерзгащих солей для реювешльных побэгов приводило к активации роста и ризогенеза. Наиболее активно побеги росли и укоренялись на питательной среде с повышенными концентрациями- Р- и К-содэрхащих

солей (1,5 мэ) и сахарозы (7%).

Из литературных источников известно, что температура ниже 20°С, интенсивность освещения 30 Клк, короткий световой день и пониженная влажность способствуют стабилизации зрелого возрастного состояния у иктактных растений к.иаНх. В наших экспериментах при культивировании побегов плюща е условиях понижения температуры (20 и 16°С) к относительной влажности е культуралышх сосудах (50-70%), а также повышения интенсивности освещения до 30000 лк мы не наблюдали появления у ювенильных и рзювекилышх побегов каких-либо признакоз зрелой возрастной фазы. Исследованные физические условия оказывали влияние на активность морфогенвтических процессов (скорость роста и ризогекеза), но не оказывали никакого влияния на морфологию побегов.

Культивирование з условиях освещения светом различной длены волны способствовало поддержанию ювенялыюго состояния исследуемых побегов плюща. Наблюдалось значительное сходство действия красного света на укоренение побегов с действием ауксинов, а действия синего свста но форму листа с действием цктокиншов.

В условиях освещения побегов синим светом наблюдались значительные различия в активности морфегеяеткческих процессов у ювенильных и реювенильных побегов. Укореняемость и активность рост« у рзювенильных побегов была наполовину шже, чем у юбэшшьных побегов. При освещении белым светом у ювенкльннх и роючэнидьных побегов также наблюдались различия в активности морфоганетическпх ответов, хотя и менее существенные, чем при освещении синим светом (табл.3).

Таблица 3.

Изменение морфэгенетической активности побегов плша после 5 месяцев

культивирования в условиях света разной длины волны.

Признаки Исходная количество побегов, %

Еозрастная фаза КС СС БС

укоренение ювен. 90 . 62 58

зрел. 92 29 44

активный ювен. 88 53 67

рост зрел. 84 25 48

Несмотря на сходную реакцию ювенильных и реювенильных побегов на внешние факторы и сохранение ими ювенильных морфологических признаков, некоторые различия в ответах на действие регуляторов роста, трофических факторов, синего и белого света позволяют предполагать о существовании некоторых различий в физиологическом состоянии

ювенильных побегов и реювензльных, формируемых исходно зрелой меристемой (рис.2 г-г, тзбл.З).

Снижение ыорфогенетического потенциала иеристем побегов Hederá hol i:: При ДЛИТеЛЬНОМ КУЛЬ'ГИВНрОВаНИИ in vitre. Большинство образующихся из апексов побегов шкща имели хорошо выраженный ювенильный фенотип. В течение :хрех первых пассажей мы наблюдали увеличение длины основных лебегов и количество формируемых ими узлов. Увеличивалось число образуемых основным побегом пазушных и адвентивных побегов. Все развивающиеся побеги активно росли. Затем до восьмого пасса-ка происходило снижение величин всех оцениваемых показателей (табл.4). Если во втором пассаке длина основного ювэеильного побега составляла в среднем 22,4-1,8 мм, а реювзнильного - 16,35±1,8 ш, то в восьмом пзеезне основные побеги вырастали в среднем до 4,8-0,7 мм и 3,4-0,5 мм,соответственно. Количество узлов, формируемых основные побегом, уменьшилось приблизительно наполовину. В течение второго пассажа стебель шзнильного побега закладывал 6,5-0,3 узлов и реюзе-нильного - 5,7-~-0,з узлов, а в восьмом пас.сане только 4,3^0,4 и 3,6^ 0,3. За этот ке период культивирования значительно уменьшилось число образующихся на основном побеге пазушных и адвентивных с 3,45-0,41 для ювенильных и 2,35-0,53 для реюввнильных до, соответственно, 0,8¿ 0,2 и 0,4±а,1.

Таблица 4.

Характеристика морфогекетического потенциала меристем побегов Hederá hali-.t in vitro.

N пассажа исход, возраст фаза.-. длина осн; побега кол-во узлов OCHOEH. побега кол-во образуют. побегов количество побегов,%

ювенильн. I активы. фенотип рост иекр0'3

ювен. 2 зрел. 22,4±1,8 I6,S±I,8 6,5- 0,3 5,7± 0,3 3,4±50,4 2,35-0,5 85 100 80 100

ЮБ8Н. 8 зрел. 4,8-0,7 3,4±0,5 4,3±0,4 3,6±0,3 0,8±0,2 0,4¿0,I 95 12,5 80 - 20,0

Активный рост сохраняли в восьмом пассаже только 12,5% ювенильных побегов. Среди реювенильных - активно растущих побегов уже не отмечалось.

Первый случай некроза у ювенильных апексов наблюдался в пятой субкультуре, для реювеЕильзых - в седьмой. Как правило, некротизиро-вали апексы, уке на способные формировать побег. В 9-10-ом пассажах

наблюдалось наибольшее количество некротизирующих апикальных меристем и составило 33-26% для ювенильных к 27-50% для реювенильных побегов, соответственно.

Наши результаты позволяют говорить о существовании определенного морфогенетического потенциала меристемы, реализация которого приводит к физиологическому старению и гибели меристем.

Изменение возрастного состояния клонов побегов Co.-iandrum sativum L. В Процессе ДЛИТвЛЬНОГО культивировании in vitro.

В эксперименте было использовано 3 клона in vitro побегов ко-риаддра и прослежено изменение их возрастного состояния.

В течение первых девяти месяцев культивирования (16 пассакей) более 95% побегов сохраняли признаки ювенильных растений (табл.1, рис.5 а). Первые побеги"с удлиненным стеблем к сидячими дважды-трижды перисто-рассечанЕкми с нитевидными цельными долями листья:,щ, формирующие позже соцветия, стали появляться через 3,5 месяца культивирования. Всего же за первые девять месяцев культивирования лишь единичные побеги клона приобретали признаки растений переходного и зрелого возрастного состояния у с, /f t)

Между 16-м и 19-м пассажами без какого-либо внешнего стимулирования произошел переход клонов к зрелой возрастной фазе развития. В этот период культуры побегов поддерживались на среде I. Поведение клоноз в 18-м пассаже мояпо охарактеризовать как переходное. Большая часть побегов клонов (52,5-31,6%) имела признаки переходной фазы развития (табл*5-<5г-€-а-). Б 19-м пассаже ювекильные пркзнзки сохранило только 1,3^1,7% побегов клонов, 62,6^13,1% их были зрелыми, причем 91,4-8,4%.зрелых побегов июли соцветия (рис.6 а).

Зрелым побегам также было свойственно размножение путем активации пазушных и образования адвентивных побегов в каллусе у основания стебля. Побеги, полученные из пазушных, меристем цветущих побегов, всегда были зрелыми и 80% их зацветало уже в первом пассаже после черенкования.

Адвентивные побеги, формирующиеся в каллусе у основания зрелых, изначально имели юзенильные морфологические признаки, но возвращение к зрелой возрастной фазе развития у этих побегов значительно ускорялось. Часть побегов достигала зрелого возрастного состояния уже к концу первого субкультивирования. Количество таких побегов прогрессивно увеличивалось. В 20-м пассаже 34,0^24,0% образующихся адвентивных побегов в первой субкультуре после отделения обладали ювенильнкми признаками, а уже в 24-м пассаже

Рис.5. Побеги кориандра in vitro: а - юЕенильный; б - зрелый в - нитрифицированный зрелый побег с укороченным

цветоносом; г - зрелый побег без соцветия.

кол-во ' побегов % 100

.90 80 70 60 50 40 30 20 10

□ ювенильное ' ^ переходное gg зрелое Щ цветение gj некроз Л-

rf

J

16

19

22

29

_зга

Рис.6а. Изменение возрастного состояния клона побегов кориандра

□ .sativum при ДЯИТеЛЬНОМ КуЛЬТИВИрОВаНИИ in vitra.

КОЛ-ВО

побегов

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

il

20

24

26

33 N пассажа

Рис.66.Изменение возрастного состояния адвентивных побегов

С. sativum при ДЛИТвЛЬНОМ КуЛЬТИВИрОВаНИИ in vitro.

только 3,5^3,5% образующихся адвентивных побегов сохраняли звегатль-ное возрзствое состояние в первой субкультуре (рис.6 б). Начиная с 32-го пассажа уже не образовывались низнеспособные адвентивные побеги, что, на ней взгляд, является признаком старения клона.

Увеличение периода культивирования одаого из трех клоков на среде I до четырех пассажей с 27-го до 31-го привело к возобновления процессоз роэвезшгзйцйи. Б течение 29-го я 31-го пассазсей образовалось около 10% новых адвентивных побегов от общего количества побегов клона. Кз них к концу пассана швенкльнпе признаю! со-хрняяли, соответственно. 1,1 и 2,75; а 2,3 и 3.3S побегов имели признаки переходной формы. Следовательно, при длительном культивировании для процессов реазвенилизации клона (в частности, формирования адаентивных побегов) требуется ужа более длительная обработка цитоккнжами. Зти данные такта подтверждают факт снижения со временем культивирования способности побегов к реюзешишзации.

О старении зрелого кдона кориандра при длительном культивировании свидетельствуют факты постепенного увеличения количества аномальных и некротизирукщих. побегов. В ряде случаев формировались виарафщцровшннае побега, а также укороченные побега с сидячими, зрелей морфологии ллстьклк и коротким цветоносом с необильным сс-пвотаем или побега с, листьями зрелой «лорфологик, не форлздзуотде coiy.s-тй (рис.5 в,г), ¿шкялкыне нехярозч отмечены с 10-го пассажа. КоксотизяроЕалз, в осчоззом, отцветающие и побеги с аномглышг-л развитием. К 33-му хгассзгу час.*« •¿е.'фог'хяфузчях побзгез последнего клопа, испсльсуе.мого в акстериглонте, составило 62.6% (рис.6 а). Увеличение пойегоз с аномалиями развития и юшеалыжх некрозов приходилось па теряод культизчров&нта , при котором реввекклизвштя клонов была минимальна или отсутствовала. Эти дазнь'е позволяют говорить о процессе старения клоков, ведущем к ш, гибели.

ЗАИЛШЕНЕЕ

Формирование юзэаилкннмн мэристемаш кориандра в условиях in vitro ювешлышх побегов и зрелыми меристемами - зрелых побегов, а такие сохранение побегами длнца, развивающимися из изолированных меристем в течение первых пассакей культивирования своей походной возрастной фазы' подтвердили гипотезу о детерминации возрастного состояния на уровне меристемы.

Меристемы побегов плгщз в системе in vitro обладали з значительней степени способностью к ресвенилизЕЩШ. .Развитие у побегов швда ювешхльнкх морфгатизиологических признаков происходило при'

- 2.0 -

культивировании их на средах, содержащих ВАЛ, а также сильно коррелировало с укоренением на других средах. Результаты проведенных экспериментов показали, что из всех групп используемых в экспериментах регуляторов роста именно цитокинины являются гормонами, поддерживающими рост и развитие ювенильных побегов и вызывающие омоложение зрелых побегов.

При культивировании клонов кориандра на питательных средах, содержащих кинэтин и ИУК, происходило увеличение длительности юве-нильной фазы развития побегов, а также формирование адвентивных побегов ювенильной морфологии тканями зрелых побегов кориандра. Однако, несмотря на наблюдаемое омоложение, культивирование побегов кориандра в течение времени, значительно превышающего длительность обычного жизненного цикла растения, позволило наблюдать созревание и физиологическое старение клона. Клоны побегов кориандра повторили все этапы онтогенетического развития отдельного растения. Следовательно, возрастные изменения клона связаны с возрастными изменениями апикальных меристем составляющих его побегов. Анализ результатов, полученных для клонов с.sativum, позволяет говорить о неизбежном накоплении стеблевыми меристемами возрастных изменений, которые ведут к онтогенетическому старению формируемых побегов, при длительном культивировании in vitra, то есть о феномене клонового старения для однолетних травянистых растений, обусловленном старением их меристем.

В ходе '-длительного-'субкультивирозания в условиях in vitro изолированных апексов н.helix наблюдалось постепенное снижение активности морфогенетических процессов, которое приводило к гибели меристемы. Эти результаты противоречат точке зрения о потенциальном бессмертии меристемы и позволяют говорить о существовании у нее определенного морфогенетического потенциала, реализация которого приводит к физиологическому старению и смерти. Цричбм обратимость процессов физиологического старения меристем снижается с увеличением степени реализации их морфогенатического потенциала.

Анализ полученных результатов позволяет сделать следующие выводы:

ВЫВОДЫ

I. Возрастное состояние побегов детерминировано на уровне меристемы. В ходе культивирования побегов с.sativum и на первом этапе культивирования побегов н.helix ювенильные меристемы формировали ювенильные, а зрелые - зрелые побеги.

2. Процесс культивирования in vitro способствует реювенилизации

зрелых побегов. Наиболее значительную роль в реювенллизацки-и поддержании ювеняльЕого возрастного состояния побегов играют цктокияи-ны. У шоголэ'ллего поликарпического растения плюща обыкновенного происходила реювеяилкзация зрелых побегов, которая усугублялась в ходе длительного субкультивировзния. У однолетнего монокарпического растеш!я кориандра образующиеся в основании зрелых побегов адвентивные меристемы формировали побеги ювбнильной морфологии.

3. Анализ возрастных измзнений клонов кориандра с.sativum показал существование феномена созревания и старения клонов при длительном субкультЕзированйИ. В условиях in vitro происходило не только омоложение, но и накопление возрастных изменений, которые приводили к переходу ювенильных побегов кориандра в зрелое возрастное состояние и затем к старению и гибели клона.

4. Длительное культивирование изолированных апексов ювенильных и реювекильных побегов н.hei ix показало существование определенного морфогенетического потенциала меристемы, реализация которого ведет к ее гибели.

5. Существуют физиологические разлитая между ювенильными и реюве-нильеыми побегами, знрзяащиеся в разной чувствительности побегов к действию исследуемых факторов, а также быстроте перехода реювениль-ных побегов к зрелому возрастному состоянию.

6. Экзогенная ГКд з условиях in vitro способствовала формированию побегов н.hei ix переходной возрастной фазы.

V. Введеике в питательную среду ингибиторов роста и использование физических факторов культивирования, способствующих in vivo стабилизации зрелой фазы развития растений плюща обыкновенного, в условиях in vitro не приводили к переходу исследуемых побегов в зрелое возрастное состояние. - Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Катаева Н.В., Попович Е.А., Корнеева Т.В. Влияние экзогенных регуляторов роста На Старение И ОМОЛОЖбНИе ПОбеГОВ Hederá hei ix L. in vitro.//Физиология растений. 1990.Т.37.Вып.5.С.964-972-.

2. Kataeva N.V., Popovich Е.Я., Korneeva T.V. Ageing and rejuvenation of micropropagatinq plants of Hederá helix. In: Abstracts Yllth international congress on plant tissue and cell culture. Amsterdam,Hoiland,June 24-29.1990.P.108.

3. Попович E.A., Катаева H.B., Ксркеева T.B. К вопросу о старении и омоложении меристем стебля при микроклональном .размножении.//Тезисы и съезда ВОФР.МинскЛЭЭО.