Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭМБРИОГЕНЕЗА И ФОРМИРОВАНИЕ СЕМЯН СОСНЫ СИБИРСКОЙ (PLXUSSIBIRICA DU TOUR) IN VIVO И В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭМБРИОГЕНЕЗА И ФОРМИРОВАНИЕ СЕМЯН СОСНЫ СИБИРСКОЙ (PLXUSSIBIRICA DU TOUR) IN VIVO И В КУЛЬТУРЕ IN VITRO"

На правах рукописи

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭМБРИОГЕНЕЗА И ФОРМИРОВАНИЕ СЕМЯН СОСНЫ СИБИРСКОЙ (PLWSSIBIRICA DU TOUR) IN VIVO И В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

03.00.05 - ботаника

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск, 2003

Работа выполнена в Сибирском государственном технологическом унннсрсмтсте и лаборатории лесноП генетики и селекции Ипетптлта леса им. В.Н. Сукачева СО РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты;

Ведущая организация

доктор биологических наук И. И. Третьякова

доктор биологических наук Н. Н. Тупишша

кандидат биологических наук В. В. Стасова

Институт биологии Уфимского научного центра РАМ, г. Уфа

Защита состоится "4" февраля 2004 г. в "10" мании дгт. * • • • ?

совета Д 003.056.01 в Институте леса им. В.Н ОРАНл<

Красноярск. Академгородок, Факс +7(3912) ^

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Цистит,та леса им. В.Н, Сукачева ■ СО РАН

Автореферат разослан "/?" декабря 2003 г.

Ученный секретарь диссертационного совета к.ф.-м.н.

А.В. Шашкнн

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исе.чсдошшии.

Одной из главных проблем эмбриологии растений является исследование процессов образ о на пня н развития зародыша, который уже несет в себе организацию взрослого растения. К концу XX века накопились обширные данные по эмбриогенезу многих покрытосеменных и голосеменных растешШ.

Эмбриогенез у сосны сибирской (Pinus sibiríca Du Tour) - одного нз основных лесообразователей гор Южной Сибири, единства шого вида продуцирующего орехи в данном регионе до сих пор изучен очень слабо (Третьякова, 1990), Исследование генеративных органов были направлены на изучение закономерностей формирования урожаев (Ирошннков, 1974, 1978; Некрасова, 1981, 1983; Воробьев, 1974, 1984) и на анализ физиологических процессов, лежащих в основе формирования репродуктивных структур (Минина, Ларионова, 1979). При этом, выявлено, что для семян сосны сибирской характерны: высокая полиэмбриония, недоразвитость зародышей и даже полное выпаденне стадии эмбриогенеза из цикла развития, отмеченное у «аномальных» особей с признаками акселерации репродуктивного процесса.

Для изучения закономерностей эмбриогенеза сосны сибирской и регуляции эмбриональных процессов большие перспективы открываются при использовании методов культуры тканей и органов, хорошо разработанных для покрытосеменных и значительно слабее для хвойных. Для регуляции эмбриональных процессов, направленных на преодоление стерильности семян н выращивание полноценных сеянцев у сосны сибирской, перспективным методом является культивирование мегагамстофнтов и зародышей in vitro.

Этот метод: обеспечит возможность слежения за новообразованием элементов структуры зародыша, его морфогенезом, может способствовать снятию покоя зародыша семян, вызвать пролиферацию клеток; позволит понять процесс дифференциации ткани и будет способствовать получению соматических эмбрноидов.

Цель « задач и исследования. Цель работы заключалась и изучении особенностей роста и развития мегагаметофнтов н зародышей у сосны сибирской in vivo и в культуре in vitro. Задачи исследования:

- сравнительное изучение морфогенеза зародыша в семяпочках прививок сосны сибирской на сосну обыкновенную н типичных деревьев сосны сибирской в условиях in vivo;

- исследование морфогенеза побегов, женских шишек и эмбриологических структур «аномальных» особей с однолетним циклом развития мегаетробилов;

- выявление особенностей внутрисемейного роста зародыша в условиях стратификации;

- исследование процессов роста и раэв1гтия эмбрионов в м era гам его фитах и изолированных зародышей в культуре in vitro',

- индукция адвентивного почкообразовання и получение растений-регенерантов.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование особенностей эмбриогенеза женских шишек у прививок сосны i-nfiupr«-»^ на ^ргну ппыкнощщукц. типичных (двухлетний цикл развития) и «аномальных» (однолетний^^^^^ш^нтня) i

■ HvfWrtOÜ ЛНТ »J,

- ...

деревьев in то: изучены эмбрионхчьпьгс процессы и мегагамстофнтах ti изолированных зародышах на ранних стадиях их онтогенеза в контролируемых условиях in vitro', получен органогенный каллус it индуцировано образованно адвентивных почек о культуре in vitro сосны сибирской.

Практическое значение работы заключается в разработке методов мнкроклоиального размножения при помощи культуры зародышей it ппдукнии адвентивного почвообразования для плантационного выращивания пенных н уникальных генотипов сосны сибирской.

Защищаемые поломсення.

1. Завершение эмбриогенеза п формирование проростков у сосны сибирской в культуре in vitro зависят от стадии зрелости мегагамстофнтов н воздействия определенных гормонов.

2. Акселерация эмбриональных процессов в женских шишках «аномальной» сосны сибирской обу словлена спецификой развития побегов женской сексуализации.

Апробация pejy.itiiuíinioo. Материалы, составляющие основу диссертации, были представлены и докладывались на следующих региональных, всероссийских и международных конференциях: XXX VÍ Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический професс» (Новосибирск, 1998), И Всероссийская научно-практическая конференция «Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растении» (Красноярск, 1999). 11 Всероссийская научная конференция студентов н молодых ученых «Агроэкология и устойчивое развитие регионов» (Красноярск, 2000). 1 межрегиональная научно-практическая конференция «Сохранение биологического разнообразия ПрнсмпссПскоП Сибири» (Красноярск,

2000), X международный симпозиум «Концепция гомеостаза: теоретические, экспериментальные и прикладные аспекты» {Красноярск, 2000), международная конференция «Классификация и динамика лесов Дальнего Востока» (Владивосток,

2001). конференция молодых ученых Института леса СО РАН "Исследования компонентов лесных экосистем Сибири" (Красноярск, 2001), Всероссийская научно-практическая конференция «Химико-лесной комплекс: проблемы и решения» (Красноярск, 2001, 2002), И Всероссийская научно-практическая конференция «Проблемы экологии н развития городов» (Красноярск, 2001), Ш Российская конференция «Флора н растительность Сибири и Дальнего Востока» (Красноярск, 2001). международная научная конференция «Биологические ресурсы и устойчивое развитие» (Пущино, 2001), международный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва-Минск, 2001), международный симпозиум "Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources" (Yalta, Ukraine, 2002), международная конференция «Boreal Forests and Environment: Local, Regional and Global Scales» (Красноярск, 2002), II Международная конференция по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), научно-практическая конференция «Кедровые леса Западной Сибири: современное состояние, использование н восстановление» (Томск, 2002), Xt Съезд русского ботанического общества (Новосибирск, 2003), VIII Международная конференция «Биология клеток растений in vitro н биотехнология» (Саратов, 2003), XII World Forest Congress (Quebek, Canada, 2003)

Публикации. По материалом диссерташш опубликовано 20 работ н 1 статья находится ti центральной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит in введения, 6 глав, выводов н списка литературы, включающего !61 название, в т.ч. 83 на иностранных языках, а также 2 приложения. Работа изложена на 132 страницах и включает 17 таблиц н 50 рисунков.

Автор искренне признателен и выражает глубокую благодарность своему научному руководителю д.б.н. И,П. Третьяковой за всестороннюю поддержку при выполнении работы и благодарен д.б.н. E.H. Муратовой, д.б.н. Л,И, Милютину, к.б.н. 10.11. Баранникову, к.б.н, Г, В. Кузнецовой и директору Западно-Саянского опытного лесного хозяйства Ю.А, Черсповскому за многостороннюю помошь в научной работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Особенности формирования зародышей и классификация их типов у покрытосеменных н голосеменных растсниЛ in vivo н in vi ir о

В главе обсуждаются различные аспекты морфогенеза половых (знготических) л соматических зародышей покрытосеменных н голосеменных растений. Классификации эмбриональных типов зародышей разработаны для покрытосеменных растений Schnarf (1929), Soueges (1938), Johansen (1945, 1950) и Батыгпной (1999), а для голосеменных растений Singh и John (1972) и Singh (1978). В основу классификации положены способ возникновения проэмбрно н степень участия его клеток в образовании основных частей зародыша. У покрытосеменных формирование клеточных стенок завершается в зиготе, а у голосеменных проэмбрио характеризуется свободноядерной стадией развития.

В последнее десятилетне выявлено, что наиболее высокая частота регенерации идет путем соматического эмбриогенеза в культуре in vitro, который широко используется у покрытосеменных растений и слабо изучен у хвоГшых. В настоящее время эмбрногенные ткани и соматический эмбриогенез получен у 6 видов ели: Picea Rímica (Hakman, Arnold, 1988; Lu, Thorpe, 1987; Hakman, Fowke, 1987), P. abies (Hakman et al, 1985; Egcrtsdottcr, Arnold, 1998; Vaguer et al, 1998), P. mañana (Hakman, Fowke, 1987), P. amortie (Salopen et al, 1997), P. enge I ma ¡mi i (Roberts et al, 1991), A silchensis (Drake, John, 1997); y 4 видов сосны: Pinns taeda (Becwar et al, 1990; Li et al, 1997), A elliotii (Liao, Amerson, 1995), A strobus (Finer et al, 1989; Klimaszewska, Smith, 1997; Park, 2002), A lamba-liana (Gupta, Dursan, 1987); у 3 видов лиственницы; Larix decidua (Aderkas, Bonga, 1988; Behrendt, Zoglauer, 1996), L. ieptolepis (Ogita et al, 1997; Jourdein et al, 1997), L eurotepis (Bonga et al, 1994); у 1 вида пихты: Abies fraser i (Guevin, Kirby, 1997; Rajbhandari, Stomt, 1997) и у дуглаенн Pseudotsuga menziesii (Hong et a], 1991; Nagmani et al, 1997). При этом показано, что образование гаплоидных и диплоидных соматических эмбрпопдов зависит от типа эксплантов (эмбрно, мегагаметофиты), стадии развития зпготичсского зародыша, а также применения активизирующей среды, включающей гормоны, углеводы, аминокислоты и др. Наиболее трудным при культивировании и выращивании соматических змбриондов, та осе как и др. культур in vitro, у хвойных, является их дозревание и образование зародышевых корней.

В России методы микроклопального размножения были разработаны в ЦНИИЛГнСе (г. Воронеж) для ряда древесных видов (Quere its robur, Be tula pendula и Populas), в Уфимском научном центре для Larix sukaezemi и в Институте леса СО

РАН для Picea obovata, Larix sibirica и Pima sibirica, P. sylvestris. Были получены: каллусиые культуры, культура зародышей и меристем, культуры изолированных почек (Бутова и др., 1989; Скрипачеико, 1993; Путешшш, 2000; Машкина и др., 2001), показаны гистологические картины первых этапов морфогенеза в изолированных культурах у Pinns sylvestris, P. sibirica, Larix sibirica. Picea obovata (Филиппова, Третьякова, 1997-2000r.; Treryakova, Novoselova, 2001; Treryakova, Novosetova, 2002).

Культивирование мегагаметофитов in vitro и индукция соматического эмбриогенеза у сибирских видов хвоПных до сих пор не проводились. Знание закономерностей, лежащих в основе эмбриональных процессов при формировании зиготическнх зародышей у сосны сибирской in vivo и in vitro, позволит манипулировать эмбриональными процессами и индуцировать появление соматических эмбриоидов.

Глава 2. Характеристика района работ, объекты и методы исследования Характеристика района работ.

Работа проводилась на территории Погорельского ОЭПа и в естественных древостоях низкогорья Западного Саяна (Ермаковский и Шушенский районы). Климатическая, почвенная и лесорастительная характеристика районов исследования Погорельского ОЭПа н низкогорья Западного Саяна подробно дана сотрудниками Института леса (Поликарпов, Назимова, 1963; Протопопов и др., 1965; Смирнов, 1970; Поликарпов и др., 1986). Объекты и методы исследования.

Объектами исследования служили - деревья четырех клоновых прививок сосны сибирской на сосну обыкновенную (Pinus sylvestris L.), произрастающие на прививочной плантации Погорельского ОЭПа, типичные деревья сосны сибирской с двухлетним циклом развития женских шишек (№ 492, № 476) и «аномальные» формы с однолетним циклом развития (Ks 1ш, № 100), произрастающие в естественных древостоях Западного Саяна. Кроме того, в исследование были использованы семена, собранные с типичных деревьев сосны сибирской из низкогорья (район р. Оя, 450 м над у.м.) и среднегорья (район р. Мутная, 550 м над у.м.) в Западном Саян е.

С указанных выше клоновых и типичных деревьев сосны сибирской проводился сбор шишек 2-го года развития в период предшествующий оплодотворению, в период оплодотворения и последующим формированием проэмбрно и эмбрио. Сбор образцов шишек осуществлялся систематически через каждые 3 дня с периода, предшествующего оплодотворению (с 111 декады мая) до I декады июля и далее раз в 10 дней до конца августа (срок созревания семян). У аномальных гетерозисных форм сосны сибирской собирались образцы шишек первого года развития через 1 месяц после опыления н далее через каждые 3-5 дней до конца августа. Методы исаедования

В процессе исследования вегетативных и генеративных органов сосны сибирской, произрастающей на клоновых прививочных плантациях и в естественных древостоях, были использованы эмбриологические, морфометрические, цитологические методы исследования вегетативных и генеративных органов, применяли метод культуры тканей к органов, Цитоэмбр ио.юги ческие исследован ия

При эмбриологическом изучении в основном использовалась та же методика,

•¡то 11 при исследовании покрытосеменных растений (Полдуоная-Арнольд», 1976;-Бзтыгнна, 199). Для цитологических н цитохимических исследован и Л применялась фиксирующая смесь Навашина (Паушева, 1980). Постоянные препараты готовили по обшеизвестной в микротехнике методике (Прозона, 1960).

Для окрашивания тканей использовались цитохимические методы исследования. Они включают ряд приемов, направленных на выявление специфических веществ и характер распределения их в клетках. Срезы окрашивали процпоновыми красителями (Иванов. Литинская, 1967; Иванов, 1982), гематоксилином по Гейденгайну (Дженсен, 1965), реактивом Фельгена-Шнффа (Паушева, 1980).

Просмотр микроскопических образцов осуществлялся на микроскопах МБП-6. СССР и KS 300 Imaging System (Германия). Замеры эмбриональных структур проводили при помощи окуляр-микрометра с последующим переводом полученных единиц в мкм. Морфологические изменения фиксировались цифровой видеокамерой Nikon (Япония) и фотоаппаратом «Зенит».

Статистическая обработка материала проводилась вариационно-статистическим методом (Рокннкий. 1973) и с помощью пакета программ Microsoft Excel.

Морфомстрия жеиских побегов и почек

Для исследования морфогенеза женских побегов и почек проводилось изучение морфологических параметров приростов текущего года, и осуществлялся гистологический анализ женских почек в период окончания роста побегов. При исследовании морфологических параметров приростов текущего года замерялась протяженность побега (L). протяженность побега, занятого хвоен (1), определялась степень о.хвоенности побегов (отношение 1/L, выраженное в %), под считывал псь число брахибластов на побеге и длина хвои.

При гн стол отческом анализе женских почек на постоянных цитологических препаратов проводилось описание характера заложения метамерных органов: кроющих чешуй. укороченных побегов (брахибластов) и мегастробилов. Оценка семейной продуктивности

Оценка семенной продуктивности женских шишек проводилась по методу Д.А. Сабинина (1975), разработанному для злаковых культур и модифицированному для хвойных (Минина, Третьякова, 1983). Учитывали следующие показатели строения женских шишек: длина и ширина шишки, число семенных чешуй (обшее, развитых), число семян. Под показателем семенной продуктивности считали отношение числа семян (А) к числу семенных чешуй (В), увеличенных вдвое и выраженное в

Стратификация семян

Для проведения стратификации использовались 4 партии семян сосны сибнрскоП, произрастающей в Западном Саяне: №1 - семена с дерева 476, №2 -семена с дерева 492, ЛеЗ - смесь семян из района п. Листвянка (450 м над у. м,). №4 -смесь семян из района р. Мутная (550 м над у, п.). Закладка осуществлялась во влажный песок в холодной комнате при температу ре + 41 С. Анализ развития семян в процессе стратификации проводили через 1.5, 3 и 4 месяца при помощи рентгенографии (Щербакова, 1982; ОСТ 56-94-87, 1988), Учитывали длину и ширину зародыша и семени, а также определяли вес семян. Для определения жизнеспособности семян проводилось окрашивание зародыша и эндосперма при

помощи реактива Люголя (Саляева, Данович, 1983). К жизнеспособным были отнесены семена с хорошо окрашенным корешком. Культивирование эксплантов в культуре in vitro

Для изучения за кон омерн остей роста и развития в контролируемых условиях проводилось культивирование эксплантов (мегагаметофптов и изолированных зародышей) в культуре in vitro. Базовыми средами были MS (Murashige, Skoog, 1962), LP (Arnold, Eriksson, 1987) со следующими гормонами: ауксины - ИУК, 2.4 Д, а-НУК; Ш1Т0КИНИИЫ - 6-БАП, кииетин (табл. 1).

Таблица I

Гормоны № среды ИУК а-НУК 2,4 Д 6-БАП Кинетнн

MS1 0.1 0,5

MS2 0,2 1

MS3 0,1 0,03

MS4 0,1 0,03

MS5 2 0.2

MS6 1 0.2

MS7 0.5 0.2

MSS 1

MS9 2

MS10 2 2

MS 11 4

MSI 2 безгормональная

LPl 1 5 2,5 |

LP2 безгормональная

Стерилизацию эксплантов проводили в зависимости от исходного материала и применяемого вещества. В качестве стерилизаторов использовали следующие растворы: ) %-ный раствор сулемы (1-3 мин), 3 %-ный раствор Йода (3-5 мин) и 5 %-ный раствор гипохлорита Na (3-5 мин). Затем эксплаиты промывались 3 раза по 20 мин. в стерильной дистиллированной воде и в антисептических условиях в ламинар-боксе семяпочки освобождались от жестких верхних покровов и помещались на агарнзованную среду с фитогормонамн.

Культивирование мегагаметофптов и изолированных зародышей сосны сибирской проводилось на разных стадиях развития: со стадии вакуолизиро ванных архегониев (5-7 сут до оплодотворения) и зрелой яйцеклетки; со стадии зиготы и до созревания семян.

При культивировании семяпочек в стадиях вакуолизированных архегониев и зрелой яйцеклетки ткани нуцеллуса, в котором находились пыльцевые трубки, отрывались от мегагаметофита, поэтому в культуру вводились 2 варианта эксплантов; мегагаметофиты с нуцеллусом и изолированные мегагаметофиты. Культивирование мегагаметофптов на данных стадиях и в период оплодотворения осуществлялось в 2 этапа, различающихся составом компонентов модифицированной среды MS (Кашин и др., 2000). Первый этап был направлен на активизацию деления яйцеклетки и образование проэмбрно. На данном этапе ведущую роль отводили цитокининам, концентрация которых превышала концентрацию ауксинов в 5 раз - MSI, MS2

(таол.1 ). также было повышенное содержание сахарозы до 5 %. Второй этап был направлен на индукцию развития зародыша. На данном этапе культивирования преимущество отдавали ауксинам - MS3, MS4 (табл.1), содержание сахарозы уменьшалось до 3 %.

В более поздние сроки развития (конец нюня - начало июля) проводилось культивнрованне как эмбрионов вместе с мегагаметофнтамн, так и изолированных зародышей. Культивирование незрелых эмбрио вместе с мегагаметофнтамн было направлено на развитие эмбрио внутри мегагаметофнтов и для этого использовалось комбинированное влияние ауксина н шгтоквшша, среды MS5, MS6 и LP 1 (табл.I), причем концентрация ауксина была выше концентрации щггокннпна.

Культивирование изолированных недоразвитых зародышей (занимающих < '/: длины зародышевого канала) проводилось на средах MS7 и MS12 (табл.1). С целью изучения доразвитня изолированных недоразвитых зародышей в культуре in vitro и влияния на них гормонов посадка эксплантов осуществлялась на среду* с гормонами и безгормональную. Культивирование недоразвитых зародышей (занимающих > '/: длины зародышевого канала) вместе с мегагаметофнтамн производилось на среде MS 12, LP2 (табл.]).

Для получения адвентивных почек изолированные зигот иче с кие эмбрио культивировались на средах MS8, MS9 и MS11 (табл.1), В состав этих сред в качестве гормона использовался цитокиннн (БАП) в различных концентрациях. После первого пассажа полученные адвентивные почки пересаживались на две среды: MS9 - оптимальная среда для получения новых адвентивных почек, н MS10 - для дальнейшего развития полученных адвентивных почек в жизнеспособные растения.

Глава 3, Особенности эмбриогенеза сосны сибирской in vivo Эмбриогенез в семяпочках 2-го года развития на прививочной плантации сосны сибирской на сосну обыкновенную к Красноярской лесостепи

Развитие органов половой репродукции у сосны сибирской на прививочных плантациях Погорельского ОЭПа проходит в течение 3-х вегетационных периодов, так же. как у других видов сосен. В первый год развития в конце июля закладываются мужские и женские генератнвные почки. Весной следующего года (второй год) в середине мая завершаются эмбриональные процессы в почках, и происходи формирование семяпочек. D первой декаде июня протекают процессы опыления, прорастания пыльцы и развивается свободно-ядерный женский гаметофиг (до середины июля), со второй половины июля все эмбриологическое развитие останавливается: семяпочка впадает в органический покой до весны следующего года. Весной третьего года репродуктивного цикла в семяпочках формируется клеточный гаметофнт, В конце мая в апикальном конце гаметофнта образуются 2-4 клетки архегониев (рис.1). Развитие архегониев до зрелой яйцеклетки занимает 7-10 дней.

ем

■ ™¡--------------- ----------------------Рис. 1.

i т......................

; 'ц _ ■ Динамика роста

к«*« (Ц.ЙГ.Р1 Юней* прививочной

oíioi d?\ra o\u¡> eí39i ojjch от* шшнтцщш

Через 10 дней после образования архегониев центральная клетка достигает

максимальном величины и делится, образуя яйцеклетку и брюшную канальцевую клетку. С момента деления центральной клетки возобновляется активность мужского гаметофита, в котором образуются две одинаковые по размеру мужские гаметы, и начинается рост пыльцевых трубок к архегониям. Зрелая яйцеклетка имеет гомогенную окраску, ядро ее округлой формы (137±5,5 мкм в диаметре) лежит в центре архегония. Слияние мужских н женских ядер происходит в центре архегониев. Деление зиготы длится одни сутки.

Процесс формирования зародыша - непосредственно эмбриогенез у сосны сибирской можно условно разделить на 3 микроскопически видимых стадий. Первая стадия развития зародыша - стадия проэмбриогенеза наступает во второй декаде июня. Стадия проэмбриогенеза у сосны сибирской состоит из свободного деления ядер, миграции свободных ядер к основанию архегония и первых клеточных делений. Вся проэмбрпональная стадия продолжается 7 дней. Формируется 1б-клеточное четыре »ярусное проэмбрио по USE-тшту, Нижний ярус представлен эмбриональными клетками, второй - суспензорными, третий - розеточный и четвертый (верхний) остается открытым, т.е. его ядра свободно лежат в цитоплазме без образования клеточных стенок. Следует отметить, что в пределах одного мегагаметофита из 2-4 архегониев оплодотворяются, как правило 2, и в каждом мегагаметофнте идет параллельное развитие 8 зародышей. При прохождении проэмбриональной стадии развития в ме гагам етофитных клетках, дающих начало зародышевому каналу, начинается накопление нуклеиновых кислот, белков и крахмала.

Во второй декаде нюня клетки еуспензорного яруса проэмбрио растягиваются н выталкивают нижний эмбриональный этаж через оболочку архегония в ткани мегагаметофита. В это время проэмбрпональная стадия развития переходит во II стадию - стадию раннего эмбриогенеза. Вторая стадия эмбриогенеза включает быстрое растяжение эмбрионального суспензора (первичного суспензора) и деление эмбрионального этажа, формирующего группу маленьких эмбриональных клеток, расположенных в мегагаметофнте. При внедрении в зародышевый канал рост суспензоров идет в различных направлениях. В результате этого каждое проэмбрио расщепляется на отдельные эмбрионы, т.е. идет кл и важная полнэмбрнония. Наряду с кливажной можно наблюдать и простую пол и эмбрион к ю. Мегагаметофитные клетки, находящиеся в центре, теряют свое содержимое И лизируются, формируя коррозийнлто полость.

Эмбрио, расположенные первыми в мегагаметофнте, нарастают массой клеток более энергично и формируют большее число клеток, по сравнению с эмбрионами, идущими позади. Отстающие эмбрио прекращают свое развитие. Через 10-15 дней после внедрения в зародышевый канал, эмбрионы увеличиваются в размере, вступая в глобулярную стадию развития с делением на апикальную и базальную части, с длинным многоклеточным подвеском. Длина такого эмбрио составляет 121±0,9 мкм, ширина 81±2,9 мкм,

С началом дифференциации зародышевой оси зародыша наступает III стадия развития эмбрио - стадия позднего эмбриогенеза. Эта стадия начинается в середине I декады июля (через 4 недели после оплодотворения). Зародыши на данной стадии развития визуально видны в виде торпеды, длина их составляет 1-1,5 мм и уже можно видеть наметившуюся дифференциацию на основные части: семядоли, гипокотиль и зачаточный корешок.

Таким образом, активный эмбриогенез у клонов сосны сибирской, привитых на сосну обыкновенную, завершается за 40 днеП после оплодотворения. За это время длина зародыша достигает 0,3 длины оси зародышевого канала.

Эмбриогенез в семяпочках 2-го года развитая г типичных деревьев сосны сибирской в Западном Саяне

Развитие эмбриональных структур у типичных деревьев сосны сибирской, произрастающих в естественных древостоях Западного Саяна идет так же, как н у деревьев с прививочных плантаций. Образование архегоинев и оплодотворение (конец мая - начало первой декады июня) проходит на 7 дней раньше по сравнению с клоновой прививочной плантацией на Погорельском ОЭПе. В семяпочках формируются 3-4 архегония. Размеры зрелых архегоинев у деревьев в Западном Саяне не отличаются от архегоинев деревьев сосны сибирской с прививочных плантаций из Красноярской лесостепи (рис.2).

Рис. 1. Динамика роста архегоинев у типичных деревьев из Западного Саяна

Оплодотворение происходит через 5 дней после деления центральной клетки, ход оплодотворения идет аналогично деревьям с прививочной плантации.

Процесс формирования зародыша у типичных деревьев так же, как и у деревьев с клоновой плантации, проходит 3 стадии. Стадия проэмбриогенеза наступает после оплодотворения в конце первой декады нюня п продолжается 7 дней. В середине июня (через 7-9 дней после оплодотворения) клетки второго яруса проэмбрио -клетки суспензора удлиняются и выталкивают эмбриональный ярус через оболочку архегония в мегагаметофит.

Стадия раннего эмбриогенеза начинается с быстрого растяжении первичного суспензора и деления эмбрионального яруса. При вхождении эмбрионов в зародышевый канал мегагаметофита происходит кливажная полиэмбриония. Через 10-15 дней после внедрения в зародышевый канал (22-27 нюня) эмбрно достигает величины 120±1,1 мкм в длину и 82±1,5 мкм в ширину (рис.3.).

В SM -

Рис. 3. Рост эмбрно у типичных деревьев сосны сибирской т \-ivo. 1 - стадия оплодотворения; 1 - стадия внедрения эмбрно в зародышевый канал, 3 -стадия 12-клеточного эмбрно (булава), 4 -точечный зародыш, 5 ~стадия торпеды, 6 -стадия заложения семядолей.

Дифференциация зародыша (стадия позднего эмбриогенеза) происходит в начале I декады июля. В этот период длина зародыша составляет 1-1,5 мм. В конце 1 декады июля зародыш достигает 3 мм в длину и 1 мм в ширину. Рост зародыша заканчивается в начат е августа. В этот период у зародыша четко выделяются семядоли, пшокотиль и зародышевый корешок. Средняя длина зрелого зародыша составляет 6-7 мм. Морфологическое вызревание семян происходило в середине августа.

Проведенные исследования как на деревьях сосны сибирской с прививочной плантации, так и из естественных древостое в показали, что стадия развития эмбриологических структур отражает динамику роста семяпочек. Так на момент оплодотворения размеры семяпочек увеличиваются в два раза. Между клонами и типичными деревьями наблюдается дифферент!ация по величине (рис. 4),

Рис, 4. Динамика роста семяпочек по длине у деревьев (а) с прививочной плантации и типичных (б) деревьев.

В целом, эмбриогенез у сосны сибирской на прививочных плантациях (Красноярская лесостепь) и в естественном древостое (Западный Саян) происходит одинаково. Различия возникли лишь в сроках прохождения оплодотворения, стадий эмбриогенеза и формировании более мелких архегониев у деревьев с прививочной плантации. Зародыши зрелых семян сосны сибирской характеризуются незавершенностью эмбриогенеза, длина зародышевой оси занимает от '/з до У» длины зародышевого канала. Семена требуют доразвития и внутрисемейного роста зародышей.

Глава 4. Развитие эмбриональных структур у «аномальных» деревьев сосны сибирской с однолетним циклом развития женской шишки

Отдельные уникальные формы с признаками акселерации развития женских шишек были обнаружены в древостоях Западного Саяна АН Ирошннковым (деревья .N'a 808, № 810, № 100) и Ю.А. Череповским (№ 1ш). Созревание женских шишек и формирование семян у указанных выше генотипов происходит в год опыления за 1,52,5 месяца (вместо 14-15 месяцев). Формируются беззародышевые семена с развитым эндоспермом (Ирошннков, 1974; Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990; Кузнецова, 2001). Внешне «аномалии» проявляются в локализации зрелых женских шишек на кончиках побегов, там, где обычно располагается озимь.

Проведенные раннее цнтоэмбриологичеекие исследования двух «аномальных» особей сосны сибирской (деревья № 808 и № 810) показали, что заложение генеративных структур, опыление и начальные этапы формирования гаметофитов

происходят так же, как у типичных особен (Третьякова, 1990), Однако через I мес после опыления у данных особей резко возрастает активность женского гаметофита. Через 2 мес появляются архегоини, но оплодотворения яйцеклетки не происходит из-за отсутствия пли медленного роста пыльцевых трубок. Таким образом, аномальные особи не могут быть размножены семенным путем.

Еще более сильная акселерация эмбрионального развития была обнаружена у 2-х «аномальных» особей сосны сибирской дерево Л*° 1ш (Шушенский район) и Ka 100 (р. Мутная). Общей морфологической особенностью деревьев № 1ш и № 100 отличающих их от описанных выше аномальных деревьев (№ 808, № 810) является внешний вид женских побегов, несущих однолетние шишки - большая часть таких побегов была лишена хвои. Хвоя располагалась в частях женских побегов, прилегающих к женским шишкам. Морфогенез женских побегов

Рост побегов у деревьев сосны сибирской в Западном Саяне заканчивался в конце второй декады июля. Женские генеративные почки после окончания роста побегов у «аномальных» форм сосны сибирской были хорошо сформированы и составляли 12-15 мм в длину. Проведенное гистологическое исследование показало определенную последовательность в заложенин метамеров по оси женской почки. В основании почки формировались несколько рядов (3-5) стерильных чешуй, начиная с середины оси происходило заложение зачатков у короченных побегов (брахнбластов), последними в апикальной части оси побега закладывались 2-3 зачатка м era стробилов. В целом, морфогенез женских генеративных почек у «аномальных» особей отличался от типичных деревьев сосны сибирской (Минина, Ларионова, 1979: Некрасова, Воробьев, 1982). Эти отличия выражались в отсутствии хвои (брахнбластов) в базальной части побега и локализации их в непосредственной близости от женских шпшек на верхушке побегов. Охвоенность побегов колебалась от 25 до 67 %. Длина хвои составляла 13,5-15,3 см. Длина женских побегов колебалась от 38 до 113 мм. В верхушечной части женских побегов развивались 2-3 шишки.

Таким образом, морфогенез женских побегов у «аномальной» сосны с однолетинм циклом развития женской шншки направлен на акселерацию развития мегастробилов - их необычный интенсивный рост, формирование патовых структур; даже органогенез вегетативных органов (брахнбластов) на женском побеге происходит только в части побега, прилегающего к женской шишке. Структура урожая женских шишек

Женские шишки «аномальных» особей сосны сибирской отличались от типичных с 2-х летним циклом развития более мелкими размерами. Женские шншки с однолетним циклом развития формируют такое же число семенных чешуй (77 шт.), как и типичные двухлетние шишки (73 шт.). Число сформированных семян в шишке у «аномальных» деревьев, как правило, ниже, чем у типичных. Однако в 2002 г. у дерева № 100 это число превышало аналогичную величину у типичных деревьев (84 шт. у «аномальных, 73 шт. у типичных). Семенная продуктивность женских шишек с однолетним циклом развития (36,4 %) ниже, чем у типичных деревьев (69,5 %) и в то же время у дерева № 100 в 2002 г. семенная продуктивность оказалась достаточно высокой (58,3 %).

Таким образом, функциональная активность женских шишек сосны сибирской с однолетним циклом развития достаточно высокая. Женские шишки отличались от типичных лишь размерами и продуцировали меньшее число семян, хотя в отдельные годы эти различия сглаживались.

Цитоэмбрнологические исс.ч едования

Цнтоэмбриологические исследования «аномальных» особей (№№ 1ш и 100) сосны сибирской показали, что заложение генеративных структур, и начальные этапы формирования женского гаметофита у них проходят без отклонений так же, как у типичных деревьев. Опыление у «аномальных» деревьев идет в те же сроки, что и у типичных (конец первой декады июня). Прорастание пыльцы на питательных средах у типичных особен сосны сибирской в Западно-Саянской популяции колеблется от 39,3 % до 90 %, длина пыльцевых трубок - от 49,1 мкм до 200 мкм в разные годы. У деревьев с однолетним циклом развития женской шишки прорастание пыльцы варьировало от 40 % до 90 % (в среднем 65 %), длина пыльцевых трубок колебалась от 76 мкм до 160 мкм. По данным биохимического анализа, пыльца аномальных особей отличалась повышенным содержанием активных ауксинов и наоборот уменьшенным содержанием общей суммы аминокислот н низкомолекулярных углеводов (Минина. Ларионова, 1973).

Значительные отклонения от нормального эмбрионального цикла развития у «аномальных» особен сосны сибирской наблюдались в женском гаметофпте (рис. I), в котором происходило значительное сокращение свободно-ядерной стадии развития (до 3-х недель, вместо I года). Появление архегониев было отмечено через 30-40 дней после опыления (в начале З-ей декады июля). За неделю они достигали полной зрелости, в них происходило деление ядра центральной клетки с образованием яйцеклетки и брюшной канальцевой клетки. Размеры и структура архегониев аномальных деревьев не отличаются от размеров и структуры архегониев у типичных генотипов с 2-х летним развитием (табл. 4).

Таблица 4

Размеры архегониев особей сосиы сибирской с однолетним циклом развития

№ Цикл развития Время Размеры Размер мегага-

дере- женской созревания архегониев, мкм метофптов, мкм

ва шишки длина ширина дтина ширина

100 Однолетний 25.07 644±6 340±5 2100±7 1000±5

1 ш то же 25.07 643±5 339±1 1800±11 960±5

808* « « 25.08 550±5 340±7 1100±7 960±7

810* «« 25.08 527±11 286±2 1200±5 960±7

* Примечание: по данным 11.Н. Третьяковой П 9901

Архегонии в семяпочках у деревьев с однолетним циклом развития женских шишек № 1 ш и № 100 оставались без изменений около 7 сут. За этот период у чуть больше половины семяпочек (53 %) возобновлялся вторичный рост пыльцевых трубок к архегониям. На отдельных препаратах видно вхождение ядра спермия в архегоиий. Однако оплодотворения обнаружить не удалось, В ряде случаев наблюдалось деление ядра яйцеклетки в гаплоидном состоянии, однако ядра проэмбрио не обнаруживались, т.е. деление яйцеклетки оставалось не реализованным, ядро яйцеклетки подвергалось деструкции и лизировало.

Таким образ о процесс оплодотворения у рассматриваемых форм сосны сибирской с однолетним циклом развития женских шишек не происходит. Эмбриональное развитие у данных форм кедра сибирского прекращалось, и развивались только мегагаметофита, в которых зародыш не обнаруживался. В целом,

репродуктивный цикл у «аномальных» генотипов завершается за 16 месяцев, вместо 27 месяцев. Однако размножение уннхальных форм сосны сибирской семенами невозможно из-за отсутствия зародыша,

Глава 5. Особенности внутрисемейного роста зародышей у сосны сибирской при стратификации

Семенам сосны сибирской, собранным из зрелых шишек, необходимо завершение внутрнсеменного роста зародышей, которое происходит в процессе стратификации. Процесс внутр и семенного роста зародышей начинается с набухания семян. При этом происходит физическое насыщение семян водой, интенсивно идущее в первые 4 часа после замачивания - вес семян увеличивался на 14 - 17 % от первоначального. В дальнейшем семена менее активно поглощают воду и уже после 24 часов замачивания вес семян увеличивается на 18 - 20% и становится постоянным. Такие семена помещались на стратификацию, которая проводилась во влажном песке или мхе при температуре 0 - +4° С,

Зародыши семян, заложенные на стратификацию, занимали от % до V* длины зародышевого канала (рис,5). Через 1,5 месяца стратификации у большинства зародышей дли на оси увеличивалась и составляла У» длины зародышевого канала. Через 3 мес стратификации длина оси зародыша увеличилась « в 1,5 раза (рис.5). Через 4 мес стратификации размеры зародышей увеличивались в 2 раза от первоначальных данных. Зародыши зеленели, и семена прорастали.

Рис, 5. Динамика внутрисемейного роста зародыша по длине при стратификации

Полиэмбриональные мелкие семена, зародыши которых занимают менее 'Л длины зародышевого канала (высокогорные семена), требуют другого режима стратификации. Для получения проростков семена с мелкими зародышами подвергаются более длительной (двойной) стратификации (холодной, теплой и снова холодной). За два месяца холодной стратификации зародыши семян достигают 'А длины зародышевого канала. Далее семена переносятся в термостат при температуре 20 -24° С в течение I месяца. За период теплой стратификации в зародышах сосны сибирской происходят активные мнтотические деления, т.е. увеличивается число клеток. При последующем помещении семян в условия холодильной камеры и

) партия — II партия 111 партия -—- IV партия

12 3 4 Время стратификации, мес.

выдерживания их там еще в течение 1-2 месяцев внутрнсемемной рост зародышей завершается - семена готовы к прорастанию.

Таким образом, доразвитне и внутрисемейной рост зародышей у сосны сибирской происходит в течение 4-5 мес. в процессе стратификации. Чем мельче зародыши семян данного вида, тем более длительной стратификации они требуют. В целом, эмбриогенез сосны сибирской занимает 6.5-7,5 мес (2,5 мес в семяпочке и 4-5 мес при стратификации).

Глава 6. Культмвированне .мегагаметофитов и изолированных зародышей сосны сибирской в контролируемых условиях ¡и vitro Культивирование ¡полированных семяпочек и мегагаметофитов

С целью регуляции эмбриональных процессов проводилось культивирование мегагаметофитов сосны сибирской на разных стадиях развития эмбриологических структл р.

Культивирование мегагаметофитов сосны сибирской, собранных на стадии центральной клетки вакуолнзнрованных архегоннев типичных и «аномальных» генотипов (за 5-7 дней до оплодотворения), на средах MSI, MS2 показало, что эмбриональные процессы продолжаются очень редко. Наблюдается образование каллусной массы (рпс.б). Слияние гамет, деление зиготы и образование проэмбрно происходят только у 10 % эксплаптов. У большей части эксплаитов при данном режиме культивирования не удалось стимулировать деление яйцеклетки и образование зародышей, такие мегагаметофиты увеличивали свои размеры (в 2-3 раза) и сохраняли жизнеспособность 3-4 недели. Не удалось индуцировать и развитие мегагаметофитов у «аномальных» особей сосны сибирской с однолетним циклом развития женских шишек.

При культивированин мегагаметофитов на стадии зиготы и образования прозмбрио эмбриональные процессы шли, но развитие проростков не наблюдалось. Наиболее перспективными для культивирования оказались мегагаметофиты через 7 дней после оплодотворения. В этот период происходит внедрение полового эмбрпо в зародышевый канал и его кливаж. При воздействии ауксинов в сочетании с цитокннинами (MS 3-4) удалось получить поликлнваж полового зародыша и образование эмбрногенной ткани, способной в дальнейшем дать соматические змбрнонды.

Введение в культуру мегагаметофитов на стадии расщепленного 5-клеточного образования (2 недели после оплодотворения) способствовало прохождению эмбриогенеза в культуре i» vitro на средах MS1-6, через 2 месяца формировались проростки (рис. 7). Однако у таких проростков корневая система не развивалась.

Культивирование мегагаметофитов на стадии ранней дифференциации эмбрио (4-е недели после оплодотворения) на средах MS5, MS6 LP1, LP2 показало, что эмбриогенез завершается. В данных мегагаметофитах через 2 месяца на среде MS5, и через 3 месяца на среде MS6 зародыши прорастали. Образовавшиеся проростки достигли длины 16-22 мм.

Таким образом, при создании благоприятных условий в культуре in vitro мегагаметофиты сосны сибирской способны к непрерывному развитию и образованию проростков in vitro уже со стадии недифференцированного эмбрно. Культивирование ¡полинованных зиготических эмбрионов

Культивирование недоразвитых зародышей (занимающих менее 14 длины

Рис. 6 Образование каллуса у мегагаметофитов на стадии центральной клетки архегония

Рис. 7 Образование проростков из мегагаметофитов на стадии 5-клеточного образования эмбрио

Рис. В Развитие зародышей через 3 месяца пассажа на средах MS7 (а) и MS 12 (б)

Рис. 9 Развитие адвентивных почек у основания семядолей через 1,5 месяца культивирования на средах MS8. MS9

Рис. 10 Образование меристем в каллусной массе через 2-3 недели культивирования на среде МЬ9

I s

зародышевого каната) на средах MS7, MS12 показало, что па 7-е сутки культивирования появляется зародышевый корешок, происходит позеленение гппокотиля, семядоли актнвно разрастаются - образуются проростки. При дальнейшем культивировании (через 1 месяц) на среде MS без гормонов происходит рост эпнкотнля, однако корешок оставался в зачаточном состоянии. Активный рост зародышевых корешков наблюдался на среде MS7. Через 1,5 месяца культивирования у таких проростков длина корешков составляла от 10 до 13 мм. а размеры эпнкотнля были от 3 до 5 мм. На безгормональной среде у проростков корешки не развивались. Через 3 месяца культивирования на среде MS7 у эксплантов сосны сибирской наблюдалось образование боковых корешков (длиною 0,5 и 1 мм). За этот же период на среде MS12 корнеобразованне так и не происходит (рис, 8). Через 4 месяца культивирования на среде MS7 длина корешков составляла от 17 до 20 мм, боковых корешков от 0,3 до 2 мм, эпнкотнля от 5 до 8 мм.

Культивирование недоразвитых зародышей (> '/з длины зародышевого канала) вместе с мегагаметофнтами на средах MS12, LP2 у сосны сибирской привело к развитию полноценных сеянцев через 1 месяц после посадки. Однако изолированные зародыши на среде без гормонов проростков не образовывали, у таких зксплантов шло интенсивное образование каллуса.

Таким образом, недоразвитость зародышей у зрелых семян сосны сибирской является вынужденным феноменом, при непрерывном культивировании in vitro эмбриогенез семян у данного вида завершается их прорастанием. Образование адвентивных почек

Проводилось культнвпрованне знготическнх эмбрионов сосны сибирской на средах MS8, MS9, MSI1 с целью получения адвентивных почек. Выявлено, что образование адвентивных почек происходило в субэпидермальных клетках паренхимы коры пшокотиля (на 21 сутки) и в основании хвои брахибластов (через 1.5 мес) (рис. 9). Спустя 4 месяца после начала культивирования адвентивные почки увеличивались в размере и составляли до 2-4 мм. При перенесение адвентивных почек на среду MS12 наблюдается увеличение их размеров в 1,5-2 раза и появление брахибластов. При дальнейшем культивировании из таких почек образуются жизнеспособные растения.

При пересадке адвентивных почек у сосны сибирской на среду MS9 в ряде случаев (30 %) происходило активное образование каллуса. Через 2-3 недели каллус увеличивался в размерах (в 10 раз) и в однородной структуре каллусных клеток возникал» мернстематпческне очаги - 7-10 меристем на к аилу с (рис. 10). В таких меристемах на среде MSI0 идет активный морфогенез: закладываются прпмордии хвои и побегов.

Анатомическое исследование адвентивных почек сосны сибирской показало, что все почки, которые были продуцированы de novo, имели идентичную структуру, типичную для апикальных меристем хвойных. Внутри почки находится конусовидная сердцевина из паренхимных клеток, по краям которой расположены несколько слоев прокамбия, плавно переходящего в апикальную меристему.

Оценка достоверности эксперимента по индукции адвентивных почек проводилась двухфакторным дисперсионным анализом, с помощью пакета программ Microsoft Excel. Результаты анализа представлены в таблице 6.

Таблица 6

Влияние среды и времени культивирования на ширину зародышей сосны сибирской в культуре in vitro

Источник варьирования SS df ms FfcaKT F^npn P=0,05

Общее 129,13 255

Среда 33,32 3 11,11 41,79 1,96

Время 21,97 3 7,32 27,55 1,96

Совместное 10,04 9 1,12 4,20 1,96

Фактор иальное 63,80 240 0,27

Примечание: SS-сумма квадратов отклонений; df-число степеней свободы; пк-средннй квадрат (варнаиса); F фактическое - критерий F (вэрнансное отношение); F табличное - табличное значение критерия F; Р-\ровень значимости.

Согласно данным, приведенным в таблице 6, можно сделать вывод, что достоверность эксперимента высокая, т.к. фактический критерий F, для каждого фактора в отдельности и их совместного влияния, значительно превышает его табличное значенне для тех же степеней свободы.

Выводы

1. Процесс эмбриогенеза у сосны сибирской так же, как у других видов сосен состоит из 3 микроскопических стадий: проэмбрногенеза, стадий раннего и позднего эмбриогенеза. Проэмбриогенез идет по USE-типу и продолжается 7 дней. Стадия раннего эмбриогенеза включает внедрение инициалей эмбрио в зародышевый канал, их кливаж (через 7 дней после оплодотворения). Стадия позднего эмбриогенеза начинается с дифференциации оси зародыша (через 30 дней после оплодотворения) н включает внутрисемейной рост зародыша в мегагаметофитах в процессе формирования и в период его стратификации.

2. Оплодотворение и эмбриогенез у деревьев с прививочных плантаций и у деревьев из естественных древостое в сосны сибирской идет однообразно. Наблюдаются лишь различия в сроках прохождения эмбриональных событий.

3. Значительные отклонения в развитии эмбриологических структур происходят у отдельных «аномальных» форм сосны сибирской с однолетним циклом развития женских шишек. У данных особей через 30-40 дней после опыления происходит появление архегониев. Однако оплодотворения не происходит из-за потери активности мужского гаметофнта: медленного роста пыльцевых трубок it отсутствия образования мужских гамет в них. «Аномальные» формы сосны сибирской не способны к размножению in vivo из-за отсутствия зародыша.

4. Акселерация эмбриональных процессов в женских шишках сосны сибирской с однолетним циклом развития обусловлена спецификой женских побегов, рост и развитие которых направлены по пути женской сексуалиэации.

5. Культивирование мегагаметофитов сосны сибирской с двухлетним циклом (типичные формы) и однолетним циклом развития женских шишек («аномальные» формы) в культуре in vitro показало, что ход эмбрионального процесса зависит от стадии зрелости мегагаметофитов и воздействия определенных гормонов. Введение в культуру цитокининов на стадии зиготы, проэмбрио и раннего эмбрио и ауксинов на более поздних стадиях развития способствует завершению эмбриогенеза и формированию проростков.

6. Эксперименты по культивированию in vitro незрелых зародышей показали, что недоразвитость зародышей у сосны сибирской является вынужденным феноменом.

При создании благоприятных условий недоразвитые эмбрио могут формировать проростки без стратификации.

7. Эксплангы эмбрионов сосны сибирской в культуре in vitro могут формировать адвентивные почки. Субкультивпроваине адвентивных почек из среде MS с 6-БАП приводит к образованию мер!(стоматических очагов и затем проростков,

8. В целом, при культивировании мегагамстофитов сосны сибирской были выявлены гормональные и трофические зависимости развития эмбриональных структур и определенно влияние стадии зрелости мегагамстофитов па развитие этих структур, а также индуцировано развитие адвентивных побегов, с помощью которого возможно проводить массовое размножение улучшенных форм сосны сибирской.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Новоселова N.B. Цитоэмбрнологичсскнс особенности формирования ссмян кедра сибирского in vivo и in vitro H Материалы XXXVI межд. студ. Конференции "Студент и на\ чпо-тсхннчсскнн прогресс", Биология, Новосибирск, 1998. - С. 2021.

2. Третьякова И.Н., Новоселова Н.В. Механизм формирования пол нам бри опии у семян кедра сибирского //Материалы II Всероссийской научно-практической конф. "Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений, Красноярск, 1999.-С. 15-16.

3. Новоселова Н.В., Череповскпй Ю.А. Цитоэмбрнологическне исследования гетерознсных мутантных форм кедра сибирского in vivo и in vitro // Материалы If Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученных "Агроэкология и устойчивое развитие регионов", Ч 2, Красноярск, 2000, — С. 28.

4. Третьякова ПН., Новоселова Н.В, Акселерация репродуктивного процесса у редких гетерознсных форм кедра сибирского (Pinus sibii ica Du Tour) в Западном Саяне - показатель эволюционного прогресса // Материалы межрегиональной научной конф, "Сохранение бноразнообразня Пр| [енисейской Сибири", Красноярск, 2000. - С. 44-45.

5. Новоселова Н.В., Третьякова H.H. Цитоэмбрнологическне исследования зрелых семяпочек типичных и аномальных особей кедра сибирского in vivo и in vitro It Материалы X Межд. симпозиума "Концепция гомеостаза: теоретические, экспериментальные и прикладные аспекты", Красноярск, 2001. С. 122-127,

6. Третьякова H.H., Новоселова Н.В. Цитоэмбрнологическне особенности развития семяпочек мутантных гетерознсных форм кедра сибирского (Pinus Sibirien Du Tour) in vivo и in vitro // Сборник научно-технических статей «Этап ого-экономические проблемы Восточносибирского региона, Красноярск, 2001. - С, 70-76.

7. Третьякова H.H., Бажнна Е.В., Осколков В.А., Филиппова И.П„ Новоселова Н.В., H ос кова Н.Е., Грачев E.H. Половая репродукция хвойных в условиях Сибири it Материалы совещания «Лесные стационарные исследования. Методы, результаты, перспективы», Тула 2001, - С, 502-506.

8. Третьякова H.H., Новоселова Н.В. Особенности биотехнологии семян кедра сибирского //Материалы Международной конференции «Классификация и динамика лесов Дальнего Востока», Владивосток. 2001, - С, 298-301.

9. Tret'yakova I.N., Novoselova N.V, Biotechnology of Siberian pine (Pinus sibirtca) seeds // Proceedings of Joint Symposium " Tree seed technology, physiology and tropical silviculture", Philippines, 2001. - P. 157-158.

10, Третьякова il.IL Новоселова I LB, Признаки акселерации генеративного цикла -показателя эволюционной и родин ну гости кедра сибирского в системе рода Pinus // Материалы 111 Российской конференции «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока», Красноярск, 2001. - С, 217-218,

11. Trci'yakova I., Novoselova N„ Philippova 1., Ivatiova A. Biotechnology of Siberian coniferous species // International Symposium " Molccular mechanisms of gcnetic processes and biolechnology", Moscow-Minsk. 2001.-P. 374-375.

12. Третьякова 11,11., Новоселова H.B., Филиппова И.П. Особенности биотехнологии сибирских видов хвойных // Материалы Международной научной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие», Пущцно, 2001. - Р. 222-223.

13. Третьякова И.Н, Новоселова И.В, Иванова А.Н., Филиппова И.П. Биотехнология сибирских видов хвойных в культуре in vitro И Сборник статей по материалам 2-ой Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и развития городов», Красноярск, 2001. - С. 92-96.

14. Новоселова Н.В. Биотехнологическне приемы культивирования семяпочек и зародышей кедра сибирского (Pinus sibirica Du Tour) в культуре in vitro //Материалы конференции молодых ученых "Исследования компонентов лесных экосистем Сибири", Красноярск, Институт леса СО РАН, 2001.-С. 68-71,

15. Novoselova N.V, Biotech по logy of mega gam etopbytcs and embryos of Siberian pine and formation of adventive buds //Abstract of international conference «Boreal forests and environment: local, regional, and global scales». - Krasnoyarsk, 2002. - P. 61-62.

16. 11.11. Третьякова, Н.В. Новоселова, A.M. Иванова «Анатомо-морфол отческие особенности раннего онтогенеза сибирских видов хвойных в культу ре in vitro» И между! 13 рол па я конференция по анатомии и морфологии растений Санкт-Петербург, 2002 С. i 88.

17. Н.В. Новоселова, И.Н, Третьякова Культура мегагаметофитов и зародышей кедра сибирского in vitro // Научно-практическая конференция, Томск. 2002 С. 28.

18. Третьякова Н.Н., Новоселова Н.В. Особенности развития мегагаметофитов и зародышей сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour) в культуре in vitro it Онтогенез. T.34, > 4, 2003. - С. 282-291.

19. Tret 4 a ko v a I.. Novoselova N, Culture in vitro of meg again e to phytes and embryos of Siberian pine and formation of adventive buds //Proceedings of the International Symposium "Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources", Yalta, Ukraine, 2002. - P. 23-26.

20. Trci'yakova I., Novoselova N., Noskova N., Janushkyavichane E., Menjlo L, Peculiarities of introduction in culture of Siberian conifer species // Abstracts of the VII International conference «The biology of plant cells in vitro and biotechnology», Saratov, 2003. C. 320.

21. Третьякова И.Н., Новоселова Н.В,, ЧереповскиГг Ю.А. Особенности эмбрионального развития у сосны сибирской [Pinus sibirica Du Tour) с однолетним циклом развития женской шишки в горах Западного Саяна //Физиология растений, 2003 (в печати).

Для заметок