НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ НА ПРИМЕРЕ ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ СОРТОВ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ И БРУСНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

Кутас, Елена Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ НА ПРИМЕРЕ ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ СОРТОВ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ И БРУСНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ НА ПРИМЕРЕ ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ СОРТОВ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ И БРУСНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ"

На правах рукописи

КУТАС Елена Николаевна

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ КЛОНАЛЬНОГО МИКР0РАЗМН0*ЕНИЯ РАСТЕНИЙ НА ПРИМЕРЕ ИНТГОДУЦИРОВАННЫХ СОРТОВ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ И БРУСНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

03.00.12 - Физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена а Центральном ботаническом саду Национальной Академии наук Беларуси.

НаучныИ консультант - член-корреспондент HAH Беларуси,

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки Беларуси, лауреат Государственной премии Беларуси СИДОРОВИЧ Е.А.

Официальные оппоненты! доктор биологических наук

ШАИН С.С.

доктор биологических наук НОСОВ A.M.

доктор биологических наук ГОРБУНОВ D.H.

Ведущее учреждение - Всесоюзный селекционно-технологический институт садоводства и питомннководства РАСХН.

, Зашита состоится ......... .....1997г.

в "/ час на заседании совета по защите диссертаций Д.120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии им.К.А.Тимирязева.

Адрес! 127550, Москва И-550, ул.Тимирязевская, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан . С- ............1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета

äjrflr)

А.С.ЛОСЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность таны диссертации. Теоретическую основу абсолютно всей методологии культуры клеток и тканей, а топ числе и клоналыюго микроразмножения. составляют морфогенез и регенерация растений. Однако, несмотря на имеющиеся экспериментальные работы, посшценм изучению процессов морфогенеза и регенерации в культуре in vitro, атональное микроразмножениа представляет немало сложностей, состоящих в отсутствии четких хорошо восп-производимых методик, их трудоемкости и сложности, а Также в недостаточных знаниях морфогенетических потенция растений и способов управления ими в культуре клеток и тканей. К таким растениям принадлежат интродуцированкые сорта голубики высокой и брусники обыкновенной, для которых процессы морфогенеза и регенерации в культуре in vitro практически не изучены.

Исследование процессов морфогенеза и регенерации сортов этих растений в культуре клеток и тканей, а также структурно-функциональных особенностей регенерантов и адаптации их при переходе из условий культуральдох сосудов в условия оранжереи и открытого грунта, позволит внести существенный вклад в разработку теоретических основ и путей практического использования тонального никроразмножения растений в целом, а также таких ценных плодово-ягодных культур, какими являются »продуцированные сорта голубики высокой и брусники обыкновенной, в частности.

Традиционно клональное микроразмножение принято рассматривать как метод, состоящий из соответствующих процедур: введение экспланта в стерильную культуру, собственно микроразмножение, укоренение регенерантов на питательной среде, перенос их в нестерильные условия. В большинстве случаев клональное микроразмножение сводится к "инструменту',' с помощью которого можно получить материал в неограниченном количестве.

Новизна постановки вопроса, связанного с клональным микроразмножением растений, состоит в рассмотрении его не только как метода, а как единого сложного многофакторного физиологического процесса, состоящего из двух принципиально разных этапов] in vitro (в условиях стерильной культуры) и in vivo (в условиях оранжереи и открытого грунта), базирующегося на единой теоретической основе, с одной стороны, на морфогенезе и регенерации в условиях in vitro, с другой, на структурно-функциональной адаптации регенерантов в условиях in vivo, что позволит создать теоретические предпосылки и разработать совершенную технологию клоналъного микроразмножения для любого вида растения в целом

ч брусники обыкновение

И сортов голубили высокой

я RWW??^ БИБЛИОТЕКА. Моск. •> >ь...:охоз академии им. К. Гицир!

Инв. №;

Саязь работы с крупными научными программами, темами. Проведенные исследования входили в плановые темы Центрального ботанического сада Академии наук Беларуси, координируемые Научным советом по проблеме 'Продуктивность растения" (¥ госрегистрвцин 0190010215)t

"Разработка научных основ промышленного выращивания интродуцированных плодово-ягодных растений сем.Брусничные в условиях Беларуси" (V госрегистрации 0190002195Д)|

"Разработка технологии клонлльного микроразмножения интродуцированных плидово-ягодных и декоративных растений" (¡P госрегистрации 19S4149).

Кроме того, исследования выполнялись в соответствии с республиканской комплексной прогретой фундаментальных исследований "Биотехнология".

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в тон, чтооы дать научно обоснованное представление о клональном микроразмножении растений как едином многофакторном физиологическом процессе, состоящем из двух принципиально разных этаповI 1л vitro и In vivo* базирующемся на единой теоретической основе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи!

- изучить влияние многочисленных факторов (стерилизующие соединения, тип экспланта, время года,в которое он был вычленен, генотип, компоненты, содержащиеся в питательной среде) на процесс клонлльного микроразмнотения интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной в культуре In vitroj

- исследовать морфогенез и регенерации, протекающие у эксплантов на клеточном и субклеточной уровнях на различных модификациях питательных сред;

- провести анатопо-физмологкческие исследования реакции регенерантов на условия культивирования In vitro я in vivo;

- изучить развитие и адаптацию интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, регенерированных в асептической культуре, в условиях оранжереи и открытого грунта;

- исследовать влияние осмотических ингибиторов и ретардантов на сохранение жизнеспособности регенерантов, длительно не пересаживаемых на свежие питательные среды.

Научная новизна. Впервые экспериментально показано, что клональиое микроразнножение - это не только метод, нспользуемЛ для ускоренного размножения растений, a aneen с теп, сложный, нногофакторкый физиологический процесс, контролируемый генетически, состоящий из двух принципиально разных этапов: in vitro и in vivo, базирующийся на единой теоретической основе, с одной стороны—аа морфогенеза и регенерация в условиях in vitro, с другой -

на структурно-функциональной адаптации регенерантов в условиях In vivo.

Пересмотрен устоявшийся взгляд о влиянии генотипа на морфогенез и регенерацию растений в культуре in vitro. Выявлена неоднозначная роль генотипа в процессах морфогенеза и регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной. Отношение генотипа к морфогенезу не является прямым, а комплексным, то есть оказывает свое влияние в совокупности с другими факторами (физиологическим состоянием экспланта, многочисленными компонентами питательной среды, условиями культивирования и др.).'Генотип не только служит индикатором способности зкслланта к нккроразмножеиию, но и контролирует его потенциальную способность к данному процессу.

Установлено, что морфогенез интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной протекает на фоне сбалансированной питательной среды двух модификаций (WPM и Андерсона), содержащей 4 мг/л ИУК и 15 мг/л 2-иП. Степень ре генерационной способности исследованных растений определяется возрастом и типом зкспланта, составом питательной среды, соотношением компонентов, содержащихся в ней, а также сортовой и видовой принадлежностью материала. У голубики высоким регенерационньи потенциалом обладают ювенильные экспланты, у брусники - зрелые.

На основании результатов экспериментальных исследований, полученных при изучении регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной на разных уровнях организации-от клетки до целого органа, показана принципиальная возможность регенерировать растения через активацию пазушных меристем, пролиферацию каллуса и образование адвентивных побегов непосредственно из ткани листа.

Получены оригинальные сведения, на основании сравнительного анализа структурно-функциональных особенностей регенерантоа в условиях in vitro и in vivo, позволившие показать, что условия культивирования накладывают отпечаток на структуру и функцию регенерантоа.

* •*

Обнаружены структурно-функциональные различия листьев, выращенных в асептической культуре, в условиях оранжереи и в открытом грунте, свидетельствующие о пластичности листа - органа, способного' перестраивать свою структуру и функции адекватно условиям культивирования, что теоретически является гарантом успешной адаптации -растений в результате переноса их из условий куль-туральных сосудов в условия оранжереи и открытого грунта.

Показана принципиальная возможность предотвращения процессов старения регенерантоа интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной в культуре in vitro с помощью осмотических ингибиторов и ретардантов. Установлено оптимальное содержание осмотиков и ретардантов в питательной среде,

необходимое для длительного культивирования pero*ï»r~T> на протяжении 12 месяцев без пересадок их на estгае питательные среда.

, Выявлены преимущества интрад>чированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, регенерированных в асептической культуре, по сравнению со своими двойниками, размноженными традиционным черенкованием, заключающиеся а повышенной морозоустойчивое... и усиленном оСра«звании багальяых побегов.

Впервые проведенное комплексное исследоагнии клонального микроразмножения ннтродуцированных сортов голубики высоко« и ÊpyvH хи обыкновенноЛ, включающее морфогенез к регенерации, а также структурно-функииональную адаптацию, дало возможность получить научно обоснованное предст^г-гение о клональном микроразмножении растений, как сложном, многофакторном физиологическом i роцессе, контролируемом генетически, что явилось вкладом в развитие ■ аучмой основы клонального микроразмножения растений и путей его практического использования.

Практическая значимость полученных результатов, t'a исновании результатов экспериментальных исследования, полученных по изучении процессов морфогенеза и регенерации растений в условиях in vitro, а также структурно-функциональной адаптации регенерангов в условиях in vivo,разработана технология клонального микроразмножения ннтродуцнрованных сортов i олубики высокой и брусники обыкновенной, создан банк генотипов, представленный коллекцией стерильных культур 14 »продуцированных и>ртов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной, разработаны три метода регенерации этих сортов: 1) через активацию пазушных меристем, 2) пролиферацию каллуса, 3} непосредственно из ткани листа. Регенерация интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной непосредственно из ткани листа пожег быть использована а системе генетической трансформации г с целью получения траисгенных растений с новыми ценными свойствами для селекционной работы, а также для клонального микроразмножения. Нами получены трансгенные растения непосредственно из клеток листовой ткани у двух сортов голубики высокой: Concord и Atlantic.

Разработанная технология клонального микрорвзмножени я > (тродуцирсваниых сортов голубики высокой и брусники обыкновенной обладав» рядом преимуществ, заключающихся во-первых, в сохранения технологического цикла в культуре in vitro с трех стадий до двух (за счет исключения стадии укоренения на питательной среде); во-вторых, в экономии дорогостоящих компонентов питательной среды (гормональных добавок и др.необходимых для розогенеза; в-третьих, в устранении потерь, связанных с повреждением корневой системы при отмывании ее от агара; в-четвертых, в сокращении сроков получения товарной продукции.

Материалы диссертации легли в основу опубликованной монографии, будут использованы при написании учебника для вузов по клонш ьному микроразиножению

растения, при чтении лекций по морфогенезу и регенерации а культуре клеток к тканей, а также структурно-функциональной адаптации регенерантов.

Экономическая значимость полученных результатов■ Технология клонального ' микроразмножения интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенно** позволит поставить на пропущенную основу производство здорового, экологически чистого посадочного материала таких ценных интродуцированных сортов растениК,как голубика и брусника, н удовлетворить потребности народного ; хозяйства Беларуси и других районов СНГ в »той продукции, а также может быть реализована как коммерческий продукт. Предложения о покупке технологии поступили с регионов средней полосы России и Украины.

Основные положения диссертации, выносите на защиту»

- клональное микроразмножение интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной находится в тесной зависимости от типа экспланта, его физиологического состояния, времени года в которое он был вычленен, генотипа, когшонентов, содержащихся в питательной среде;

- степень проявления и направленность процессов морфогенеза и регенерации у зкеплантов голубики и брусники контролируется соотношением ауксинов и цито-кининов, характер воздействия которых обусловлен возрастоп растения и связан ' с его сортовой и видовой принадлежность»;

- процесс адаптации регеиерантов интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной обеспечивается за счет перестройки их структурно-функциональной организации, вызванной как изменившимися факторами среди обитания (при переходе из условий in vitro в условия in vivo), так и адекватной реакцией на них, проявившейся в изменении количественных и качественных показателей анатомической структуры листа растсжия-регенеранта.

Личный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены автором лично при выполнении плановик теп научной тематики Центрального ботанического сада Академии наук Беларуси в соответствии с утвержденными программами. '

Апробация результатов диссертации. Основные результаты работы были представлены в форме тезисов и устных докладов и обсуждены на Всесоюзной конференции по теоретической и прикладной карпологии (Кишинев, 1989), Республиканской научной конференция, посвященной 150-летию Ботанического сада им.акад. А.В.Фомина (Киев, 1989), Межреспубликанском научном Ьеникаре по «колого-био-. логическому изучению ягодных растений сем.Б£усни<ате и опыту освоения их промышленной культуры в СССР (Ганцевичи, 1991), Научной конференции по генетиче- ; сКой инженерии и биотехнологии (1<Ьнск, 1994), Международном симпозиуме по-биотехнологии растений и генетической инженерии (Киев, 1?94), Втором съезде-

ьелорусского общества физиологов растений (Минск, 1SS5), Межгосударственной научной конференции по биогэ'ическэму разнообразии и интродукции растений (Санкт-Петербург, 199S), Втс • ч международном симпозиуме по клональному микроразмножению растения (Салс-пилс, lV3b), Научной конференции по сохранении биологического разнообразия Белорусского Гоозерья (Витебск, 1996).

Опубликовшмость резуъ .атоо. Катерин ы диссертации опубликованы в 3 монографиях, 18 научных статьях, 11 тезисах, авторском свидетельстве и патенте.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 273 страницах машинописного текста, состоит из введения, общей характеристики рабогы, 9 глав, выводов, списка литературы из 201 наименования отечественных и ¿93 зарубежных авторов, иллюстрирована 42 таблицами, 12 рисунксгн.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА НА СОВРШЕННОМ ЭТАПЕ И ОБОСНОВАНИЬ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дан критический обзор экспериментальных работ, выполненных в нашей стране и за рубежом в ооласти клепального микроразмножения растений, показавший слабую степень изученности вопроса.

Отпечена еще не исследованная ооласть морфогенеза и регенерации, а также структурно-функциональной адаптации регенерантов к условиям культивирозания для интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной -растений, имеющих важное народно-хозяйственное значение.

Сформулировано основное направление исследований и обоснована необходимость его гроведения.

ОБЬШЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования служили 14 «продуцированных Cv^tob голубики высокой (Bluecrop, Bluoray, Dxxi, Herbert, Earlyblue, .encocas, Scaramel, Delite, Woodart, Atlantic, Concord, Tifblue, Covill, Stanley) и 4 сорта брусники обыкновенной (Koralle, Masovia, Erntedank, Erntekrone). Приведена эко-лого-биологическая характеристика перечисленных растений, а т кже сведения о их пищевой н лекарственной ценности.

Методика исследований базировалась, с одной стороны, на классических приемах, общепринятых в культуре клеток и тканей, описанных в сборнике "Биотехнология растений! культура клеток и тканей" (М., 1989), а с другой - нуждалась в постоянной корректировке в соответствии с экспериментами,

преследующим решение определенных задач: изучение факторов, влияющих на процесс клоналъного микроразгаюженкя мнтродуцированных соритов голубики высокой и брусники обыкновенной, исследование процессов морфогенеза и регенерации, анатомо-физкологические исследования реакции регенератов на условия культивирования, адаптации регенерантов к условиям произрастания, длительное хранение регенерантов в культуре in vitro. . ' . -.

. Поскольку общепринятые методики пришлось модифицировать ко многим экспериментам, то мы сочли целесообразный, с цель« лучвего восприятия материала, останавливаться на них в каждой глава диссертации.

Статистическую обработку данных проводили с использованием ЭВМ.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПРОЦЕСС КЛОНАЛЪНОГО М1КР0РАЗМЮ1ЕНИЯ .

ЮТРОДУЦИРОВАЖЬК СОРТОВ VaOCINItM OCKYMBQSUM L. И

VAOCINHM VITIS-IDAEA L. В КУЛЬТУРЕ IN УГЛЮ

Сиричо/щи спщиш«. Необходимо отметить, что лроцесс клоналъного ннкроразмножения начинается с изолирования акспланта, его стерилизации и посадки на питательную среду. Немаловажная роль а нем принадлежит подбору стерилизующих соединений, эффективности их концентраций и продолжительности времени обработки с целью освобождения материала от инфекции и получения высокого выхода жизнеспособных зксплантов.

В качестве стерилизующих соединений испытывали О,IX раствор диацида, О,IX - суп et«, 0,8% - азотнокислого серебра, 0,04Х азотнокислой ртути, 6Х -гилохлорида кальция в сочетании с обработкой 70Х этанолом, с экспозицией 5 сек для этанола, 10 мин для остальные растворов. ■

Зксшшнтами служили верхушечные и боковые почки молодых побегов 14 сортов голубики высокой (Atlantic, Concord, Tifblue,. DelJto, Woodart, Stanley, Bluecrop, Blueray, Covill, Earlyblue, Herbert, Ranoocas, Scamnel, Dixi) и 5 сортов брусники обыкновенной (Koralle, Masovia; ErntadanK, Erntekrone, Erntezegen).

Анализ результатов экспериментальных исследований покалал, что выход жизнеспособных энсплантов зависит как от типа стерилизующего соединения, так и от видовой и сортовой принадлежности растения,кз которого иичленялн эксплант.

Оптимальным стерилизующим соединением для исслсДованньс: сортов голубики • высокой следует считать все указанные соединения,за исключением GX раствора гилохлорида кальция; для брусники обыкновенной-0,04% раствор азотнокислой ртути и 0,8% - азотнокислого серебре. При использовании перечисленных стэ;к<-лизуицих соеданенлЛ выход жизнеспособных зксплантов был максимальным и ссмтяямл

- о -

70-801 для брусники и 80-100 - для голубики.

Эксплант. Следующим фактором, оказывающим немаловажное значение на процесс «тонального микроразпнп-1 ;чя, является эксплант.

Анализ питературы по г^оллем^ регенерационной спск-обности ювенильных и зрелых эксплантов дает основание считать, что существует два аспекта данной проблемы, С одной стороны, зь^периментальгздЛ материал, полученный многочислен ными исследователями, свидетельствует о вьои/к^Я регенерационноЯ спо^-ооности, присущей овеннльнын лантан, а с другой - г,«"ин. Это >6ежяает нас в том, что только зхсперимр'иалъныи путем можно определять регенерационнуто способность того или другого экспланта, независимо от наших знаний о его физиологическом состоянии.

В эксперименте эксплантами служили апикальные и латеральные почки зрелых и молодых побегов 1ч иктроАудированных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной, а также части стерильных проростков (эпикотиль, гяпо-котилъ, стебелек, корешок, семядоли, листья,верхушка проростка).

На основании анализа экспериментального материала установлено, что для каждого типа экспланта характерен определенный регенерационный потенциал, зависящий от сортовой принадлежности растения и физиологического состояния экспланта, то есть от его возраста. Так, наибольшее число регенерантов на один овенильный эксплант получено у сорта Дикси (из семядолей - 13, листьев - П-1Г' верхушек проростков - 15). Наименьаей регенерационной способность» обладали экспланты сорта Ранкокас, за исключением гипокотиля, которому присущ относительно высокий регенерационный потенциал (7 растений-регенерантов на эксплант) Остальные сорта занимали промежуточное положение по данному показатели. У зрелых эксплантов регенерационный потенциал равен нули.

Сравнительный анализ регенерационноЯ способности различных типов эксплантов у ийтродуцировлнных сортов голубики высокой и 6{ усникн обыкновенной показал, что высокий регенерационный потенциал характерен для ювенильных эксплантов голубики и для зрелых - бруснтСи. Такая диаме-г"»^ч,но противоположная картина, наблюдаемая относительно данного показателя, на» дит на мысль о неодинаковой способности, присущей сортам этих видов растений, к синтезу эндогенных регуляторов роста в одних и тех же типах экспланточ. "огично предположить, что у брусники обыкновенной больше синтезируется эндогенных гормонов а зрелых эксплантах, по сравнению с ювенильными, а у голубики высокой -наоборот. Не исключено, «по это может быть связано с принадлежностью интро-дуцнрованных сортов голубики к листопадным кустарникам, а брусники - к вечнозеленым кустарничкам.

Время гок». Время года« в которое был вычленен экеллаит, играет большую роль в процессе клонального микроразмножения. Особую остроту приобретает этот вопрос по отношению к кнтродуцнровашшп сортам голубики высокой и брусники обыкновенной, так как зги сорта относятся к сем.Ericaceae и содержат гораздо большее количество фенолов по сравнению с растениями из других семейств. "

При вычленении экспланта происходит механическое повреждение тканей, сопровождаемое резким усилением биосинтеза фенольмых соединений. При выходе фенолов из вакуолей (в которых они локализованы) в протоплазму, в результате поранения клетки. во время вычленения экспланта, они неизбежно подвергаются ферментативному окислению, в результате которого образуются токсические соединения - хиноны, вызывающие некроз и гибель экспланта.

Вообще некротическая реакция рассматривается как защоная сверхчувствительная функция, осуществляемая при помощи полифенолькых соединений, так как продукты окисления фенолов создают на пути распространения инфекции хинонные барьеры, в результате возникают защитные некрозы. Однако такие защитные некрозы крайне нежелательны при введении экспланта в стерильную культуру. В ягой связи возникла необходимость в определении благоприятного времени года для отбора эксплантоа, в течение которого некроз юс будет мшимальши. •

Как показал анализ экспериментального материала, полученного для интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, экспланты, вычлененные в различное время года, по-разнону реагировали в культуре in vitro (табл. 1,2).

Экспланта брусники обыкновенной, отобранные в январе-феврале и мае-декабре, оказались в конечной итоге Н&соособшгт к пролиферации. Згспланты, отоб-раншз в марте-апреле, быстро регенерировал« побеги без образования каллуса, в отличие от экспяантов, вычлененных в другое время года, которые были способны к образованию только каллуса. В случае формирования побегов из таких апеллянтов, достигая в длину не более 6 мм, они приостанавливали рост за счет увеличения массы каллуса, и деградировали, а каллус в конечном итоге бурел.

Оптимальным временем для отбора эксплантов у'интродуцированных сортов брусники обыкновенной следует считать март-апрель. Вероятно, а это время происходит снижение уровня фенолышх ингибиторов роста, накопившихся в .точках осень« и зимой иобеспечивающих им состояние покоя. Не исключена возможность, что в марте-апреле у исследованных сортов брусники обыкновенной природные цитокннины и ауксьны переходит в активную форму, что способствует нормальной регенерации побегов из почек, вычлененных в это время года. Отсутствие регенерации как таковой у ькелкантоа, отобранных в ноябре-декабре, может быть

Таблица 1.

Влияние врепеии года на пролиферации т У1Мо эксллантов интродуцированньк сортов брусники облвю&екной'1

Сорт !

Врепя отбора зхешшнтов КогаПе ! Мавоуга 1 Епке..гЗпе 1 ! Примечание

1 ! 2 1 3 I 1 2 1 3 ! 1 2 ! 3 I 1 ! 2 ! 3 1

Январь-февраль 45 5+1 ++ 35 2+1 ++ 40 3+1 •и- 25 2+1 ++ Регечерированше побеги с наллусоп побурели

Март-апрель 85 9+1 - ВО 7+1 - 75 6±1 . - 65 5+1 - Регенерированные побеги росли нормально

МаЯ-ивнь 55 6+1 ++ 45 4+1 ++ 50 4+1 ++ 40 3+1 ++ Часть побегов с ьаллусоп побурела

Киль-август 35 0 + Ъ 0 + 30 0 + 30 0 + Часть побегов с 1£аллусои побурела

Сентябрь-октябрь 20 0 + 15 0 + 25 0 + 15 0 + Экснланти с каллусоп побурели

Ноябрь-декабрь 0 0 - 0 0 - С 0 0 0 - Скслланты побурели

Данные из 15 эксалаятоь на покорность.

Условные обозначения: 1 - ирсцсчт прошферирогавык окл/антов, спустя 45 лней их культивирования;

2 - количество побегов, регенерированных на 1 эксалаат (штук);

3 - калл/сообр&зоьалиа: (интенсивнее), + (кэд!ениэе), - (отсутствует).

* • ' Таблице 2.

Влияние врзменк отбора гхспланюз иытродуцированиых сортов голубики высокой на их жизнеспособность в культуре in vitro (данные из 15 эксомнтов на повтореость)

! Сорт 1 ■

. Время I ,. ,,.- . , --1 1 ......1

• отбора .'., ! Bluecrcp ! Blueray ! Dixi ! Herbert ! - Ranoocas 1 Примечание

3!—'.шантов i ' 1 I .и . I ; ;.

! 1 I 2 ! 3 11 I 2 i 3 ! i 12! 3 t 1 I 2 ! 3 ! 1 12 I 3 t

Январь-февраль * ■ /8 22 - 80 20 - 82 18 - 84 16 - 78 22 « Экспланти, отобранные с

Ilapr-änpenb . . 60 40 + 84 16 + 68 32 + 80 20 + 58 42 + воябр* по апрель, регене-

Май-игаь 8 92. .V- , 0 100' - 0 100 - 2 98 - 2 98 - риромли побеги после

Июль-август : 14 86 ++ 20 , 80 ++10 90 . + . 4 96 + 16 84 + пересади юс со среда

Сентябрь-октябрь 64 36 ++ - 56 ■ 44 . ++ 50 50 .++ ' 56 44 4+ 50 50 -н- Андерсона на среду ИМ

Ноябрь-цекабрь ; 70 [х 80 20 - 80 20 - 76 24 - 70 30 -

Условныг обозначения! 1- процент жизнеспособных (зеленых) эксолантов, '.'.'<

2 - процент окисленных (бурых) эксшшятоа,

3 - каллусообразование: ++ (интенсивное), + (медленное),*- (отсутствует). Слщачапм: WPM - tfcocty Plant Mediua. ' "

сопряжено с накоплением • почках фенольных ингибиторов роста, что а своп очередь приводит к резкому с.<иенко вндогенных ауксинов и цитокинкнов и переходу их в иеахтивиув форму.

Анализ экспериментального материала »продуцированных сортов голубики высокой показал, что наиболее благоприятное время года для отбора эксплантов следует считать с ноября по tupr. В эти месяц» у всех сортов баз исключения отмечен высокий процент жизнеспособных эксплантов (табл. 2).

Гсиишц. С целъв выяснения роли генотипа в процессе клонального микроразмножения кнтродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной нами были проведены экспериментальные исследования, касающиеся изучения влияния генотипа на коэффициент размножения и норфометрическме показатели регенератов этих растений.

Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод о различии в коэффициенте размножения и морфометрмческих показателях у исследованных растений (табл. 3).

Дальнейшие исследования были направлены на увеличение коэффициента размножения у сорта Mbodart, Delite, Tifblue и основывались на предположении, что сам по себе генотип не оказывает влияния на регенерацкониыЯ процесс, а служит индикатором способности эхспланта определенного сорта или вида растения к данному процессу. Бели это так, то у сортов, обладаюцих низким коэффициентом размножения (Woodart - 1 регенералт на эксплант, Delite - 2,5, Stanley - 3,5, табл.2) можно добиться его увеличения. Подтверждениемправильности навих суждений являются результаты экспериментальных исследований, позволявшие увеличить этот показатель в 5 раз для сорта Woodart, в 2,2 - для Delite, В 1,8 - для Tifblue (табл .4) при содержании в питательной среде ИУК12-иП - 4«15 (табл.4). На наш взгляд, следует обратить особое внимание на то обстоятельство, что на одну я ту же концентрацию гормонов исследованные три сорта отозвались по-разному, т.е. увеличение коэффициента размножения произошло на неодинаковую величину. Этот факт является с-чдетельством того, что генотип служит не только индикатором способности экспланта к микрорезм-ножению, но и контролирует его потенциальную возможность к данному процессу.

Анализ литературных данных и материалы собственных исследований заставляют пересмотреть устоявшийся взгляд о влияния генотипа на регенерации. Не отрицая значительной роли генотипа в этом процессе, мы считаем, что если какой-либо вид растения или сорт не образует регенерантов в случае применения ряда модификаций питательных сред, это не может быть основанием для утверждения об отсутствии способности к регенерации у данного растения, так как она генетически

Таблица 3.

Влияние генотипа ыа коэффициент размножения и порфоиетричаскме показатели интродуцированньк сортов г^пубики

высокой (среда WFM 1:5 ИУХ/2-иП)* '• .

! Сорт

Пдказатель 1 ■ ■ — ■ ■ .........,., ,.,,.,. ...... ......

! Vtoodart i Delite. ! Atlantic ! , Ccncord 1 Stanley 1 Tifblue

Коэффициент размножения (количество регенерантов на одни эксшшнт)

Высота регекеранта (ми) 10 + 1 . 18 + 2 ' 30 + 3 28 + 1 20 + 2 : 17 + 1 -

Размер листа регеиеранта .- -

(urn, «") 3,3 х г,«** 3,9x2,6 5,0x4,1 5,0x3,9 4,5 х 3,1 4,0 х 2,7

к ■ - -

Показания сняты спустя 45 дней, культивирования. Данные представляет средам ара^кетичесгуе .

+ среднсквадратическая ошибка при а *= 10.

Сокращения: ИРМ - Vfcody Plant MaUum

ИУК - индолилуксусиая кислота (ит/л"^)

2-иП - взоаентенши-адгмш (ht/jT*) ля .

Представлены усредненные (по 10-15 листьям) данные.

1 + 0 2,5 + 0,5 6 + 1 5,5 + 0,5 3,5 + 0,5 2,5 + 0,5

Таблица 4.

Влияние регуляторов роста ка двух типах питательных сред на коэффициент размножения у интродуцированных сортов голубики высокой (освещенность 3000 лк, I - 25°С+1, фотопериод 16 ч)

J • Вариант питательной среды

Сорт 1 Woody Plant Medium t Андерсона

1 ИУК: |2иП(иг/л" Iкоэффициент 1\1размножения, M шт. I ИУК: {2иП(пг/л"1) !коэффициент !размножения, ! ат.

ltS 1,0+0 1:5 1,5+0,5

Uoaoact 2tl0 4:15 3,5+1 5,0+0,5 2:10 4:15 2,5+1 4,0+0,5

5x25 3,0+0,5 5:25 3,0+1

1:5 2,5+0 1:5 1,0+0

Délite 2:10 4:15 3,0+0,5 5,5+1 2:10 4:15 2,511 3,5+0,5

5:25 2,5+1 5:25 2,3+1

1:5 2,5+0,5 1:5 1,5+0,5

Tifblue 2:10 4:15 3,5+1 4,5+1 2:10 4:5 2,0+1 4,5+1

5:25 2,0+0,5 5:25 2,5+0

Сокращения! КУК - индолилуксусная кислота 2-иП - изопентениладенин

S ■ . - •

^терминирована. Это линь свидетельствует о неправильном сбалансировании питательной среды и других факторов, необходимых для регенерации того или другого вида растения или сорта. На наш взгляд, при соответствующей оптимизации состава питательных сред, условий культивирования, правильного отбора »кспланта, можно созвать морфогенез и регенерацию у любого генотипа, несмотря на все сложность этих нногофакторкх процессов. Стало быть, нельзя недооценивать роль геь -типа а клональном микроразложении растений, равно как и преувеличивать его.

морфогенез ИНГРОДУЦИРОВАИНЫХ ООРГОВ МОДСПШМ CGHXMBOSOM Ь.

И vaccinu« vxtis—idaea 1>. В КУЛЬТУРЕ in vitro

Изучение морфогенеза было проведено'намв у 14 штроцуцированимс сортов голубики высокой к 4 сортов брусники обыкновенной на трах типах питательных гред девяти модификаций, различающихся концентрацией макро- и микросолей, гормональных добавок (табл. 5). -... ..• „

Результаты эксперименталышх исследований показали, что морфогенез исследованных сортов растений зависит от типа питательной среды, ег состава, соотношения гормональных добавок в ней.

Из всех исследованных типов сред наиболее активное побегообразование происходило иа среде wpm (к> 8) и Андерсона (If 9). Спустя 4-5 пассажей, почти у всех микрочеренков, высаженных для побегообразования, наблюдали рмзогенеа ■а среде IP 8 и W 9, чего не было отпечено на средах других модификаций. Это служит доказательством универсальности этих сред для обоих морфогенетичесхих процессов: побегообразования и рмзогенеза. Несмотря на то, что б подавляющем большинстве случаев ризогенез.индуцируется только после -пересадки регене-рантов на среду для корнеобразования, дополненную экзогенным ауксином, в данном случае, образование корней на среде для побегообразования. не исключает предположения о том, что в регенерантах этих сортов достаточно содержится эндогенного ауксина, способного вызвать корнеобразованхэ без пересадки на специальную среду для риэогенеза, дополненную экзогекнан ауксином.

У остальных эксплантов (эпикотиль, гипокотшьи др.) через 5-6 недель культивирования образовался морфогенный каллус с последующей регенерацией из него побегов. Высоким морфогенетическим потенциалом обладали все без исключения э.сспланты на двух средах и Андерсона трех годкфикаиий, содержащие цитокинин (2-иП) и ауксин (КУК) в следующих соотношениях! 2,5 » 1, 4 j 1, 3,75 «1. -

На основании изучения морфогенетическкх процессов, протекающих у эксп.мантов исследовзнных сортов, показана принципиальная возможность

Таблиц) 5.

Состав модифицированных питательных сред, использованных для изучения морфогенеза »продуцированных сортов Уасс1п1ш1 »гиа-кЗаеа I.. к Уасс1шиа оогутЬ—лт Ь.

Квгаонеиты $ Надифювцяя среда (вооер)

питательных 1-сред (вг/л) 1 1 1 2 I 3 1 4 1 5 ! 6 ! 7 ! 1 <»

Нахросоли по МЭ Полна* норна - 1/2 ЬЗ - - 1/2 МЗ 1/2 МЗ - -

№росолн по МЭ п - 1/10 МБ - - 1/2 КЗ 1/10 МЗ - -

Макросоли по КЕМ - Полная норм - Полная но^иа - - - СЬ-ои* ЦГ^ГЛ -

Жгросоли по МИ - и - п - - - м -

Насрисолн по Андерсону - - - - Потная нерпа - - - Полная норма

Микросоли по Андерсону - - - - п - - - м

Мезоинозкт 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Адешн сульфат - 80 80 80 80 40 чО 80 80

Тиамин (Вд) 0,4 - - 0,4 - 0,1 0,1 0,4 0,4

Оиридасии (В^) - - 0,4

Продолжение табл. 5.

Компоненты ■■ ! Модификация среды (номер) • Г

питательных ' „* " !-:->— ■ —:-

сред (иг/л) 1112 13 1 4 ! 5 Г б ! 7 »8 19

Ннасошлуксусяая кислота ■ 5 2 1 1,5 2,5 4 4

Бензила! шнопурин • • ; * • - '" ; - ■ 2 ■ - -

Гибберелловая кислота " - . 4 - .-• - -

йзопентекиладении 10 , 10 '. 2 5 2 ........- ' • 10 15 15

Сахароза' '* „,. . :20000 ' 20000, 20000 20000 20000 20000 - . 20000 30000 30000

Агар'. • 6000 . 6000 6000 6000 6000 , 6000 6000 • 6000 , 6000

Рй - ' ' '■ ' • ' . ' *";:• • ; 4,0 а 4,0 ," 4.0 4,0, " 4,0 ' 4,0 4,0 *,0

Сокрадения: № - Мурагиге-Скуга

... " дам - ИЬос1у Р1агА МееШиш

- компонент отсутствует в среде

получения регенерантов двумя одами: 1) через актии«!.,т плэушньк меристем, н 2) пролиферацию морфогенного каллуса с последующей регенерацией из него побегов.

Результаты исследований, полученные при изучении морфогенеза у различных типов эксплантов у интродуцированных сортов голубики высокоП и брусники обыкновенной на модифицированных питательных средах, использованы нам» при разработке технологии клепального микроразмножения данных сортов.

РЕГЕНЕРАЦИЯ ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ СОРТОВ VACCINIUM CORYMBQStM L.

И VACCINIUM VITIS-IDAEA L. В КУЛЬТУРЕ IN VI7K0

Регенерация растений является узловым моментом во всей методологии культуры клеток и тканей. Без регенерации теряют свою значимость исследования касающиеся роста и дифференциации, гибридизации, генетической трансформации и, наконец, теряет свою значимость клонирование ценных сортов многочисленных культур в прогшшленном масштабе.

В этой связи нами проведены экспериментальные исследования, позволяющие изучить регенерацию 14 интродуцированных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной в культуре in vitro и определить факторы,влияющие на этот процесс.

Базируясь на предположении, что состав питательной среды играет одну из основополагающих ролей в регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной,эксперимента были проведены на четырех типах питательных сред: MS, V.TM, Андерсона, Лирека 18-ти модификаций, различающихся содержанием макро- и микроэлементов, гормональных добавок, витаминов и других компонентов.

Подробный анализ экспериментальных данных показал, что регенерационный потенциал интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной зависит от типа питательной среды и компонентов, содержащихся а ней. Оптимальной средой для данного показателя следует считать две модификации питательных сред, содержащие: 1) соли и витамины по KFM, 2) соли и витамины по Андерсону, мезоинозит, аденин сульфат, гормональные добавки, сахарозу и агар. Эти среды были положены в основу при разработке технологии «тонального микроразмножения исследованных растений.

Сравнение регенерационного потенциала интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной на одних и тех же модифик^ ях питательных сред дает возможность убедиться в существовании видовых различий для данного показателя. У брусники этот показатель в 2,5 раза выше, чем у голубики.

В результате исследования питательных сред на регенерационную способность опытных растений мы смогли оценить комплексное влияние компонентов, содержащихся в них, на этот процесс, выявить существование видовых различий в нем, а также определить оптимальные модификации питательных сред для регенерации исследованных растений.

Изучение влияния ауксина (ИУК) и цитокннина (2-иП) различных концентраций на регенерацию гобегов показело, что самый высокий регенерационный потенциал для исследованных сортов голубики и брусники отмечен на среде, содержащей 5 мг/л ИУК и 20 мг/л 2-иП, однако в этой ситуации побеги отличались по морфологии. Остается пока не ясным какова природа данного морфоза? Она носит эпигенетический характер или затрагивает геном растения? С нашей точки зрения, ответить на этот вопрос помогут цитогенетические исследования. Если окажется, что морфозы носят случайный характер и не затрагивают наследственность растения, то концентрации (5 мг/л ИУК и 20 мг/л 2-иП) можно будет использовать для получения генетически однородного материала. В противном случае материал с измененной плоидаостыо может найти применение в селекции.

При других концентрациях ауксина (1, 2, 4 мг/л) и цитокннина (5, 10, 15 мг/л) регенеранты имели нормальную морфологию, аномалий в их строении не обнаружено. Это дает возможность использовать перечисленные концентрации стимуляторов роста для регенерации исследованных Сортов.

На основании результатов экспер °нтального материала, полученного по изучению укоренения 14 интродуцироэанных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной в зависимости от типа ауксина (ИМК, ИУК, НУК) и его концентраций (0,25, 0,50, 1,00 мг/л) в питательной среде, можно прийти к выводу, что оптимальным вариантом для ризогенеза исследованных сортов следует считать 1 мг/л ИМК.

Принимая во внимание то обстоятельство, что ризогенез у интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной происходит к." т на среде для ризогенеза, содержащей ауксин, так и на среде для побегообразования, в присутствии ауксина и цитокннина, было интересно проследить,произойдет ли образование корней у регенерантов непосредственно в почвенном субстрате, минуя стадию укоренения их на питательной среде.

Анализ экспериментального материала свидетельствует о возможности укоренения регенерантов интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной в почвенмом субстрате, минуя стадию укоренения на питательной среде. Доказательством неоспоримости данного вывода может служить сравнительная характеристика укоренения регенерантов на различных типах субстрата. Самый высокий процент укоренения от 90 до 100 составил у всех сортов без исключения

на субстрате, содержащем торфгперлмт (Iii). Кескольк ниже этот показатель.был на субстрате торф тасок (1:1)нперлите,пропитаннои раствором макро- и микро.. солей» : ', \ . .'• v" ,.

Укоренение регенератов интродуцкрованных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной непосредственно в субстрате позволит исключить из технологического цикла стада» укоренения на питательной среде, сэкономив при этом расход дорогостоящих компонентов, необходимых для приготовления питательной среды, избежать потерь, связанных с повреждением корневой системы при отмывании ее от агара, сократить сроки получения товарной продукции и, в целом, удешевить технологчю клонвльного кикроразмножения данных культур.

' Завершая изложение экспериментального материала, касающегося регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, остановится

- на регенерации побегов непосредственно из ткани листа. •

• Результаты экспериментальных исследований показали, что регенерация побегов из листьев зависела от типа экспланта, состава питательной среды, соотно-' пения гормонов в ней к сортовых особенностей материала. Оптимальной средой

■ для регенерации побегов" из ткани листа у кнтродуцированных сортов голубики

° высокой я брусники обыкновенной следует считать модифицированную среду WEM и ' Андерсона, содержащую 1 иг/л ИУК и 5 иг/л 2-иП. .

Сравнительный анализ регенерационной способности целых листьев и кусочков * листа показал, что целые листья обладают большей регенерационной способностью по сравнению с кусочками листа. Можно думать, что при использовании в качестве

■ эксплантов кусочков листа теряется функциональная целостность листа,как органа

- - это во-первых) во-вторых, при механическом повреждении экслланта происходит . фенольное окисление, что вызывает некроз зкспланта; в третьих, кусочки листа

' обладают неодинаковым мермстематическик потенциалом. Все вместе взятое, с нашей точки зрения,'приводит к снижению регенерационного потенциала в случае . использования кусочков' листа хю сравнению с целит листьями. /

! Анатомические исследования показали, что высокими меристемотическими потенциями обладали клетки субзпидермального слоя мезофилла адаксиальной стороны листа в зове центральной, жилки у основания листовой пластинки. Менее вшвннп были клетки в средней и верхней части листа. Вероятно, высокая активность '

■ меристематяческой ткани у основания листовой нластинкж, обусловленная направленностью транспорта- ассимИлятов в растении, является сдаюй из причин активной

' регенерации побегов у основания листовой пластинки. '

• Принимая во внимание, что регенерация побегов происходила непосредственно , из клеток мезофилла листа, минуя стадию образования каллуса, можно полагать, что полученный таким образом материал идентичен материнскому', т.е. сохранена

его сортовая принадлежность, что особенно важно при клональыоп мнкроразмноже-нин.

Разработанный метод прямой регенерации из ткани листа может Сыть использован в целях генетической трансформации для получения трансгенных растений.

Следует сказать, что при введении в клетку бактериальных плаэпид, нам удалось получить растения-регенеранты непосредственно из трансформированных клеток листовгП ткани у двух сортов голубики высокой: Corraord и Atlantic.

АНАТОМО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕАКЦИИ РЕГШЕРАНГОВ

VAOCINIUM схяотюоеим L. И VACCIITOM Vms-ICAEA I.. НА УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Сдним из ведущих факторов культивирования в условиях in vitro является освещенность.

Исходя из предпосылки, что свет оказывает влияние на структурю-функцио-ндлъную организацию растений в культуре клеток и тканей, нами было исследовано влияние интенсивности освещения на содержание пигментов н анатомическую структур1 листа растений-регенерантоа интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной в культуре in vitro.

Анализ содержания зеленых и желтых пигментов при различной освещенности (1000, 2000, 4000 лк) показал, что для большинства сортов (Atlantic, Concord, Rar.oocas, Covili, Earlyblue, Herbert, Oixi, Bluecrop. Tifblue, Maaovta, Emtradank) характерна классическая закономерность в изменен ¡ч содержания хло-рофмллсв и карогиноидов. При увеличении интенсивности освещения до 4000 ЯК содержание хлорофилла*"а", "б" и их суммы уменьшалось, а каротиноцдов - увеличивалось. При умекьветш интенсивности освещения до 1000 лк содержание зеленых пигментов увеличивалось, а желтых уменьшалось. Это свидетельствует о лабильности пигментной системы пластид, что способствует адаптации регенератов « условиях in vitro к различной освещенности: от 1000 до 4000 лкк Косвенным подтверждением лабильности пигментной системы пластид как следствия'адаптации растений в условиях in vitro к различному режиму освещения, могут -служить результаты морфометрических показателей, свидетельствуй»»«. об-усг>еяноп~'культк'-вировании регенерантов в данных условиях.

Свет оказывает влияние не только на функциопялм»ит>ироцессы| * протекающие в тканях листа, но и на его структурную организации.! Изучение'внутреннего строения листа регенератов, в зави jctm от интенсивности освещения в условиях in vitro,показало, что изменение интенсивности освещения не приводит с появлению новых признаков структуры листа, а лишь усиливает или ослабляет

существующие. В изменении толщины листовой пластинк i рослеживали прямую зависимость от интенсивности освещения, В изменении размера устьиц наблюдали обратную зависимость. Например, при увеличении интенсивности освещения с 2000 до 4000 лк толщина листовой пластинки увеличилась у сорта Bluecrop с 63 до 76 мкн, у сорта Dixi - с 70 до 85 мкм. При уменьшении интенсивности освощения с 2000 до 1000 лк величина данного показателя уменьшилась у сорта Bluecrop - с 65 до 58 нкм, у Dixi с 70 до 60 мкм.

• В условиях in vitro, независимо от интенсивности освещения,регенеранты имели гомогенную структуру листа. Мезофилл не был дифференцирован на столбчатую и губчату» паренхиму н состоял из паренхимных клеток округлой, изодиа-метрическоП формы. Эпидермис листа однослойный, без кутикулы. Стенки эпидер-нальных клеток извилистой Форш. Устьица с недоразвитыми замыкающими клетками.

У регенерзнтов, развиваввихс в условиях оранжереи и открытого грунта, лист дорзивентралышй. Мезофилл листа четко дифференцирован на столбчатую и губчатую паренхиму. Устьица с развитии« замыкающими клетками. Эпидермис листа однослойный,с тонкой кутикулой.

Исследованные нами сорта растений реагировали на условия культивирования

изменением как общего плана строения листа, так и количественных показателей.

Условия открытого грунта с повышенное солнечной инсоляцией и относительно

низкой влажностью воздуха способствовали увеличение толщины пластинки листа,

коэффициента палисадностн, длины клеток столбчатой паренхимы, числа устьиц на

о * 1

1 мм поверхности листа, а условия оранжереи с пониженной солнечной инсоляцией

к относительно высокой влажность» воздуха приводили к уменьшению величины

данных показателей. "

, адаптация РЕГааеРАШОВ ингкдуцигованньк сортов vftociniuh ооюмвоеш l. и VAccuaw vitis-idma l. к условиям ih vivo

С навей точки зрения в основе клонального мнкроразмножения лежат два принципиально резных этапа« in. vitro и in vivo. На первом из них жизнедеятельность размножаемого материала происходит в замкнутом стерильногг пространстве, на питательной среде,'в строго контролируемых условиях. После переноса регенерзнтов в условия in vivo начинается второй этап в жизнедеятельности растений, совершенно отличный от условий in vitro. Переход растений из условий in vitro в условия in vivo в, большинстве случаев является критическим и связан с гибелью растений.

На наш взгляд* понять причину гибели растений при адаптации и предотвратить ее поможет сравнительный анапнз структурно-функциональных особенностей

регенерантов в условиях In vivo и vitro.

Как показали исследования, проведенные нами по изучению внутреннего строения листа, в зависимости от условий культивирования, регенеранты интроду-цировзнных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, выращенные в ус* /юанях in vitro, не имели четкой дифференциации мезофилла на столбчатую и губчатую ткань, имели тонкую листовую пластинку, слаборазвитый кутикулярный покров, недоразвить»! устьичный аппарат, способствующий постоянному открытию устьиц и чрезмерной транспирации.

Листья регенерантов, развивающиеся в условиях оранжереи^ имели четкую дифференциацию мезофилла на столбчатую и губчатую паренхиму, кутихуляркый покров, развитый устьнчныЯ аппарат, что способствовало нормальному с -лечению транслирации,

Листья растений, высаженных в открытый грунт, по общему плану строения не отличались от листьев оранжерейных растений. Они имели четко дифференцированную структуру листа на столбчатую и губчатую ткань, хорошо развитый ку-тикулярный покров, устьичный аппарат.

Логично предположить, что различия в структуре листа сопряжены с их функ-цио ¡льными различиями. Реальным подтверждением тому является низкая интенсивность фотосинтеза в условиях In vitro, что связано с отсутствием четкой дифференциации листа на столбчатую и губчатую ткань, с низкой концентрацией COj в культуральных сосудах. Различил эти в основном являются результатом воздействия специфической среды в асептической культуре,н они исчезают после переноса растений я условия in vivo, благодаря повышению к нцентрацин 00^, что способствует увеличению интенсивности фотосинтеза и как следствие-ускорение роста perei рантов.

На основании сравнительного анализа структурно-функциональных особенностей регенерантов в условиях in vitro н in vivo, базирующегося на материалах собственных исследований и литературных данных, г« привли к выводу, что условия культивирования in vitro и in vivo накладывают отпечаток на структуру и функцию регенерантов - это во-первых. Во-вторых, структурно-функциональная организация регенерантов-нобилъная система и может перестраиваться в соответствии с изменившимися условиями окружающей среды. Это значит, что различия в строении и функция листьев растений, выращенных в асептической культуре, в условиях оранжереи или в открытом грунте, свидетельствуют о пластичности листа - органа, способного пеоестраиватъ свои структуру и функцию адекватно условиям культивирования, <п еретически является гарантом успешной адаптации растений при переносе их из условий in vitro в условия in vivo.

На практике, как показали наан наблюдения за развитием «продуцированных

сорго» голубики высокой и брусники обыкновенной прк переносе их из условий in vitro а условия in'vivo, паи удалось избежать потерь материала в критический для него момент, благодаря совладению технических приемов, базирующихся на результатах собственных аксперимеаталъных исследования.

. В целях предотвращения гибели материала от чрезмерной тренслирации (это касается не только голубики и брусники) которая происходит из-за резкого снижения влажности в условиях in vivo, а так^же из-за несовершенной структурно-функциональной организации листа, с точки зрения именно этих условий, в первую очередь необходимо поднять тургор регенератов до максимальной величины. Следующим непрамеям* условием является создание градиента давления пара ь^сду листьями и воздухом и поддержание влажности и температуры, аналогичной условиям in vitro. Все «то вместе взятое даст возможность сохранить регенеранты от увядания, снизит., днтенсивность фотосинтеза и приостановить их рост, позволив запасу имеющихся в реген е рант ах метаболитов пойти на образование корней. После образования корней необходимо постепенно снижать влажность воздуха и увеличивать интенсивность освещения, что позволит завершить структурную перестройку листа, а именно: появится кутикуяярный слой, изменят .форму клетка эпидермиса, произойдут изменения в строении мезофилла (см.стр.22, 23). Лист приобретет черты жсеронорфной структуры, н растению не странна низкая влажность воздуха и даже сильный ветер, характерный дпя условий открытого грунта. ■ • . ' "

Подтверждением тонул может служить пример 100Z адаптации растений-регене-рантов кнтродуцироваинш сортов голубики высокой и брусники обыкновенной не ' только в условиях оранжереи, но и в условиях открытого грунта, о чем речь пойдет в следующей главе.

РАЗШГГШ ИШКЩУЦИГОВМиК СОРТОВ VACCINICM СОЮМВОЯМ L. и VAOCIKXUM VITXS-ПЛЕЛ L.', РЕГЕНЕРИРОВАННЫХ В КУЯЫУРЕ ю vrrao, В УСЛОВИЯХ ОТКРЫТОГО ГРУНТА

Вопросу культивирозания материала в условиях in vitro посвящено огромное количество публикаций! Однако сведения, касающнасч выращивания растений-регенерангоа в условиях' in vivo весьма ограничены. Несмотря на ограниченное число публикаций, позволим себе обобщить имеющийся материал по данному вопросу.

Большинство авторов, работающих с травянистыми растениями, склонны считать, что материал, полученный в кужьтуре in vitro имеет преимущества перед сортами и клонами, размнохенньии традиционным методом, В случае различия между ними, то они сглаживаются в первые один-два сезона- £абоаая с

кустарниковыми и древесными растениями, исследователи отмечают общую тенденций образования аксиллярных побегов. Однако, несмотря на положительную характеристику материала, полученного в культуре in vitro, нельзя обойти молчанием отрицательные моменты, проявляющиеся в аномальном развитии растений (голегание, аномальное развитие корневой системы, гибель растений).

С нашей точки зрения, такие отклонения в развитии растений не являются причиной, кроющейся в сапом методе клонального микроразмножения, ибо некоторые авторш склонны их приписывать именно методу и считать это его недостатком, наряду с преимуществами. По нашему глубокому убеждению, сложившемуся в результате анализа экспериментального материала по морфогенезу и регенерации, а также структурно-функциональной адаптации регенератов ннтродуц ванных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, одной из основных овибок, приводящих к негативным последствиям, является рассмотрение клонального м»к-роразмножения только как метода ("инструмента"), с помощью которого можно получить материал в неограниченном количестве.

Целостная картина клонального микроразмножения может быть получена только в результате рассмотрения его как единого сложного многофакторного процесса, сое «mero из двух принципиально разных этапов in vitro и in vivo, базирующегося на морфогенезе и регенерации, структурно-функциональной адаптации, а не только как метода, используемого в культуре in vitro, что позволит создать теоретические предпосылки и разработать совершенную технологии клонального микроразмножения для любого вида растения.

Результаты исследований растений-регенерантов а полевъг условиях являются индикатором нашей работы в условиях in vitro, так как исследования в условиях in vivo - это продолжение работы, начатой в условиях in vitro.

Сравнительный анализ результатов наблюдений (методика проведения исследований подробно изложена в диссертации) за сезонным развитием голубики высокой (сорт Bluecrop) и брусники обыкновенной (сорт Koralle), полученных в стерильной культуре и традиционным черенкованием,показал, что они в своем развитии не уступали своим двойникам (растениям из черенков), а по некоторым показателям даже превосходили их.

Показатели цветения и плодоношения отличались у растений, размноженных в стерильной культуре и обычным черенкованием. Количество цветочных кистей на одно растение, количество цветков в кисти, количество ягод в,кисти, пассе ягод с одного куста были несколько выше v растений из стерильной культуры по сравнению с растениями из черенков. По все фенологические фазы (набухание почек, распускание листьев, начало цветения, массовое цветение, конец цветения) наступали одновременно и не зависели от метода размножения, за исключением

двух фенофи! созревание ягод и конец периода вегетг яи, которые наступали поэм у растений из стерильной культуры. Несмотря на более позднее наступление конца вегетации у растений-регенерантоа, они оказались более морозоустойчивыми по сравнению со саоиаи даоЯниканк, растениями из черенков. Можно думать, что причиной высокой морозоустойчивости растений, размноженных в стерильной культуре и низкой - черенкованием, является различие в их функциональной активности. Вероятно, исследстакня в »том направлении прольют свет на процесс адаптации растений к низким температурам в совершенно ином ключе, чем это было до сих пэр. Самое существенное влияние оказал метод размножения на коли-. чество Назальных побегов у исследованных растений. Этот показатель был в два раза выше у растений на стернльиой культуры; независимо от года набладениП и . погодных условий. Вероятно, «то можно объяснить усилением синтеза эндогенных цитокинкноа в ювеннльнон растеши., способствующих активации пазушных меристем ■ ' и как следствие-увеличение числа банальных побегов.

' Сравнительная характеристика «¡зонного развития padrejoiS, полученных в стерильной культуре, с растениями, разжоженнымк традиционным методом, показывает, что в своем развитии они не уступали растениям из черенков, а по по-■ роэоустойчивости и образованию оаэальных побегов значительно превосходили их. .

ДЛИТЕШЮЕ ХРАНИЖЕ РЕПШЕРАНТОВ ИНТРСДОЦИРОВАННЫХ ООРГСВ VbCCINIUM

. GQRYKBOSU-l L. И VSCCINIttI VITXS-IDPEA L.'B КУЛЬТУРЕ IN VITRO '..

Исследования, проведенные нами.по изучения морфогенеза и регенерации интродуцированных сортов голубики вдеокой и брусники обыкновенной позволили получить стерильную культуру 14 сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной. Практически создана коллекция стерпльшм культур 18 сортов рас-, ' тений сем.Вересковыа. Порученный материал представляет большую ценность как с научной, так и с практической точки зрения.

. В мировой практике- в течение многих лет для поддержания коллецин стериль-- ных культур использовали постоянное выращивание их при оптимальных условиях для данных растений. Однако оказалось, что такое выращивание имеет ряд существенных недостатков! во-первых, возможность появления сокаклональной изменчивости .(из-за нарушения генетической стабильности часто пересаливаемого натериа ла), во-вторых, опасность загрязнения чужеродна» генетическим материалом и случайной утерей собственного генетического материала, в-третьих, трудоемкость процессов (необходимость регулярной пересадки на свежун питательную среду), в четвертых, высокая стоимость компонентов питательной среды, трабуежх для .частых пересадок. ; •••'.' •. v. ' t'

Изложенное достаточно ясно свидетельствует о необходимости изменения кинетики роста стерильной культуры и увеличения временного интервала пеаду пересадками до максимально возможного. Хранение культуры в состоянии замедленного роста дзет возможность уменьшить расход реактивов в результате сокращений количества пересадок и будет способствовать поддержанию генетической стабильности коллекционного материала.

Основным препятствием в хранении растительного материала брусники и голубики является его быстрое старение, ведущее а конечно*! итоге к гибели растения.

На наш взгляд,одним из путей решения данной проблемы, исходя из возможностей нашей лаборатории, является замедление роста стерильных куг тур с помощь» осмотических ингибиторов, а также ретардантов. К сожалению, сведения, касавшиеся влияния осмотических ингибиторов и ретардантов на жизнеспособность регенерантов в культуре in vitro,малочисленны и вовсе отсутствуют для интро-дуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной.

3 качестве объектов исследования использовали регенеранты 6 сортов голубики высоюй (Bluecrop, Biueray, Dixi, Herbert, Rancocae, Scamnel) и трех сортов брусники обыкновенной (Koralle, №sovia, Erntedank). Опыты проводили с маннитом«сорбитом в диапазоне концентраций 1-3 г/л, а также с хлорхолин-хлоридом (XXX, 2 г/л) и абсцизовой кислотой (3 г/л, 10 г/л). В ходе экспериментов растения культивировали без пересадок на свежую питательную среду на протяжении 12 месяцев. Жизнеспособность (Ж) материала оценивали по разработанному нами методу, включающему четырехбальную шкалу, согласно которой 0 баллов гибель растения, 1,2,3 - промежуточное состояние, 4 - максимальная жизнеспособность. Термин "жизнеспособность" использован нами как понятие характеризующее потенциальную продолжительность жизни растений а культуре in vitro при длительном культивировании их без обновления питательных сред.

Анализ экспериментального материала показал, что самая высокая жизнеспособность, в результате беспересадочного к>льтивирования материала на свежие питательные среды а течение 12 месяцев, характерна для сорта Koralle (брусника)^, 21 балла на среде N» 2, содержащей 8 г/л абсцизовой кислоты (АБК). Самая низкая-у сорта Rancocas (голубика) на среде № 5, содержащей 2 г/л vорбит а. Остальные сорта заняли промежуточное положение по данному показателю. Это лвляется свидетельством зависимости жизнеспособности как от сортовой принадлежности материала, так и от ингибитора, содержащегося в питательной среде. Оптимальным вариантом для д \льного культивирования исследованных сортов голубики высокой следует сч*.агь среды W 7-V 9, содержащие маннит. Для четырех сортов (Bluecrop, Dixi. Scanmel, Biueray) среду IF 3, содержащую 3 г/л

каинита, для Herbert - среду Я* 8 - 2 г/л макните, - -я Rancocae - среду If 7 ~ 1 г/л пахните.

Для длительного культивирования исследованных сортов брусники обыкновенной оптимальными являются Среды № 1-Х» 3, содержащие 2 г/л XXX и АБХ 8 мг/л • к 10 иг/л. Среды, содержащие сорбит, не могут быть рекомендованы для длительного культивирования (12 месяцев без пересадок) интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, а среды, содержащие XXX и АБК, могут быть рекомендованы только для брусники обыкновенной. '

Сравнительный анализ жизнеспособности сортов голубики высокой и брусники обыкновенной показал, что она выае у сортов брусники обыкновенной независимо от ингпоитора, присутствующего в питательной среде. Вероятно, это связано с функциональными особенностями, присущими вечнозеленым кустарничкам, к которым принадлежит брусника.

Таким образом, результаты экспериментальных исследований позволяют заключить, что добавление в питательную среду ингибиторов«роста способствует снижению скорости роста, предотвращению старения и сохранении жизнеспособности регенерантов на протяжении 12 месяцев без пересадок их на свежие питательные среды. При этом необходимо учитывать сортовую и видовую специфику исследованного материала, четко проявившуюся на действие ингибиторов, а также избирательное действие самих ингибиторов. ■

ВЫВОДЫ ,

1. Клональное микроразтожение интродуцированных сортов голубики высокой н брусники обыкновенной - сложный мюгофактортй физиологический процесс, состоящий из двух принципиально разных этапов: in vitro и In vivo, базирующийся на единой теоретической основе, с одной стороны, на морфогенезе н регенерации в условиях ; in vitro, с другой - на структур«о-функционакьной адаптации регенерантов при переходе их из условий in vitro в условия in vivo,. зависящий от стерилизующего соединения, типа экспланта, его физиологического состояния, времени года в которое он был вычленен, генотипа, компонентов, содержащихся в питательной среде, условий культивирования,

Оптимальным стерилизующим соединением для голубики следует считать 0,1Х-ный раствор диацкда или су немы, для брусники - 0, ОАХ-ный раствор азотнокислой ртути или 0,82-ный раствор азотнокислого серебра; временен отбора апеллянтов: март, апрель для брусники, ноябрь-мари для голубики. •

. 2. Морфогенез и регенерация интродударованных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной связаны с генотипом, который служит индикатором

способности эксопанта к микроразмножению, а также контролирует его потенциал«-|"/о возможность к данному процессу. При соответствующей оптимизации состава гитательнмх сред, гормонального баланса, правильного отбора экслланта и сой-гздении условий культивирования, можно вызвать моофогонез и регенерацию практически у любого генотипа, несмотря на всю сложность этих многофакторных процессов.

Степень регенерационной способности интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной определяется возрастом и типом экспланта, зависит от состава питательной среда, соотношения гормонов в ней, сортовых и видовых особенностей материала. У интродуцированных сортов голубики наибольшим регенерацконным потенциалом обладают ювенкльные апеллянты, у _/сннги -зрелые.

3. Показана гринципиальнал возможность осуществления регенерации интродуцированных сортов голубики высокой.и брусники обыкновенной в культуре клеток

и тканей тремя методами! 1) через активацию пазушных меристем, 2) дифференциацию почек в каллусноЛ культуре, 3) дифференциацию гочех непосредственно а тхани листа, минуя стадию образования каллуса.

Цптимальньпи питательными средами для регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной следует считать две модификации (из 18 исследованных), содержащие полную норму макро- и микроэлементов, ло 1JPN и Андерсону, 4 мг/л нндолилуксусной кислоты, 15 мг/л изопентениладенина, витамины, аденин сульфат, мезоинозит.

4. Обнаруженная лабильность пигментной систесш пластид, а также количественных элементов анатомической структуры листа у регенерантов интродуцированных сортов голуомки высокой и брусники обыкновенной является одним из nyifl их приспособления к различному режиму освещения (1000 - 4000 як) в условиях In vitro.

5. Условия культивирования in vitro и in vivo накладывают отпечаток на структуру к функцию регенерантов интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, проявившуюся а изменении качественных и количественных показателей анатомической структуры листа. Структурно-функциональная организация регенерантов-мобильная система и может перестраиваться в соответствии с изменившимися условиями окружающей среды, что теоретически является гарантом их успешной адаптации при переходе из условий in vitro В условия in vivo.

Выживание растений-регенерант в условиях in vivo зависит огг строгого соблюдения требований по уходу за ними, основанных на теоретических знаниях, базирующихся на экспериментальных исследованиях.

6. Иитродуцнровлнкые сорта голубики высокой и 'тусникк обыкновенной, регенерированные в асептической культуре, по-сравнение со своими двойниками, размноженными традиционным черенкованнен, обладают рядом преимуществ, главными из которых являются повышенная морозоустойчивость и усиленное образование базальных побегов, служащих предпосылкой к обильному образованию цветочных почек и как следствие - высокому урожаю.

7. Снижению скорости роста, предотвращению процессов старения, сохранению жизнеспособности ре гене рантов интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной на протяжении 12 месяцев без пересадок их на свежие питательные среды способствует добавление в питательную среду ингибиторов роста. Лрн этом необходимо учитывать сортовую и видовую специфику исследованного материала,четко проявившуюся на действие ингибиторов, а также избирательное действие самих ингибиторов, .«^неспособность регенератов зависит как от -количественного содержания ингибиторов в среде, так и от видовой и сортовой принадлежности растения. У сортов брусники этот показатель выяе, чем у голубики. - '

Оптимальным вариантом для длительного культивирования регекерантов голубики высокой следует считать среды, содержащие маннит (1-3 г/л), для брусники обыкновенной - хлорколинхлорнд (2 г/л) и абсцизовув кислоту (6, 10 мг/л).

8. Разработана технология клонаяьного микроразмножения интродуцированных сортов голубики высокой м брусники обыкновенной (в основу которой положены методы регенерации данных культур, защищенные авторским свидетельством и патентами), обладающая рядом преимуществ, способствующих сокращению сроков получения оздоровленной, зкологически чистой продукции, снижению ее себестоимости, удовлетворению спроса потребителя в этой продукции,независимо от времени года.-, • . .

Разработан способ хранения регенерантов, позволивший создать банк генотипов стерильных культур 14 интродуцированных сортов голубики высокой и 4 . сортов брусники обыкновенной, служащий одним из путей сохранения биоразнообразия растений, а также способствующий решению задач, возникающих в генетике, селекции, растениеводстве.

СПИСОК ОСНОВЛСС РАГОГ, 0ПУБЯИК0ВАИВК ПО ТН№ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сидоровнч Е.А., Кутас Е^Н., Чертах В.Ф., Судебная C.B. Ускоренное: семенное размножение голубики высокой в культуре in vitre // Весц! АН БССР. Сер.б1ял.навук.-1989, H» 5.-С.З-5. .

2. лутас E.H., Черник В.Ф., Судебная C.B. Культивирование зародышей Vaccinijm curynbosum L. в асептической культуре // Теоретическая и прпелад-нан карпология! Тез. докл. Всесоюз. конф.-Кишинев, l989.-C.62.

3. Сндорович Е.А., Чутас E.H., Черник В.Ф., Судейная C.B. Асептическое прорастание сепян Vaccinum carymbosum L. // Роль ботанических садов в охране н обогащении растительного пира: Тез. докл. научи. конф.-Киев, 1939, Т.1.-С.72-73.

4. Сндорович Е.А., кутас L.H. Клопальное микроразгшохение Vaccinluri vitis-.daea L. // Дскл. АН БССР.-1991, V 4.-C.362-3S4.

5. Сиьорович Е.А., <\утас E.H. Влияние условий освещения на прорастание селян и (золированных зародышей Vaccinlura vitl3-idaea L. в кулы г in vitro // Весцл АН БССР. Сер.б1ял.навук.-1991, » 1.-С.97-98.

о. Сндорович Е.А., Кутас E.H., Черник В.Ф., Судейная C.B. Влияние условий освещения на прорастание семян и изолированных зародышей Vacciniun corymboaura L. в культуре in vitro // Бюл.1л.ботан.сада.-1991.-Вып.159.-С.94-95.

7. Сндорович Е.А., Кутас E.H., Рубан H.H. Разработка технологии клональ-но.о гшкрораэмножения интродуцированных сортов гстубики высокой и брусники обь нооенной // Эколого-биологпческое изучение ягодных растений сем.Брусличные и с are освоения их промышленной культуры в СССР: Тез. докл. Межреспубликанского научн. семинара.-Ганиевмчи, 1991.-С.174-175.

S. кутас. E.H., Трухан Н.В., Морозов О.В. Семенное размножение гибридов брусники обыкновенной в культуре in vitro // Эколого-биологическое изучение ягодных растений сем.Брусничные н опыт освоения их промышленной культуры в СССР: Тез. докл. ^^республиканского научн. семинара,-Ганцевичи, 1991.-С.82-83.

9. Сндорович Е.А., Кутас E.H., Трухан Н.В. Рененерационная способность ^аэ*-ичных типов экеллантов у интродуцированных сортов Vaccinixsn corymbosum L. в культуре in vitro// Весц! АН Беларус!. Сер.б1ял.навук.-1993, 1С 1.-С.З-5.

10. Черник В.Ф., Кутас E.H. Регенерация растений из эксплантоа стерильных проростков у двух интродуцированных сортов Vaociniura corymbosum L. // Весц! АН Беларус!. Сер.б!ял.навук.-1^92, ff 3-4.-С.6-9.

11. Сндорович Е.А., Кутас E.H. Морфогенез Vaccinium vitis-jdaea L. в культуре m vitro // Becui АН Беларус1. Сер.б!ял.навук.-1993, К» 2.-С.38-42.

12. Сндорович Е.А., Кутас E.H., Трухан Н.В. Влияние стерилизующих соединений на выход жизнеспособных зкеплактов интродуцированных сортов Vaccinium corymbosum L., Vacciniun vitie-idaea L. в культуре in vitro // Becui AH Беларус!. Сер.б!ял.навук.-1994, If .-C.3-5.

13. Сндорович Е.А., Кутас E.H., Трухан Н.В. Регенерация побегов из эксп-лантов листа интродуцированных сортов Vaccinium coryrabosun L. о к/льтуре

in vitro // Генетическая инженерия и биотехнология Тез. докл. научи, конф. -Минск, 1994.-С.62. ' . •

14. Sidorovich S.A., Kutas E.N. Shoot regeneration from leaf explants of introduced Vacciniuti vitis-idaaa L. in vitro culture // Plant Biotechnology and Genetic Engineering. International Symposium.-Kiev, 1994.-P.34. • <-" 15, Сидорович E.A., Кутас E.H., Филипеня В.Л. Влияние осмотических ингибиторов на сохранение жизнеспособности ннтродуинрованных сортов Vacciniura coryniboBum L. и Vacciniun vitie-idae» L. в культуре in vitro // Докл. AH Беларусн.-1995.-Т.39, # 1.-C.63-«;

' 16. Сидорович К.A.Y Кутас E.H., Брель H.Г..Регенерация in vitro из листовых эксолантов брусники обыкновенной // Докл. АН Беларуси.-1996.-Т.40, If 1.-С.77-80.

17. Сидорович Е.А., Кутас 1_. 1. Влияние сезона отбора зксплаитсв на регенерацию Vacciniun vitis-idaea L. в культуре in vitro // Тез. докл. Второго съезда белорусского общества физиологов растений.-Минск) 1995.-С.35-36.

18. Сидорович Е.А., Кутас E.H. Влияние времени года на жизнеспособность »ксллантов Vacciniun coryntosum L. в культуре in vitro // Тез. докл. Второго съезда белорусского общества физиологов растений.-Минск, 1995.-C.3S-37.

19. Кутас E.H. Влияние интенсивности освещения на анатомическую структуру листа Vacciniura corymbosun L. в культуре in vitro // Тез. докл. Второго съезда белорусского общества физиологов растений.-Минск, 1995.-С.21-22.

20. Кутас E.H. Влияние интенсивности освещения на содержание пигментов в регенерантах Vaccinium corymbosumL. в культуре in vitro // Тез. Второг-о съезда белорусского общества физиологов растений.-Минск, 1995.-С.57-58.

21. Сидорович Е.А., Кутас E.H. Влияние зксплаита на регенерационный потенциал »продуцированных сортов Vaocinium oorymbosini L. и Vaccinium vitis-idaea L. в культуре in vitro // Биологическое разнообразие. Интродукция растен»й| Тез. докл. научн. хонф°.-Санкт-Петербург, 1S95.-С. 181-183.

22. A.c. 1824115 Россия, 5А01Н4/00. Способ размножения Vaccinium vitie-idaea L. in vitro /Б.А.Сидорович, E.H.Кутас (Россия).- If 4910564/13? Заявл. 12.02.91. Опубл. 30.06.93, Btoi. н.If 24.-С.14. -

23. Пат« 881 Беларусь,' А01Н4/00. Способ размножения Vaccirduro vitis- . idaea Ь. in vitro / Е.А.Сидорович, Е.Н.Кутос (Беларусь).-» 9>4910564j Заявл. 05.08.93. Ооубл. 15.12.95, Официальный «иммш» V 4 (ч.1).-С.68. .

24. Получено РЕШЕНИЕ государственной патентной зкспертизы (Беларусь)

от 30.05.96. о выдаче патента на изобретение "Способ клонального кикроразмко-жения Vacciniun оогуиЬоеит L. (Сидорович Е.А., Кутас Е.Н., Трухан Н.В. , 4и-липеня В.Л.) согласно заявке If 620 от 10.08.93.

25. Кутас E.H. Роль «тонального гшкрораэмна»ения в сохранении Скоразнооо-;лэия растений // Сохранение миологического разнообразия Белорусского |*оозерья| Tes. докл. научи. конф.-Влтебсх,

¿6. Скдорозич ...A. , Чутос E.H. члонапъное ми L:po размножение новых плодово-ягодных растений.-Кн.: Навука i тзхн!ка, 19Эо.-24о с.

Р Э 3 I) M Э Кутас Алена МгкалаеУна

Навуксвыя асновы кланальнага м1краразннах£ння расл!н на прыкг 13е 1нтра-дукаваных г«»тункяу буякоУ высок!х I брусн1ц звнчайных.

\лпчавыл совы: буякх высокая, Cpycuiju звычаПныя, inградукавалыя гатунк!, марфагенез, рленерацыя.

Абъект даследавання - 14 1нтрадукаваних гатункау буякоу bmcokIx 14-бруснт звычаГных.

Мэта даследавання - дацъ навукова-абгрунтаванае уяуленне аб кландиышм 1разкнахэнн1 лк складаным многафактарным }1з1яяаг1чным працэсе, сгагучаю-чым два npuHnw.OBa розныя этапы: In vitra i in vxva, гру:гтуючымся на адзшай тэарэтычнай иснове.

Метад-i даследавання - клас!чныя прыемы, агульнапрынятыя у культуры кле.л х ткл1<ак, колькасная 1 якасная светлавая м1красхап!я.

Упершьиш праведзена комплекс нае даслеяаванне кланальнага м1краразмнажзння 1нградукяваных 'атунка? буякоу высок1х 1 бруснш з вы чайных. Атрыманыя оын!к1 на 1няуцыруечаму марфагекэзу, рэгенерацы!, а таксана структурна-функцыяналь-наму прыстасавашш рьгенерантау, значна гашырыл! тзарэтычнае удаление ab кплнальным м1краразмнахэнн! як складаным многафактарным ф1з1ялвг1чным "рацэсв, кантралюямым генетычна.

Наказана прынцыпоаая магчыпасць рэгенерацы1 1нтрадукаваных гатункау буягоу bmcokix i 6русн1ц звычайных трыма метадам1: 1) праз актыаацыю пазушных перыстэп, 2) дыферэнцыяцьио пупыпак з калуснай культуры, 3) дыферэнцыяцыю пупы-шак у тканцы л1сця, м1ну»чы стада» утварэння калусу. На аснове вын!кау экспериментальных даследавання^ створены банк генатыпау, прадстаулены калекцыяй стэрыльных культур 14 1нтрадукаааных гатункау буякоу вьюокЬс 14- 6русн1ц звычайных. Раслрацавана тэхнапог1я кланальнага м!ксаразмнажзння гэтых культур, ото дазвол1ць настав1ць на промысле аснову атрыманне акалаг1чна чыстага насадачнап матэрыялу i задавол!ць попьгг у 1м рэспубл!к! Беларуси 1 другХх рэ-г1енау am. SuHiici даелндвпянкяу мавць грунтоунае 1 прикладное значэнне для f lavsxiurjrii, ф!з1ялог11 расл1н, лясноЯ I сельскай гаспадарк!.

РЕЗЮМЕ

Кутас Елена Николаевна

Научные основы клонального микроразмножения растений на примере интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной.

Ключевые слова: голубика высокая, брусника обыкновенная, интродуцирован-ные сорта, клопальное микроразмножение, морфогенез, регенерация.

Объект исследования - 14 интродуцированных сортов голубики высокой и 4 -брусники обыкновенной.

Цель исследования - дать научно-обоснованное представление о клональном микроразмножении как сложном многофакторном физиологическом процессе, состоящем из двух принципиально разных этапов: in vitro и in vivo, базирующемся на единой теоретической основе.

Методы исследования - классические приемы общепринятые в культуре клеток и тканей, количественная и качественная световая микроскопия.

Впервые проведено ¡гачплексное исследование клонального пикроразмнОкшил интродуцированных сортов голубики высоко" и брусники обыкновенной. Полученные результаты по индуцируемому морфогенезу, регенерации, а также структурно-функциональной адаптации регенерантоа, существенно расширили теоретическое пг оставление о клональном микроразмноженин как сложном многофакторном физиологическом процессе, контролируемом генетически. Показана принципиальная возможность регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной тремя методами: 1) через активацию пазушных меристем, 2) дифференциацию почек в каллусной культуре, 3) дифференциацию почек в ткани листа, минуя стадию образования каллуса. На основании результатов экспериментальных / исследований создан банк' генотипов, представленный коллекцией стерильных культур 14 интродуцированных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной. Разработана технология клонального микроразмножения этих культур, что позволит поставить на прошаленкую основу получение экологически чистого посадочного материала и удовлетворить спрос в нем республики Беларусь и других регионов СНГ. Результаты исследований имеют фундаментальное и прикладное значение для биотехнологии, физиологии растений, лесного и сельского хозяйства.

SUMMARY Kutas Elena Nitolaevna

Scientific foundations o£ clonal micropropagation of plants on the cxw^ls of Introduced species cf Vacciniua coryinbceun L. and Vaccinlun vitis-ioaea.

Key wardat Vacciniua corymbosum, Vacciniun vitis-idaea, introduced species, clonal micropropagation, morphogenesis, regeneration.

Object of in/estigationi 14 introduced species of Vaccinixm corjiabosua and 4 species of Vaccimum vitis-idaea.

Hve objective of the investigation in to provide scientifica justified view on th«i clonal micropropagation as a ccnplicatod multifactor physiological process consisting of tvo principally different stagesi in vitro and in vivo, grounded on a single theoretical basis.

Methods of investigation! classical procedures caution for cells and tissue! quatitative and qualitative light microscopy.

Canplcx investigation of clonal micropropagation of introduced species of accinium corymbosvm and Vacclniun vitis-idaea was conducted for the first tin«, "Ova results obtained on induced morphogenesis, regeneration aa well as structural-functional adaptation of rogenerants have considerably broadened theoretical view on clonal micropropagation as a complicated irultifactor physiological process that is genetically controlled. Principal possibility of regeneration of introduced species of Vacciniua oorymbosun and Vacciniun vitis-idaea using three methods is shewn: 1) via activation of axile meristtsn, 2) differentiation of kidneys in callus culture, 3) differentiation of kidneys in leaf tissue without the stage of callus formation.

Based on tba results of the experimental investigations a bank of genotypes has been created ccnpriaing a collection of sterile cultures of 14 introduced species of Vacciniun cazymbosua and 4 species of vacciniua vitis-idaea. A technology has been developed for the clonal nicropropagation of these species which allows to get ecologically ppre planting material on industrial basis and meet, the demands for it in the Republic of Belarus and other regions of CIS. Tbe results of the investigations are of fundamental and applied ineortance for biotechnology, plant physiology, fared try and agriculture.

Тираж

Типография Московской с.-х. академии им.К.А.Тимирязава 127550. Москва И-ббСГ, Тимирязевская ул., 44

Информация о работе

Кутас, Елена Николаевна
доктора биологических наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.12

Автореферат

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ НА ПРИМЕРЕ ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ СОРТОВ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ И БРУСНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы