Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Научные основы клонального микроразмножения растений на примере интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Научные основы клонального микроразмножения растений на примере интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной"

^ А

а? На правах рукопкск

КУТАС Елена Николаевна

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ КЛОНАЛЬНОГО МИКР0РАЗМН0ХЕНИЯ РАСТЕНИЙ НА ПРИМЕРЕ ИНТРОДУЦИРОВ^ННЫХ СОРТОВ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ И БРУСНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

03.00.12 - Физиология растений

!

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических

наук

Москва 1997

Работа выполнена в Центральном ботаническом саду Национальной Академии наук Беларуси.

* Научный-консультант - член-корреспондент HAH Беларуси,

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки Беларуси, лауреат Государственной прении Беларуси СИДОРОВИЧ Е.А.

Официальные оппоненты! доктор биологических наук

И1АИН С.С.

доктор биологических наук НОСОВ A.M.

доктор биологических наук ГОРБУНОВ D.H.

Ведущее учреждение - Всесоюзный селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства РАСХН.

Замыта состоится "..................1997г.

в "¿У чао на заседании совета по защите диссертаций Д.120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии им.К.А.Тимирязева.

Адрес« 127550, Москва И-550, ул.Тимирязевская, 49. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан . /.Y.V.^V/ ......... .1997r

Ученый секретарь диссертационного совета А.С.ЛОСЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Теоретическую основу абсолютно всей методологии культуры клеток и тканей, в том числе и клонального михроразмножения . составляют морфогенез и регенерация растений. Однако, несмотря на имеющиеся экспериментальные работы, посвягцешшо изучению процессов морфогенеза и регенерации в культуре in vitro, клональное михроразииожениа представляет непало сложностей, состоящих в отсутствии четких хорошо восп-производимых методик, их трудоемкости и сложности, а также в недостаточных знаниях морфогенетических потенций растений и способов управления ими в культуре клеток и тканей. К таким растениям принадлежат интродуцированные сорта голуб;:ки високой и брусники обыкновенной, для которых процессы морфогенеза и регенерации а культуре in vitro практически не изучены.

Исследование процессов морфогенеза и регенерации сортов этих растений а культуре клеток и тканей, а также структурно-функциональных особенностей регенерантоз и адаптации их при переходе из условий культуральных сосудов в условия оранжереи и открытого грунта, позволит внести существенный вклад в разработку теоретических основ и путей практического использования клонального микроразмножения растений в целом, а также таких ценных плодово-ягодных культур, какими являются иптродуцкрованиые copra голубики высокой и брусники обыкновенной, в частности.

Традиционно клональное мнкроразмножение принято рассматривать как метод, состоящий из соответствующих процедур: введение экспланта в стерильную культуру, собственно микроразмножениэ, укоренение регенерантов на питательной среде, перенос их в нестерильные услоеия. В большинстве случаев клональное микроразмножение сводится к "инструменту1,' с помощью которого можно получить материал в неограниченном количестве.

Новизна постановки вопроса, связанного с клональным микроразмножением растений, состоит в рассмотрении его не только как метода, а как единого сложного многофакторного физиологического процесса, состоящего из двух принципиально разных этапов! in vitro (в услооиях стерильной культуры) и in vivo (в условиях оранжереи и открытого грунта), базирующегося на единой теоретической основе, с одной стороны, на морфогенезе и регенерации в условиях in vitro, с другой, на сгруктурно-функциоихчън'оЯ адаптации регенерантов а условиях in vivo, что позволит создать теоретические предпосылки и разработать совершенную технологию клонального микроразмножения для любого вида растения в целом, а также для интродуцированных сортов голубики высокой м брусники обыкновенной в частности.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Проведенные исследования входили в плановые теми Центрального ботанического сада Академии наук Беларуси, координируете Научный советом по проблеме "Продуктивность растений" (íl* госрегистрации 0190010215)¡

"Разработка научаах основ промышленного вырагцивания интродуцированных плодово-ягодных растений сем,Брусничные в условиях Беларуси" (if госрегистрации 01900021954)}

"Разработка технологии клоняльного пнкроразмножения интродуцированных плодово-ягодных и декоративных растений" (N® госрегистрации 1994149).

Кроме того, исследования выполнялись в соответствии с республиканской комплексной программой фундаментальных исследований "Биотехнология".

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в том, чтобы дать научно обоснованное представление о клональном микроразмножении растения как едином многофакторном физиологическом процессе, состоящем из двух принципиально разных этапов! in vitro и in vivo, базирующемся на единой теоретической основе.

Дпя достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задач

- изучить влияние многочисленных факторов (стерилизуодие соединения, тип зкспланта, время года,в которое он был вычленен, генотип, компоненты, содержащиеся в питательной среде) на процесс клопального микроразмножения интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной в культуре in vitroi

- исследовать морфогенез и регенерация, протекающие у эксплантов на клеточном и субклеточной уровнях на различных модификациях питательных' сред)

- провести анатоно-физиологические исследования реакции регенерантов на условия культивирования in vitro и in vivo*

- изучить развитие и адаптации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, регенерированных в асептической культуре, в условиях оранжереи и открытого грунта;

- исследовать влияние осмотических ингибиторов и ретардантов на сохранение янзнеспособности регенератов, длительно не пересаливаемых на свежие питательные среди.

Научная новизна. Впервые экспериментально показано, что клонсльное кихрорезмножение - это не только метод, используемый для ускоренного размножения растений, а вместе с тек, сложный, иногофакторный физиологический процесс, контролируете генетически, состоящий из двух принципиально разных этапов: in vitro и in vivo, базирующиеся на единой теоретической основе, с одной стороны—па морфогенеза и регенерации в условиях in vitro, с другой -

на структурно-функциональной адаптации регенерантов в условиях in vivo.

Пересмотрен устоявшийся взгляд о влиянии генотипа на морфогенез и регенерацию растений в культуре in vitro. Выявлена неоднозначная роль генотипа в процессах морфогенеза и регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной. Отношение генотипа к норфогенезу не является прямым, а комплексный, то есть оказывает свое влияние в совокупности с другими факторами (физиологическим состоянием экспланта, многочисленными компонентами питательной среды, условиями культивирования и др.). Генотип не только служит индикатором способности экспланта к микроразмножению, но и контролирует его потенциальную способность к данному процессу.

Установлено, что морфогенез интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной протекает на фоне сбалансированной питательной среда двух модификаций (WPM и Андерсона), содержащей 4 мг/л ИУК и 15 мг/л 2-иП. Степень регенерационной способности исследованных растений определяется возрастом и типом экспланта, составом питательной среды, соотношением компонентов, содержащихся в ней, а также сортовой и видовой принадлежность» материала. У голубики высоким регенерационным потенциалом обладают ювенильные экспланты, у брусники - зрелые.

На основании результатов экспериментальных исследований, полученных при изучении регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной на разных уровнях органчзации-от клетки до целого органа, показана принципиальная возможность регенерировать растения через активацию пазушных меристем, пролиферацию каллуса и образование адвентивных побегов непосредственно из ткани листа.

Получены оригинальные сведейия, на основании сравнительного анализа структурно-функциональных особенностей регенерантов в условиях in vitro и in vivo, позволившие показать, что условия культивирования накладывают отпечаток на структуру и функцию регенерантов.

Обнаружены структурно-функциональные различий листьев, выраженных в асептической культуре, в условиях оранжереи и в открытом грунте, свидетельствующие о пластичности листа - органа, способного' перестраивать свою структуру и функцию адекватно условиям культизирования, что теоретически является гарантом успешной адаптации растений в результате переноса их из условий куль-туральных сосудов в условия оранжереи и открытого грунта.

Показана принципиальная возможность предотвращения процессов старения регенерантов интродуцированных сортов голубики высокой н брусники обыкновенной в культуре in vitro с помощью осмотических ингибиторов и ретардантов. Установлено оптимальное содержание осмотиков и ретардантов в питательной среде,

необходимое для длительного гультмоирования peraicparao на протяжении 12 месяцев без пересадок их на сзеше питательные среды.

, Выявлены преимущества интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, регенерирован»« в асептической культуре, по сравнению со своими двойниками, размноженными традиционным черенкованием, заключающиеся в повышенной морозоустойчивое..! и усиленном образовании багальных побегов.

Впервые проведенное комплексное исследование клонального микроразмножения интродуцированных сортов голубихи высокой и брусники обыкновенной, включающее морфогенез к регенерацию, а также структурно-функциональную адаптацию, дало возможность получить научно обоснованное представление о клоналыюм пикроразм-нохекии растений, как сложном, многофакторном физиологическом процессе, контролируемом генетически, что явилось вхладом в развитие научной основы клонального микроразмножения растений и путей его практического использования.

Практическая значимость полученных результатов. На основании результатов экспериментальных исследований, полученных по изучению процессов морфогенеза и регенерации растений в условиях in vitro, a также структурно-функциональной адаптации регенерангов в условиях in vivo,разработана технология клонального микроразмножения интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, создан банк генотипов, представленный коллекцией стерильных культур интродуцированных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной, разработаны три метода регенерации этих сортов: 1) через активации пазушных меристем, 2) пролиферацию каллуса, 3) непосредственно из ткани листа. Регенерация интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной непосредственно из ткани листа может быть использована в системе генетической трансформации,с цель» получения трансгенных растений с новыми ценными свойствами для селекционной работы, а также для клонального микроразмножения. Нами получены трансгенные растения непосредственно из клеток листовой ткани у • двух сортов голубики высокой: Concord и Atlantic.

Разработанная технология клонального никроразмножеиия интродуцированных сортов голубики высокой и бруснихм обыкновенной обладаем рядом преимуществ, заключающихся во-первых, в сокращении технологического цикла в культуре in vitro с трех стадий до двух (за счет исключения стадии укоренения на питательной, среде); во-вторых, в экономии дорогостоящих компонентов питательной среды (гормональных добавок и др.),необходимых для рнзогенеза; в-третьих, в устрша нии потеря», связанных с повреждением корневой системы при отмывании ее от агара; в-четвертых, в сокращении сроков получения товарной продукции.

• Материалы диссертации легли в основу опубликованной монографии, будут использованы при написании учебника для вузов по клсиаяьному макроразиножеыию

растений, при чтении лекций по морфогенезу и регенерации в культуре клеток и тканей, а также структурно-функциональной адаптации регенераитов.

Экономическая значимость полученных результатов. Технология клоналыюго микроразмножения ш продуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной позволит поставить на протшленнуо основу производство здорового, экологически чистого посадочного материала таких цегаак интродуцированных сортов растений,как голубика и брусника, и удовлетворить потребности народного хозяйства Беларуси и других районов СНГ в этой продукции, а также может быть реализована как коммерческий продукт. Предложения о покупке технологии поступили с регионов средней полосы России и Украины.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- клональное кнкроразмнокенме интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной находится в тесной зависимости от типа экспланта, его физиологического состояния, времени года в которое он был вычленен, генотипа, компонентов, содержащихся в питательной среде;

- степень проявления и направленность процессов морфогенеза и регенерации у зксплантсв голубики и брусники контролируется соотношением ауксинов и цито-кшшнов, характер воздействия которых обусловлен возрастом растения и связан

с его сортовой и видовой принадлетаостыо;

- процесс адаптации регенераитов интродуцирозпппл сортов голубики высокой и брусники обикновенноЯ обеспечивается за счет перестройки их структурно-функциональной организации, вызванной как изменившимся факторами среда обитания (при переходе из условий in vitro в условия in vivo) § так и адекватной реакцией на них, проявившейся в изменении количественных и улчгствешгах показателей анатомической структуры листа растгнля-регенеранта.

Личный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены автором лично при выполнении плановых тем научной тематики Центрального ботанического сада Академии наук Беларуси в соответствии с утвержденными программами.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты работы были представлены в форме тезисов и устных докладов и обсуждены на Всесоюзной конференции по теоретической й прикладной карпологии (Кипгинев, 1989), Республиканской научной конференции, посвяценной 150-летия ботанического сада им.акад. А.В.Фомина (Киев, 1989), Межреспубликанском научном Ьемикаре по эколого-биологическому изучению ягодных растений сем.Брусничные и опыту освоения их промышленной культуры в СССР (Ганцевичи, 1991), Научной конференции по генетической инженерии и биотехнологии (Минск, 1994), Международном симпозиуме по' биотехнологии растений и генетической инженерии (Киев, 1994), Втором сгег.де

белорусского общества физиологов растений (Минск, 1995), Межгосударственной научной конференции по биологическому разнообразии и интродукции растений (Санкт-Петербург, 199Ь), Бторсп международном симпозиуме по клепальному микро-размноженив растений (Салгспилс, 1996), Научной конференции по сохранению биологического разнообразия Белорусского Поозерья (Витебск, 1936).

Опубликованность резул. .-атор. Материалы диссертации опубликованы в 3 монографиях, 18 научных статьях, 11 тезисах, авторском свидетельстве и патенте.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 273 страницах машинописного текста, состоит иэ »ведения, общей характеристики работы, 9 глав, выводов, списка литературы из 201 наименования отечественных и 493 зарубежных авторов, иллюстрирована 42 таблицами, 12 рисунками.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ СОСТОЯНИЕ БОЛЮСА НА C0BPÏMEHH0M ЭТАПЕ И ОБОСНОВАНИЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дан критический обзор экспериментальных работ, выполненных в нашей стране и за рубежом в области клонального иикрораэмножения растений, показавший слабую степень изученности вопроса.

Отмечена еще не исследованная область морфогенеза и регенерации, а также структурно-функциональной адаптации регенерантов к условиям культивирования для интродуцировакных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной -растений, имеющих важное народно-хозяйственное значение.

Сформулировано основное направление исследований и обоснована необходимость его проведения.

0Ш2С1Ы И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования служили 14 интродуцированных сортов голубики высокой (Bluecrop, Blueray, Dixi, Herbert, Earlyblue, i^ncocas, Scanmel, Delite, Woodart, Atlantic, Concord, Tifblue, Covin, Stanley) и 4 сорта брусники обыкновенной (Koralle, Masovia, Emtedank, Erntefcröne). Приведена око-лого-биологическая характеристика перечисленных растений, а также сведения о их пищевой и лекарственной ценности.

Методика исследований базировалась, с одной стороны, на классических приемах, общепринятых в культуре клеток и тханей, описанных в сборнике "Биотехнология растений! культура клеток и тканей" (М., 1989), а с другой нуждалась в постоянной корректировке в соответствии с экспериментами,

преследующий решение определенных задач: изучение факторов, влияющих на процесс клонольного пнкроразмножения интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, исследование процессов морфогенеза и регенерации, анатомо-физиолегические исследования реакции регенерантов на условия культивирования, адаптации регенерантов к условиям произрастания, длительное хранение регенерантов в культуре in vitro.

Поскольку общепринятые методики пришлось модифицировать ко многим экспериментам, то мы сочли целесообразным, с целью лучшего восприятия материала, останавливаться на них в каждой главе диссертации.

Статистическую обработку данных проводили с использованием ЭВМ.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПРОЦЕСС КЛОНАЛЬНОГО МЖРОРАЗЖОЖОВД .

ингродуцирсшиих сортов vaccinim атамвоам ь. и

VSCCINim VXTIS-IDMA L. В КУЛЬТУРЕ IN VXTPO

Огерылизуиде соединения. Необходимо отметить, что лроцесс клонального микроразмножения начинается с изолирования экспланта, его стерилизации и посадки на питательную среду. Немаловажная роль а нем принадлежит подбору стерилизующих соединений, эффективности их концентраций и лродолжительности времени обработа, с целью освобождения материала от инфекции и получения высокого выхода жизнеспособных эксплантов.

В качестве стерилизующих соединений испытывали 0,1% раствор диацила, О,IX - супены, 0,Si - азотнокислого серебра, 0,ОАХ азотнокислой ртути, 6% -гипохлорида кальция в сочетании с обработкой 70% этанолом, с экспозицией 5 сек для этанола, 10 мин для остальные растворов.

Зксплаигами служили верхушечные и бокоьыч пзчкн молодых побегов 14 сортов голубики высокой (Atlantic, Concord, Tifblue,. Dcl.i te, Waodart, Stanley, Blue-crop, Blueray, Covill, Earlyblue, Herbert, Rancocae, Scaratel, Dixi) и 5 сортов брусники обыкновенной (Koralle, I-lasoviaj Erntedanlc, Erntekröne, Erntezegen).

Анализ результатов эксяер^ментальных исследований показал, что выход жизнеспособных эксплантов зависит как от типа стерилизующего соединения, так и от видовой и сортовoil принадлежности растения, гз которого вычленяли эксплаит.

Оптимальным стерилизующим соединением для исслсДованпьс: cjpTOB голубики высокой следует считать все указанные соединенна,за исключением ьХ раствора гипохлорида кальция; для брусники обь!кновен1юй-0,04% раствор азотнокислой ртути и 0,8% - азотнокислого серобра. Ирм использовании перечисленных сг>;>м~ пизующих соединенлй выход жизнеспособных эхеплантов был макспнальг.ым и с ^ :т?.тш

- а -

70-80% для брусники и 80-100 - для голубики.

Эксляаит. Следукхции фактором, сказывагацим немаловажное значение на процесс клепального микроразгаюхекяя, является эксплант.

Анализ литературы по проолене регенерационной способности ввенильни* и зрелых зкеплантов дает основание считать, что существует два аспекта данной проблемы. С одноП стороны, зиспернменталышй материал, полученный многочислен ными исследователями, свидетельствует о высокой регенерационной способности, присущей ювенильным эхеплантам, а с другой - зрглыи. Это убеждает нас в том, что только экспериментальным путем можно определить регенерацнонную способность того или другого зхспланта, независимо от наших знаний о его физиологическом состоянии.

В ¿эксперименте эксплантами служила апикальные и латеральные почки зрелы* и молодых побегов 14 интродуцированнъос сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной, а также части стерильных проростков (эпикотиль, гипо-котилъ, стебелек, корешок, семядоли, листья,верхушка проростка).

На основании анализа экспериментального материала установлено, что для каждого типа «кспланта характерен определенный регенерационный потенциал, зависящей от соргговой принадлежности растения и физиологического состояния экспланта, то есть от его возраста. Так,наибольшее число регенерантов на один ювенильный эксплант получено у сорта Дикси (из семядолей - 13, листьев - 11-13 верхушек проростков - 15). Накменыаей регенерационной способностью обладали зкепланты сорта Ранкокас, за исключением гипокотиля, которому присущ относительно высокий регенерационный потенциал (7 растений-регенерантов на зкеплант) Остальные сорта занимали промежуточное положение по данному показателю. У зрелых зкеплантов регенерационный потенциал равен кул».

Сравнительный анализ регенерационной способности различных типов зкеплантов у интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной показал, что высокий регенерационный потенциал характерен для ювенилъных эксплантов голубики и для зрелых - брусники. Такая диаметрально противоположная картина, наблюдаемая относительно данного показателя, наводит на мысль о неодинаковой способности, присущей сортам этих видов растений, к синтезу эндогенных регуляторов роста в одних и тех же типах эксплантов. Логично предположить, что у брусники обыкновенной больше синтезируется эндогенных гормонов в зрелых эксплантах, по сравнению с ювенильными, а у голубики высокой -наоборот. Не исключено, что это может быть связано с принадлежностью интро-дуцированных сортов голубики к листопадным кустарникам, а брусники - к вечнозеленым кустарничкам.

Рреия года. Время года, в которое был вычленен эксглаит, играет большую роль в процессе клоналъного мнкроразмножения. Особую остроту приобретает этот вопрос по отношению к интродуцироваяным сортам голубики высокой и брусники обыкновенной, так как эти сорта относятся к сем.Ericaceae и содержат гораздо большее количество фенолов по сравнению с растениями из других семейств.

При вычленении экспланта происходит механическое повреждение тканей, сопровождаемое резким усилением биосинтеза фенольных соединений. При выходе фенолов из вакуолей (в которых они локализованы) в протоплазму, в результате поранения клетки во время вычленения экспланта, они неизбежно подвергаются ферментативному окислению, в результате которого образуются токсические соединения - хиноны, вызывающие некроз и гибель экспланта.

Вообще некротическая реакция рассматривается как защитная сверхчувствительная функция, осуществляемая при помощи полифенолькых соединений, так как продукты окисления фенолов создают на пути распространения инфекции хиионные барьеры, в результате возникают защитные некрозы. Однако такие защитные некрозы крайне нежелательны при введении экспланта в стерильную культуру. В этой связи возникла необходимость в определении благоприятного времени года для отбора эксплантоа,в течение которого некроз их будет нкникельным.

Как показал анализ экспериментального материала, полученного для интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, экспланты, вычлененные а различное время года, по-разному реагировали в культуре in vitro (табл. 1, 2).

Экспланты брусники обыкновенной, отобранные в январе-феьрале и мае-декабре, оказались в конечном итоге неспособными к. пролиферации. Эгспланты, отобранные в марте-апреле, быстро регенерировали побеги без образования каллуса, в отличие от эксплантов, вычлененных в другое время года, которые были способны к образовании только каллуса. В случав формирования побегов из таких эксплантов, достигая в длину не более 6 мм, они приостанавливали рост за счет увеличения массы каллуса, и деградировали, а каллус в конечном итоге бурел.

Оптимальным временем для отбора эксплантов у"интродуцированных сортов брусники обыкновенной следует считать март-апрель. Вероятно, в это время происходит снижение уровня фенольных ингибиторов роста, накопившихся в почках осенью и зимой иобеспечивающих ¡и состояние покоя. Не исключена возможность, что в марте-апреле у нсследованных сортов брусники обьгаов^нной природные цитокинины и ауксыт переходят в активную форму, что способствует нормальной регенерации побегов из почзк, вычлененных в это время года. Отсутствие регенерации как таковой у i-ксплактов, отобранных в чоябре-декябр€, может быть

Таблица 1.

Влияние времени года на пролиферацию in vitro эксплантов интродуцированных сортов брусники обыкновенной*

Время отбора

Сорт

Köralle

Masovxa

! Emtedank

I Ernteiaröna

Примечание

зылищхтю 1 1 2 1 3 1 2 3 1 2 3 1 1 2 - 1 3

Январь-февраль 45 5+1 ++ 35 2+1 ++ 40 3+1 ++ 25 2+1 ++ Регенерированные побеги с каллусом побурели

Март-апрель 85 9+1 ' - 80 ■ 7+1 - 75 6^1 . 65 5+1 - Регенерированные побеги росли нормально .

№8-игаь 55 6+1 ++ 45 .4+1 ++ 50 4+1 ++ 40 3+1 ++ Часть побегов с каллусом побурела

Июль-август 35 0 + 25 0 + 30 0 + 30 0 + Часть побегов с каллусом побурела

Сентябрь-октябрь 20 0 + 15 0 + 25 0 + 15 0 + Экспланты с каллусом побурели

Ноябрь-декабрь 0 0 0 0 - С 0 - 0 0 - - Зкспланты побурели

Данные из 15 эксплантов на позторностъ.

Условные обозначения: 1 - процент пролиферировавиих эксплантов, спустя 45 дней их культивирования;

2 - количество побегов, регенерированных на 1 эксплант"(штук)У

Елилние времени отбора гкспланюз интродуцированных сортов голубики высокой на их хизнеспособность в культуре in vitro (данные из 15 эксплантов на повторность)

Врамя отбора

Сорт

Bluecrop ! Blueray !

Dixi

Herbert

Rancocas

Примечание

^JwlUitiHIÜÖ i- 1 2 ! 3 1 •213 1 ! 2 ! 3 ! 1 2 ! 3 1 2 ! 3 ■

Январь-февраль '/8 22 - 80 20 - 82 18 - 84 16 - 78 22 - Экспланты, отобранные с

¡•¡арт-алрель 60 40 + 84 16 + 6? 32 + 80 20 + 58 42 + ноября по апрель, регене-

Май-ивнъ 8 92 - .0 100 - 0 100 - 2 98 - 2 98 - рировали побеги после

Июль-август 14 86 ++ 20 . 80 ++ 10 SO + 4 96 + 16 84 + пересадки их со среды

СектнЗрь-октябрь 64 35 ++ 56 - 44' ++ 50 50 -н- 56 44 +t 50 50 н- Андерсона на среду VJFM

Нзябрь-цежбрь 70 ,30 - 80 20 - 80 20 - 76 24 - 70 30 -

Усливныз обозначения; 1 - процент жизнеспособных (зеленых) эксплантов, '

2 - процент окисленных (бурых) зисшшнтов,

3 - галлусообразование: -н- (интенсивное), + (медленное), - (отсутствует).

Союхщения: '.'Ж - Woody Plant Medium.

сопряжено с накоплением в почках фенольных иигибиторов роста, что в свою очередь приводит к резкому атжению эндогенных ауксинов и цитокинкнов и переходу их в неактивную форму. .

Анализ экспериментального материала интродуцированных сортов голубики высокой показал, что наиболее благоприятное врем* года для отбора эксплантов следует считать с ноября по март. В эти месяцы у всех сортов баз исключения отмечен высокий процент жизнеспособных эксплантов (табл. 2).

Геаогош. С целью выяснения роли генотипа в процессе клонального микроразмножения интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной нами были проведены экспериментальные исследования, касающиеся изучения влияния генотипа на коэффициент размножения и морфометрические показатели регенерантов этих растений.

Полученные экспериментальные данные позволяет сделать вывод о различии В коэффициенте размножения и морфомвтрических показателях у исследованных растений (табл. 3).

Дальнейоие исследования были направлены на увеличение коэффициента размножения у сорта Vtoodart, Delite, Tifblue и основывались на предположении, что сам по себе генотип не оказывает влияния на регенерационный процесс, а служит индикатором способности экспланта определенного сорта или вида растения к данному процессу. Если это так, то у сортов, обладающих низким коэффициентом размножения (Woodart - 1 регенерант на эксплант, Delite - 2,5, Stanley - 3,5, табл.2) можно добиться его увеличения. Подтверждениемправильности наших суждений являются результаты экспериментальных исследований, позволившие увеличить этот показатель в 5 раз для сорта Woodart, в 2,2 - для Delite, в 1,8 - для Tifblue (табл .4) при содержании в питательной среде НУК«2-иП - 4:15 (табл.4). На нав взгляд, следует обратить особое внимание на то обстоятельство, что на одну и ту же концентрацию гормонов исследованные три сорта отозвались по-разному, т.е. увеличение коэффициента размножения произошло на неодинаковую величину. Этот факт является свидетельством того, что генотип служит не только индикатором способности экспланта к микроразмножению, но и контролирует его потенциальную возможность к данному процессу.

Анализ литературных данных и материалы собственных исследований заставляет пересмотреть устоявшийся взгляд о влияния генотипа на регенерацию. Не отрицая значительной роли генотипа в этом процессе, мы считаем, что если какой-либо вид растения или сорт не образует регенерантов в случае применения ряда модификаций питательных сред, это не иожет быть основанием для утверждения об отсутствии способности к регенерации у данного растения, так как она генетически

Таблица 3.

Влияние генотипа на коэффициент размножения и морфометрические показатели интродуцированных сортов гт.убики

высокой (среда НЕМ 1:5 ИУК/2-tfl)*

! Сорт

Показатель 1-:-

! '.toodart ! Delite ! Atlantic 1 Concord ! Stanley ! Tifblue

Коэффициент размножения (количество регенёрантов 1+0

ча один экснлант)

Высота регеперанта (мм)

Размер .чиста рехецеранта (1Ж1( ва)

х

Показания сняты спустя 45 дней- культивирования. Данные представляют средни» арифметическую + среднеквадратическая оаибка при п = 10.

Сокращения: wem - Woody Plant haümi

'ЛУК - индолалуксусная кислота (мг/л-^)

2-иП - изосентенил^адгкин (мт/л-1) хж .

Представлены усредагнные (по 10-15 листьям) данные.

2,5 + 0,5 6 + 1 5,5 + 0,5 3,5 + 0,5 2,5 + 0,5

10 + 1 .13 + 2

30 + 3

23 + 1

20 + 2

17 + 1

1

3,8 х 2,4 3,9 х 2,6 5,0 х 4,1 5,0 х 3,9

4,5 х 3,1

4,0 х 2,7

Таблица 4.

Влияние регуляторов роста на двух типах питательных сред на коэффициент размножения у интродуцировашшх сортов голубики высокой (освещенность 3000 лк, 1 = 25°С+1, фотопериод 16 ч)

Вариант питательной среды

1 ИйосЗу Plant МесПип 1 Андерсона

1 ИУК: 2иП(мг/л" (коэффициент 1\1размножения, М шт. I ИУК: |2иП(мг/л-1) 1 коэффициент .; !размножения, ! шт.

1:5 1,0+0 1:5 1,5+0,5

Иооаал 2:10 4:15 3,5+1 5,0+0,5 2:10 4:15 2,5+1 4,0+0,5

5:25 3,0+0,5 5:25 3,0+1

1:5 2,5+0 1:5 1,0+0

2:10 4:15 3,0+0,5 5,5+1 2:10 4:15 2,5+1 3,5+0,5

5:25 2,5+1 5:25 2,3+1

1:5 2,5+0,5 1:5 1,5+0,5

'ПГЫие 2:10 4:15 3,5+1 4,5+1 2:10 4:5 2,0+1 4,5+1

5:25 2,0+0,5 5:25 2,5+0

Сокращения: ИУК - индолилухсусная кислота 2-иП - изопентениладенин

детерминирована. Это лишь свидетельствует о неправильном сбалансировании питательной среда и других факторов, необходимых для регенерации того или другого вида растения или сорта. На наш взгляд, при соответствующей оптимизации состава питательных сред, условий культивирования, правильного отбора экснланта, можно '.звать морфогенез и регенерацию у любого генотипа, несмотря на всю сложность этих многофакторкх процессов. Стало быть,нельзя недооценивать роль ге>, • типа а клональиом микроразмножении растений, равно как и преувеличивать его.

МОРФОГЕНЕЗ ИНГРОДУЦИРОВАННЫХ ООРТОВ УАССПШМ СШМССШ Ь.

и тасспщм угпб-юаеа ь. в культуре 1Н \ятао

Изучение морфогенеза было проведено нами у 14 интроАудированных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной на трех типах питательных гред девяти модификаций, различающихся концентрацией макро- и микросолей, гормональных добавок (табл. 5).

Результата экспериментальных исследований показали, что морфогенез исследованных сортов растений зависит от типа питательной среда, ее состава, соотношения гормональных добавок в ней.

Из всех исследованных типов сред наиболее активное побегообразование происходило на среде И?М (К1 3) и Андерсона (I? 9). Спустя 4-5 пассажей, почти у всех микрочеренкоа, высаженных для побегообразования, наблюдали ризогенез на среде Т 8 и 1Р9, чего не было отмечено на средах других модификаций. Это служит доказательством универсальности этих сред для обоих морфогенетичесхмх процессов: побегообразования и ризогенеза. Несмотря на то, что ь подавлякцем большинстве случаев ризогенез индуцируется только после ■пересадки регене-рантов на среду для корнеобразования, дополненную экзогенным ауксином, в данном случае образование корней на среде для побегообразования не исключает предположения о том, что в регеиерантах этих сортов достаточно содержится эндогенного ауксина, способного вызвать корнеобразованиг без пересадки на специальную среду для ризогенеза, дополненную экзогенным ауксином.

У остальных зксплангов (эпикотиль, гипокотильи др.) через 5-6 недель культивирования образовался морфогенный каллус с последующей регенерацией из него побегов. Высоким морфогекеткческим потенциалом обладали все баз исключения эхсплауты на двух средах КРК и Андерсона трех модификаций, содержащие цитокинин (2-иП) и ау.<син (ИУК) в следующих соотношениях: 2,5 г 1, 4 : 1, 3,75 : 1.

На основании изучения морфогенетическкх процессов, протекающих у эксплантов исследованных сортов, показана принципиальная возможность

Таблица 5.

Состав модифицированных питательных сред, использованных для изучения морфогенеза ^продуцированных сортов

Л/ассиши зп.ЬЫ-1с1аеа Ь. и Уассатит согугЬозт Ь.

Компонента ! Модификация среда (номер)

питательных • 1 ,,.,_, , , -

сред (мг/л) ! 1 12! 3 I 4 I 5 ! 6 ! 7 ! - ! Ь

Махросолн по кг Полная норма 1/2 KS - - 1/2 MS 1/2 MS -

Микросоли по № - 1/10 MS ■ - - 1/2 MS 1/10 MS - -

Макросоли по ИРМ Ik - Полная . норна Полная норма - - - - Полная Eoptja -

Микросоли по ИМ п - - к -

Макросоли по Андерсону - - - Полная норма - - - Полная норма

Микросоли по Андерсону - - - " - - - ii

Мезоинозит 100 100 100 1С0 100 100 100 100 100

Аденин сульфат - 80 80 80 80 40 40 80 80

Тиамин (Б^) 0,4 - - 0,4 - 0,1 0,1 . 0,4 0,4

Пиридоксин (В^) - - - 0,4 - - - -

Продолжение табл. 5.

Компоненты

Модификация среды (номер)

1 * п 1 с* д е/1 оншл сред (иг/л) ! 1 ! 2 ! 3 * 4 ! 5 ! 6 : 7 ! 8 ! 9

Индалнлуксусная кислота 1,0 5 - 2 1 1.5 2,5 4 4

Бензиланинопурин - - - - 2 - -

Гибберелловая кислота - 4 - - ■ - - ■ "

Кзопонгекилздения 10 ю 2 5 2 - - 10 15 15

Сахароза 20000 ' 20000 20000 20000 20000 20000 20000 30000 30000'

Агар 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000

рН 4,0 4,0, 4,0 4,0 4,0 4,0 " ' 4,0 4,0 4,0

Сокращения: ¡Б - Мураслге-Скуга

НЕМ - 1.ЪоЗу Р1апй МесЛии

- компонент отсутствует в среде

получения регенерантов двумя , тодаши 1) через активации пазушных меристем, и 2) пролиферацию морфогенж>л> каллуса с последующей регенерацией из него побегов.

Результаты исследований, полученные при изучении морфогенеза у различных типов эксплантов у интродуцированных сортов голубики высокой и бруснихи обыкновенной на модифицированных питательных средах, использованы нами при разработке технологии клепального микроразмнохения данных сортов.

регшерация ингюдуцированных сортов vaccinium corymbosum l.

и vaccinitm vitis-idaea l. в культуре in vi'iko

Регенерация растений является узловым моментом во всей методологии культуры клеток и тканей. Без регенерации теряют свою значимость исследования касающиеся роста и дифференциации, гибридизации, генетической трансформации и, наконец, теряет свою значимость клонирование ценных сортов многочисленных культур в промышленном масштабе.

В этой связи нами проведены экспериментальные исследования, позволяющие изучить регенерацию 14 интродуцированных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной в культуре in vitro и определить факторы, влияющие на этот процесс.

Базируясь на предположении, что состав питательной среды играет одну из основополагающих ролей в регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, эксперимент» были проведены на четырех типах питательных сред: MS, ИРМ, Андерсона, Лирена 18-ти модификаций, различающихся содержанием макро- и микроэлементов, гормональных добавок, витаминов и других компонентов.

Подробный анализ экспериментальных данных показал, что регенерационный потенциал интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной зависит от типа питательной среды и компонентов, содержащихся в ней. Оптимальной средой для данного показателя следует считать две модификации питательных сред, содержащие: 1) соли и витамины по WEM, 2) соли и витамины по Андерсону, мезоинозит, аденин сульфат, гормональные добавки, сахарозу и агар. Эти среды были положены в основу при разработке технологии клонального микроразмножения исследованных растений.

Сравнение регенерационного потенциала интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной на одних и тех же модифти ..¡ях питательных сред дает возможность убедиться в существовании видовых различий для данного показателя. У брусники этот показатель в 2,5 раза выше, чем у голубики.

В,результате исследования питательных сред на регенерационную способность опытных растений мы смогли оценить комплексное влияние компонентов, содержащихся в них, на этот процесс, выявить существование видовых различий в нем, а также определить оптимальные модификации питательных сред для регенерации исследованных растений.

Изучение влияния ауксина (КУК) и цитокинина (2-иП) различных концентраций на регенерацию побегов показгло, что самый высокий регенерацжншый потенциал для исследованных сортов голубики и брусники-, отмечен на среде, содержащей 5 мг/л ИУК и 20 мг/л 2-иП, однако в этой ситуации побеги отличались по морфологии. Остается пока не ясным какова природа данного морфоза? Она носит эпигенетический характер или затрагивает геном растения7 С нашей точки зрения, ответить на этот вопрос помогут цитогенетические исследования. Если окажется, что морфозы носят случайный характер и не затрагивают наследственность растения, то концентрации (5 мг/л ИУК и 20 мг/л 2-иП) можно будет использовать для получения генетически однородного материала. В противном случае материал с измененной плоидностыо может найти применение в селекции.

При других концентрациях ауксина (1, 2, 4 мг/л) и цитокинина (5, 10, 15 мг/л) регенераты имели нормальную морфологию, аномалий в их строении не обнаружено. Это дает возможность использовать перечисленные концентрации стимуляторов роста для регенерации исследованных сортов.

На основании результатов эксперт -антального материала, полученного по изучению укоренения 14 интродуцированных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной в зависимости от типа ауксина (ИМК, ИУК, НУК) и его концентраций (0,25, 0,50, 1,00 мг/л) в питательной среде, можно прийти к выводу, что оптимальным вариантом для ризогенеза исследованных сортов следует считать 1 мг/л ИМК.

Принимая во внимание то обстоятельство, что ризогенез у интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной происходит кг, -г на среде для ризогенеза, содержащей ауксин, так и на среде для побегообразования, в присутствии ауксина и цитокинина, было интересно проследить, произойдет ли образование корней у регенерантов непосредственно в почвенном субстрате, минуя стадию укоренения их на питательной среде.

Анализ экспериментального материала свидетельствует о возможности укоренения регенерантов интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной в почвенном субстрате, минуя стадию укоренения на питательной среде. Доказательством неоспоримости данного вывода может служить сравнительная характеристика укоренения регенерантов на различных типах субстрата. Самый высокий процент укоренения от 90 до 100 составил у всех сортов без исключения

-го-

на субстрате, содержащей торф:перлит (1:1). Нескольк. ниже этот показатель.был на субстрате торф:песок (1:1) « перлите, пропитанном раствором макро- и микросолей.

Укоренение регенерантов кнтродуцнрованных сортов голубики высокой и брусники обыккопенной непосредственно в субстрате позволит исключить из технологического цикла стада» укоренения на питательной среде, сэкономив при этом расход дорогостоящих компонеатоа, необходимых для приготовления питательной среды, избежать потерь, саяавшяк с повреждением корневой системы при отмывании ее от агора, сократить сроки получения товарной продукции и, в целом, удешевить технолотч» клональизго кихроразмнехеняя данных культур.

Эаверсал изложения экспериментального материала, касающегося регенерации илтродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, остановимся на регенерации побегов непосредственно из ткани листа.

Результаты эхЬператгнтальшх исследований показали, что регенерация побегов из листьев зависала от типа акспланта, состава питательной среды, соотношения гормонов в ней и сортовых особенностей материала. Оптимальной средой для регенерации побегов из ткани листа у интродуцированкых сортов голубики высокой и брусники обыкновенной следует считать модифицированную среду WPH и Андерсона, содержащую 1 иг/г. ИУК и 5 мг/л 2-иП.

Сравнительный анализ регенерацнонной способности целкх листьев и кусочков листа показал, что целые листья обладают большей регенерацконной способностью по сравнении с кусочками листа. Можно думать, что при использовании в качества эксплантов кусочков листа теряется функциональная целостность листа, как органа - это во-первых; во-вторых, при механическом повреждении экспланта происходит фенольное окисление, что вызывает некроз экспланта; в третьих, кусочки листа обладал: неодинаковым мернстепатическик потенциалом. &се вместе взятое, с нашей точки зрения, приводит к снижению регенграционного потенциала в случае использования кусочков листа по сравнена» с целыми листьями.

Анатомические исследования показали, что высокими керистематическими потенциями обладали клетки субэпидериалыюго слоя мезофилла адаксиальной стороны листа в зоне центральной жилки у основания листовой пласткнхи. Менее активными были клетки в средней и верхней части листа. Вероятно, высекая активность мерист^атвческоб ткани у основания листовой пластинки, обусловленная направленностью транспорта ассимйлятов d растении, является одной из причин активной регенерации побегов у основания яустовоЗ пластинки.

Принимая во внимание, что регенерация побегов происходила непосредственно из клеток мезофилла листа, минуя стад«1 образования каллуса, можно полагать, что полученный таким образом материал идентичен материнскому,.т.е. сохранена

его сортовая принадлежность, что особенно важно при кл опальном пикроразмнохе-нии.

Разработанный метод прямой регенерации из ткани листа может бить использован в целях генетической трансформации для получения трансгенных растений.

Следует сказать, что при введении в клетку бактериальных плззмид, нам удалось получить растения-регенерантн непосредственно из трансформированных клеток листовой ткани у двух сортов голубики еысохоЙ! concord и Atlantic.

АНАТОНО-ФИЗИОЛОГНЧЕСКИЕ ИССЛВДОВАНИЯ РЕАКЦИИ РШЛЕРА1ГГОВ

vaccinium согоотоЕШ L. и vaccihujm vitis-idaea I,. НА.

уаювия культивирования

Одним из ведущих факторов культивирования в условиях in.vitro является освещенность.

Исходя из предпосылки, что свет оказывает влияние на структурно-функциональную организацию растений в культуре клеток и тканей, нами било исследовано влияние интенсивности освещения на содержание пигментов и анатомическую структур." листа растений-регенерантов интрсдуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной в культуре in vitro.

Анализ содержания зеленых и желтых пигментов при различной освещенности (1000, 2000, 4000 лк) показал, что для большинства сортов (Atlantic, Concord, Еалоэсаз, Covill, Earlyblue, Herbert, Dixi, Bluecrop, Tifblue, Masovia, Erntedank) характерна классическая закономерность в изненен-m содержания хлорофилле!» и карогиноидов. При увеличении интенсивности освещения до 4000 лк содержание хлорофилле»"а", "б" и их суммы уменьпалосъ, а каротиноидов - увеличивалось. При уменьаешш интенсивности освещения до 1000 лк содержание зеленых пигментов увеличивалось, а желтых уменьшалось. Это свидетельствует о лабильности пигментной система пластид, что способствует адаптации регенерантов в условиях in vitro к различной освеценности« от 1000 до 4000 лк. Косвешшм подтверждением лабильности пигментной системы пластид как следствия 'адаптации растений в условиях in vitro к различному рйгаиу освещения, могут, шуштъ ■ результаты морфометрических показателей, caiyjeTenbcrsyir^Si об-успе^гом'культи-вировании регенерантов в данных условиях.

Свет оказывает влияние не только на фуккциональам! процессыj''-протекаицие в тканях листа, но и на его структурную организадав.1 Изучение- внутреннего строения листа регенерантов, о зааи jcth ot интенсивности освещения в условиях in vitro,показало, что изменение интенсивности освещения не приводит к появ-лсикя новых признаков структуры листа, а лишь усиливает ши ослабляет

существующие. В изменении толщины листовой пластинк фослеживали прянув зависимость от интенсивности освещения. В изменении размера устьиц наблюдали обратную зависимость. Например, при увеличении интенсивности освещения с 2000 до 4000 лк толщина листовой пластинки увеличилась у сорта Bluecrop с 65 до 76 мкм, у сорта Dixi - с 70 до 85 мкм. При уменьшении интенсивности освещения с 2000 до 1000 лк величина данного показателя уменьшилась у сорта Bluecrop - с 65 до £8 мкм, у Dixi с 70 до 60 мкм.

■ В условиях in vitro, независимо от интенсивности освещения, регенеранты имел» гомогенную структуру листа. Мезофилл не был дифференцирован на столбчатую у губчатую паренхиму и состоял из паренхииных клеток округлой, изодиа-мегрическоП формы. Эпидермис листа однослойный, без кутикулы. Стенки эпидер-малькых клеток извилистой формы. Устьица с недоразвитыми замыкаыщши клетками.

У регенерантов, развивавших^,! в условиях оранжереи и открытого грунта, лист дорзивентральный. Мезофилл листа четко дифференцирован на столбчатую и губчатую паренхиму. Устьица с развитыми замыкающими клетками. Эпидермис листа однослойный, с тонкой кутикулой.

Исследование нами сорта растений реагировали на условия культивирования

изменением как общего плана строения листа, так и количественных показателей.

Условия открытого грунта с повышенной солнечной инсоляцией и относительно

низкой влажностью воздуха способствовали увеличений толщины пластинки листа,

коэффициента палиседности, длины клеток столбчатой паренхимы, числа устьиц на ó

1 мм поверхности листа, а условия оранжереи с пониженной солнечной инсоляцией и относительно высокой влажность» воздуха приводили к уменьшению величины данных показателей.

адаптация ршнераигов ингродуцированньк сортов vaocinium ооккмвобш l. и vacc1niu1 vitis-xdaea l. к условиям i?) vivo

С нашей точки зрения в основе клонального микроразмножения лекат два принципиально разных этапа: in vitro и in vivo. На перзом из них жизнедеятельность размножаемого материала происходит в замкнутом стерильное пространстве, на питательной среде/в строго контролируемых условиях. После переноса регенерантов в условия in vivo начинается второй этап в жизнедеятельности растений, совершенно отличный от условий in vitro. Переход растений из условий in vitro в условия in vivo в, большинстве случаев является критическим и связан с гибелью растений.

На наш взгляд, понять причину гибели растений при адаптации и предотвратить ее поможет сравнительный аначиз структурно-функциональных особенностей

регенерантов в условиях in vivo и vitro.

Как показали исследования, проведенные нами по изучению внутреннего строения листа, в зависимости от условий культивирования, регенеранты интроду-цированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, выращенные в условиях in vitro, не имели четкой дифференциации мезофилла на столбчатую и губчатую ткань, имели тонкую листовую пластшгку, слаборазвитый кутикулярный покров, недоразвитый устьичный аппарат, способствующий постоянному открытию устьиц и чрезмерной транспирации.

Листья регенерантов, развивающиеся в условиях оранжереи^ имели четкую дифференциацию мезофилла на столбчатую и губчатую паренхиму, кутнкуллркый покров, развитый устьичный аппарат, что способствовало нормальному о лечению транспирации.

)жстья растений, высаженных в открытый грунт, по общему плану строения не отличались от листьев оранжерейных растений. Они имели четко дифференцированную структуру листа на столбчатую и губчатую ткань, хорошо развитый ку-тикулярный покроп, устьичный аппарат.

Логично предположить, что различия в структуре листа сопряжены с их фунх-цио тльными различиями. Реальным подтверждением тому является низкая интенсивность фотосинтеза в условиях in vitro, что связано с отсутствием четкой дифференциации листа на столбчатую и губчатую ткань, с низкой концентрацией СО^ в культуральных сосудах. Различия эти в основном является результатом воздействия специфической среды в асептической культуре,и они исчезают после переноса растений я условия in vivo, благодаря повыяеиига клщентрации СО^, что способствует увеличению интенсивности фотосинтеза и как следствие-ускорение роста perei: .рантов.

На основании сравнительного анализа структурно-функциональных особенностей регенерантов в условиях in vitro п in vivo, базирующегося на материалах собственных исследований и литературных данных,мы прияли к выводу, что условия культивирования in vitro и in vivo накладывают отпечаток на структуру и функцию регенерантов - это во-первых. Во-вторых, структурно-функциональная организация регенерантов-мобильная система и может перестраиваться в соответствии с изменившимися условиями окружающей среды. Это значит, что различил в строении и функции листьев растений, выращенных в асептичаской культуре, в условиях оранжереи или в открытом грунте, свидетельствуют-о пластичности листа - органа, способного перестраивать свою структуру и функцию адекватно условиям культивирования, «п зоретнчески является гарантом успешной адаптации растений при переносе их из условий in vitro а условия in vivo.

На практике, как показали паяй наблюдения за развитием интродуцированных

сортов голубики высокой и брусники обыкновенной пр" переносе их из условлй in vitro в условия in vivo, нам удалось избежать потерь материала в критический для наго момент, благодаря соблюдению технических приемов, базирующихся на результатах собственных экспериментальных исследований.

В целях предотвраценкя гибели материала от чрезмерной транспирации (это касается на только голубики и брусники) которая происходит из-за резкого снижения влажности в условиях in vivo, а так^же из-за несовершенной структурно-функциональной организации листа, с точки зрения именно этих условий, в первую очередь необходимо поднять тургор регенерантов до максимальной величины. Следующим непременным условием является создание градиента давления пара 1-._дду листьями и воздухом и поддержание влажности и температуры, аналогичной условиям in vitro. Все это вместе взятое даст возможность сохранить регенеранты от увядания, снизит, днтенсивностъ фотосинтеза и приостановить их рост, позвояиз запасу имеющихся в регенерантах метаболитов пойти на образование корней. После образования корней необходимо постепенно снижать влажность воздуха и увеличивать интенсивность освещения, что позволит завершить структурную перестройку листа, а именно: появится кутикулярный слой, изменят ,форму клетки эпидермиса, произойдут изменения в строении мезофилла (си.стр.22, 23). Лист приобретет черты ксероморфной структуры, и растению не страшна низкая влажность воздуха и даже сильный ветер, характерный для условий открытого грунта.

Подтверждением тому"> может служить пример 100% адаптации растеиий-регеяе-раитов интродуцироеанньгс сортов голубики высокой и брусники обыкновенной не только в условиях оранжереи, но и в условиях открытого грунта, о чем речь пойдет в следующей главе.

РАЗШИЕ ИНГРОДУЦИРОЕАНШХ ООРГОВ VACCINIUi OORXMBOsm L. И VACCINIO! VITIS-IEAEA L., РЕШШРЙРОйАН&К В ШЫУРЕ IH VITRO, В УСЛОВИЯХ ОТКРЫТОГО ШНГА

Вопросу культивирозания материала в условиях in vitro посвяцено огромное количество публикаций". Однако сведения, касающиеся выращивания растений-регенерантов в условиях in vivo весьма ограничены. Ниснотрй на ограниченное число публикаций, позволим себе обобщить имеютцйся материал по данному вопросу.

Больаинство авторов, работающих с травянистыми растениями, склонны считать, что материал, полученный в культуре in vitro имеет преимущества перед сортами и клонами, разшохенными традиционным методом. В случае различия между ними, то они сглаживаются в первые один-два сезойа. Работая с

кустарниковыми и древесными растениями, исследователи отмечают общую тенденцию образования аксиллярных побегов. Однако, несмотря на положительную характеристику материала, полученного в культуре in vitro, нельзя обойти молчанием отрицательные момента, проявляющиеся в аномальном развитии растений (полегание, анональное развитие корневой системы, гибель растений).

С нашей точки зрения, такие отклонения в развитии растений не являются причиной, кроющейся в самом методе клонального микроразмножения, ибо некоторые авторы склонны их приписывать именно методу и считать это его недостатком, наряду с преимуществами. По нашему глубокому убеждению, сложившемуся в результате анализа экспериментального материала по морфогенезу и регенерации, а также структурно-функциональной адаптации регенерантов интродуц >ванных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, одной из основных ошибок, приводящих к негативным последствиям, является рассмотрение клонального микроразмножения только как метода ("инструмента"), с помощью которого можно получить материал в неограниченном количестве.

Целостная картина клонального микроразмножения может бить получена только в результате рассмотрения его как единого сложного многофакторного процесса, сос' япего из двух принципиально разных этапов in vitro и in vivo» базирующегося на морфогенезе и регенерации, структурно-функциональной адаптации, а не только как метода, используемого в культуре in vitro, что позволит соз-дагь теоретические предпосылки и разработать совероеннуЛ технологии клонального микроразмноженкя для любого вида растения.

Результаты исследований растений-регенераитов в полевьг: условиях являются индикатором нашей работы в условиях in vitro, так как исследования в условиях in vivo - это продолжение работы, начатой в условиях in vitro.

Сравнительный анализ результатов наблюдений (методика проведения исследований подробно изложена в диссертации) за сезонным развитием голубики высокой (сорт Bluecrop) и брусники обыкновенной (сорт Koralle), полученных в стерильной культуре и традиционным черенкованием, показал, что они в своем раз, витии не уступали своим двойникам (растениям из черенков) , а по некоторым показателям даже превосходили их.

Показатели цветения и плодоношения отличались у растений, размноженных в стерильной культуре и обычным черенкованием. Количество цветочных кистей на одно растение, количество цветков в кисти, количество ягод в,кисти, масса ягод с одного куста были несколько выше у растений из стерильной культур* по сравнению с растениями из черенков. По . все. фенологические фазы (набухание почек, распускание листьев, начало цветения, массовое цветение, конец цветения) наступали одновременно и не зависели от метода размножения, за исключением

двух фенофаз: созревание ягод и конец периода вегет; ли, которые наступали позже у растений из стерильной культуры. Несмотря на более позднее наступление конца вегетации у растений-регенерантов, они оказались более морозоустойчивыми по сравнению со своими дзо.1кикамк, растениями из черенков. Можно думать, что причиной высокой морозоустойчивости растений, размножешг.;х в стерильной культуре и низкой - черенкованием, является различие в их функциональной активности. Вероятно,исследования в этсм направлении прольют свет на процесс адаптации растений к низким температурам а совершенно ином ключе, чем это било до сих пэр. Самое существенное влияние оказал метод размножения на количество еазальнмх побегов у исследова:шых растений. Этот показатель Был в два раза вше у растений из стерильной культуры, независимо от года наблюдений и погодных условий. Вероятно, это можно объяснить усилением синтеза эндогенных цитокининов в ювеннлъном растени*., способствующих активации пазушных меристем и как следствие-увеличению числа бозальных побегов.

Сравнительная характеристика сезонного развитая растений, полученных а стерильной культуре, с растениями, размноженным; традиционный методом, показывает, что в своем развитии они не уступали растениям из черенков, а по морозоустойчивости и образованию базалышх побегов значительно превосходили их.

ДШтаЫЮЕ ХРАНЕНИЕ РЫЪНЕРАШШ ШТР0ДУЦИР08АНШХ СОРТОВ таоспши

сдажвогш ь. и \®сспшп ушб-имд х,.'В культуре га \лтао

Исследования, проведенные нами.по изучении морфогенеза и регенерации ннт-родуцированных сортов голубики высокой к брусники обыкновенной позволили получить стерильную культуру 14 сортов голубики высокой н 4 сортов брусники обыкновенной. Практически создана коллекция стерильных культур 18 сортов растений сем.Вересковые. Полученной материал представляет больиу» ценность как с научной, так и с практической точки зрения.

В мировой практике в течение многих лет для поддержания коллеции стерильных культур использовали постоянное выращивание их при оптимальных условиях для данных растений. Однако оказалось, что такое выращивание имеет ряд существенных недостатков: во-первых, возможность появления сокаклоналъной изменчивости (из-за нарушения генетической стабильности часто пересаживаемого материала), во-вторых, опасность загрязнения чужеродным генетическим материалом и случайной утерей собственного генетического материала, в-третьих, трудоемкость процессов (необходимость регулярной пересадки на свежую питательную среду), ъ четвертых, высокая стоимость компонентов питательной среды, трэбуемых для частых пересадок. - •

Изложенное достаточно ясно свидетельствует о необходимости изменения кинетики роста стерильной культуры и увеличения временного интерпала между пересадками до максимально возможного. Хранение культуры в состоянии замедленного роста даст возможность уменьшить расход реактивов в результате сокращения количества пересадок и будет способствовать поддержанию генетической стабильности коллекционного материала.

Основным препятствием в хранении растительного материала брусники и голубики является его быстрое старение, ведущее в конечном итоге к гибели растения.

На наш взгляд, одним из путей решения данной проблемы, исходя из возможностей нашей лаборатории, является замедление роста стерильных куг-тур с помощью осмотических ингибиторов, а также ретардантов. К сожалению,сведения, касающиеся влияния осмотичесхих ингибиторов и ретардантов на жизнеспособность регенерантов в культуре in vitro, малочисленны и вовсе отсутствуют для интро-дуцироеанных сортов голубики высокой й брусники обыкновенной.

3 качестве объектов исследования использовали регенеранты 6 сортов голубики высокой (Bluccrop, Blueray, Dixi, Herbert, Rancocaa, Scamnel) и трех сортов брусники обыкновенной (Koralle, Masovia, Erntedank). Опыты проводили с маннитоми сорбитом в диапазоне концентраций 1-3 г/л, а также с хлорхолин-хлоридом (XXX, 2 г/л) и абсцизовой кислотой (8 г/л, 10 г/л). В ходе экспериментов растения культивировали без пересадок на свежую питательную среду на протяжении 12 месяцев. Жизнеспособность (Ж) материала оценивали по разработанному нами методу, включающему четырехбальную шкалу, согласно которой 0 баллов гибель растения, 1,2,3 - промежуточное состояние, U - максимальная жизнеспособность. Термин "жизнеспособность" использован нами как понятие характеризующее потенциальную продолжительность жизни растений в культуре in vitro при длительном культивировании их без обновления питательных сред.

Анализ экспериментального материала показал, что самая высокая жизнеспособность, в результате беспересадочного культивирования материала на свежие питательные среды в течение 12 месяцев, характерна для сорта Koralle (брусника)^,21 балла на среде № 2, содержащей 8 г/л абсцизовой кислоты (АБК). Самая низкая-у сорта Rancocaa (голубика) на среде If 5, содержащей 2 г/л сорбита. Остальные сорта заняли промежуточное положение по данному показателю. Это является свидетельством зависимости жизнеспособности как от сортовой принадлежности материала, так и от ингибитора, содержащегося в питательной среде. Оптимальным вариантом для р- ильного культивирования исследованных сортов голубики высокой следует счь.^гь среды IP 7-V 9, содержащие маннит. Для четырех сортов (Bluecrop, Dixi, Scajimel, Blueray) среду № 3, содержащую 3 г/л

маннкта, дня Herbert - среду ¡F 8 - 2 г/л ианнита, " -я Ranoocas - среду № 7 - 1 г/л маннита.

Для длительного культивирования исследованных сортов брусники обыкновенной оптимальными являются среды N* 1-№ 3, содержащие 2 г/л XXX и АБК 8 мг/л и 10 иг/л. Среды, содержащие сорбит, не могут быть рекомендованы для длительного культивирования (12 месяцев без пересадок) интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, а среды, содержащие XXX и АБК, могут быть рекомендованы только для брусники обыкновенной.

Сравнительный анализ жизнеспособности сортов голубики высокой и брусники обыкновенной показал, что она выше у сортов брусники обыкновенной независимо от ингпоитора, присутствующего в питательной среде. Вероятно, это связано с функциональными особенностям», присущими вечнозеленым кустарничкам, к которым принадлежит брусника.

Таким образом, результата экспериментальных исследований позволяют заключить, что добавление в питательную среду ингибиторов'роста способствует снижению скорости роста, предотвращению старения и сохранению жизнеспособности регенерантов на протяжении 12 месяцев без пересадок их на свежие питательные среды. При этом необходимо учитывать сортовую и видовую специфику исследованного материала, четко проявившуюся на действие ингибиторов, а также избирательное действие самих ингибиторов.

ВЫВОДЫ

1. Клональное микроразмножение интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной - сложный многсфакторный физиологический процесс, состоящий из двух принципиально разных этапов: in vitro и in vivo, базирующийся на единой теоретической основе, с одной стороны, на морфогенезе и регенерации в условиях in vitro, с другой - на структурко-функциснальной адаптации регенерантов при переходе их из условий in vitro в условия ir. vivo, зависящий от стерилизующего соединения, типа экспланта, его физиологического состояния, времени года в которое он был вычленен, генопша, компонентов, содержащихся в питательной среде, условий культивирования»

Оптимальным стерилизующим соединением для голубики следуем считать 0,1%-ный раствор диацида или сулемы, для брусники - 0,04Х-ный раствор азотнокислой ртути или 0,8%-ный раствор азотнокислого серебра; временем отбора зксплантов: март, апрель для брусники, ноябрь-март для голубики.

2. Морфогенез и регенерация интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной связаны с генотипом, который служит индикатором

способности экспланта к микроразмножению, а также контролирует его потенциальную возможность к данному процессу. При соответствующей оптимизации состава питательных сред, гормонального баланса, правильного отбора зкспланта и соблюдении условий культивирования, можно вызвать морфогенез и регенерацию практически у любого генотипа, несмотря на всю сложность этих многофакторпых процессов.

Степень регенерационной способности интродуцированнмх сортов голубики высокой и брусники обыкновенной определяется воэрэстоя и типом экспланта, зависит от состава питательной среды, соотнооения гормонов в ней, сортовых и видовых особенностей материала. У интродуцированных сортов голубики наибольшим регенерационным потенциалом обладают ювенильные экспланты, у /сннки -зрелые.

3. Показана принципиальная возноадость осуществления регенерации интродуцированных сортов голубики высокой,и брусники обыкновенной в культуре клеток

и тканей тремя методами: 1) через активацию пазуиных меристем, 2) дифференциация почек в каллусноП культуре, 3) , дифференциацию почек непосредственно в ткани листа, минуя стадию образования каллуса. '

Оптимальными питательными средами дал регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной следует считать две модификации (из 16 исследованных), содержащие полную норму макро- и микроэлементов, по KPi-i и Андерсону, 4 мг/л индолилуксусной кислоты, 15 мг/л иэопентениладенина, витамины, аденин сульфат, мезоинозит.

4. Обнаруженная лабильность пигментной системы пластид, а также количественных элементов анатомической структуры листа у регенерантов «продуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной является одним из пуней их приспособления к различному режиму освещения (1000 - 4000 лк) в условиях in vitro.

5. Условия культивирования in vitro и in vivo накладывают отпечаток, на структуру н функцию регенерантов интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, проявившуюся в изменении качественных и количественных показателей анатомической структуры листа. Структурно-функциональная организация регенерантов-мобильная система и может перестраиваться в соответствии с изменившимися условиями окружающей среды, что теоретически является гарантом их успешной адаптации при переходе из условий in vitro Ь условия

in vivo.

Вьвшваиие растений-регенерйит. » условиях in vivo зависит от строгого соблюдения требований по уходу за ними, основанных на теоретических гнаниях, базирующихся на экспериментальных исследованиях.

6. Интродуцированные сорта голубики высокой и ^чусники обыкновенной, регенерированные в асептической культуре, по сравнения со своими двойниками, размноженными традиционным черенкованием, обладают рядом преимуществ, главными из которых являются повышенная морозоустойчивость и усиленное образование базальных побегов, служащих предпосылкой к обильному образованию цветочных почек и как следствие - высокому урожаю.

7. Снижению скорости роста, предотвращению процессов старения, сохранению жизнеспособности регенерантов ni продуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной на протяжении 12 месяцев без пересадок их на свежие питательные среды способствует добавление в питательную среду ингибиторов роста. фи этом необходимо учитывать сортовую и видовую специфику исследованного материала,четко проявившуюся на действие ингибиторов, а также избирательное действие самих ингибиторов, .^неспособность регенерантов зависит как от количественного содереклшя ингибиторов в среде, так и от видовой и сортовой принадлежности растения. У сортов брусники этот показатель выае, чем у голубики.

Оптимальным вариантом для длительного культивирования регекерантов голубики высокой следует считать среды, содержащие маннит (1-3 г/л), для брусники обыкновенной - хлорхолинхлорпд (2 г/л) и абсцизооую кислоту (8, 10 мг/л).

8. Разработана технология клональиого тжроразмножения интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной (в основу которой положены методы регенерации данных культур, защищенные авторским свидетельством и патентами), обладающая рядом преимуществ, способствую^« сокращению сроков получения оздоровленной, экологически чистой продукции, снижению ее себестоимости, удовлетворению спроса потребителя в этой продукции,независимо от времени года.

Разработан способ хранения регенератов, позволиввий создать банк генотипов стерильных культур 14 интродуцированных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной, служащий одним из путей сохранения бноразнооб-разия растений, а также способствующий реиению задач, возникающее в генетике, селекции, растениеводстзе.

/

СШ1С0К ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБГИХОВАНННХ ПО IEME ДИССЕРТАЦИИ

1. Сидорсанч Е.А., Кутас E.JH., Чериик В.Ф., Судейная C.B. Ускоренное семенное размножение голубики высокой в культуре in vitre // Becui АН БССР. Сер.б1ял.навук.-1989, tf 5.-С.З-5..

2. Кутас. E.H., Черник В.Ф., Судейная C.B. Культивирование зародышей Vacciniura corymbosum L. в асептической культуре // Теоретическая и прикладная карпология: Тез. докл. Всесоюэ. конф.-Кишинев, 1989.-С.62.

3. Сидорович Е.А., Кутас E.H., Черник В.Ф., Судейная C.B. Асептическое прорастание семян Vaccinium corymbosum L. // Роль ботанических садов н охране и обогащении растительного мира: Тез. докл. научн. конф.-Киев, 1939, Т.1.-С.72-73.

4. Сидорович Е.А., Кутас E.H. Клональноо мнкроразпножоние Vacciniura vitis-idaea L. II Дскл. АН БССР.-1991, № 4.-C.362-3S4.

5. Сидорович Е.А., Кутас E.H. Влияние условий освещения на прорастание семлн и изолированных зародышей Vacciniura vitis-idaea L. в культ з in vitro // Весц! АН БССР. Сер.(Яял.навук.-1991, ÍP 1.-С.97-98.

6. Сидорович Е.А., Кутас E.H., Черник В.Ф., Судейная C.B. Влияние условий освещения на прорастание семлн и изолированных зародышей Vaccinium corymboaura Í. в культуре in vitro // Бюл.Гл.ботян.сада.-1991.-Выл.159.-С.94-95.

7. Сидорович Е.А., Кутас E.H., Рубан H.H. Разработка технологии клональ-ного микроразмножения интродуцированнмх сортов голубики высокой и брусники обь'-нооенноЯ // Эколого-биологическое изучение ягодных растений сем.Брусничные и опыт освоения их промышленной культуры в ООСР: Тез. докл. Межреспубликанского научн. семинара.-Ганцевичи, 1991.-С.174-175.

8. Кутас E.H., Трухан Н.В., Морозов О.В. Семенное размножение гибридов брусники обыкновенной в культуре in vitro II Эколого-биологическое изучение ягодных растений сем.Брусничные и опыт освоения их промышленной культуры в СССР: Тез. докл. Межреспубликанского научн. семинара.-Ганцевичи, 1991.-С.82-83.

9. Сидорович Е.А., Кугас E.H., Трухан Н.В. Рененерационная способность различных типов зкепяантов у интродуцированных сортов Vacciniura coryntoosum

L. в культуре in vitro// Весц1 АН Беларусь Сер.б1ял.навук.-1993, № 1.-С.З-5,

10. Черник В.Ф., Кутас E.H. Регенерация растений из зкеплантов стерильных проростков у двух интродуцкрованных сортов Vacciniura ccrymboaum L. // Весц! АН Беларус!. Сер.б1ял.навук.-1992, H" 3-4.-Ç.6-9.

11. Сидорович Е.А., Кутас E.H. Морфогенез Vaccinium vitis-idaea L. в культуре in vitro // Beaji AH Bejiapyci. Сер.б1ял.навук.-1993, ff 2.-C.38-42.

12. Сидорович Е.А., Кутас E.H., Трухан Н.В. Влияние стерилизующих соединений на выход жизнеспособных зкеплантов интродуцированнья сортов Vaccinium corymbosum L., Vaccinium vitis-idaea L. в культуре in vitro // Becui АН Беларус!. Сер.б1ял.навук.-1994, К '.-С.3-5.

13. Сидорович Е.А., Кутас E.H., Трухан Н.В. Регенерация побегов из зкеплантов листа интродуцированкых сортов Vaccinium corymbosum L. в культуре

in vitro // Генетическая инженерия и биотехнология Тез. докл. научи, конф. -Минск, 1994.-C.b2.

14. Siciurovich Е.А., Kutas E.K. Shoot regeneration frcr.i leaf exylants o£ introduced Vacciniua vitis-idaea L. in vitro culture // Plant Biotechnolo-yy and Genatic Engineering. International Sympceiun.-Kiev, IS'94.-P.34.

15. Сидорович E.A., Kyrac E.H., Сллипеня В.Л. Влияние осмотических ингибиторов на сохранение жизнеспособности интродуцированных сортов Vacciniura corynlxisum L. и Vacciniura vitis-idaea L. в культуре in vitro // Докл. АН Беларуси.-1595.-Т.39, II" 1.-С.63-66.

16. Сидорович К.Л., Кутас E.H., Брель Н.Г. Регенерация in vitro из листовых зксппентов брусники обыкновенной // Докл. АН Беларуси.-1996.-Т.40, № 1.-С.77-80.

17. Сидорович Е.А,, Кутас L. 1. Влияние сезона отбора зксплантсв на регенерацию Vacciniua vitis-idaea L. в культуре in vitxa // Тез. докл. Всорого съезда белорусского общества физиологов растений.-Минску 1995.-С.35-36.

18. Сидорович Е.А., Кутас E.H. Влияние времени года на жизнеспособность зкеплантоо Vacciniura corjüibosum L. в культуре in vitro // Тез. докл. Второго съезда белорусского общества физиологов растений.-Минск, 1995.-С.36-37.

19. Кутас E.H. Влияние интенсивности освещения на анатомическую структуру листа Vacciniun согуюЬоашп L. в культуре in vitro // Тез. докл. Второго съезда белорусского общества физиологов растений.-Минск, 1995.-С.21-22.

20. Кутас E.H. Влияние интенсивности освещения на содержание пигментов с рагенерантах Vacciniura corytnbosüm L. в культуре in vitro // Тез. Второго съезда белорусского общества' физиогог'оз растений.-Минск, 1995.-С.57-58.

21. Сидорович Е.А,, Кутас E.H. Влияние экспланта на регенерационный потенциал интродуцированных сортов Vaccinivur, схггупЬозш L. и Vaccinium vitis-idaea L. в культура in vitro // Биологическое разнообразие. Интродукция растений: Тез. докл. научн. конф'.-Санкт-Петербург, 1995.-С. 181-183.

22. A.c. 1824115 Россия, 5А01Н4/00. Способ размножения Vaccinium vitis-idaea L. in vitro / Е.А.СидороЕич, Е.Н.Кутас (Россия).- N> 4910564/13; Заявл. 12.02.91. Опубл. 30.06.93, Бол. н. К* 24.-С.14.

23. Пат. 881 Беларусь,' А01Н4/00. Слоссб разложения Vaccinium vitis-idaea h. in vitro / E.A.Сидорович, Е.Н.Кутас (Беларусь).-!? 93--4910564; Заявл. 05.03.93. Оиубл. 15.12.95, СфвдиальшЯ бюллетень Р 4 (ч.1).-С.68.

24. Получено РЕШЕНИЕ государственной патентной экспертизы (Беларусь)

от 30.05.96. о выдаче патента на изобретение "Способ клонального r.Hr.pGразмножения Vacciniura corymbosum L. (Сидорович Е.А., Кутас 'E.H., Трухан Н.В., 4и-липеня B.J1.) согласно заявке ff 620 ст 10.08.93.

25, Кутас E.H. Роль клонального мккрораэкножения в сохранении биоразнообразия растений // Сохранение биологического разнообразия Белорусского Поозерья! Тез. докл. научи. конф.-Витебск, ÍS9G.-C.40-41. '

26. Сидорознч S.A., Кутас E.H. Клоиальное микроразмножениа новых гшодово-лгодных растений.-Mi.: Навука i тохнхка, 1996.-246 с.

Р Э 3 В M Э

Кутас Алена М1каляеуна

Наеуковыя асновы кланальнага и1краразпналання расл!н на прык> тзе 1нтра-дукаваных гатункау буя ко? вьюокгх i бруаиц звычайных.

Клвчавня сг.овы: буякл высокзд, брусн!цы звычаПкыя, 1нтрадукаваныя гатунк1, нарфагенез, рэгенерацыя.

Абъект даследавэння - 14 1нтрадукаваных гатункау буяко? высок1х 14-бруойц звычайных.

Мэта даследаваиня - дадь навукова-абгрунтаванае ?я$?леине аб кланальным м1крэразкна*энн1 як складанып многафактарным ф1з1ялгг!чн№1 працэсе, сг.алучаю-чыя два прыяцыловй розныя этапы: In vitra i in viva, груитуючгтся на адэ^аП тэарзтачнай аснове. •

Метода даследаваиня - клаоДчныя приемы, агульнапрынятыя J культуры клета : i ткаиаи, колькасная i якасная светлавая м1краскап1я. •

Упергеыни праведзена комплекснае даследаванне кланальнага м1краразмнажэння 1нтрадукаваных гатункау буякоу вьюок!х 1 брусий; звычайных. Атрымания buhíkí на 1ндуцыруемаму марфагенззу, рэгенерацы1, а таксама структурна-функцыякаль-наму прыстасаваннв рэгенерантаУ, значна namjptwi тэарэтычнае рярленне аб кланальным м1краразггнажэнн! як складаным многафактарным ф!з1ялаг1чным працэсе, кантралшмым генетычна. ,■-''■

Паказана прынцьшовая натчкмасць рэгенервцы! хнтрадукаваных гатункау буякоу BbicoKix i брусий звычайных трыма метадам!: 1) праз актывацыга пазушных меристэм, 2) диферэнцылцыа пупьшак з калуснаЯ кудьтуры, 3) дыферанцыяцыю пупы-иак у тканцы л1сця, м!нуочы стады» утварэння калусу. На аснове вын!кау экспериментальных даследаванняУ створаны банк генами?, прадстаулены калекцылй стэрыльных культур 14 1нтрадукаваных гатункау буякоу въюок!х i 4 - брусн1ц звычайных. Распрацавана тэхналог!я кланальнага м1краразмн8жэння гэтых культур, иго дазвол!ць пастав1ць на прамыслс аснову arptwaime эхалаг!чна чыстага пасадачнага матэрыялу i задавол!ць.попыт у 1м рэспубл!к1 Беларусь i ípyrix рэ-rieirny СНД. Bkhíkí даследазеиияу меюць грунто^нае t прикладное значэнае для б1ятзжалог.и, iÍ3ÍMorii pauiiii, лясной i сельскай гаспадарк!.'

Р Е 3 В М Е Кутас Елена Николаевна

Научные основы клонального никроразмножения растений на примере интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной.

Ключевые слова: голубика высокая, брусника обыкновенная, интродуцированные сорта, клоналыюе микроразмнодение, морфогенез, регенерация.

Объект исследования - 14 интродуцированных сортов голубики высокой и 4 -брусники обыкновенной.

Цель исследования - дать научно-обоснованное представление о клональном микроразмножении как сложном многофакторном физиологическом процессе, состоящей из двух принципиально разных этапов: in vitro и in vivo, базирующемся на единой теоретической основе.

Методы исследования - классические приемы общепринятые в культуре клеток и тканей, количественная и качественная световая микроскопия.

Впервые проведено ■/к<ч"1лексное исследование клонального микроразмно^эния интродуцированных сорт^а голубики высокг" и брусники обыкновенной. Полученные результаты по индуцируемому морфогенезу, регенерации, а также структурно-функциональной адаптации регенерантов, существенно расширили теоретическое nf оставление о клональном микроразмножении как сложном многофакторном физиологическом процессе, контролируемом генетически. Показана принципиальная возможность регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной тремя методами: 1) через активацию пазушных меристем, 2) дифференциацию почек в к&ллусной культуре, 3) дифференциацию почек в ткани листа, минуя стадию образования каллуса. На основании результатов экспериментальных исследований создан банк генотипов, представленный коллекцией стерильных культур 14 интродуцированных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной. Разработана технология клонального микроразмножения этих культур, что позволит поставить на промышленную основу получение экологически чистого посадочного материала и удовлетворить спрос в нем республики Беларусь и других регионов СНГ. Результаты исследований имеют фундаментальное и прикладное значение для биотехнологии, физиологии растений, лесного и сельского хозяйства.

SUMMARY Kutas Elena Nikolaevna

Scientific foundations of clonal micropropagation of plants on tha exargla of introduced species cf Vaccinium corymbocum L. and Vacciniura vitis-idaoa,

Key wordsi Vaccinium corymbosum, Vacciniura vitis-idaea, introduced species,, clonal micropropagation, morphogenesis, regeneration.

Object of investigation! 14 introduced species of Vaccinium coryisbosua, and 4 species of Vaccinium vitis-idaea.

The objective of the investigation is to provide ccientifica justified view on the clonal micropropagation as a carpiicated roultifactor physiological process consisting of tvjo principally different stages: in vitro and in vivo, grounded on a single theoretical basis.

Methods of investigation! classical procedures cannon for cells and tissue, quatitative and qualitative light microscopy.

Complex investigation of clonal micropropagation of introduced species of acciniura C0rymb03um and Vacciniun vitis-idaea was conducted for the first time, tta results obtained on induced morphogenesis, regeneration as well as structural-functional adaptation of rogenerants have considerably broadened theoretical view on clonal"micropropagation as a conplicated multifactor physiological process that is genetically controlled. Principal possibility of regeneration of introduced species of Vaccinium corymbocun and Vacciniun vitis-idaea using three methods is shown: 1) via activation of axile meristera, 2) differentiation of kidneys in callus culture, 3) differentiation of kidneys in leaf tissue without tha stage of callus formation.

Based on tha results of the experimental investigations a tank of genotypes has been created corqprising a collection of sterile cultures of 14 introduced species of Vaccinias ooryrrbosun arid 4 species of Vaccinium vitis-idaea. A technology has been developed for tha clonal, micropropagation of these species which allows to get ecologically ppre planting material on industrial basis and meet the dessnda for It in the Republic of Belarus and • other regions of CIS. The results of the Investigations are of fundamental and applied importance for biotechnology, plant physiology, forestry and agriculture.