Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологические и биохимические изменения при культивировании IN VITRO ювенильных и зрелых побегов плюща обыкновенного (HEDERA HELIX L. )

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Морфологические и биохимические изменения при культивировании IN VITRO ювенильных и зрелых побегов плюща обыкновенного (HEDERA HELIX L. )"

РГБ OA

- 8 МАЙ 19S5

РОССИЙСКАЯ АКАДШЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ©{ЭКОЛОГИИ РАСТЕНИЙ на К. А. ТИМИРЯЗЕВА

lh правах рукописи

ЮРНЕЕВА Татьяна Владимировна

ШРФОЛЭГИЧЕСШ И БЮШИЧВСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ КУЛЬТКР31РОВАНИИ IN VITRO ЮВЕНИЛЬНЫХ И ЗРЕЛЫХ ПОБЕГОВ ПЛША ОБЫКНОВЕННОГО ( HEDERA HELIX L. )

Оа 00.12 - фи8Ко.югня растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЫОСКВА 1995

Диссертационная работа выполнена в Отделе Околоти клетки и биотехнологии Ордена Трудоього Красного Ннаиани Института физиологии растений км. К. А. Тиыарявева РАН.

Научный руководитель - кандидат биологически* наук

Вэдудая организация - Главный ботанический сад РАН

Защита диссертации соотоитса * 30 " мая Ю95г. р 13 часов на васвданин Диссертационного совета К 002.46.01 при институте физиологии растений мы. К. А. Тимирйвева РАН по адресу. 127276, г. кЬсква, ул. Ботаническая, д. 36.

0 диссертацией воюю оеаакодоьсв в библиотека И№ РАН.

Автореферат равосл&м апреля 19«Ьг.

Н. а Катаева

Официальные оппоненты: - доктор биологичзскиа наук

И. П. Ершков

кандидат биодогиадскых наук Я П. Аксенова

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акг}шыюсть теш. Проблет старения клонов вегетативно размножающихся растений является одной ira фундаментальных проблем в биологии развития. Явление клонового старения описано рядом исследователей ( Кренке, 1940; Trlppl, 1960, 1873; Sax 196? Ефейкин 1970; Тринклер, 1972). Однако, до сих гор нет единой точки зрения на возможные причины этого явления. Сложность проблемы заключается в многообразии взаимосвязанных и взаимообусловленных процессов, составляющих сущность старения.

Изучение фазовых переходов затруднено тшетэ из-аа отсутствия надежных морфологических и физиологических критериев, позволяющих четко разделять ювенильную и зрелую фазы развития. В связи с этим, большой интерес представляет поиск белков, специфичных для определенной возрастной фазы . Наличие таких фазоспецифичных белков позволит использовать их в качестве биохимического критерия оценки возрастного состояния растения при отсутствии или неоднозначности шрфологичеашх и физиологических признаков.

В качестве одного из подходов к решению.вопроса о старении и вырождении клонов мояет быть с успехом испольэован метод кикроклонапьного разшюиения растений. При выращивании [слонов в культуре in vitro появляется возможность, моделировать условия культивирования ускорявшие или, наоборот, замедляющие процессы старения. Однако, о возрастных изменениях клонов in vitro на сегодняшний день известно очень немного, причем данные достаточно противоречивы.

Цэхь н задачи 'пиаведрваяиа. Целью наших исследований являлось изучение морфологических и биохимических различий между двумя возрастными фазами развития плюща обыкновенного in vivo и при культивировании in vitro й поиск биохимических маркеров, адекватно характеризующих возрастные фазы этого растения.

Для достижения цели исследований в работе были поставлены следующие задача получить in vitro клоны побегов плюща обыкновенного из меристем ювенильных и зрелых побегов; получить антисыворотки к белкам меристем ювенильных и зрелых по-

бегов; провести иммунохиыическое сравнение различных органоп у ювенильных и зрелых побегов плюда; провести сравнение профилей белков, полученных от побегов и каллусов ювенильных, реювенильных и врелых клонов с целью выявления белковых маркеров возрастных фаз in vivo и in vitro; провести сравнение гормонального баланса побегов плица двух возрастных фаз с целью возможного выявления связи между возрастной фазой и количественным содержанием эндогенных фитогормонов;

Научная новизна Впервые изучены профили белков тканей двух возрастных клонов плюша обыкновенного, культивируемых In vitro. Показаны количественные различия между ними в содержании отдельных белков. Впервые в динамике изучены изменения в белковом составе, происходящие при дедифференциации тканей различных возрастных фаз. Показано наличие каллусоспецифичных белков. Впервые изучено содержание цитокининов в тканях плющ обыкновенного двух возрастных фаз. Показано, что-меристемы, ювенильного растения содержат более высокий уровень цитокининов по сравнению с меристемами зрелого растения.

Теоретическое значение. В работе удалось показать наличие в тканях плюща обыкновенного "ювенильного" белка, который может быть использован в качестве маркера фавоспецифичности. Обнаружение данного белка в растениях in vitro и в каллусах является одним из подтверадений предположения о происходящем в культуре in vitro процесса омоложения. Наблюдаемые различия в содержании эндогенных цитокининов между ювекильными и зрелыми растениями, подтверждают предположение о взаимосвязи между возрастными изменениями и внутренним гормональным балансом раатений.

Публикации и апробация работы, to материалам диссертации опубликовано 7 работ. Результаты диссертационной работы представлялись на Шшле по физиологии растений (Пушино, 1990), на втором Всесоювном съезде общества физиологов растений (Ыинск, 1991), на третьем съезда Всероссийского общэотва физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993) и на второй Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алматы, 1993).

Структура диссертации. Работа ивложена на -fSo страницах

мэшнописного текста, содержит 6 таблиц, 30 рисунков и состоит из введения, 3-х глав, выводов и приложения. Список использованной литературы включает гН источник отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Растительный материал. В качестве объекта исследования использовали плющ обыкновенный, который мокет находиться в двух возрастных фазах - ьвенилъной и зрелой - четко различающихся между собой по морфофизиологическим признакам. Это свойство позволяло оценивать возрастные фазы побегов плща в условиях in vivo и in vitro по их морфологически« и физиологическим характеристикам (форме листьев, ориентации стебля, филлотаксису, скорости роста и способности к ригогонезу). Иэрфофизиологические характеристики побегов разных возрастных фаз представлены в табл. 1.

В работе использовали различные части растений ввениль-ной и зрелой фаз, а такие побеги 2-х клонов (ювенагьного и реювенильного), полученные in vitro от меристем ювенильных к зрелых побегов плюшэ.

Условия культивирования. В состав всех питательных сред входили минеральные соли по Иу рас иге и Скугу (Kfirashlçre, Skoog 1962) с добавлением витаминов в концентрации 1мг/л (ти-ашнаКС!, пиридоксина-HCl, никотиновой кислоты), 32 сахарозы н 0,72 агара (основная среда). Для поддернания in vitro побе-'гов ювенильного возрастного состояния в среду добавляли б ис/л BAIL Для индукции переходного возрастного состояния побегов использовали среду с гибберелловой ( ImM ) и абсцизовой (1 шМ ) кислотами.

Флаконы и пробирки с растениями выращивали в камере фитотрона MP РАН, где поддерживалась постоянна» температура 2^+1"с, 16-часовой фотопериод, осйепенность 5000 лк и относительная влажность воздуха 702. Каллусы, культивировали в чайках Петри в темной камере с рабочим режимом 25*0 и относительной влажностью 701 или в камере фитотрона

Таблица 1. Морфофиэиологические приэнаки побегов плюда. культивируемых in vitro.

| ввенилькые 1 | ^релые 1 ! переходные | реювенильные ! 1

| Б-ти лопастной | цельный |от 3-х лопастного|5-ти лопастной

| лист | лист | до цельного | лист

| очередное листо-|спиральное ди- | очередное | очередное лис-

| расположение (сторасподожекие(листорасположение|торасположение

| активный рост | слабый рост | средний рост (активный рост

| и ризогенеэ | и ризогенеэ 1 | и ризогенез | и ризогенеэ 1 1

Определение содержания эндогенных Фитогормонов. Количественное содержание фитогормонов цитокининового типа действия и абсциБовой кислоты определяли в почках и листьях побегов плица методом иммуноферкентного анализа (ИФА) модифицированного ЕЕ Катаевой с соавторами (1990). В соответствии с методикой Родбарса (Rodbars, 1974) определяли зависимость иеяяу ферментной активностью при инкубации антител и возрастающими концентрациями гормона и ферментной активностью при инкубации 608 экзогенного гормона Полученные значения использовали для построения калибровочных графиков, с помощью которых определяли содержание гормона в образцах. Для опыта брали полностью развернувшиеся листья, находящиеся в одной фазе развития.

Получение антисьшороток к белкам меристем. Для. получения анткеывороток (АС) от- растений ювенильной и зрелой фаз брали пааушные и верхушечные почки, иа которых вычленяли меристемы, состоящие из конуса нарастания и нескольких листовых примор-дий. Материал растирали в охлажденном 0,05 М Трис-HCI буфере (рН 8,5). Полученную ({ акцию суммарных водорастворимых белков очищали от нивкомолекулярных соединений на колонке с сефадек-сом G-БО фирмы "Pharmacia" (Швеция). Затем проводили осаждение белка сульфатом аммония (3QZ насыщение), растворяли в физиологическом растворе и проводили диализ против физиологического раствора Концентрацию белка определяли методом Лоури ( Lowry 0. Н. . et. al. , 1951). фракцию белков ( 1 мг/мл ) вво-' дилн кроликам внутримышечно в течение 6 недель с недельным

интервалом между инъекциями. При первой инъекции к раствору белков добавляли равный объем полного адьюванта врейнда. Последующие инъекции проводили с добавлением неполного адъюванта врейнда. Затем черев 1 месяц после последней инъекции для усиления иммунного ответа проводили реиммунизацию животных, вводя внутримышечно фракцию белков с полным адъювантон фрейн-да. На 7-8 день после ре иммунизации у кроликов брали кровь .из краевой вены уха. «рагащв у-глобулинов получали двойным осад-дением сульфатом аммония ( 302 насыщение) о последующим растворением в физиологическом растворе и диализом против физиологического раствора. В очищенной сыворотке определяли белок методом Лоурн и хранили ее при температуре (-20) С. Таким образом были получены 2 антисыворотки: АС-1 - к бедкам меристем ювенидъньсс побегов, и АС-2 - к белкам меристем зрелых побегов.

Истощение исходных антисывсроток. Для получения антисывороток уэкой специфичности проводили истощэние исходной АС гетерологичными АГ по методике Абелева и Авенкровой (1960). К порциям АС, разлитых в пробирки, добавляли возраставшие объемы тканевых АГ. Затем содержимое пробирок перемешивали, иику-. бировали 16 минут при Ь 37°С и выдерживали в течение суток пря Ь 4°С. Шпавший преципитат осаждали центрифугированием при 6 тьс.оО./шда, в течение 10-20 минут и отбрасывали. Полнота истовдния контролировалась методом ИФА.

Для освобождения, АС от общих для равных органов АГ ис-'польвовали: для АС-1 - суммарные водорастворимые бедки зрелой листовой пластинки и зрелого стебля , для АС-2 - белки юве-ггальной листовой пластинки и свенильного стебля.

Для иммунологической характеристики подученных АС и выявления различий между ними проводилось сравнение степени взаимодействия этих сывороток с различными тканевыми АГ. В качестве АГ испольвовали белковые фракции из разных органов гаешигьной фазы ( меристемы, листовой пластинки, черешка, стебля, воздушных корней) и зрелой фазы ( меристемы, листовой пластинки, черешка, стебля). Эффективность взаимодействия оценивали с помощью ИФА.

Электрофорез водорастворимых белков в ПЛАТ. Одномзрный

электрофореэ с додецилсульфатом натрия, проводили по Лэмли (Laerrmli U.K., 1070) в градиенте ПААГ 8-181 в приборе для вертикального электрофореза в течение 12 ч при силе тока 50 мА и напряжении 40 Е Растворимые белки экстрагировали иэ листовой пластинки, листового черешка, стебля ювенильных и прелых побегов in vivo, из различных частей побегов ювениль-ного и реювенильного клонов растений in vitro, а так»? из каллуса, лолученного от.различных частей побегов этих клонов.

Молекулярную массу белков определяли с помощь» стандартных метчиков фирмы "Pharmacia" (Швеция). Для определения количественного вклада одного белка в суммарный белок и изменения этой доли в процессе культивирования электрофореграымы сканировали на денситометре фирмы Desaga Heidelberg Chromatogramm Densitometer CD-50 при длине волны БбО нм и сравнивали денеитограммы между собой. Каждый эксперимент проводили ni ^неа чем в 4-х-независимых повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние черенкования на возрастное состояние побегов плюща

От растений, ювенильной и зрелой возрастных фав, произрастающих в пределах их естественного местообитания, были получены черенки, которые после укоренения высаживали в сосуды с почвой. В процессе укоренения ювенильные и врелые черенки четко различались медщу собой по ряду морфологических и физиологических признаков, в частности в скорости роста и интенсивности корнеобравования.

Укорененные черенки от ювенильного растения трогались в, рост через 1-2 недели после посадки в почву. На протяжении всего периода культивирования (20 месяцев) полученные побеги сохраняли ювенильные морфологические признаки и имели высокую скорость роста. Зрелые черенки имели более продолжительный период адаптации в почве и трогались в рост через 3-4 недели после высадки в почву. На протяжении первых 2-х месяцев полученные побеги сохраняли признаки зрелого растения и имели за-цед^нный рост (в течение месяца формировался 1 лист). На третий месяц скорость роста этих побегов несколько возрастала ( в среднем образовывалось 2 листа в месяц). Одновременно по

являлись признаки переходного состояния: направление роста стебля менялось от ортотропного (характерного для зрелого растения) к плагнотропному (характерному для ювенильного растения); форма листовой пластинки изменялась от цельной к 3-х лопастной (характерной для переходного состояния), при этом листорасположение оставалось спиральным (характерным для зрелого растения). На 6-9 месяцы почти все побеги, полученные из врелых черенков, имели морфологические признаки, характерные для ювенильной Фазы и почти не отличались по скорости роста от побегов, полученных иэ ювенильних черенков (в течение месяца формировалось 3-4 листа). Динамика изменения возрастного состояния побегов, полученных из зрелых черенков представлена на рис. 1.

месяцы б

Рис.1 Изменение возрастного состояния побегов, полученных из черенков зрелых растений плюша обыкновенного I - зрелые побеги; II - побеги е переходными признаками; III - реювенильные побеги

- .10 -

Таким обравом, в результате черенкования у побегов, полученных от зрелых черенков наблюдалось появление ювенильных морфсфизиологических признаков, что может свидетельствовать об изменении возрастного состояния.

2. Влияние культивирования in vitro на возрастное состояние

побегов плюша.

Для получения растений in vitro в качестве первичных эк-сплантов использовали меристемы ювенильных и арель« побегов с несколькими парами листовых примордий. Из меристем, взятых, от ювенильных побегор, в течение нулевого и первого пассажей об-

Рис.2 Изменение возрастного состояния побегов, полученных из меристем зрелых растений плюша при культивировании in vitre I - врелые побеги-, II - побеги с переходными признаками; III - реювенильные побеги

рааовьтались побеги длиной Б-10 мм с ювенильными прививками (Табл.1) и в последующих пассажах при микрочеренковании побеги сохраняли ювенильнью характеристики. Побеги, полученные из меристем врелых растений росли медленнее, чем побеги, полученные ив меристем ювенильных растений. На нулевом и первом пат -сажах из этих меристем формировались побеги длиной 2-Б мм с морфологическими признаками зрелых растений (Табл.1). При дальнейшем микрочеренковании полученных побегов и их культивировании с каждым пассажем наблюдали увеличение числа побегов с ювенильными признаками. Так, уже в течение 2-4-го пассажей на побегах формировались 3-х лопастные листочки (признак переходной возрастной фазы) и при этом увеличивалась скорость роста побегов. К концу 9-го пассажа все полученные побеги имели реювенильные признаки (Табл. 1;Ркс.2).

Таким образом, были получены два клона растений in vitro: ювенильный - из меристемы ювенильного растения и рею-венильный - из меристемы зрелого растения.

3. Определение эндогенных фитогормонов в почках и листьях ювенильных и.врелых побегов плюшд обыкновенного.

Уровень эндогенных цитокининов в меристемах и листьях двух возрастных фаз измерялся с помощью ИФА. Показано, что содержание эндогенных цитокининов как ряда оеатина, так и ряда иэопентениладеына в почках ювенильных растений значительно выше, чем в почках 8релых растений. Листья ювенильных и iврелых возрастных фаз по содержанию эндогенных цитокининов не различались. Листья in vitro также не отличались по содержанию цитокининов от листьев in vivo. Отчасти это может объясняться тем, что цитокинины не синтезируются в листьях и попадают туда с активным и пассивным транспортом. В содержании эндогенной АБК между органами разных возрастных фаз заметных различий также не обнаружено (Таблица 2).

Листья и ' почки зрелых растений не отличались по уровню эндогенных цитокининов друг от друга, тогда как в ювенильных растениях почки имели бол^е высокий уровень эндогенных цито-кининое, чем листья. Возможно это связано с тем, что апексы ювенильных побегов обладают большей скоростью роста по срав-

ненив со зрелыми побегами и вследствие этого большей аттраги-русарй способностью. Однако нельзя отрицать возможности того, что более активный рост ювенильных побегов может бьпгь следствием более высокого уровня эндогенных цитскининов в почках ювенильных растений, т. к. цитокинииы способствуют активации клеточных делений.

Таблица 2. Содержание эндогенных гормонов в вегетативных почках и листьях плюща обыкновенного

рЧ^\ГОрМОНЫ | орган 1 ^^ i - ...... ..... " ■ (содержание гормонов в нг/г i сырого веса|

| 3? ' + 3 1 ИПА+2ИП 1 АБК | 1

1 I почка 1 1 1 1

j ювенильног- j побега | 32б± 95 | 42.1±0.1 10.8±1.2 |

(почка зрелого побега | 7.9i0.1 1 4.3+2. б 11.3+3.1 |

| лист 1 1

| ювенильного побега I 7.7±4.1 I б. 2±0. 4 12.1±2.1 |

| лист зрелого побега I 8.8±8.1 |5.7*3.1 11.6*2.3 |

| лист in vitro | 1.4±1.2 1 | 5. 6+2.0 .....j._______■ _. , u.ttae 1 i

8Р - зеатинрибозид; 3 - веатин; ИПА - изопентениладеновин; 2ИЙ - изопентениладенин; АБК - абсцизовая кислота

4. Иммунологическая характеристика антисывороток, полученных против белков меристем ювенильных и зрелых побегов плюща.

Используя экстракты водорастворимых белков, вьщеленнда из почек ювенильных и зрелых побегов нами были получены кроличьи поликлональные антисыворотки (АС), которые были охарактеризованы с помощью иммуноферментного анализа. Были неучены перекрестные реакции анг. исывороток АСЫ и АС-2 (АС-1 - .антисыворотка, полученная к белкам меристем ювенильных побегов, АС-2 - антисыворотка, полученная к белкам меристем зрелых побегов) с гетерологичными тканевыми антигенами (АГ), выделен-нши .18 равных органов: черешков, листовых пластинок, стеблей, воздушных корней. Полученные АС взаимодействовали со всеми изученными АГ, до при этом обладали разной интенсив-

йостью реакции. Как и следовало ожидать, наибольшую степень сродства полученных АС, наблюдали по отношению к гомологичным АГ (выделенным иэ меристем побегов, находящихся на ювенильной п зрелой стадиях развития), а наименьшую - к АГ, выделенных ив воздушных корней, полученных от ювенильиых растений (Рис.3 А; 4 А). Для усиления специфичности полученных АС к АГ меристем их истощали АГ, выделенными иэ листовой пластиики. Причем, АС-1 истощали АГ эрелой листовой пластинки, АС-г - АГ ювенильной листовой пластинки. Полноту истощения контролировали с помощью ИОД.

В результате проведенной серии экспериментов истощенная АС-1 не реагировала с АГ листовой пластинки и листового черепка зрелой возрастной фазы и обладала незначительным сродством с аналогичными антигенами ювенильного растения, что свидетельствовало о наличии антигенов, специфичных для ювениль-Еого состояния. Также наблюдалось уменьшение эффективности перекрестных реакций истопрнной АС-1 с другими АГ (рис. ЗБ ).

Истощенная АС-2 полностью потеряла способность реагировать с АГ, как ювенильной, так и эрелой листовой пластинки. На наш взгляд,, это свидетельствует об удалении из АС общих для листовой пластинки и меристемы антител, и, об отсутствии специфичных для зрелой листовой пластин»« (по сравнению с ювенильной) антигенов. Цри этом произошли изменения в эффективности перекрестных реакций истощенной АС-2 с АГ других органов (рис. 4Б).

Таким образом, иммунологическое изучение АГ состава показало, что АГ состав разных органов качественно близок шяду собой и между возрастными фазами. Однако, данные по изменению эффективности взаимодействия истощенных АС с тканевыми АГ указывают на определенную иммунологическую специфичность разновозрастных тканей. Поскольку АС-1, истощенная по АГ зрелого листа, не реагировала с АГ зрелого листа и зрелого черешка, но реагировала с АГ листа и черешка ювенильной возрастной фазы, а АС-2, истогэнная по АГ ювенильного листа ни с одним из листовых АГ не реагировала, но имела высокую эффективность' перекреста с АГ черешка и ювенильной и врелой фаз было сделано заключение о наличии: (а) дагмун^логической неоднородности различных органов; (б) качественных различий в АГ

~ fc) 00

шш

д-uj .III

и -J «, « H

I g 7

5 5 í.

S

a S

К

8 s- S hl « i s S

п.

составе листовых пластинок между ювенильной и зрелой возрастными фавами; (в) качественных различий в АГ составе черешков двух возрастных фаз.

Б. Особенности белковых профилей меристем и листьев побегов, находящихся на равных возрастных фазах in vivo и in vitro.

Большой интерес для исследователей представляет поиск фаяоспецифичных белков, т.к. это позволит использовать их в качестве маркеров возрастных фаз. Однако, ивучение таких фа-воспецифичных белков связано со значительными трудностями, вследствие отсутствия надежных физиологических и биохимических критериев, позволявших четко разделять ювенильную и зрелую возрастные фаза Цель данного эксперимента состояла в том, чтобы опираясь на различия морфофизиологических возрастных признаков найти различия в белковом составе между двумя возрастными фагами.

Профили бежав ьзэристем in vivió и in vitro. Профили белков меристем ювенильнкх и зрелых побегов содержали четыре интенсивных мультиплетных пика в молекулярных областях от 100 до 14 кДа и в целом были схожи между собой (Рис.5А-Б).

Характерный для почек растений in vitro белковый спектр состоял также из 4 групп белков, находящихся в молекулярных областях от 100 до 14 Кда. Выявлены достоверные (Р-0,80-0,95) количественные различия в содержании отдельных белков медду растениями, культивируемыми на разных питательных средах. Так, на среде, содержащей БАЛ и способствующей поддержанию ювенильной фазы наблюдалось более высокое содержание белка N 18 с молекулярной массой 40 кДз, а на среде, способствующей поддержанию переходного состояния и содержащей ГК и АБК -белков N 2; 4; 7; 7А с молекулярными массами 84, 75 , 65, 61. Г кДа соответственно.

Цри. сравнении спектров белков почек, полученных от растений, культивируемых in vitro с профиля »¿и белков меристем, растений in vivo также были отмечены качественные и количественные различия (Рис.5, 6 ). Так, белок N7A, присутствующий в растениях in vivo только в ювенильном листе обнаруживался в почках растений, культивируемых in vitro на равных средах.

-1С-

Дянные сканирования злектрофорвграш беляок жристеи д ~ ювенилытх побегов Я - зрелы* побегов ¡¡adera hellx U in vivo

РИС. 5

Лшяые скалироьаимя алектро}орвграии белков почек побегов Seder a helix L, кулътивируехых in vitro пн пктателъних средах, содержаарлг А - бспвнлаиияопурнв Б - гибОерехзовуя к абецквоаув

рис.6 кислот

ПрофоЕЯ болгшз лжтьез in vivo и in Vitra При сравнении профилей белков листьев цаекильных и врелых растений in vivo била выявлены достоверные CP- 0,90) качественные различия по одному цикорному бедку N7A с иол. м. 61.6 кДа. Этот белок присутствовал в тканях ювенилького листа ц отсутствовал в тканях врэлого листа (рис.7 А-Б). lie яду тканями листьев ювенильных и врелых растений наблюдали достоверные (Р -0,80-0.95) различия до количественному содержанию белков N2,17,24,26 с молекулярными массами 84,^1,19,17 кДа соответственно. При сравнении спектров' белков листьев in vitro (Рис.8 А-Б) были выявлены достоверные (Р- 0,80-0,95) различия в содержании отдельных белков между растениями, культивируемыми на раяньа питательных средах. На среде, способствующей цоддерканию ювенильной фааы, было достоверно вьш содержание белка N 6 с молекулярной массой 68 кДа, а на среде, поддержрваюирй переходную фазу более высокое содержание белков N 4; 19, 25 с молекулярными ыассаш 737 36,18 кДа соответственно. При сравнении спектров белков листьев растений, культивируемых in vitro со спектрои белков листьев растений in vivo были также выявлены количественные различия по некоторым белкам.

Таким образои, показано наличие в тканях листа in vivo специфичного для ювенильной возрастной фазы бедка N7A с шл. м. 61.6 кДа, а также количественные различия в содержании белков тканей вегетативных почек и листьев двух возрастных фаз. Оазоспецифнчный белок N 7А, присутствующий только е ювенильной растении проявлялся в побегах, культивируемых in vitro, что иожет служить одшш из подтверждений предположения о происходящем процессе омоложения при культивировании in vitro.

Данные, полученные с помощью электрофореза подт-

вердили выводы сделанные на основании иммунологических исследований о наличии в-тканях листа фазоспецифичного "твенильно-го" белка..

6. Изменения в ■ содержании растворимых белков в процессе каллусогенеза.

Эксперимент 'проводился в течение 30 дней. В качестве эк-

Г V'

•' И; 'I ¡

2ч ¿г ti у> л»*

V ^ i

.^ifAi iiL..

а мь 2t latAq

""X......... II

Данные сканирования электрофореграии белков листьев данные сканирования электрофореграии белков листьев А - иве шип, пих побегов Б - я ре лих побегов побегов Hederá helix L , культивируемое in vitro

Hedora helix L in vivo Па питательных средах, содержащих

Л - бевзилаиииопурин Б - гибберелаоаую и абеццзовую

кислоты

Рис. 7 Рис.8

»

сшшнтов использовали листовые сегменты растений «авенилъннх и реювенильных клонов. Каллус получали на питательной среде содержащей в качестве экзогенных фитогормонов НУК (2мг/л) и ВАЛ (0,6 иг/л). Видимое каллусообразование наблгцали на первой педеле культивирования. Первичный каллус имел плотную структуру светло-кремового цвета и внешне не отличался у ювениль-ного и реювенильиого клонов.

Для того, чтобы представить картину изменений белкового состава в динамике через каждые 7 дней проводилась экстракция водорастворимых белков из эксплантов, культивируемых на питательной среде и их разделение в ПААГ.

Спектры белков исходных эксплантов ювенильных и реювенильных ююнов составляли схожий рисунок. Их профили имели 4 ярко-выраженные группы мажорных, белков в областях от 100 до 14 кДа. В процессе индукции кадлусогенеза у ювенильных и реювенильных клонов происходили существенные изменения в количественном содержании ряда белков. 00 изменении количественного содержания белка судили по изменению отношения данного белка к общему количеству белка в процентах. Белки, претерпе-■ вающие различные изменения в процессе каллусообразования были разделены нами на 4 группы:

I- белки, количественное содержание которых в процессе кадлусогенеза сначала увеличивалось, а ватем уменьшалось. К таким белкам нами были отнесены белки NN 2,4,7 о молекулярными кассами 84 , 76 , 65 кДа соответственно (рис.9 А-В).

II- Белки, уменьшающиеся в процентном содержании в процессе кадлусогенеза по отношению к остальным белкам. К таким белкам были отнесены белок N 9, группа белков NN17-21 и белки N26 и 27 (рис.9 Г-Е),

III- Калдусоспецифичные белки. Полосы, отсутствующие в исходных эксплантах, но появляющиеся в процессе каллусообра-еования были отнесены наш к каллусоспецифичным белкам. К этим белкам были отнесены белки NN 8, 9А, 9В, 16А, 22А, 27А, 28А, 29А с молекулярными массами 60, б£,5Ц, 43 22, 16,5" 16 и 1Ч кДа( соответственно. По местоположению калдусоспецифичные белки совпадали у ювенильных и реювенильных эксплантов. Однако, динамика их появления и поведения несколько . различались.

Рис. 9 • Количественные измеиенгаг ряда белков при индукции каыусогеяеэа листошй экспластов двух клонов Hederi jhelix в динамике.

1 - ввенильный клон; И - реп^нкиный клон

А - белок H2i Б - СелоК N *ff

В -Г -

3eioK К 7 селок N 8;

Ж - Оелок N 81 Е - бедок N 26

-21-

8АКЛЮЧ8НИЕ

В данной работе была сделана попытка проследить о помощью модельной системы на плицэ обыкновенном„возрастные изменения, происходящие при культивировании in vitro, а таю® опираясь на морфологические и физиологические критерии оценки возрастного состояния найти биохимические маркеры, с помощью которых можно было бы точно оценивать возрастное состояние растений.

Побеги пледа обладали в значительной степени способностью к оыолояениа Через 7-9 месяцев культивирования in vitro побеги плюща, полученные изначально от меристем зрелых растений практически не отличались rio морфофизиологическим признакам от побегов, полученным изначально от меристем юве-нильных растений. И в результате мы имели два клона in vitro: ювенильный - полученный от ювенильного растения, и реювениль-вый - полученный от 8релого растения.

Биохимическими маркерами возрастного состояния могут служить не только качественные различия, но и количественные. Поэтому в процессе поиска биохимических маркеров мы обращали внимание и на количественные различия.

Для поиска биохимических маркеров возрастного состояния были использованы иммунологические подходы . Использование фазоспецифичных антисывороток дало возможность исюпомить об-детканевые антигены и провести методом ИФА сравнение антигенного состава тканей разных возрастных состояний. Были установлены 3 группы белков -АГ: обиеткакевые, присутствующие во всех типах тканей; тканеспецифичные, характерные для определенного типа ткани; фазоспецифичные, присутствующие в тканях определенного возрастного состояния.

Несмотря на сильные внешние факторы .трофической и гормональной природы при культивировании in vitro, а также на процесс репрограммирования клетки при дедифферёнциации белковые профили всех изученных тканей и органов in vivo, in vitro и каллусной ткани имели схожий рисунок.

- 22-ВЫВОДЫ

1. Показано, что в процессе черенкования побегов плова обыкновенного in vivo и при микрочеренковании in vitro происходит процесс омоложения, выражающийся в изменении морфологических и физиологических признаков.

2. В тканях листа обнаружен фазоспецифичный "ввенильный" белок N 7А с мол. массой 61,6 кДа.

3. В тканях растений ювенильного и реввенильцого клонов, полученных in vitro от ювенильного и зрелого растений, а также в каллусной ткани, полученной от растений ювенильного и реювенильного клонов in vitro обнаруживается "ювенильный" белок N 7А, что может служить одним из доказательств происходящего в условиях in vitro процесса омоложения.

4. Содержание эндоген мс цитокининов в почках ювенильных растений плюща значительно выше, чем в почках зрелых растений, что может служить количественным маркером фазоспецифич-ности.

Б. Показана иммунологическая специфичность разновозрастных тканей, выражающаяся в количественном и качественном различии белков-антигенов.

6. Установлено изменение относительного содержания ряда белков и появление калдусоспецифичных белков в процессе кал-лусогенеза Различия в количественном содержании белков у каллусов полученных от растений ю^Йнильнфс и реювенильных клонов сохраняются независимо от их ¡¡происхождения.

7. Белковые,, профили растений!культивируемых in vitro и каллусов, полученных от этих ргютений'сохраняли в своей основе рисунок белковых профилей растений in vival

- 23 -

Список работ, опубликованных по теш диссертации:

1. Катаева K.R, Попович Е.Л., Корнаева Е Влияние эк-оогзшгах регуляторов роста на старение и ошлосэние побегов Hodera hollx L in vitro.// Физиология растений, 1990, т.37, nun. 5, с. 964-972.

2 . Корнеева Т. Е , Катаева Е а , Попович В. А. Лшуиохи-mvieское изучение белков-антигенов, детерыинируаднх ЮБешиьнув И сроду» фазы пл/па обыкновенного. //Тезисы II съезда ВО®, 15ШСК, 1990.

а Корнеева Т. R , Каяьельес II Л,, Катаева Н. а Изучен!» белковых профилей Hederá helix L при;индукции кадлусообраго-вашзд о учетом возрастных состояний.// Тезисы III съезда ВО®, Сайте-Петербург, т. 3, с. 336, 1903.

4. Корнеева Т. а , Каньельес Л. Ы. , Катаева Н. а Сравнительное изучение изыенениЯ профилей белков в культуре in vitro зрелых и ювенильных побегов Hederá helix и Согу1из avellana в связи с дедифференцировкой и каллусообраэовани-еы. // Теэисы II Уездународной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Алматы, т. 1, о. 16, 199а

5. Корнеева Т.Е, Катаева ЕЕ Особенности белкового состава меристем и листьев Hederá helix L двух возрастных фаз.// Физиология растений, 1994, т.41, N6, с.832-837.

6. Попович Е. А., Катаева Н. Е , Корнеева Т. Е К вопросу о старений и омолокекии меристем стебля при микроклональпои размножении. //Теэисы 11 съеэда ВОМР. Иинск, 1990.

7. Kataeva N. V. .Popovioh Е. А., Korneeva Т. V. Ageing and rejuvenation of mlcropropagatlng plants of Hederá helix. Abstracts YII International congress on plant tissue and cell culture. Amsterdam, Holland, June 24-29,-1990, p. 108.

УЧАСТОК МЦОхиТЕЯкНОЯ Т6ХЯНИЦ ОИЦ рАМ H

подо. к печати о- ц ,м ь заказ яч- тираж loo аа.