Биологические особенности культивирования in vitro семян и зародышей редких видов растений

Ветчинкина, Екатерина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологические особенности культивирования in vitro семян и зародышей редких видов растений
ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Биологические особенности культивирования in vitro семян и зародышей редких видов растений"

На правах рукописи

0О4602310

ВЕТЧИНКИНА Екатерина Михайловна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO СЕМЯН И ЗАРОДЫШЕЙ РЕДКИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.02.01 - Ботаника

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 0 [¿дя 20'0

Москва-2010

004602310

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук

Главный ботанический сад им. Н. В. Цицина РАН

Научный руководитель: кандидат с.-х. наук

Молканова Ольга Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Карписонова Римма Анатольевна доктор биологических наук Калашникова Елена Анатольевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Центральный сибирский ботанический сад СО РА1

Защита диссертации состоится 20 мая 2010 г. в 13 часов на заседании Диссертационного сове

Д.002.028.01 в Главном ботаническом саду им. Н. В. Цицина Российской академии наук

конференц-зале лабораторного корпуса.

Адрес: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 4, ГБС РАН

Факс: 8(495)977-91-72

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГБС РАН по адресу:

127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 4

Автореферат разосланной? апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

СХЛ Э ю-к- Виноградо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время одной из наиболее острых экологических проблем является стремительное сокращение ареалов распространения и полное исчезновение многих видов растений. В связи с этим все большую актуальность приобретает необходимость разработки методов сохранения и поддержания биологического разнообразия как in situ, так и ex situ (Андреев, Горбунов, 1999). Эффективность сохранения растений ex situ может быть существенно повышена путем создания генетических банков in vitro. Использование системы in vitro по сравнению с традиционными методами поддержания коллекций растений имеет целый ряд преимуществ, в том числе и возможность успешной репродукции видов, естественное возобновление которых в природе ослаблено или затруднено (Молканова и др., 2008; Новикова и др., 2008). При создании генетических банков редких и исчезающих растений в качестве исходного предпочтителен семенной материал, поскольку, таким образом, при использовании небольшого количества ценного материала и без нарушения естественных популяций сохранность генетического разнообразия вида обеспечивается на максимальном уровне. В экспериментальной работе с семенами многих редких видов возникает такая проблема, как покой семян и его преодоление. Культура in vitro позволяет значительно сократить срок выведения семян из покоя,(Батыгина, Васильева, 2002; Ишмуратова, Ткаченко, 2009). Важнейшей задачей генетического банка, особенно актуальной для редких и исчезающих видов, является поддержание генетической чистоты сохраняемых in vitro таксонов, а также их всестороннее изучение. Использование современных молекулярно-генетических методов исследования генетической вариабельности не только позволяет контролировать стабильность хранящихся in vitro растений (Артюкова и др., 2004), но также дает возможность для быстрой и точной идентификации видовой подлинности вновь поступающих образцов и молекулярного маркирования растений на популяционном уровне, в том числе и редких видов сохраняемых в коллекциях in vitro (Журавлев и др., 1999, Боронникова, 2009).

Цель и задачи исследований - выявление специфики культивирования семян и зародышей представителей родов Iris L., Beíamcanda Adans., Paeonia L. и Fritillaria L. в культуре in vitro и оптимизация методов сохранения исследуемых таксонов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. исследовать особенности покоя семян представителей Iris, Beíamcanda, Paeonia и Fritillaria и способов его преодоление в условиях in vitro',

2. оценить возможность использования эмбриокультуры как метода преодоления покоя вышеназванных таксонов;

3. изучить влияние условий стратификации, степени развития зародыша и состава питательной среды на начальные этапы онтогенеза растений in vitro;

4. разработать методику культивирования in vitro зародышей исследуемых таксонов;

5. изучить возможности применения ISSR-анализа для идентификации и паспортизации коллекций in vitro.

Научная новизна исследований. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro зародышей Iris, Beíamcanda, Paeonia и Fritillaria, определены оптимальные сроки их изоляции.

Впервые для некоторых представителей рода Iris, Beíamcanda, Paeonia и Fritillaria экспериментально установлены границы наступления стадии относительной автономности зародыша.

Отработаны методы культивирования семян и зародышей исследуемых таксонов, показано преимущество эмбриокультуры по сравнению с традиционными способами преодоления покоя семян.

Впервые показана возможность использования ISSR-анализа для идентификации видовой подлинности и паспортизации коллекций in vitro.

Практическая денность работы. Подобраны оптимальные условия для культивирования in vitro семян и зародышей исследуемых таксонов.

Создан генетический банк in vitro представителей Iris, Beíamcanda, Paeonia и Fritillaria, включающий в том числе 37 образцов редких и исчезающих видов.

Предложен подход ISSR-анализа для уточнения видовой подлинности образцов семян некоторых редких видов рода Iris и детектирования на популяционном уровне Beíamcanda chinensis в коллекциях in vitro.

Апробадия работы. Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на III Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 2003); VIII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004); Молодежном научном семинаре «Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем» (Екатеринбург, 2004); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 140-летию РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева (Москва, 2005); Международной научной конференции «Плодо- и семеноведение. Состояние и перспективы исследований» (Киев, 2005); Международном симпозиуме ирисоводов «Задачи международного сотрудничества ирисоводов» (Москва, 2005); I Международной Школе для молодых ученых «Эмбриология и Биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005); IV Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 2007). И Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2008).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 2 статьи в реферируемом журнале.

_£ приложений, объемом страниц. Список использованной литературы включает 2_yS

наименований, из них на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений ГБС им. Н.В. Цицина РАН в 2003 -

2009 гг.

В качестве исходного материала использовали экспедиционный и коллекционный семенной материал из фондов ГБС им. Н.В. Цицина РАН, а также семена, полученные в системе межботанического обмена.

Для семян исследуемых видов Iris и Belamcanda, характерен комбинированный и физиологический покой различной глубины (Аф-В,.3; В,_з); для семян видов Paeonia - простой глубокий морфофизиологический покой (Б-В3); для видов Fritillaria - сложный глубокий морфофизиологический покой (БВ-Вз) (Николаева, 1985,1999).

Модельными объектами в эксперименте служили 31 вид Iris, в том числе 6 занесенных в Красную книгу РФ (/. acutiloba С.А. Mey., I. aphylla L., I. ensata Tunb., I. nota Bieb., I. pumila L. s. 1., I.scariosa Willd. ex Lik); 16 видов Paeonia, в том числе 6 занесенных в Красную книгу РФ (P. caucasica (Schipcz) Schipcz., Р. lactißora Pall, P. obovata Maxim, P. oreogeton S. Moore, P. tenuifollia L„ P.wittmanniana Hartwiss ex Lindl.), 26 видов Fritillaria, в том числе 3 занесенных в Красную книгу РФ (F.caucasica Adams., F. meleagris L., F. ruthenica Wikstr.) и Belamcanda chinensis (L.) CD (Красная книга РФ).

Методика биотехнологических исследований основывалась на общепринятых классических приемах работы с культурами изолированных тканей и органов растений (Бутенко, 1999). Во всех вариантах эксперимента использовали питательную среду Murashige, Skoog (1962). В связи со спецификой покоя исследуемых таксонов, для каждого из них были использованы индивидуальные схемы культивирования.

Семена видов рода Iris и Belamcanda chinensis культивировали на среде с добавлением 1 мг/л ГК3, также использовали несколько способов предобработки семян: замачивание в растворе ГК3 в концентрации 1 и 10 мг/л в течение суток, холодная стратификация в течение 1 и 3 месяцев. Обработанные семена и изолированные из них зародыши помещали на среду безгормонального состава. Контролем являлись необработанные семена и изолированные из них зародыши, культивируемые на безгормональной среде.

Незрелые зародыши извлекали из семян 13 модельных видов рода Iris и Belamcanda chinensis в разные периоды созревания: 20-30 дней после опыления (ДПО), 35-45 ДПО, 50-60 ДПО, 65-75 ДПО и культивировали на питательных средах MC: с добавлением 0,1 мг/л БАП, питательная среда с

увеличенными в два раза концентрациями минеральных и органических компонентов, питательная среда, не содержащая гормональных добавок.

Семена видов рода Paeonia культивировали на безгормональной питательной среде. Изолированные из зрелых семян зародыши на этапе теплой стратификации культивировали на питательных средах с добавлением 0,1 и 0,3 мг/л БАП, а также на питательной среде с увеличенными в два раза концентрациями минеральных и органических компонентов и безгормональной питательной среде (контроль); на этапе холодной стратификации на питательных средах (8 вариантов) с добавлением БАП (0,1; 0,5 и 1 мг/л) и ГК3 (0,1 и 1 мг/л) и безгормональной питательной среде (контроль).

Незрелые зародыши извлекали из семян 3 модельных видов рода Paeonia в разные периоды созревания: 20-30 ДПО, 30-40 ДПО, 40-50 ДПО и культивировали на питательных средах с добавлением 0,1 мг/л БАП, питательной среде с увеличенными в два раза концентрациями минеральных и органических компонентов и безгормональной питательной среде (контроль).

Семена видов рода Fritillaria культивировали на безгормональной питательной среде (контроль) и питательных средах с добавлением 1 мг/л БАП и 1 мг/л ГК3 в течение 2-х этапной стратификации: 5-7 недель при температуре 20-22°С, 2-9-12 недель при температуре 3-5°С. Для эмбриокультуры зародыши изолировали из семян на разных этапах стратификации (5, 9, 12 и 18 недель) и культивировали на питательных средах (10 вариантов) с добавлением ГК3 (0,1 - 1 мг/л) и БАП (0,1 - 1 мг/л), а также на питательной среде с увеличенными в 2 раза концентрациями минеральных и органических компонентов. Контроль - питательная среда, не содержащая гормональных добавок.

Математическую обработку данных проводили стандартными методами (Доспехов, 1985, Зайцев, 1984) с использованием пакета программ Microsoft Office.

В молекулярных исследованиях использованы образцы семян I. pitmila (3 популяции), 1. aphylla (4 популяции), I. scariosa (3 популяции), I. notha (2 популяции) и I. variegata (2 популяции), а так же образцы 3-х популяций Belamcanda chinensis.

ДНК исходных образцов выделяли с использованием набора NucleoSpin® Plant II (MACHEREY-NAGEL, Germany) из 100 мг свежего растительного материала, полученного из листьев 2-3 недельных проростков. ДНК контрольных образцов выделяли тем же способом из молодых вегетирующих листьев.

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе DNA Engine Diad™ (Bio-Rad, USA) с ISSR-праймерами: Ml, M2, МЗ, М4, М5, М9, Mil, М12, М13, М14, UBC881, UBC855, 844В, HB 15, синтезированными ЗАО «СИНТОЛ» («Биоком», Россия). Для полимеразной цепной реакции были использованы наборы реактивов производства "Диалат-ЛТД" (Москва). Все реакции были проведены в двукратной повторное™.

ISSR-профили анализировались с помощью программы Cross Checker (Version 2.91) (Buntjer,1999). Учитывали только хорошо различимые фрагменты. За полиморфные принимали ДНК-фрагменты, присутствующие в спектре не всех образцов. Уровень геномной вариабельности оценивали по значениям генетических расстояний. Межвидовые и внутривидовые генетические расстояния определялись с использованием коэффициента Жаккарда. Расчеты выполняли с помощью программы PAST (Version 1.89) (Hammer et al., 2001), используя кластерный анализ методом невзвешенного парно-группового арифметического усреднения (UPGMA). Анализ образцов на гибридное происхождение проводили с помощью программы NewHybrids (Version 1.1 beta) (Anderson, Thomson, 2002)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.Культура in vitro семян и зародышей представителей Iris и Belamcanda.

1.1.Влияние гиббереллиновой кислоты на преодоление покоя семян и развитие зародышей в культуре in vitro.

Для семян исследуемых видов Iris и Belamcanda, характерен комбинированный и физиологический покой различной глубины (Аф-Вы; Ви), обработка семян гиббереллинами (ГК) способствует преодолению покоя такого типа (Николаева, 1985,1999; Небыков и др., 2005).

На динамику прорастания значительное влияние оказали тип покоя, используемый способ аппликации ГК3 и продолжительность периода хранения исходных семян.

Из всех высаженных семян, проростки были получены только у 16 видов, процент прорастания при этом варьировал. Было показано, что во всех вариантах эксперимента показатель прорастания культивируемых in vitro семян, прошедших 2-х летний период хранения был значительно ниже по сравнению с показателем прорастания семян, хранившихся 1 год. Для семян, покой которых относится к комбинированному типу было отмечено совместное стимулирующее действие ГКз и скарификации (Табл.1).

Таблица 1

Влияние скарификации и гиббереллиновой кислоты на прорастания семян in vitro._

Вид Семена без скарификации Скарифицированные семена

ms„ ms + 1 мг/л ГКз 10 мг/л ГК3; ms mso ms + 1 мг/л ГК, 10 мг/л ГК3, ms

Belamcanda chinensis 53,62 ± 1,2 54,79 ± 1,0 54,94 ± 1,0 70,79 ±2,1 80,86 ±2,3 82,86 ± 1,7

J. ensata 55,64 ±2,1 53,12 ±1,6 52,33 ±1,1 69,64 ±3,1 75,12 ±1,6 77,22 ±2,2

1. laevigata 8,01 ± 0,2 7,95 ± 0,5 7,63 ± 0,3 21,37 ±1,1 28,62 ±1,1 26,15 ± 1,0

I. pseudacorus 15,58 ± 1,1 13,12 ±0,9 14,45 ±0,8 35,32 ±2,1 42,18 ± 1,4 43,43 ±1,3

L setosa 17,32 ±0,8 17,00 ±0,8 17,67 ± 0,2 27,83 ± 1,4 35,63 ± 1,7 36,0 ± 2,7

I. sibirica 62,37 ± 1,0 60,20 ±1,2 63,05 ± 1,0 71,45 ±2, 78,12 ±2,2 81,34 ±2,5

I. spuria 8,52 ± 0,7 9,11 ± 0,6 8,79 ±0,3 13,75 ±0,9 15,62 ±1,1 13,01 ±1,1

Установлено, что между способами аппликации ГКз ни в одном из вариантов эксперимента ни для одного из исследуемых видов значимых различий выявлено не было.

Положительное влияние ГК) на процент прорастания было показано только для видов с промежуточным физиологическим типом покоя семян (¡.еташ, ¡.¡¡Ыпса, ¡.рзе^асогш, Ве1атсат1а сЫпеюк и др.), хранившихся 1 год (Рис.1).

Belamcanda chinensis

ДЛНП.'л*

■ Контроль —

«ль нулыииироиаии -MS + 1 мг/л ГК

-10 .V.01 ГК : MS

/. pseudacorus

длтельиость культикироС'Лния, недели - КонфОЛЬ —■—MS » 1 мг/л ГК —10мг/л ГК ; MS

Рис.1. Влияние гиббереллиновой кислоты на динамику прорастания in vitro семян с промежуточным типом физиологического покоя.

Значимого влияния на прорастание семян с неглубоким типом физиологического покоя, не зависимо от года хранения (i.pumila, 1. scariosa) показано не было. Для видов, семена которых имеют глубокий физиологический покой {¡.gramínea, I.ldatti и др.), использование двух предложенных вариантов аппликации ГК3 оказалось не результативным - семена не прорастали.

Показано, что развитие зародышей, выделенных из семян, прошедших предобработку зависело от длительности периода хранения, типа покоя исходных семян и концентрации используемой ГКз.

В данном варианте эксперимента проростки были получены из культивируемых зародышей всех 32 исследуемых видов. Наибольший процент прорастания изолированных зародышей наблюдался у видов с неглубоким типом физиологического покоя семян, в этом варианте эксперимента максимальный результат (I.pumila - 92,15%) был получен у контрольных образцов, обработка семян ГК3 приводила к снижению процента прорастания (I.pumila - 79,85%). Установлено, что для зародышей, выделенных из семян с промежуточным и глубоким типом покоя семян процент прорастания в контрольном варианте был значительно ниже. Также показано, что предобработка семян ГК3 существенно увеличивала прорастание изолированных зародышей по сравнению с контролем, однако показатель прорастания, в среднем не превышал 50% (¡.gramínea - 49,23%) для видов с глубоким типом физиологического покоя семян и 73% (¡.versicolor -72,47%) для видов с промежуточным типом физиологического покоя семян.

Развитие проростков, полученных из изолированных зародышей, зависело от продолжительности периода хранения, типа покоя исходных семян и используемой концентрации ГК3.

Максимальные показатели развития для проростков, полученных из зародышей изолированных, из семян с неглубоким типом физиологического покоя и хранившихся 1 год отмечены в контрольном варианте (без обработки ГК3) (Рис.2); из хранившихся 2 года - в варианте с предобработкой семян ГК3 в концентрации 10 мг/л.

□ Без обработки Ш1мг/лГК аЮмг/лГК

[ о Без обработки и1мг/лГК вЮмг/лГК~~|

см pumila

16 14

4 7 10 18 25 35 45 55 S5 длительность культивирования, сутки_

I. pseudacorus

7 10 18 25 35 45 55 65 длительность культивирования, сутки

Рис.2. Изменение длины наиболее развитого листа у проростков, полученных из зародышей, изолированных из семян с неглубоким {¡.pumila) и промежуточным {¡.pseudacorus) типом физиологического покоя семян, обработанных ГК3

Для развития проростков, полученных из зародышей, изолированных из семян с промежуточным и глубоким типом физиологического покоя, показано стимулирующее влияние предобработки исходных семян ГК3, не зависимо от продолжительности периода хранения (Рис.2).

1.2.Влияние стратификации на преодоление покоя семян и развитие зародышей в культуре in vitro.

Универсальным фактором, устраняющим физиологический покой семян, является холодная стратификации (Поздова, Разумова 1997; Baskin & Baskin, 2004).

На динамику прорастания значительное влияние оказали тип покоя, длительность стратификации и периода хранения исходных семян. Показано, что в контрольном варианте эксперимента процент прорастания культивируемых in vitro семян всех видов, прошедших 2-х летний период хранения был значительно ниже по сравнению с процентом прорастания семян, хранившихся 1 год. Для видов с неглубоким типом покоя {I.pumila, ¡.scariosa) показано, что стратификация ингибирует прорастание семян, хранившихся 1 год, и значительно стимулирует прорастание семян, хранившихся два года. (Рис.3).

100

■уо ; SO

¡5 ?0 i- ■

ï» ■

S 50 :.........

!<Ю j

| 30 î

20 ;

10 !—

0 =

А В

Рис.3. Влияние стратификации на динамику прорастания in vitro семян с неглубоким типом физиологического покоя (/. pumila). А - 1 год хранения семян, В - 2 года хранения семян.

Во всех остальных вариантах эксперимента, не зависимо от срока хранения, было показано стимулирующее влияние стратификации на прорастание семян, находящихся в глубоком и промежуточном физиологическом покое.

Установлено, что развитие зародышей, выделенных из семян, прошедших стратификацию, зависело от длительности периода хранения, типа покоя исходных семян и длительности стратификации.

Максимальные показатели развития проростков, полученных из зародышей, изолированных из семян с неглубоким типом физиологического покоя и хранившихся 1 год отмечены в контрольном варианте (без стратификации) (Рис.4).

I II

4 7 Ю 18 28 34 44 54 G4 длительность культивирования, дни в Контроль □ 1 месяц стратификации И 3 месяца стратификации

ri i ill (111

4 7 10 18 28 34 44 54 64 длительность культиаироиания, дни ■ Контроль □ 1 месяц стратификации я 3 месяца стратификации

Рис.4. Динамика изменения числа листьев у проростков, полученных из зародышей, изолированных из стратифицированных семян с неглубоким (/. ¿сапом) и глубоким (/. к1аШГ) типом физиологического покоя.

Для развития проростков, полученных из зародышей, изолированных из семян с промежуточным и глубоким типом физиологического покоя, показано стимулирующее влияние стратификации исходных семян на развитие проростков, не зависимо от периода хранения (Рис.4).

1.3.Эмбриокультура незрелых зародышей представителей Iris и Belamcanda.

Использование культуры незрелых зародышей позволяет значительно сократить период покоя семян. Благодаря свойству относительной «автономности» зародыша (способности развиваться в нормальное растение вне материнского организма), прорастание в условиях культуры in vitro становиться возможным уже на ранних стадиях эмбриогенеза (Батыгина, Васильева, 1987; 2002).

Показано, что критерием выбора сроков изоляции зародышей для введения в культуру in vitro всех 14 модельных видов, является достижение ими стадии относительной автономности, которая, как было установлено экспериментальным путем, наступает на 35-45 ДПО - в период дифференциации осевых органов.

Общей закономерностью для всех изученных видов является снижение жизнеспособности и процента прорастания зародышей, изолированных в более поздние фазы развития (65-75ДПО) по сравнению с прорастанием зародышей первого возрастного периода (35-45ДПО) (Табл.2, Рис.5). В наибольшей степени такая динамика выражена у видов Subgenus Xyridion, семена которых характеризуются комбинированным - физическим с глубоким физиологическим - типом покоя (Аф-В3), в наименьшей у видов Subgenus Iris, семена которых имеют неглубокий физиологический тип покоя (Bi.2). Подобная закономерность, очевидно, является следствием блокировки прорастания зародыша в связи со вступлением семени в фазу индукции процессов детерминации покоя (Морозова, 1997; Finkelstein et al., 2008).

Таблица 2

Влияние стадии развития и состава питательной среды на жизнеспособность культивируемых in vitro зародышей.

Вид Систематическое положение Стадия развития зародышей / вариант питательной среды / процент жизнеспособных зародышей

35-45 ДПО 50-60 ДПО 65-75 ДПО

MS+ОДмг/л ВАР MSo 2 х MS MS+ОДмг/л ВАР MSo 2 х MS Мв+ОДмг/л ВАР MS„ 2 х MS

Belamcanda chinensis Genus Belamcanda 98,62±4,3 73,45±1,1 - 64,72±0,9 45,11±1,6 47,53±0,9 68,92±1,9 78,19±2,0 65,71±1,4

I. pumita Subgenus Iris 88,67±1,1 91,64 ±0,8 96,72±1,0 62,75±3,8 70,68±2,1 75,11±1,8 83,П±3,1 87,15±0,6 79,69±4,2

I. aphyila Subgenus Iris 95,15±1,3 80,23±3,1 87,61±2,4 78,13±1,1 87,88±2,4 93,33±2,2 87,25±3,1 97,0±3,5 82,13±1,2

L ensata Subgenus Limniris 97,17±4,4 75,50±3,3 62,73±3,5 59,54±2,7 73,62±3,8 42,48±2,6 73,42±4,3 80,19±0,8 56,76±2,4

1. pseudacorus Subgenus Limniris 91,67±2,7 78,22±3,2 67,58±2,1 72,76±3,8 64,88±2Д 54,61±0,8 60,64±3,4 72,73±3,6 58,25±0,9

1. klattii Subgenus Xyridion 97,39±2,2 84,53±3,7 89,92±1,8 88,89±2,5 80,86±5,2 72,57±2,7 52,47±0,3 46,71±2,8 31,53±2,5

1. carthaliniae Subgenus Xyridion 95,85±4,7 83,81±2,1 86,97±1,3 83,34±2,5 77,78±3,5 58,27±1,3 46,94±2,3 49,82±2,1 21,63±0,8

Рис.5. Динамика прорастания культивируемых in vitro зародышей видов рода Iris. I - 35-45 ДПО; II - 50-60 ДПО; III - 65-75ДПО.

Выявленные общие закономерности развития исходных эксплантов и их видоспецифичная отзывчивость на условия культивирования, а также связь этих процессов с типом покоя семян исследуемых видов и стадией развития изолированных из них зародышей, являлись определяющими не только на ранних этапах культивирования, но и в течении ювенильного и имматурного периода развития растений m v/íro

Для видов рода Iris и Belamcanda chinensis, семена которых находятся в промежуточном или глубоком покое (/. pseudacorus, /. klattii,) максимальные значения основных показателей развития (число листьев, длина листа, длина корня) в фазе проростка были отмечены для растений, полученных из зародышей 35-45 ДПО, минимальные - для проростков, полученных из зародышей 50-60 ДПО (Рис.6).

проростка), 35 день (ювенильный период) и 65 день культивирования (имматурный период). Условные обозначения: I - 35-45 ДПО, II - 50-60 ДПО; III - 65-75ДПО.

Присутствие 0,1 мг/л БАП в среде оказывает стимулирующий эффект на рост зародышей и проростков всех исследуемых видов только на первых этапах культивирования (до 10-15 дня), что может свидетельствовать о достижении растениями, вступившими в ювенильную стадию развития абсолютной автономности.

Для видов, семена которых имеют неглубокий покой (I.pumila) основные показатели роста растений, культивируемых на средах без добавления БАП, к 65 дню культивирования значимо не отличаются. Для I. pseudacorus и большинства остальных видов рода Iris, а также Belamcanda chinensis, предпочтительнее было культивирование на безгормональной питательной среде, а для I. klattii и видов Subgenus Xyridion - на среде с высоким содержанием основных питательных веществ.

В результате проведенных нами исследований для всех 14 модельных видов рода Iris и Belamcanda chinensis показана возможность использования эмбриокультуры, как метода преодоления покоя семян. Зародыши всех видов, извлеченные из незрелых семян способны прорастать в условиях in vitro с 35-45ДПО и в дальнейшем формировать нормальные растения. Установлено, что реализация программы относительной автономности развития эксплантов in vitro детерминируется типом покоя семян, сроком изоляции зародышей и условиями культивирования.

2.Культура in vitro семян н зародышей представнтелей Paeonia

Семена видов рода Paeonia имеют простой глубокий морфофизиологический покой и для его нарушения необходима двухэтапная стратификации - теплая (для доразвития зародыша) и холодная (для снятия физиологического механизма торможения прорастания - ФМТ) (Николаева, 1985; 1999).

В ходе проведенного эксперимента было показано, что для преодоления покоя и получения нормальных проростков in vitro, использование культуры семян неэффективно. При длительном культивировании семян происходит поликонденсация в питательную среду веществ фенольной природы, которая приводит к ингибированию клеточных делений, снижению жизнеспособности и дальнейшей гибели зародыша в семени.

На первом этапе культивирования изолированных зародышей данного таксона (теплая стратификация), оптимальной является безгормональная питательная среда. Установлено, что жизнеспособность изолированных зародышей зависит от продолжительности хранения исходных семян (Табл.3).

Таблица 3

Влияние состава питательной среды на жизнеспособность Рлепш/оНа на этапе теплой стратификации.

Вариант питательной среды Продолжительность культивирования / процент жизнеспособных эксплантов

1 неделя 3 недели 5 недель

1 год* 2 года 1 год 2 год 1 год 2 года

MSo 13,71 ±0,9 3,45 ± 0,2 56,71 ± 1,2 15,34 ±0,5 87,20 ± 2,1 31,54 ±0,9

2 xMS 10,23 ± 0,6 1,11 ±0,0 15,46 ±0,9 7,28 ±0,2 49,12 ±1,7 10,37 ± 0,9

MS + 0.1БАП 19,76 ±0,7 2,53 ±0,1 23,93 ± 1,2 4,95 ±0,4 28,56 ± 0,8 9,89 ±0,3

MS + О.ЗБАП 15,54 ±1,0 0,98 ±0,0 20,48 ± 0,8 2,29 ±0,2 25,29 ± 1,1 11,17 ±0,2

* - длительность хранения исходных семян.

Питательные среды, содержащие различные концентрации БАП, в первые недели развития зародышей стимулировали активацию их роста, однако даленейшее культивирование растений на этих средах приводило к появлению большого количества различных аномалий развития и, как следствие, остановке роста растений. В некоторых случаях отмечено появление морфогенного (P.peregrina) и неморфогенного (Р. mascula, Р. amomala) каллуса на семядолях и гипокотиле, образование которого ингибировало нормальное развитие растений, что согласуется с данными других исследователей (Брюхин, 1993; Зарипова, 2007; Stanys et al, 2007).

Для некоторых видов (Р. delavayi, Р. peregrina и Р. lutea) было предпочтительно культивирование зародышей на питательной среде с повышенным содержанием питательных веществ.

Добавление в питательную среду ГКэ в концентрации 0,1 - 1 мг/л позволяет сократить период эпикотильного покоя, однако не заменяет полностью необходимость холодной стратификации (развития апикальной меристемы побега без выдерживания проростков при низких положительных температурах ни в одном из вариантов опыта получено не было) (Табл.4).

Таблица 4

Влияние состава питательной среды на прорастание Р. anómala на этапе холодной стратификации.

Вариант питательной среды Продолжительность холодной стратификации / прорастание, %

3 недели 5 недель 7 недель

Контроль (MSo) 0 43,18 ±1,0 83,32 ± 1,5

0,1 ГК3 0 45,52 ±0,8 82,23 ±2,1

0,1 ГК, 40.1 БАП 0 42,76 ±0,9 80,32 ±1,3

0,1 ГКз + 0,5 БАП 0 40,23 ±1,0 79,51 ±1,2

0,1 ГК3 + 1 БАП 0 34,12 ±0,9 73,11 ±0,9

1 ГК, 2,10 ±0,1 52,87 ± 1,0 91,33 ±1,6

1 ГК3 + 0,1 БАП 1,15± 0,1 46,12 ±0,9 83,39 ±1,1

1 ГКз+0,5 БАП 0 42,42 ± 0,9 80,05 ±1,2

1 ГКз +1 БАП 0 36,38 ±1,1 75,33 ±1,3

Установлено, что длительность этапа холодной стратификации зависит от видовой принадлежности объекта и продолжается от 4-5 (Р. másenla) до 7-8 недель (Р. suffruticosa) (Рис.7).

см 10,00 9.00 8.00 7,00 б.ОО 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0,00

а Длина корня ■ Длина с^модол-зй □ Длине эпикотиля |

о Длина юэрня ■ Длине Сбтлядолей ОДпина --злииотиля

А В

Рис.7. Развитие проростков видов Paeonia на 5(А) и 8(В) неделе холодной стратификации. Условные обозначения. 1 - Р. delavayi, 2- Р. anómala, 3 - Р. mascula, 4 - Р. wittmanniana, 5 - Р.lutea, 6 -Р. tenuifolia, 1 - Р. suffruticosa, 8 -Р. lactiflora.

Недостаточный период холодной стратификации у всех модельных видов Paeonia приводил к проявлению физиологической карликовости проростков.

В ходе эксперимента с эмбриокультурой незрелых зародышей было установлено, что получение проростков возможно только при использовании в качестве исходного материала эксплантов, изолированных из семян на 40-50 ДПО. На этом этапе формирования семени зародыш Paeonia находится в стадии торпеды и достигает относительной автономности (Батыгина, Васильева, 2002). Оптимальной для культивирования незрелых зародышей была безгормональная среда, в остальных вариантах эксперимента был получен высокий процент аномалий роста и развития.

В результате проведенных нами исследований для всех видов рода Paeonia показана возможность использования культуры зрелых и незрелых зародышей in vitro, как метода преодоления покоя семян. Показано, преимущество эмбриокультуры, по сравнению с культурой семян и установлена видоспецифичность в поведении эксплантов на разных этапах культивирования.

З.Культура in vitro семян и зародышей представителей Fritillaria.

Семена видов рода Fritillaria., находятся в сложном глубоком морфофизиологическом покое и для доразвития зародыша и снятия ФМТ нуждаются в многоэтапной стратификации, включающей чередование теплого и холодного периода (Николаева, 1985; Разумова, Поздова, 1999).

В ходе исследования было установлено, что для снятия покоя и получения нормальных проростков, на первом этапе культивирования обязательна теплая стратификация на протяжении 4-5 недель. Без предварительного культивирования семян при 20-22°С процессов доразвития зародыша в семени не происходит (Табл.5).

Таблица 5

Влияние температурного режима на процесс доразвития зародыша видов рода Fritillaria в течение

Вид Продолжительность культивирования / семена с развитым зародышем, %

3 недели 20-22°С 3 недели 3-5°С

1 год 2 года 1 год 2 года

F. grandiflora 46,25 ± 1,2 0 0 0

F. imperiales 64,32 ± 0,2 0,99 ± 0,02 1,23 ±0,2 0

F. lutea 70,91 ± 1,9 0 3,11 ±0,7 0

F. meleagris 77,35 ± 1,7 0 2,63 ± 0,2 0

F. michailovskyi 5,22 ± 0,1 0 2,49 ± 0,4 0

F. montana 80,11 ±0,3 3,45 ±0,2 2,27 ± 0,3 0

F. pallidiflora 34,16 ± 1,2 0 1,78 ±0,02 0

F. ruthenica 78,23 ± 2,3 3,53 ±0,2 1,37 ±0,1 0

F. sewerzovii 84,58 ±3,0 5,86 ± 0,3 5,76 ±0,05 0

Показано, что на доразвитне зародыша оказывает влияние длительность периода теплой и холодной стратификации. Активный линейный рост зародыша наблюдается до 5-7 недели теплой стратификации. Дальнейшее развитее зародышей в семенах возобновлялось только в условиях низких положительных температур. Длительность холодной стратификации, в течение которой происходило окончательное формирование зародыша и нарушение действия ФМТ, существенно влияла на прорастание культивируемых семян всех видов. Максимальный процент прорастания для семян всех видов был получен только после трех месяцев холодной стратификации (Рис.8).

- Л 2 меснцл холодной слрлификации

- 3 МССЯЦй ХОЛОДНОЙ сгрлификйции

Рис.8. Влияние продолжительности периода холодной стратификации на прорастание in vitro семян видов рода Fritillaria.

Добавление в питательную среду регуляторов роста (1 мг/л ГК3 и 1 мг/л ВАР) значимого влияния на доразвитие зародыша в период теплой и холодной стратификации не оказывает.

В результате проведенного эксперимента было установлено, что дальнейшего роста и развития зародышей Fritillaria извлеченных из семени на разных этапах стратификации и высаженных на различные варианты питательных сред получено не было. Нормальные проростки развивались из семян, полностью прошедших все необходимые этапы стратификации, что свидетельствует о сложности биохимических и метаболических процессов, связанных с выходом семени из состояния покоя данного типа (Разумова, 1997; Кравкина, Котеева, 2005,2007).

В ходе проведенных исследований на всех представителей Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria показано преимущество эмбриокультуры, как метода преодоления покоя семян. В зависимости от типа покоя и его сложности, использование культуры изолированных зародышей позволяет частично или полностью снять необходимость холодной стратификации и соответственно сократить период прорастания.

Показано, что критерием выбора сроков для культивирования изолированных зародышей является достижение ими стадии относительной автономности. По полученным экспериментальным данным и анализу литературных источников Родионенко, 1956; Lakshmanan, Philip, 1970; Алимова и др., 1985; Guignard, 1962; Соколовская, Яковлев, 1978; 1980; Smith, Grierson, 1985; Батыгина, Васильева, 1987, 2002; Сравнительная эмбриология..., 1987, 1990; Эмбриология цветковых..., 1997 и др.) предложены следующие схемы становления стадии относительной автономности зародыша, связи этого процесса с покоем семян и использованием в работе с эмбриокультурой модельных объектов (Рис.9).

Из представленных схем видно, что у всех изучаемых объектов относительная автономность зародыша достигается в период дифференциации основных органов, а в зависимости от типа покоя наступление этой стадии может происходить как в середине или конце эмбрионального, так и в латентный период онтогенеза, на основании чего, были установлены оптимальные сроки изоляции зародышей модельных объектов и условия их культивирования in vitro.

fШ Глобулярный яародолк

Форшфовашк; исря<жии Мбега

'Г>тФ«т

тш

j 0{юрш1рляаш№>Й39ро;рчш

Ü1

I '«окулярныйзародыш

ФорМНрОШШИС кернсгемы побега

Дифферентами«;

«КЖЙЫХ OplíUKIlí

Гло(гулхриый '.иродыш

Формирование мсрисгсмы пойла

Зрелоесемя

Ins и Belamcanda chinensis

Автономность зародыша

Стадия относительной автономности

Оптимальная ф азл для культуры V2 vitrv

Рис.9. Схемы становления относительной автономности зародыша у представителей родов Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria.

4.Создание генетического банка in vitro.

В ходе проведенных исследований оптимизирована система размножения и сохранения in vitro редких и ценных представителей Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria с использованием культуры семян и зародышей (Рис.10).

1. Введение в культуру in vitro

2. Мнкроразмножение

3. Депонирование

4. Контроль 4.1 Визуальный контроль 4.2 Молекуляр но-ген ет ические исследования

Рис.10. Схема размножения и сохранения in vitro редких и ценных представителей Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria с использованием культуры семян и зародышей.

Рис. 11. Стадия пролиферации I.ensata, Р.anómala, F.ruthenica.

Подобраны и оптимизированы условия культивирования исследованных таксонов на всех основных этапах: введения в культуру, микроразмножения и длительного депонирования.

Создан генетический банк in vitro представителей родов Iris, Belamcanda, Paeonia и FritiUaria, в том числе включающий 37 образцов видов, занесенных в Красную книгу РФ.

5.Использование ISSR-анализа для идентификации и паспортизации растений в коллекциях генетических банков in vitro.

В последнее десятилетие наряду с традиционными приемами исследований все более широкое использование получают молекулярно-генетические методы, с применением которых, в настоящее время созданы ДНК-банки ценных, редких и исчезающих видов растений, проводятся исследования по изучению внутривидовой изменчивости сохраняемых объектов, уточнению спорных вопросов их систематики и классификации, разработке методики генетической паспортизации популяций и исследованию генетической стабильности хранящихся ex situ таксонов (Журавлев и др., 1999; Артюкова и др., 2001; Козыренко и др, 2004,2009).

Семена некоторых представителей рода Iris, в частности редких видов подрода Iris (I.pumila, I.aphylla, I. scariosa, I. variegata) и видов серии Spuriae подрода Xyridion (I.notha) (Родионенко, 1961) практически не отличимы по анатомо-морфологическим признакам, что затрудняет работу по созданию генетических банков in vitro, т.к. в спорных случаях на установление подлинности образцов может уйти (в зависимости от глубины покоя семян) до трех - пяти лет. Использование высокоэффективных молекулярных методов, таких как ISSR-анализ, дает возможность для быстрой и точной идентификации генетической подлинности образцов на родовом, видовом и популяционном ypoBHe(Joshi et al, 2000; Боронникова, 2009; Wang et al, 2009), что может способствовать решению проблемы.

При проведении ISSR-анализа протестировали 14 ISSR-праймеров, из которых для дальнейшего анализа было отобрано 8, обеспечивающих получение достаточного количества полиморфных ампликонов.

Количество амплифицированных ISSR-фрагментов было различным: наименьшее их число - 13, было получено при использовании праймера М12, основанного на динуклеотидном повторе [СА], наибольшее - 27, для праймера 844В, в состав которого входит динуклеотидный повтор [СТ].

Размер амплифицированных ДНК-фрагментов варьировал в диапазоне от 125 п.н. (праймер М2) до 2290 п.н. (праймер 844В).

По полученным на основе ISSR-спектров данным были составлены бинарные матрицы и проведен кластерный анализ методом UPGMA (Рис.12).

•V, Й 'Л

11111 § 5 ? 3 В 1 и S 3 Н В ? ! J {; I i J I

ЧУ

Jrt

— 5-

'•л V V Ъ к i' °1 ™> *"l

llll JBIIIII

□ - образцы неустановленной видовой принадлежности

Рис.12. Дендрограмма генетических взаимоотношений видов рода/га, построенная методом Ш Уассагс!) по результатам гаЗЯ-анализа. В узлах ветвей указан индекс бутстрэпа(%). Буквами обозначен контроль: Р - /. ритИа, N - 1.поЛа, А - /. ар1пу11а, Б - /. зсагша, V - /. \ariegata.

Установлено, что по степени генетической близости исследуемые образцы объединяются в б (Belamcanda chinensis рассматривается как внешняя группа) основных кластеров, 5 из которых соответствуют отдельным рассматриваемым видам. На наибольшем генетическом расстоянии ото всех находится I. notha, что подчеркивает его обособленность, как вида, принадлежащего к другому, систематически удаленному, подроду Xyridion (серия Spuriae). Для остальных 4-х видов, показано, что результаты проведенного ISSR-анализа также, в целом, отражают представления современной систематики о генетическом родстве I. pumila, I. aphylla, I. scariosa и /. variegata, входящих в состав подрода Iris (Родионенко, 1961, Mathew, 1981). Наиболее тесная связь внутри подрода наблюдается для I. aphylla и /. variegata, несколько удален от них вид I. pumila и, наконец, самым большим генетическим расстоянием характеризуется I.scariosa.

Большинство из проанализированных образцов четко кластеризуются в соответствии с их видовой принадлежностью, однако некоторые образцы попадают в чужие кластеры, что указывает на их неверное определением. Так образцы I.aph_I и I.aph_4, полученные из одного источника и включенные в работу как /. aphylla, по результатам кластерного анализа относятся к другим видам - ¡.variegata и I.pumila соответственно. Также по данным кластерного анализа, проведенного на основе полученных ISSR-спектров и дополнительного анализа методом главных координат, для образцов l.scar_0 и 1.рит_2, включенных в эксперимент как I.scariosa и I. pumila, было показано, что данные образцы, образуют отдельный кластер и, очевидно, не принадлежат ни к одному из заявленных видов.

Однако по фенотипу исходные родительские растения являются заявленными I.scariosa и I.pumila. В связи с чем, было выдвинуто предположение о возможном гибридном происхождения данных образцов. Для проверки этого предположения данные полученных ISSR-спектров всех образцов

I. scariosa и I. pumila по всем 8 праймерам были дополнительно проанализированы с помощью программы NewHybrids (Version 1.1 beta) (Anderson, 2003) (Табл.б).

Таблица б

Анализ ISSR-профилей образцов I.pumila и I.scariosa в программе NewHybrids.

Номер образца Статистическая вероятность принадлежности образца к видовой/гибридной категории

Риге 0 Риге 1 Fl F2 0 Вх 1 Вх

1* 0.00000 0.95544 0,00237 0.00221 0.00002 0.03996

2 0.00000 0.84397 0.01990 0,00678 0.00002 0.12933

3 0.00000 0.99596 0.00001 0,00000 0,00000 0.00403

4 0.00000 0.98752 0.00006 0.00002 0,00000 0.01240

5 0,00000 0,99343 0,00010 0.00002 0.00000 0.00645

6 0.78334 0.00000 0.00000 0.00015 0.21651 0.00000

7 0.81214 0.00000 0.00000 0.00032 0.18754 0.00000

8 0.64074 0,00000 0.00000 0.00009 0.35917 0.00000

9 0.90982 0,00000 0.00000 0.00001 0.09017 0.00000

10" 0.99988 0.00000 0.00000 0.00000 0.00012 0.00000

11 0.94268 0,00000 0.00000 0.00001 0.05731 0.00000

12 0.00031 0.00000 0.00024 0.02076 0.97869 0.00000

13 0,03063 0,00000 0,00000 0.00136 0.96801 0.00000

14 0,00183 0,00000 0,00017 0.01681 0.98119 0.00000

15 0.00083 0,00000 0.00009 0.01094 0.98814 0.00000

Условные обозначения: Pure 0-первый вид; Pure_l - второй вид; F1 - гибриды Fl; F2-гибриды F2; 0_Вх - беккросс с участием первого вида; 1_Вх - беккросс с участием второго вида; * - контроль I.pumila ** - контроль I.scariosa, 1-5 - образцы I.pumila-, 6-11 - образцы I.scariosa, 12-15 - образцы неустановленной видовой принадлежности.

По полученным с помощью программы NewHybrids результатам, установлено, что все проанализированные генотипы данной выборки, кроме спорных, с высоким уровнем апостериорной вероятности - 84,4-99,5% и 64,1 - 99,9% для образцов I.pumila и I.scariosa соответственно, отнесены программой к двум родительским видам. Что же касается спорных образцов l.scar_0 и 1рит_2, то с высокой долей апостериорной вероятности (96,8-98,8%) программа определяет их как бэккроссы к I.scariosa, что вполне объясняет наличие у исходных растений и полученных с них образцов семян фенотипических признаков двух видов одновременно. Для окончательного подтверждения или опровержения данной гипотезы и получения максимально достоверного результата необходимо проведение цитологических исследований и кариологического анализа с прямым подсчетом хромосом.

Проведенный ISSR-анализ позволил изучить генетическую изменчивость исследуемых обраэдв на межвидовом и популяционном уровне.

Всего в результате проведенного ISSR-анализа было получено и проанализировано 149 ДНК-фрагментов. Уровень полиморфизма варьировал внутри видов в широких пределах и в среднем составил: 69,60% для I. pumila, 71,60% для I. notha; 77,36% для I. scariosa, 75,32% и 70,35% для I.variegata и I. aphylla соответственно и 53,2% для Belamcanda chlnensis. (Табл. 7).

Таблица 7..

Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей исследуемых образцов.

Вид/ Праймер Полиморфные ампликоны, %

844В UBC881 Ml М2 МЗ М4 М12 М14

I.pumila 80,25 71,43 8125 30,00 91,66 78,57 77,78 46,15

I.notha 84,61 66,67 72,22 63,64 63,64 85,71 66,67 66,67

I.scariosa 80,00 84,61 88,24 57,14 92,31 77,78 83,33 57,14

I.variegata 85,71 94,12 73,33 50,00 66,67 78,57 87,50 66,67

I. aphylla 92,31 75,00 83,33 66,67 70,00 60,00 55,56 60,00

Iris 100 100 100 100 100 100 100 94,74

Belamcanda chinensis 50,00 63,64 64,29 75,00 40,00 40,00 62,50 30,00

Все образцы 100 100 100 100 100 100 100 100

По полученным жспериментальным данным у всех исследованных видов были выявлены общие и специфические мономорфные и полиморфные ДНК-фрагменты. Наличие мономорфных фрагментов у близких видов предполагает общность структурно-функциональной организации их геномов. Для 5 видов рода Iris с помощью праймера М14 показано наличие одного общего специфичного мономорфного фрагмента длинной 390 п.н. (Рис.13), а для Belamcanda - четырех: 510 п.н., 1075 и 310 п.н., 1325 п.н. - праймеры МЗ, М4 и М12 соответственно Мономорфные ДНК-фрагменты могут быть обозначены как «родовые» и считаться ISSR-маркерами для данных представителей родов Iris и Belamcanda.

М 1 Í 3 4 '5 о í 8 9 10 11 И13 141516 1718 19 20а 22 23 24 25 26 2 7 28 29 30 3132 33 34 35 36 3738 3940 4142 43 44 J54Ó 47

■ '' . wJiHtií; j ;4¡; '

'"•Т *"'!**« Www' f¡2f|ítMWH«wtíyw„w»iW«f:

и ^ »• W W4t »« ^ ■

V.J! •«* f<§ «*» fc* W ¿4 ** *** • * ví ** H *"* "* . . ... ... I ..« i

Wí uv W : • f W..

www""""""4"""''

—'мономорфный для видов рода Iris ДНК-фрагмент.

Рис.13. ISSR-профили образцов, полученные при использовании праймера М14. Условные обозначения: М - маркер молекулярных размеров; 1-6 - /. pumita; 7-11 -1. notha-, 12-20 - I.scariosa, 21-27-1. variegata; 28-38 -1. aphylla, 39-47 - Belamcanda chinensis.

В результате проведенного исследования было выявлено несколько специфичных «видовых» ISSR-маркера. Наименьшее их число - 1 - было получено в профилях образцов I. pumila (930 п.н. -праймер М4). Наибольшим числом видоспецифичных фрагментов характеризовались ISSR-спектры исследованных образцов Belamcanda chinensis и I. notha - 6 и 4 ДНК-фрагмента соответственно. На ISSR-спектрах I. scariosa было выявлено 3 видоспецифичных фрагмента. Для остальных исследованных видов подобных фрагментов детектировано не было. Подобные результаты можно объяснить систематической отдаленностью Belamcanda chinensis и I. notha, от видов подрода Iris и относительно небольшим количеством протестированных ISSR-праймеров.

Помимо видоспецифичных маркеров в ISSR-спектрах были обнаружены уникальные полиморфные ДНК-фрагменты, присущие только отдельным популяциям на уровне вида.

Выявленные в ходе данной работы специфичные «видовые» и «популяционные» полиморфные ISSR-маркеры позволяют использовать полученные данные в дальнейших исследованиях по разработке генетической паспортизации коллекций in vitro редких и исчезающих видов растений с использованием существующих современных методик (Соболев и др, 2006; Гончарова и др., 2009; Боронникова, 2009).

В данной работе изучалась возможность использования метода молекулярно-генетического маркирования трех популяций Belamcanda chinensis, основанного на ISSR-анализе (Боронникова, 2009), в котором учитываются как мономорфные, так и полиморфные ДНК-фрагменты, характеризующие геномы изучаемых объектов на надвидовом, видовом и популяционном уровнях.

Из всех полученных в ходе ÍSSR-анализа ампликонов для паспортизации объектов было отобрано 22 четко воспроизводимых мономорфных и полиморфных ДНК-маркера.

Род Belamcanda является монотипным в связи с чем, исходная методика паспортизации была несколько модифицирована и для используемых в маркировании ампликонов были приняты следующие обозначения: BG - мономорфные и ВР - полиморфные ISSR-маркеры, специфичные для вида; Bs -полиморфные ISSR-маркеры, специфичные для отдельных популяций. Для каждой из трех исследованных популяций было отобрано 9 фрагментов, сочетания которых уникальны и не совпадают ни у одной из них (Табл.8).

Таблица i

Молекулярно-генетические формулы популяций Belamcanda chinemis.

Популяция Тип фрагментов-ДНК

BG Bp Bs

В. 5 Вр635м4;Вр720м1;Вр805м2 Bs490M3;BS970MI;BsI080S44b

В.6 В0595ш ВР380МЗ; Вр635м4; Bpl 185ussi В5730М4;В8950М12;ВЗ1030ш

В.8 BQ1325mi2 Bp430M14;Bp720„,;Bp96(W BS365M4;BS1125u88,;Bs1660MI2

Помимо буквенно-цифровой записи паспорт популяции может быть представлен в виде штрих-кода (Рис.14).

Маркер молекулярного веса

Штрих-код

Номер фрагмента

Обозначение ДНК-фрагмента

1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400

300

BS1660M12

Bg1325m12 Bsl 125цш

ВР960Ш

ВР720Ш В0595ш

Вр430ы,4 Bs365m4 Bg310M4

Рис. 14. Молекулярно-генетический штрих-код популяции Belamcanda chinensis - В.8.

Предложенные генетические паспорта позволяют идентифицировать принадлежность объекта не только к роду (виду), но и к группе популяций, и к конкретной популяции, что дает возможность использовать их в качестве основы для дальнейших всесторонних исследований по молекулярному маркированию на популяционном уровне как Belamcanda chinensis, так и других редких таксонов, сохраняемых в коллекциях in vitro.

выводы

1. Для представителей Iris, Belamcanda, Paeonia и FritiUaria, показано преимущество эмбриокультуры in vitro как метода преодоления покоя семян по сравнению с традиционными способами.

2. Показана специфичность поведения эксплантов модельных видов Iris, Belamcanda, Paeonia и FritiUaria в зависимости от типа покоя исходных семян, способов его преодоления и условий культивирования in vitro:

а) у представителей рода Iris и Belamcanda chinensis холодная стратификация и использование ГК3 стимулирует рост и развитие изолированных зародышей из обработанных семян с промежуточным и глубоким типом физиологического покоя;

б) на этапе теплой стратификации при культивировании изолированных зародышей видов рода Paeonia, оптимальной является безгормональная питательная среда; на этапе холодной стратификации добавление в питательную среду ГК3 в концентрации 0,1-1 мг/л позволяет сократить период эпикотильного покоя;

в) для нарушения покоя и получения нормальных проростков видов FritiUaria, первым этапом культивирования семян является обязательная теплая стратификация на протяжении 4-5 недель.

3. Для некоторых представителей рода Iris, Belamcanda, Paeonia и FritiUaria экспериментально установлены границы наступления стадии относительной автономности зародыша. У всех изученных объектов стадия относительной автономности зародыша наступает в период дифференциации основных органов, а в зависимости от типа покоя наступление этой стадии может происходить как в середине (35-45ДПО - Iris и Belamcanda chinensis) или конце (40-50 ДПО - Paeonia) эмбрионального, так и в латентный период онтогенеза (FritiUaria).

4. Показано, что реализация программы автономного развития in vitro детерминируется типом покоя семян видов, степенью развития зародыша и составом питательной среды, на основании чего определены оптимальные сроки изоляции зародышей и условия их культивирования in vitro.

5. Показана возможность использования молекулярно-генетических методов для уточнения видовой аутентичности семян некоторых редких видов рода Iris.

6. Апробирован метод ISSR-анализа для детектирования 3-х популяций Belamcanda chinensis: выявлены 3 мономорфных и 19 полиморфных ДНК-фрагмента, позволяющих идентифицировать изученные объекты на популяционном уровне.

7. Создан генетический банк in vitro представителей родов Iris, Belamcanda, Paeonia и FritiUaria, в том числе включающий 37 образцов видов, занесенных в Красную книгу РФ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Ветчинкина Е. М., Мамаева Н. А., Демидов А. С. Использование биотехнологических методов для ускорения размножения гибридов Iris hybrida hört. // Материалы III Междунар. науч. конф. (23-25 сентября 2003 г.) «Биологическое разнообразие. Интродукция растений». СПб, 2003. С. 354-355.

Ветчинкина Е. М., Мамаева Н. А., Демидов А. С. Возможности использования эмбриокультуры для ускорения селекционного процесса у Бородатых ирисов // Материалы конф., посвященной 100-летию научной селекции в России (9-11 декабря 2003 г.). М., 2003. С. 48-50.

Мамаева Н. А., Ветчинкина Е. М., Шишкина А. Использование культуры семян и зародышей in vitro для сохранения биоразнообразия рода Iris // Материалы VIII Молодежной конф. ботаников в Санкт-Петербурге (17-21 мая 2004 г.). СПб, 2004. С. 220.

Молканова О. И., Ветчинкина Е. М., Мамаева Н. А. Биотехнологические методы в селекции и генетике растений // Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития. III ВСГиС (6-12 июня 2004 г.). М„ 2004. С. 232.

Ветчинкина Е. М., Мамаева Н. А. Некоторые перспективы использования культуры семян и зародышей in vitro для изучения и сохранения биоразнообразия рода Iris L. // Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем, 25-28 октября 2004 г. Сб. статей. Екатеринбург, 2004. С. 21- 25.

Ветчинкина Е. М., Мамаева Н. А., А. А. Шишкина, О. И. Молканова, А. А. Соловьев, Демидов А. С. Перспективы использования биотехнологических и цитогенетических методов в современном ирисоводстве // Междунар. науч. конф., посвященная 60-летию Главного ботанического сада им. Н. В. Цицина РАН «Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов» (5-7 июля 2005 г.). М., 2005. С. 329-331.

Мамаева Н. А., Ветчинкина Е. М. Садовые Бородатые ирисы Главного ботанического сада им. Н. В. Цицина РАН // Матер1али V М1жнар. наук. конф. молодих дослщниыв, присвячено! 70-ртю Нацюнального боташчного саду ¡м. М. М. Гришка HAH Украши «Теоретичш та прикладш аспекта ¡нтродукщ! рослин i зеленого буд1вництва» (7-10 червня 2005 р.). Кшв, 2005. С. 74-75.

Ветчинкина Е. М., Мамаева Н. А. Некоторые аспекты использования эмбриокультуры рода Iris L. // 1нтродукщя та збережения рослинного р13номангггя. Вюник КиГвського нацюнального ушверситету ¡меш Тараса Шевченка. Кшв, 9/2005. С. 15-16.

Горбунов Ю. Н., Ветчинкина Е. М., Мамаева Н. А., Молканова О. И. Клонапьное микроразмножение как метод сохранения редких и ценных видов растений // Современные направления деятельности ботанических садов и держателей ботанических коллекций по сохранению биоразнообразия растительного мира. Материалы Междунар. науч. конфер., посвященной 100-летию со дня рождения академика Н. В. Смольского (27-29 сентября 2005 г.). Минск, 2005. С. 204-207.

О. И. Молканова, А. С. Демидов, Е. М. Ветчинкина, Н. А. Мамаева, А. А. Шишкина, А. А. Соловьев. Современные технологии в селекции садовых Бородатых ирисов // Материалы научно-практической конференции «Инновационные подходы в селекции цветочно-декоративных, субтропических и плодовых культур» (21-24 сентября 2005 г.). Сочи, 2005. С. 4449.

Ветчинкина Е. М., Мамаева Н. А. Эмбриокультура как метод сохранения и изучения биоразнообразия рода Iris L. И Задачи международного сотрудничества ирисоводов (тезисы докладов). Междунар. симпозиум ирисоводов(10-11 июня 2005 г.). М., 2005. С. 11-16.

Н. А. Мамаева, Е. М. Ветчинкина, А. А. Шишкина, А. С. Демидов, И. В. Васильева, А. А. Соловьев. Изучение коллекции ирисов ГБС РАН // Общие вопросы ботаники. Сб. статей молодых ученых, посвященный 60-летию Главного ботанического сада им. Н. В. Цицина РАН. М.:Геос, 2005. С. 23-28.

Vetchinkina Е. М., Mamaeva N. A. In vitro development and morphogenetic potential of Iris species embryos. //1 Международная Школа для молодых ученых «Эмбриология и Биотехнология» (4-9 декабря 2005 г.). СПб, 2005. С. 57.

Ветчинкина Е. М., Сучкова Н.К., Коновалова Л.Н., Молканова О.И. Использование биотехнологических методов для сохранения генофонда ценных и редких видов растений ex situ. Всероссийская научно-практическая конференция «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира», Волгоград, 2006.

Ветчинкина Е. М., Кабанов А. В., Карьянова И. В., Кудусова В. Л., Мамаева Н. А., Васильева И. В., Дьякова Г. М., Демидов А. С. Создание сортовых коллекций как способ сохранения и расширения

растительного биоразнообразия II Междунар. науч. конф. «Старинные парки и ботанические сады -научные центры сохранения биоразнообразия растений и охрана историко-культурного наследия», приуроченная к 210-летию со Дня основания Национального дендрологического парка «Софиевка» -НДИ НАН Украины (25-28 сентября 2006). Киев, 2006. С. 389-392.

16. .Молканова О. И., Мамаева Н. А., Ветчинкина Е. М. Сохранение генофонда редких и ценных растений в коллекциях in vitro И Материалы IV Междунар. науч. конф. «Биологическое разнообразие. Интродукция растений». (5-8 июня 2007 г.).СПб, 2007. С. 157-158.

17. Мамаева Н. А., Ветчинкина Е. М., Васильева И. В., Демидов А. С. Сохранение биоразнообразия рода Iris L. ex situ II Материалы IV Междунар. науч. конф. «Биологическое разнообразие. Интродукция растений». (5-8 июня 2007 г.).СПб, 2007. С. 316-317.

18. Мамаева Н. А., Ветчинкина Б. М., Горбунов Ю. Н., Молканова О. И. Сохранение растений в генетических банках in vitro: преимущества и недостатки //Бюллетень ГБС. 2008. Вып. 194. С. 141-149.

19. Ветчинкина Е. М., Малаева Е. В., Мамаева Н. А., Зинииа Ю. М., Коновалова JI. Н., Коротков О. И., Молканова О. И. Использование биотехнологических методов для сохранения генофонда редких и ценных видов растений. IX международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Звенигород, 8-12 сентября 2008 г. С. 66-67.

20. Ветчинкина Е. М., Молканова О. И. Использование эмбриокультуры для создания генетических банков растений in vitro. IX международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Звенигород, 8-12 сентября 2008 г. С. 68-69.

21. Брюхова С. Д., Мамаева Н. А., Ветчинкина Е. М. Особенности культивирования in vitro семян и зародышей Belamcanda chinensis (L.) DC. Материалы II Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира». Волгоград, 19-21 августа 2008 г. С. 46-50.

22. Ветчинкина Е. М., Мамаева н. А., Молканова О. И. Изучение биологических особенностей семян садовых Бородатых ирисов в культуре in vitro // Экспериментальные основы интродукции декоративных растений. - М„ 2009. - Вып. 1. - С. 36-42.

23. Молканова О.И., Васильева О.Г., Мамаева Н.А., Ветчинкина Е.М., Коновалова Т.Ю. Биотехнологические и молекулярно-генетические методы для сохранения и воспроизводства полезных и редких видов растений. // История науки и техники, 20ÍC (в печати).

Подписано к печати 08.04.2010

Формат 60x84/16.

Печать трафаретная

Усл.-печ. л. 1,2

Тираж 100 экз.

Заказ № 499

Отпечатано в издательском центре

ФГОУ ВПО МГАУ

127550, Москва, Тимирязевская, 58

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ветчинкина, Екатерина Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

X. Стратегия сохранения биологического разнообразия растений - теоретические вопросы и практические решения.

2. Культура in vitro — основные этапы, модели и факторы, влияющие на микроклональное размножение растений.

3. Покой семени.

3.1 Классификация типов покоя семян.

3.2 Методы преодоления покоя семян.

4. Эмбриокультура in vitro.

4.1 Теоретические основы.

4.2 Области практического применения.

5. Молекулярно-генетические методы в исследованиях по сохранению биоразнообразия растений.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Культура 1/1 vitro семян и зародышей представителей рода Iris и Belamcanda.

1.1 Влияние гибберелловой кислоты на преодоление покоя семян и развитие зародышей в культуре in vitro.,.

1.2. Влияние стратификации на преодоление покоя семян и развитие зародышей в культуре in itro.

1.3. Эмбриокультура незрелых зародышей представителей рода Iris и Belamcanda.

2. Культура in vitro семян и зародышей представителей рода Paeonia.

3. Культура in vitro семян и зародышей представителей рода Fritillaria.

4. Создание банка стерильных культур in vitro.

5. Использование ISSR-анализа для идентификации и паспортизации растений в коллекциях генетических банков in vitro.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические особенности культивирования in vitro семян и зародышей редких видов растений"

Актуальность темы. В настоящее время одной из наиболее острых экологических проблем является стремительное сокращение ареалов распространения и полное исчезновение многих видов растений. В связи с этим все большую актуальность приобретает необходимость разработки методов сохранения и поддержания биологического разнообразия как in situ, так и ex situ (Андреев, Горбунов, 1999). Эффективность сохранения растений ex situ может быть существенно повышена путем создания генетических банков in vitro. Использование системы in vitro по сравнению с традиционными методами поддержания коллекций растений имеет целый ряд преимуществ:

1) возможность успешной репродукции видов, естественное возобновление которых в природе ослаблено или затруднено;

2) обеспечение достаточной репрезентативности и поддержание генетического разнообразия охраняемого генофонда in vitro;

3) возможность использования минимального количества эксплантов для получения стерильных культур без нарушения природных популяций;

4) низкий травматизм и потери ценного исходного материала на этапе введении в культуру; 1

5) преодоление покоя семян (Молканова и др., 2008; Новикова и др., 2008).

При создании генетических банков редких и исчезающих растений в качестве исходного предпочтителен семенной материал, поскольку, при использовании небольшого количества ценного материала и без нарушения естественных популяций сохранность генетического разнообразия вида обеспечивается на максимальном уровне. В экспериментальной работе с семенами многих редких видов возникает такая проблема, как покой семян и его преодоление. Культура in vitro позволяет значительно сократить срок выведения семян из покоя (Багыгина, Васильева, 2002; Ишмуратова, Ткаченко, 2009). Важнейшей задачей генетического банка, особенно актуальной для редких и исчезающих видов, является поддержание генетической чистоты сохраняемых in vitro таксонов, а также их всестороннее изучение. Использование современных молекулярно-генетических методов исследования генетической вариабельности не только позволяет контролировать стабильность хранящихся in vitro растений (Артюкова и др., 2004), но также дает возможность для быстрой и точной идентификации видовой подлинности вновь поступающих образцов и молекулярного маркирования растений на популяционном уровне, в том числе и редких видов сохраняемых в коллекциях in vitro (Журавлев и др., 1999, Боронникова, 2009).

Цель и задачи исследований - выявление специфики культивирования семян и зародышей представителей родов Iris L., Belamcanda Adans., Paeonia L. и Fritillaria L. в культуре in vitro и оптимизация методов сохранения исследуемых таксонов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. исследовать особенности покоя семян представителей Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria и способов его преодоление в условиях in vitro;

2. оценить возможность использования эмбриокультуры как метода преодоления покоя вышеназванных таксонов;

3. изучить влияние условий стратификации, степени развития зародыша и состава питательной среды на начальные этапы онтогенеза растений in vitro',

4. разработать методику культивирования in vitro зародышей исследуемых таксонов;

5. изучить возможности применения ISSR-анализа для идентификации и паспортизации коллекций in vitro.

Научная новизна исследований. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro зародышей Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria, определены оптимальные сроки их изоляции.

Впервые для некоторых представителей рода Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria экспериментально установлены границы наступления стадии относительной автономности зародыша. Отработаны методы культивирования семян и зародышей исследуемых таксонов, показано преимущество эмбриокультуры по сравнению с традиционными способами преодоления покоя семян.

Практическая ценность работы. Подобраны оптимальные условия для культивирования in vitro семян и зародышей исследуемых таксонов.

Создан генетический банк in vitro представителей Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria, включающий в том числе 37 образцов редких и исчезающих видов.

Предложен подход ISSR-анализа для уточнения видовой подлинности образцов семян некоторых редких видов рода Iris и детектирования на популяционном уровне Belamcanda chinensis в коллекциях in vitro.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на III Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 2003); VIII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004); Молодежном научном семинаре «Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем» (Екатеринбург, 2004); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 140-летию РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева (Москва, 2005); Международной научной конференции «Плодо- и семеноведение. Состояние и перспективы исследований» (Киев, 2005); Международном симпозиуме ирисоводов «Задачи международного сотрудничества ирисоводов» (Москва, 2005); I Международной Школе для молодых ученых «Эмбриология и Биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005); IV Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 2007). II Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2008).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 170 страницах компьютерного текста, содержит 20 таблиц, 39 рисунков и 9 приложений, объемом 13 страниц. Список использованной литературы включает 285 наименований, из них 144 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Ветчинкина, Екатерина Михайловна

выводы

1. Для представителей Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria, показано преимущество эмбриокультуры in vitro как метода преодоления покоя семян по сравнению с традиционными способами.

2. Показана специфичность поведения эксплантов модельных видов Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria в зависимости от типа покоя исходных семян, способов его преодоления и условий культивирования in vitro: а) у представителей рода Iris и Belamcanda chinensis холодная стратификация и использование ГКз стимулирует рост и развитие изолированных зародышей из обработанных семян с промежуточным и глубоким типом физиологического покоя; б) на этапе теплой стратификации при культивировании изолированных зародышей видов рода Paeonia, оптимальной является безгормональная питательная среда; на этапе холодной стратификации добавление в питательную среду ГК3 в концентрации 0,1-1 мг/л позволяет сократить период эпикотильного покоя; в) для нарушения покоя и получения нормальных проростков видов Fritillaria, первым этапом культивирования семян является обязательная теплая стратификация па протяжении 4-5 недель.

3. Для некоторых представителей рода Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria экспериментально установлены границы наступления стадии относительной автономности зародыша. У .всех изученных объектов стадия относительной автономности зародыша наступает в период дифференциации основных органов, а в зависимости от типа покоя наступление этой стадии может происходить как в середине (35-45ДПО - Iris и Belamcanda chinensis) или конце (40-50 ДПО - Paeonia) эмбрионального, так и в латентный период онтогенеза {Fritillaria).

7. Создан генетический банк in vitro представителей родов Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria, в том числе включающий 37 образцов видов, занесенных в Красную книгу РФ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ветчинкина, Екатерина Михайловна, Москва

1. Антонов А.С. Геносистематика растений. М.: ИКЦ Академкнига.- 2006. -293с.

2. Алексеева Н.Б. Виды рода Iris L. во флоре России. Проблемы охраны в природе и интродукции // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. Санкт-Петербург — 2005.- 18с.

3. Азаркович М.И., Гумилевская Н.А. Анализ белков семядолей зрелых семян конского каштана // Физиология растений. 2006. - Т. 53. - № 5- С. 711-720.

4. Артюкова Е.В., Гончаров А.А., Козыренко М.М., Реунова Г.Д., Журавлев Ю.Н. Филогенетические связи дальневосточных аралиевых по результатам сравнения последовательностей ITS региона ядерной рДНК // Генетика. 2005. - Т. 41. - N 6. -С.800-810.

5. Артюкова Е.В., Козыренко М.М., Илюшко М.В., Журавлев Ю.Н., Реунова Г.Д. Исследование генетической изменчивости Iris setosa II Молекулярная биология.-2001.-Т. 35. -№ 1.-С. 152-156.

6. Андреев Л.Н., Горбунов Ю.Н. Сохранение редких и исчезающих растений in situ: достижения и проблемы // Изучение и охрана разнообразия фауны, флоры и основных экосистем Евразии: Матер. Междунар. конф. М. 2000. - С. 19-23.

7. Байбурина Р.К., Мухаметвафина А.А., Миронова Л.Н. Особенности регенерации гибридов азиатских лилий из фрагментов соцветий в культуре in vitro II Сельскохозяйственная биология. 2006. - № 1. - С. 80 -85.

8. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Прикладные аспекты эмбриологии. Автономность зародыша и эмбриокультура цветковых растений // Бот. журн. 1987. -Т.72. - № 2. - С. 55-61.

9. Батыгина Т.Б. Генетическая гетерогенность семян: эмбриологические аспекты // Физиология растений. 1999. - Т. 46. - № 3 - С. 438-454.

10. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений. СПб.:Изд. СПб.Ун-та, 2002.-230 с.

11. Бельтюкова Н.Н. Оценка состояния ценопопуляций некоторых редких видов растений Пермского края с использованием молекулярно-генетических методов / Автреф. дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. Пермь, 2010. - 19с.

12. Биотехнология растения: культура клеток / Г.П. Болвел и др., пер. с англ. Под ред. Р.Г. Бутенко. М.: Агропромиздат. 1989 -. 280 с.

13. Боронникова С.В. Молекулярное маркирование и генетическая паспортизазия ресурсных и редких видов растений с целью оптимизации сохранения их генофондов // Аграрный вестник Урала. 2009. - № 2(56). - С. 57-59.

14. Боронникова С.В., Тихомирова Н.Н., Кравченко О.А. Характеристика генофондов редкого лекарственного вида Adonis vernalis L. с использованием ISSR-маркеров // Аграрный вестник Урала. 2009.-№ 5(59). - С. 67-70.

15. Боронникова С.В. Генетическая паспортизация редких и нуждающихся в охране видов растений как основа оптимизации сохранения их генофондов // Вопросы современной науки и практики. Университет им. В.И.Вернадского. — 2009. — Вып.3(17). С. 8-16.

16. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro (эмбриоидогенез у покрытосемянных) // Ботан. журн. 1978. - Т. 63. -№ 1.-С. 87-111.

17. Болтенков Е.В Изучение особенностей культивирования in vitro тканей дальневосточных видов рода Iris L. (Iridaceae) для использования в биотехнологии / Автореф. дис. канд. биол. наук. Владивосток. - 2002. - 24 с.

18. Болтенков Е.В., Рыбин В.Г., Зарембо Е.В. Особенности культивирования каллусной ткани Iris ensata Thunb. II Прикладная биохимия и микробиология. 2004Т. 40.-№2.-С. 244-251.

19. Бурова Э.А. Культура изолированных зародышей ирисов. // Интродукция растений. Минск: Наука и техника, 1976. С. 23-29.

20. Брюхин В.Б. Развитие зародыша пиона in vivo и in vitro / Автореф. дис. канд. биол. наук. Санкт-Петербург. - 1993. - 21 с.

21. Бутенко Р.Г. Клеточные и молекулярные аспекты морфогенеза растений in vitro III Чайлахян. Чтения. Пущино: Пущинский НЦ. 994. - С. 7-26.

22. Бутенко Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений / Рост растений и природные регуляторы. М.: Наука, 1977. - 95 с.

23. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986.-280 с.

24. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.:ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

25. Барсукова Е.Н., Уманец А.В., Бабиков А.В. К методике оптимизации среды для культивирования Actinidia kolomikta Maxim in vitro.11 Генетические ресурсы растениеводства Дальнего Востока. Владивосток: Дальнаука, 2004. - С. 389-393.

26. Болтенков Е.В. Культура изолированных зародышей видов рода Iris L. // Биолого-почвенный институт ДВО РАН. Владивосток. - 2000. - С.25-26.

27. Вечернина Н.А., Таварткиладзе O.K., Клементьева Л.А., Долганова З.В. Особенности регенерации и размножения растений рода Iris {Iridaceae) in vitro II Раст. Ресурсы. 2004. - Вып. 4. - С. 54-65.

28. Вечернина Н.А. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений. Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2004. - 205 с.

29. Васильева О.Г. Биолого-морфологические основы клонального микроразмножения некоторых представителей рода Rhododendron L. // Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. Москва. - 2009. - 132 с.

30. Валуева Т.А., Мосолов, В.В. Белки-ингибиторы протеиназ в семенах. 1. Классификация, распространение, структура и свойства // Физиология растений. -1999. Т. 46. - № 3.- С. 362-378.

31. Валуева Т.А., Мосолов, В.В. Белки-ингибиторы протеиназ в семенах. 1. Классификация, распространение, структура и свойства // Физиология растений. -1999(1).-Т. 46. -№ 3 С. 379-387.

32. Высоцкий В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала плодово-ягодных культур / Автореф. дисс. . докт. с.-х. наук. М. - 1998. - 44 с.

33. Высоцкий В.А., Бартенева JI.B. Особенности клонального размножения актинидии // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. -М.,1991-С.213-216.

34. Высоцкий В.А., Ипполитова Н.А., Талалаева Г.А. Культура изолированных почек пиона и разработка приемов микроразмножения /Технология выращивания цветочных культур в условиях Урала. 1984. - С. 33-40.

35. Высоцкий В.А., Бартенева JI.B., Упадышев М.Т. Введение в культуру дикорастущих видов актинидии, способы размножения in vitro II Сб. Научн. трудов ВНИИ садоводства. 1990. - Вып. 57. - С. 39-40.

36. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев: Наукова думка. 1984. - 260 с.39. 40. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. Новосибирск. - 1990. - 140 с.

37. Глазко В.И. Оценка полиморфизма различных генетических элементов в контроле разнообразия генофондов культурных растений // Вестник ВОГиС. 2008. -Т. 12.-№4.-С. 590-593.

38. Головнина К. А. Использование молекулярных маркеров для установления филогенетических взаимоотношений видов в родах Triticum L. и Iris L. / автреф. дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. Новосибирск. - 2008. - 19 с.

39. Гончарова JI.B., Баранов О.Ю., Юхимчук А.Н., Спиридович Е.В., Володько И.К. Использование молекулярно-генетических маркеров дляпаспортизации коллекции рода Rhododendron L. // Бюллетень Никитского ботанического сада. 2009. - Вып. 99. - С. 5-10.

40. Горбунов Ю.Н. Конвенция о биологическом разнообразии и ботанические сады России / Тезисы докладов участников конференции «Стратегия ботанических садов России в началеТретьего тысячелетия». Петрозаводск. - 2001.

41. Даскалюк А.П., Самоил В.В., Даскалюк Ю.А. Покой семян яблони: особенности становления и снятия при стратификации // Физиология растений. -1999. Т. 46. - № 3.- С. 419-425.

42. Дивашук М.Г. Идентификация хромосомных транслокаций и замещений у некоторых форм яровой тритикале / Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. Москва. - 2007. -134 с.

43. Дерфлинг К. Гормоны растений М, 1989. - 160 с.

44. Долгих Ю.И. Сомаююнальная изменчивость растений и возможности ее практического использования (на примере кукурузы) / Автореф. дисс. д-ра биол. наук.- М., 2005.-45 с.

45. Еникеев Х.К., Высоцкий В.А., Плотникова Г.А. Развитие зародышей вишни и черешни в культуре in vitro изолированных на ранних фазах эмбриогенеза // Сельскохозяйственная биология. 1984. - №11.- С.46-47.

46. Журавлев Ю.Н., Корень О.Г., Музарок Т.И., Реунова Г.Д., Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Илюшко М.В. Молекулярные маркеры для сохранения редких видов растений Дальнего Востока // Физиология растений. -1999. Т. -46. - № 6. -С.953-964.

47. Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Реунова Г.Д., Илюшко М.В. ДНК-типирование дальневосточных видов рода Iris L. с помощью метода RAPD-PCR // Генетика. 1998. - Т. 34. - № 3. - С. 368-372.

48. Зарипова А.А., Ишмуратова М.М. Введение Paeonia anomala L. in vitro II V молодеж. науч. конф. "Актуал.пробл.биологии":Тез.докл Сыктывкар, 1998-С.69.

49. Зарипова А.А. Начальные этапы клонального микроразмножения пиона уклоняющегося боковыми почками // Вестник ОГУ. 2009. -№6. - С. 140-142.

50. Зарипова А.А., Шаяхметов И.Ф., Байбурина Р.К. Культура зародышей Paeonia anomala L. (Paeoniaceae) // Вестник Башкирского университета. 2007. -Т.12.-№4.-С. 36-37.

51. Забаровский Е.Р. // Молекулярная биология. 2001. Т. 35. № 2. С. 224

52. Зарнадзе Н.Ж., Кутубидзе В.В., Кунах В.А. Получение каллюсных тканей от актинидии chinensis и deliciosa II Субтропические культуры. 1993. - №1. -С. 17-24.

53. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура незрелых зародышей миндаля от межвидовой гибридизации и свободного опыления // Бюлл. ГБС. 1985. - Вып. 115.-С.85-90.

54. Здруйковская-Рихтер А.И. Морфогенетические процессы в тканях изолированных зародышей ранних стадий развития плодовых растений // Бот. жур. -1991. Т.70 - № 10 - С.1355-1361.

55. Злацкая А.В., Шитикова Ю.В., Король JI.B. Изучение внутривидового и межвидового консерватизма локусов микросателлитов (SSR) // Бюллетень Никитского ботанического сада. 2009. - Вып. 99. - С. 59-63.

56. Игнатова С.А. Биотехнологические основы получения гаплоидов, отдаленных гибридов и соматических регенерантов зерновых и бобовых культур в различных системах in vitro / Автореф. дис. докт. биол. наук Ялта. - 2004. - 19 с.

57. Изучение редких растений в условиях реинтродукции / Сост. Баранова О.Г., Дедюхина О.Н., Яговкина О.В. Ижевск, 2008. - 53 с.

58. Ишмуратова М.М. Использование культуры тканей для размножения редких и исчезающих видов растений / Биол. науки в высш. шк. Пробл. и решения. -Бирск, 1998. С. 41-44.

59. Ишмуратова М.М. Особенности культивирования in vitro растений различных экологических групп на примере видов рода Iris L. // Раст. ресурсы.1999.- Т.35. Вып. 4. - С. 67-73.

60. Ишмуратова М.М., Рахимова А.Ф. Использование культуры in vitro для размножения гибридов Iris L. // Раст. ресурсы. 1999. - Т. 35. - Вып. 4. - С.74-78.

61. Ишмуратова М.И., Ткаченко К.Г. Семена травянистых растений: особенности латентного периода, использование в интродукции и размножении in vitro. Уфа: Гилем, 2009. - 116 с.

62. Калашникова Е.А. Влияние факторов гормональной и негормональной природы на морфогенетический потенциал интактных растений пшеницы в культуре in vitro II Сельскохозяйственная биотехнология. / Под. ред. Шевелухи B.C. Евразия,2000.-Т.2.-С. 71-80.

63. Калинин Ф.Л., Бутенко Р.Г. Методы культуры тканей в физиологии растений Киев: Наукова думка, 1980. - 425 с.

64. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений -М.: Наука, 1983.-230 с.

65. Кузеванов В.Я., Сизых С.В. Университетский ботанический сад как ресурс для национальных и международных образовательных программ // Ботанический сад Иркутского госуниверситета. Иркутск, 2006.

66. Кузьмина Н.А. Культура клеток и тканей растений. Омск: Омский ГПУ, 1999.-270 с.

67. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Гостимский С.А. Наследование и характеристика RAPD-маркеров, выявленных у сомаклональных вариантов гороха // Доклады Академии Наук. 2000. - Т. 372. - № 4. - С. 565-567.

68. Котеева Н.К., Кравкина И.М. Структурные изменения в клетках семени Tulipa tarda (Liliaceae) в процессе доразвития при холодной и теплой стратификации.

69. Эпидерма семядоли зародыша // Бот. журн. 2005. - Т.90. - №12. - С. 1824-1836.

70. Котеева Н.К., Кравкина И.М. Структурные изменения в клетках семени Tulipa tarda (Liliaceae) в процессе доразвития при холодной и теплой стратификации.

71. Эндосперм // Бот. журн. 2007. - Т.92. - №12. - С. 1924-1933.

72. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Болтенков Е.В., Лауве Л.С. Сомаклональная изменчивость Iris pseudacorus L. по данным RAPD- и цитогенетического анализа // Биотехнология. 2004. - № 2. - С. 13-23

73. Конвенция о биологическом разнообразии: Текст и прил. NEP/CBD/COP/8/12, 2006. 38 с.

74. Коновалов Ф.А. Картирование и молекулярно-генетический анализ генов гороха (Pisum sativum L.) / Дисс'. на соиск. уч. ст. к.б.н. Москва. - 2006. - 126 с.

75. Конарев А.В. Использование молекулярных маркеров в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции // Аграрная Россия. -2006. -№6.- С.4-23

76. Коваленко О.В. Генетические аспекты морфогенеза растений // Успехи соврем. Биологии. 1993. - Т. 113. - №3. - С. 269-285.

77. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Куксо П.А. Морфогенез в культуре in vitro: роль фитогормонов // Успехи современной биологии. 1999. - Т. 119. - Вып. 6-С.567-577.

78. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции. М, 1973. - 98 с.

79. Ковалева И.С., Данилова Т.В., Молканова О.И. Усовершенствование методики микроклонального размножения малино-ежевичного гибрида Тайберри // Бюлл. Гл. ботан. сада. 2000. - Вып. 179. - С. 74-80.

80. Кутас Е.Н. Научные основы клонального микроразмножения растений на примере интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной.: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Москва. - 1997. - 24 с.

81. Лабецкая Н.В.; Лауве Л.С.; Журавлев Ю.Н. Введение в культуру in vitro Iris oxypetala Bunge // Раст. ресурсы. 2000. - T.36. - Вып.1. - С. 67-70.

82. Лемеш В.А., Шут М.В., Хотылева Л.В. RAPD-анализ межвидового полиморфизма льна (род Ыппт) // Вестник ВОГиС- 2005 Том 9 - № 4. - С. 490-494.

83. Макаревич И.Ф., Щербик С.В., Блинов А.Г., Доронькин В.М. Филогенетические взаимоотношения сибирских видов рода Iris L. (Iridaceae), выявленные с помощью RAPD-PCR метода // Turczaninowia. 2001. - Т. 4. - Вып. 4. -С. 80-92.

84. Мартын Г.И., Мусатенко Л.И., Сытник К.М. Субструктура клеток зародышей некоторых видов семян, характеризующихся глубоким физиологическим покоем // Укр., ботан. журн. 2005. - Т.62. - № 3. - С 321-328.

85. Мельникова Н.В., Борхерт Е.В., Мартынов С.П., Окунева И.Б., Молканова О.И., Упелниек В.П., Кудрявцев A.M. Использование RAPD-анализа для верификации коллекций in vitro сирени обыкновенной (Syringa vulgaris L.) // Генетика.-2009.-Т. 45,-№ 1.-С. 97-103.

86. Международная программа ботанических садов по охране растений. М.: Междунар. совет ботан. садов по охране растений. Botanic Gardens Conserv.Intern., 2000. 57 с.

87. Малышев С.В., Картель Н.А. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений // Молекулярная биология. -1997. Т.31. - № 62. - С.197-208.

88. Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологических систем получения и сохранения декоративных и плодовых культур // Сборник научных трудов Никитского ботанического сада. 2009. - Т. 131-С. 9-27.

89. Молканова О.И. Генетические банки растений в ботанических садах России // Сборник научных трудов Никитского ботанического сада. 2009. - Т. 131. — С, 22-27.

90. Морозова Н.М. Экспрессия генов в эмбриогенезе / Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. СПб.: Мир и семья, 1997. 823 с.

91. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Порофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологий. -М: Наука, 1990. 120 с

92. Молканова О.И. Использование биотехнологических методов для сохранения генофонда растений ex siti / XII съезд Русского ботанического общества. Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века. Часть 2. -Петрозаводск, 2008. С. 28-33.

93. Малаева Е.В. Биологические и молекулярно-генетические особенности дальневосточных видов рода Actinidia Lindl. // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. -Москва.-2008.- 19 с.

94. Набиева А.Ю. Сохранение и размножение в культуре генотипов редких видов лилий Азиатской части России. // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. -Новосибирск. 2009. - 17 с.

95. Новоселова Н.В. Закономерности эмбриогенеза и формирования семян сосны сибирской (Pinus sibirica Du Tour) in vivo в культуре in vitro II Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. Красноярск. - 2003. - 21 с.

96. Национальный доклад РФ «по доступу к генетическим ресурсам и совместному использованию выгод». М. - 2001.

97. Немойкина A.JI. Влияние света и гормонов на морфогенез юкки слоновой культуре in vitro / Автореф. дис. канд. биол. наук Томск, 2003. -19 с.

98. Немойкина A.JL, Карначук Р.А. Морфогенез и гормональный баланс юкки слоновой в культуре in vitro на свету разного спектрального состава // Научный вестник Черновицкого университета: сборник научных трудов. Биология. 2002. -Вып. 145.-С. 72-76.

99. Николаева М.Г., Разумова М.В, Гладкова В.Н. Справочник попрорастанию покоящихся семян. Л.: Наука, 1985. - 347 с.

100. Николаева М.Г., Лянгузова И.В., Поздова Л.М. Биология семян / РАН. Ботан. ин-т им. В.Л.Комарова СПб., 1999. 232 с.

101. Николаева М.Г. Особенности прорастания семян в зависимости от филогенетического положения растений и эколого-географических условий их обитания // Физиология растений. 1999 (1). - Т. 46. - № 3. - С.432-437.

102. Николаева М.Г. Эколого-физиологические особенности покоя и прорастания семян // Ботанический журнал. 2001. - № 12. - Т. 86. - С.1-15.

103. Новикова Т.Н., Набиева А.Ю., Полубоярова Т.В. Сохранение редких и полезных растений в коллекции Центрального сибирского ботанического сада // Вестник ВОГиС. 2008. - Т. 12. - № 4. - С. 564-572.

104. Обручева Н.В. Новое о семенах геномика и протеомика // Физиология растений. - 2005. - Т.52. - №2. - С. 316-319.

105. Обручева Н.В., Антипова О.В. Общность физиологических механизмов подготовки к прорастанию у семян с различным типом покоя // Физиология растений.- 1999. Т. 46. - № 3. - С. 426-431.

106. Обручева Н.В., Антипова О.В. Морфология и физиология прорастания семян / Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. СПб.: Мир и семья, 1997. 823 с.

107. Орлов П. А. Клеточные и генно-инженерные технологии модификации растений. Минск: Тонпик, 2006. - 284 с.

108. Поздова Л.М., Разумова М.В. Покой семян / Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. СПб.: Мир и семья, 1997. 823 с.

109. Понтович В.Э. Тканевые и гормональные взаимодействия при раннем эмбриогенезе in vitro / Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.: Колос, 1979.-С. 104- 114.

110. Потапова Л.В., Шагжиева К.Ш., Варламова А.А. Бурятия: концептуальные основы стратегии устойчивого развития. М., 2000. С. 151-170.

111. Разумова М.В., Поздова Л.М. Влияние температуры на доразвитие зародыша и прорастание семян двух видов Fritillaria (Liliaceae) // Бот. журн. 1999. -Т.84. -№6. - С. 63-70.

112. Размахнин Е.П. Закономерности гаплопродукции в культуре пыльников пырея сизого Agrohyron glaucum Desf. / Автореф. дис. канд. биол. наук. -Новосибирск, 2003. 145 с.

113. Редкие и исчезающие виды природной флоры СССР. Л.:Наука.Д983. 263с.

114. Родионенко Г.И. Семя ириса и его особенности // Докл. Акад. Наук СССР. 1955.- Том 4. - № 4. - С. 653-656.

115. Родионенко Г.И. Род Ирис (Iris L.). Вопросы морфологии, биологии, эволюции и систематики // M.-JL: Изд-во академии наук СССР, 1961. 215 с.

116. Стратегия ботанических садов России по сохранению биологического разнообразия растений. М.:Красная Звезда, 2003. 32 с.

117. Сравнительная эмбриология цветковых растений: Однодольные: Butomaceae-Lemnaceae / Алимова Г.К., Анисимова Г.М., Батыгина Т.Б. и др. Ботан. ин-т им. В.Л.Комарова Л.: Наука. Ленингр. отд-ние, 1990. 332 с.

118. Сравнительная эмбриология цветковых растений. Davidiacceae-Asteraceae / Ботан. ин-т им. В.Л.Комарова; Отв. ред. Яковлев М.С.; Алимова Г.К. и др. Л.: Наука, Ленингр. отд-ние, 1987. Т.4. - 391 с.

119. Сравнительная анатомия семян. Однодольные / Ботан. ин-т им. В.Л.Комарова; Под ред. Тахтаджяна А.Л. Л.: Наука, Ленингр. отд-ние, 1985. -Т.1.-317 с.

120. Сельскохозяйственная биотехнология / Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. -М.: Высш. шк., 2003. 469 с.

121. Сохранение растений в генетических банках in vitro: преимущества и недостатки / Мамаева Н.А., Ветчинкина Е.М., Горбунов Ю.Н., Молканова О.И. // Бюллетень ГБС. -2008. -Вып. 194.-С. 141-149.

122. Соболев В.В., Соболева А.Г., Андреева Г.Н., Карлов Г.И. Оценка межвидового и межсортового полиморфизма малины и маркирование признака ремонтантности с использованием ISSR-ПЦР-анализа // Известия ТСХА. 2009. -Вып. 2.-С. 103-109.

123. Соболев В.В., Карлов Г.И., Соболева А.Г., Озеровский А.В., Казаков И.В., Фесысов А.А. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины // Сельскохозяйственная биология. -2006.-№5.-С. 48-52.

124. Сулимова Г.Е., 2004 ("http://www.lab-cga.ru/articles/JornalO 1/Statial.htm)

125. Талалаева Г.А. Действие некоторых регуляторов роста на изолированные почки пиона травянистого / Технология выращивания цветочных культур в условиях Урала, 1984.-С. 28-33.

126. Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений // Биотехнология растений: культура клеток-М.:ВО «АгропромизДат», 1989.-С.97-127.

127. Тихонова B.JI. Долговременное хранение семян // Физиология растений — 1999. Т. 46. - № 3.- С. 467-476.

128. Шнеер B.C. ДНКгШтрихкодирование видов животных и растений -способ их молекулярной идентификации и изучения биоразнообразия // Журнал общей биологии. 2009. - Т. 70. - № 4. - С. 269-315.

129. Эмбриология растений: использование в генетике, селекции, биотехнологии / Перевод с англ Батыгина Т.Б. и др. М.: Агропромиздат., 1990 — 509с.

130. Al Zahim M.A., Ford Lloyd B.V., Newbury H.J. Detection of somaclonal variation in garlic (Allium sativum L.) using RAPD and cytological analysis // Plant Cell Reports. -1999. -Vol. 18. № 6. - P. 473-477.

131. Avise J.C. Molecular markers, natural history and evolution. Chapman and Hall: An International Thomson Publishing Company. 1994. - 122 p.

132. Anzidei M.; Schiff S.; Bennici A. Prove di germinazione in vitro di Iris pallida Lam. / Atti del Convegno intern."Coltivazione e miglioramento di piante officinali".-Trento, 1996.-P. 559-561.

133. Albers M.R.J., Kunneman B.P.A.M. Micropropagation of Paeonia II Acta Hort. 1992. - Vol. 314. - P. 85-92.

134. Berleth Т., Chatfleld S. Embryogenesis: Pattern formation from a single cell / The Arabidopsis Book of American Society of Plant Biologists. 2002. - 27p.

135. Bouza L.; Jacques M.; Miginiac E. In vitro propagation of Paeonia suffruticosa Andr.cv."Mme de Vatry": developmental effects of exogenous hormones during the multiplication phase // Scien Hortic I1 1994a. Vol.57. - N 3 - P. 241-251.

136. Bouza L., Jacques M., Miginiac E. Requirements for in vitro rooting of Paeonia suffruticosa Andr.cv.'Mme de Vatry' // Scien Hortic. 19946. - Vol.58. - N 3. -P.223-233.

137. Bajaj Y.P.S. Biotechnology in Agriculture and Forestly. High-Tech and Micropropagation II / ed. By Y.P. S. Bajaj. Verlag Berlin Heidelberg. - 1992. - Vol. 20. -P. 268-284.

138. Bajaj Y.P.S. Biotechnology in Agriculture and Forestly. High-Tech and Micropropagation II / ed. By Y.P. S. Bajaj. Verlag Berlin Heidelberg. - 1992. - Vol. 20. -P.173-197.

139. Bajaj Y.P.S. Biotechnology in Agriculture and Forestly. High-Tech and Micropropagation II / ed. By Y.P. S. Bajaj. Verlag Berlin Heidelberg. - 1991. - Vol. 15. -P. 258-269.

140. Bajaj Y.P.S. Biotechnology in Agriculture and Forestly. High-Tech and Micropropagation II / ed. By Y.P. S. Bajaj. Verlag Berlin Heidelberg. - 1988. - Vol. 4. -P. 246-268.

141. Baskin J.M., Baskin C.C. Some considerations for adoption of Nikolaeva's formula system into seed dormancy classification // Seed Science Research. 2008. -Vol.18.-P. 131-137.

142. Beruto M., Lanteri L., Portogallo C. Micropropagation of tree peony (Paeonia suffruticosa) II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2004. - Vol. 79. - P. 249-255.

143. Bewleyl J.D. Seed germination and dormancy // The Plant Cell. 1997. -Vol.9.-P. 1055-1066.

144. Bouck A., Peeler R., Arnold M.L., Wessler S.R. Genetic mapping of species boundaries in Louisiana irises using IRRE retrotransposon display markers // Genetics. -2005.-Vol. 171(3).-P. 1289-303.

145. Bogani P., Simoni A., Lio P., Scalpi A., Buiatti M. Genome flux in tomato cell clones cultured in vitro in different physiological equilibria. II. A RAPD analysis of variability // Genome. 1996. - Vol. 39. - P. 846-853.

146. Brown P., Tanksley S.D. Characterization and genetic mapping in simple sequence repeats in the tomato genome // Mol Gen Genet. 1996. - Vol. 250. - P. 39 - 49.

147. Bahf L.R., Compton M.E. Competence for in vitro bulblet regenerationl among eight Lilium genotypes // Hort. Science. 2004. - 39, № 1. - P. 127-129.

148. Buntjer J.B., Otsen M., Nijman I.J., Kuiper M.T., Lenstra J.A. Phylogeny of bovine species based on AFLP fingerprinting // Heredity. -2002. Vol.88. - № 1- P.46-51.

149. Chaturvedi R, Razdan M.K., BhojWani S.S. In vitro morphogenesis in zygotic embryo cultures of neem (Azadirachta indica A. Juss.) // Plant .Cell Rep. 2004. -V.22(ll).-801-809.

150. Consonni G., Gavazzi G., Dolfini S. Genetic analysis as a tool to investigate the molecular mechanisms underlying seed development in maize // Annals of Botany. -2005. Vol. 96. - P. 353-362.

151. Cnops G., den Boer В., Gerats A., Van Montagu M. and Van Lijsebettens M. Chromosome landing at the Arabidopsis TORNADO locus using an AFLP-based strategy // Mol Gen Genet. 1996. - Vol. 253(1-2). - P.32-41.

152. Debeaujon I., Leon-Kloosterziel K.M., Koornneef M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis // Plant Physiol. 2000. -Vol. 122(2).- 403-413.

153. Debeaujon I, Koornneef M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid // Plant Physiol. 2000. - Vol. 122(2). - P. 415-24.

154. Devos, K.M., Gale M.D. The use of random amplified polymorphic DNA markers in wheat // Theor. Appl. Genet. 1992. - Vol. 84. - P. 567-572.

155. Devos K.M., Gale M.D. The genetic maps of wheat and their potential in plant breeding // Outlook Agric. 1993. - Vol. 22. - P. 93-99.

156. Dodds, J.H., Roberts L.W. Experiments in plant tissue culture. New York, Cambridge University Press. 1985. - 232 p.

157. Debergh, P.C.; Zimmerman, R.H. Micropropagation: technology and application.The Netherlands, Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1991. - 484 p.

158. Ellison A.M. Interspecific and intraspecific variation in seed size and germination requirements of Sarrcenia (Sarraceniaceae) // American Journal of Botany. -2001.-Vol. 88.- N.-3.- P. 429-437.

159. Fennimore S.A.; Foley M.E. Genetic and physiological evidence for the role of gibberellic acid in the germination of dormant Avena fatua seeds // Journal of Experimental Botany. 1998. - Vol. 49. - No. 318. - P. 89-94.

160. Finch-Savage, W.E., Leubner-Metzger G. Seed dormancy and the control of germination // New Phytologist. 2006. - V. 171 - P. 501-523.

161. Finkelstein R., Reeves W., Ariizumii Т., Steber C. Molecular aspects of seed dormancy // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. Vol. - 59. - P. 387-415.

162. Forbis T.A., Floyd S.K., de Queiroz A. The evolution of embryo size in angiosperms and other seed plants: Implications for the evolution of seed dormancy // Evolution. 2002. - Vol. 56. - P. 2112 - 2125.

163. Garcia D., Fitz Gerald J.N., Berger F. Maternal control of integument cell elongation and zygotic control of endosperm growth are coordinated -to determine seed size in Arabidopsis II The Plant Cell. 2005. - Vol. 17. - P. 52-60.

164. Gehan Jayasuriya K.M.G., Baskin J.M., Baskin C.C. Sensitivity cycling and its ecological role in seeds with physical dormancy // Seed Science Research. 2009. -Vol.19.-P. 3-13.

165. Glendon D., Ascough J.E., Johannes van Staden E. Micropropagation of Iridaceae a review // Plant Cell Tiss Organ Cult. - 2009. - Vol. 97 - P.l-19.

166. Grechko V.V. Molecular DNA markers in phylogeny and systematics // Russian Journal of Genetics. 2002. - Vol. 38. - № 8. - P.851-868 (Translated from Genetika. - 2002. - Vol. 38. - №8. - P. 1013-1033).

167. Godwin I.D., Sangduen N., Kunanuvatchaidach R. et al. RAPD polymorphisms among variant and phenotypically normal rice {Oryza sativa var. mdica) somaclonal progenies // Plant Cell Reports. 1997. - Vol. 16. - № 5. - P. 320-324.

168. Gao S.L, Zhu D.N., Cai Z.H., Jiang Y., Xu D.R. Organ culture of a precious Chinese medicinal plant Fritillaria unibracteata //Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1999.-Vol. 59.-P. 197-201.

169. Gabryszewska E. The influence of cytokinins, thidiazuron, paclobutrazol and red light on shoot proliferation of herbaceous peony cv. Jadwiga in vitro // J. Fruit and Ornam. Plant Res. 1998. - Vol.6. -N 3. - P. 157-169.

170. Goldblatt P., Mabberley DJ. Belamcanda included in Iris, and the new combination I. domestica {Iridaceae: Irideae) II Novon: A Journal for Botanical Nomenclature.-2005.-Vol. 15.-№ l.-P. 128-132.

171. Golovnina K.A., Glushkov S.A., Blinov A.G., Mayorov V.I., Adkison L.R., Goncharov N.P. Molecular phylogeny of the genus Triticum L. // Plant Systematics and Evolution. 2007. - Vol. 264. - P. 195-216.

172. Gupta P.K., Varshney R.K., Sharma P.C., Ramesh B. Molecular markers and their applications in wheat breeding // Plant Breed. 1999. - Vol. 118. - P. 369-407.

173. Galande A.A., Tiwari R., Ammiraju J.S.S., Santra D.K., Lagu M.D., Rao V.S., Gupta V.S., MisraB.K., Nagarajan S., Ranjekar P.K. Genetic analysis of kernel hardness in bread wheat using PCR-based markers // Theor. Appl. Genet 2001.- Vol.103.- P.601-606.

174. Global Strategy Plant Conservation: www.bgci.org.uk/fi les/7/0/globalstrategy. p df.

175. Hernandez P., Rubio M.J., Martin A. Development of RAPD markers in tritordeum and addition lines of Hordeum chilense in Triticum aestivum // Plant Breed. -1996.-Vol. 118.-P. 52-56.

176. Hai-Shan C. The efficiencies of various embryo rescue methods in interspecific crosses of Lilium //Bot. Bull. Acad. Sin. 2002. -Vol. 43. - P.139-146.

177. Hicks M., Adams D., O'Keefe S., Macdonald E., Hodgetts R. The development of RAPD and microsatellite markers in lodgepole pine (Pinus contorta'var. latifolid) И Genome. 1998. - Vol. 41. - P. 797-805.

178. Hosoki Т., Ando M., Kubara Т., Hamada M., Itami M. In vitro propagation of herbaceous peony {Paeonia lactiflora Pall.) by a longitudinal shoot-split method // Plant Cell Reports. 1989. - Vol. 8. - P.243- 246.

179. Hu J., Quiros C.F. Identification of brokkoli and cauli-flower cultivars with RAPD markers // Plant Cell Rep. 1991. - V. 10. - P.505-511.

180. Irzikowska L., Wolko В., Swi?cicki W.K. The genetic linkage map of pea {Pisum sativum L.) based on molecular, biochemical and morphological markers // Pisum Genetics.-2001.-Vol. 33.-P. 13-18.

181. Ikeda N., Niimi Y., Dong-Sheng H. Production of seedlings from ovules excised at the zygote stage in Lilium spp. // P. Cell Tiss. Org.Cult. 2003. - Vol.73. -P.159-166.

182. In vitro collecting techniques for germplasm conservation. / Ed. Pence V.C., Sandoval J.A., Villalobos V. M. // IPGRI Technical Bulletin. 2002. - No. 7. - 101 p.

183. Joshi S.P., Gupta V.S., Aggarwal R.K., Ranjekar P.K., Brar D.S. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza II Theor Appl Genet. 2000. - № 100. - P. 1311-1320.

Информация о работе

Ветчинкина, Екатерина Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.01

Диссертация

Биологические особенности культивирования in vitro семян и зародышей редких видов растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы