Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Формирование и комплексное изучение коллекции клематисов (род Clematis L.): биотехнологические и молекулярно-генетические аспекты
ВАК РФ 03.00.05, Ботаника
Автореферат диссертации по теме "Формирование и комплексное изучение коллекции клематисов (род Clematis L.): биотехнологические и молекулярно-генетические аспекты"
На правах рукописи
Короткое Олег Игоревич
ФОРМИРОВАНИЕ И КОМПЛЕКСНОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ КЛЕМАТИСОВ (РОД CLEMATISh.)-. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
Специальность 03 00 05 - ботаника
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
003166040
Москва-2008
Работа выполнена в ГУ «Волгоградский региональный ботанический сад»
Научный руководитель - кандидат с -х наук О И Молканова
Официальные оппоненты
доктор биологических наук А С Демидов
кандидат биологических наук В. П Упелниек
Ведущая организация. ФГОУВПОРГАУ- МСХАимК А.Тимирязева
Защита диссертации состоится 10 апреля 2008 г в 13 часов на заседании Диссертационного
совета Д 002 028 01 в Главном ботаническом саду им Н. В Цицина Российской академии
наук в конференц-зале лабораторного корпуса
Адрес 127276, г Москва, ул Ботаническая, д 4, ГБСРАН
Факс 8(495)977-91-72
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Главного ботанического сада им Н В Цицина РАН
Автореферат разослан « 7 » марта 2008 г Ученый секретарь
диссертационного совета /ТАу, /О
доктор биологических наук Ю К Виноградова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Отечественная история селекции клематисов начинает свой отсчет с 1958 года Наша страна занимала ведущие позиции в мировой сечекции этой культуры Советскими селекционерами выведено более 360 сортов клематиса Последний сорт клематиса, выведенный в нашей стране, зарегистрирован в международном регистре в 1989 году После распада Советского Союза традиции отечественной школы селекции были утрачены
По данным инвентаризации коллекционных фондов российских ботанических садов от 20 до 30 % сортов, выведенных отечественными селекционерами, безвозвратно утеряно
В связи с возрастающим спросом на посадочный материал клематисов, отсутствием питомников по производству посадочного материала, становится актуальной проблема их массового размножения Ситуация, сложившаяся с некоторыми коллекциями в ботанических садах, делает особенно актуальной проблему сохранения генофонда декоративных растений отечественной селекции и, в частности, культуры клематиса Наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ, одним из наиболее эффективных методов сохранения является создание генетических банков т vitro Разработка эффективных методов микроклонального размножения является основой работ по сохранению генофонда клематисов, одним из перспективных направлений сохранения биоразнообразия растений
Использование молекулярно-генетических методов крайне актуально для решения проблем, связанных с контролем генетической стабильности хранящихся образцов при создании банков т vitro ДНК-маркеры обладают существенными преимуществами по сравнению с морфологическими маркерами они позволяют выявлять полиморфизм в любом участке генома, дают возможность вести анализ по неограниченному числу локусов
Цель и задачи исследования Цель исследований - создание наиболее репрезентативной национальной коллекции клематисов (род Clematis L), комплексное изучение биологических особенностей размножения и сохранение ex situ
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи
- создание крупнейшей на территории России коллекции клематисов,
- отработка технологии вегетативного размножения в условиях искусственного тумана,
- усовершенствование системы производства посадочного материала с использованием методов биотехнологии,
- создание генетического банка клематисов in vitro,
- изучение возможности молекулярно-генетической идепгификации сортов клематиса,
- расчет себестоимости посадочного материала игематисов, полученного методом клонапьного микроразмножения
Научная новизна. Впервые на территории России создана крупнейшая коллекция клематисов, содержащая около 290 видов и сортов отечественной и зарубежной селекции Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования т vitro различных сортовых групп клематиса, разработана универсальная технология клонального микроразмножения 110 сортов на основе прямой регенерации растений путем активации пазушных меристем Впервые для стерилизации использовался препарат "Лизоформин", что позволило сделать метод клонального микроразмножения экономически более эффективным Впервые в России создан банк ДНК клематисов, представленный 90 образцами Проведен RAPD-анализ 74 сортов и видов клематиса, который может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма, что крайне актуально для малоизученных таксономических групп, к которым относится род Clematis В дальнейшем метод может быть использован для проверки генетической стабильности образцов, хранящихся в банке т vitro, для исследования сомаклональной изменчивости, а также паспортизации коллекций клематисов
Практическая ценность работы и реализация результатов исследований. Разработана промышленная технология производства клематисов, сочетающая традиционные методы вегетативного размножения с биотехнологическими методами, что делает ее экономически более эффективной Технология внедрена 6 производство на базе тепличного хозяйства в г Волжский и отмечена золотой медалью «За научные инновации года» на Международной выставке «Цветы 2006»
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Н В Смольского (Минск 2005), на Международной конференции «Цветоводство без границ» (Харьков 2006), на Всероссийской конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия» (Волгоград 2006), на IV Международной конференции «Биологическое разнообразие Интродукция растений» (Санкт-Петербург 2007), на II Семинаре по реинтродукции растений (Волгоград 2007) Научные разработки экспонировались на различных выставках, в том числе на Международной выставке «Зеленая неделя» в Германии, где были отмечены почетным дипломом и серебряной медалью выставки, были отмечены золотой медалью Международной выставки «Цветы 2006», серебряной медалью Международной выставки «Цветы 2007», золотой медалью выставки «Дача, сад, огород 2007»
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы исследований,
экспериментальную часть, состоящую из 5 глав, заключение и выводы Работа изложена на 204 страницах, содержит 22 таблицы и 20 рисунков Список использованной литературы включает 197 источников из них 55 на иностранных языках Кроме того, имеется 4 приложения на 40 страницах
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектом исследований служила коллекция клематисов ГУ ВРБС, представленная 38 видами рода Clematis, 3 видами рода Atragene и 246 сортами отечественной и зарубежной селекции, принадлежащими к 14 сортовым группам по международной садовой классификации В экспериментах по отработке методов вегетативного размножения использовали 108 сортов и видов
Для введения в культуру in vitro использовалось 8 видов и 84 сорта коллекции ГУ ВРБС Изучение возможности идентификации сортов кпематиса, с использованием методов молекулярной биологии проводилось на 50 сортах, кроме этого дополнительно было отобрано 14 близкородственных сортов, имеющих в качестве родительских линий 5 сортов в различных комбинациях, а также 8 сортов группы Atragene
При отработке вегетативного размножения клематисов методом зеленого черенкования с использованием искусственного тумана была изучена зависимость укоренения черенков от сорта, величины листовой пластинки, массы черенка, степени одревеснения побегов
При оптимизации технологии клонального микроразмножения в качестве первичных эксплантов использовали конус нарастания (апекс) с листовыми примордиями и латеральные почки зеленых побегов На этапе введения в культуру отрабатывали различные приемы стерилизации В ходе эксперимента изучали зависимость жизнеспособности эксплантов от срока их изоляции и фазы развития маточного растения
Для культивирования регенерантов на стадии пролиферации использовали минеральную основу питательной среды MS (Murashige, Skoog, 1962) в сочетании с агаром и сахарозой В качестве регуляторов роста в питательную среду добавляли кинетин 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 мг/л, 6-Бензиламинопурин (БАП) 0,1-0,7, 1,0, 2,5, 5 мг/л, тидиазурон, зеатин, и комбинации этих препаратов с 3-индолилуксусной кислотой (ИУК)
На стадии укоренения в качестве фитогормонов использовали В-индолил - 3-масляную кислоту (ИМК), 3-индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрациях 0,1-1 мг/л, а также оба фитогормона в сочетании
Адаптация регенерантов проводилась с применением пищевой полиэтиленовой пленки, с постепенным ее перфорированием
RAPD -анализ генотипов. Растительную ДНК выделяли стандартными методами (Дрейлер, 1991), хранили при температуре -20°С.
Полимеразную цепную реакцию проводили в термоциклере «MJJA research USA» с RAPD-праймерами (ЗАО «Синтол», Москва). Реакционная смесь для ПЦР (25 мкл) содержала следующие компоненты: 1 е.а. Taq-ДНК-полимеразы («Силекс М», Москва); 2,5 мМ MgCb-Taq-буфера (поставляется вместе с ферментом); дезоксинуклеозидтрифосфаты (по 0,25 мМ каждого) («Силекс М»); RAPD-праймеры (по 30 пкмоль каждого праймера); 20 нг тотальной геномной ДНК.
Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2 % агарозном геле с ТВЕ-буфером (трисборат ЭДТА, х 0,5) с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл) при U = 6 В/см. Визуализацию проводили в УФ-свете и фотодокументировали цифровой фотокамерой. Учитывали только четко различимые ПЦР-фрагменты. Полиморфными считали фрагменты ДНК, присутствующие в спектре не всех сортов. Матрицы данных, полученные в результате анализа электрофоретических профилей продуктов RAPD-ПЦР, анализировали с помощью программы Тгеесоп.
Математическую обработку данных проводили стандартными методами (Доспехов, 1985) с использованием пакета программ Microsoft Office.
ФОРМИРОВАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ КЛЕМАТИСОВ ГУ ВРБС
В настоящее время коллекционный фонд ГУ ВРБС представлен 38 видами рода Clematis, 3 видами рода Atragene и 246 сортами отечественной и зарубежной селекции, принадлежащими к 14 сортовым группам по международной садовой классификации (рис. 1).
з%- 7%
□ 1 а 2 аз в 4 Q5 Q6 Ш 7 □ 8 0 3 £210 Ш11 D12 ВИЗ 014;
Рис 1. Структура коллекции клематисов ГУ ВРБС (по сортовым группам) Условные обозначения: l.Atragene. 2.Cirrhosa. 3.Flammula. 4.Forsteri. 5.Heracliefolia. 6.Integrifolia. 7.Montana. 8.Tangutica. 9.Texensis. lO.Viorna. ll.Vitalba. 12.Viticella. 13.Early Large-flowered. 14.Late Large-flowered.
В коллекции ботанического сада представлены сорта как отечественной, так и зарубежной селекции (рис. 2).
□ 1 02 03 В4 Е5 06 И 7 £38 И9 В10 011 012
Рис. 2. Структура коллекции клематисов ГУ ВРБС по принадлежности к селекционным центрам.
Условные обозначения: I. Швеция. 2.Великобритания. З.Япония. 4.Новая Зеландия. 5.Польша. 6.США. 7.СССР. 8.Германия. 9.Голландия. Ю.Канада. И.Франция. 12.Другие.
В сортовой структуре коллекции 31 % (74 сорта) занимают сорта, выведенные в Великобритании, 9 % (22 сорта) - сорта, выведенные в Польше, В % (18 сортов) - сорта, выведенные во Франции.
Представлены сорта селекционных центров Японии, Швеции, Голландии, США, Канады и др. По одному сорту из Аргентины, Дании и Южной Кореи.
Отечественная селекция представлена 69 культиварами, что составляет 30 % сортовой коллекции ГУ ВРБС и около 20 % от всех сортов, выведенных на территории бывшего СССР.
Продолжительность периода роста вегетативных побегов у разных мелкоцветковых групп клематиса неодинаковая. Обычно в последней декаде марта - первой декаде апреля начинают вегетировать клематисы групп Atragene Уюгпа, УШсеПа, на неделю позже —
Tangutica, Texensis, Montana, Integrifoha, еще позже Heracliefoha, Vitalba В Волгоградской области в течение июня—июля у многих видов клематиса обычно заканчивается рост побегов
Как и мелкоцветковые группы, сорта клематиса входящие в Раннюю и Позднюю крупноцветковые группы, различаются между собой по продолжительности периода роста вегетативных побегов В третьей декаде марта начинают вегетировать такие сорта как Victoria, Лесная Опера, Никитский Розовый, Asao и др Большинство же сортов и форм начинает вегетацию в течение первой декады апреля Позже других, в конце апреля, приступают к росту Ramona, Салют Победы, Paul Farges, Брызги Моря Большинство сортов и форм заканчивает рост побегов в течение июня, и только Ville de Lyon и Paul Farges заканчивают его к середине июля
Многие виды клематиса отличаются длительным цветением Средняя продолжительность цветения у разных видов в Волгоградской области длится от 2—2,5 недель до 3—4 месяцев Так, непродолжительно (2—4 недели) цветут клематисы группы Montana, Clematis recta L От 1 до 2 месяцев цветет большинство видов клематиса Clematis fusca Turcz, С vitalba L, С virgimana L , С flammula L, С viticella L, С integrifoha L Самым длительным периодом цветения, продолжающимся до 3—4 месяцев, отличаются С termflora DC, С orientalis L., С forsten Grnel Сорта и формы клематиса по срокам цветения в Волгоградской области разделены нами на следующие группы.
Клематисы поздневесеннего цветениЛ. К ним относится большинство сортов и форм, зацветающих в течение мая в 1-й декаде группа Atragene — 22 вида и сорта цветущие до 20 дней, во 2-й декаде сорта Moonlight, patens Manshuu Ki (Wada's Primrose), Asao, Guernsey Cream, Baltyk, Лесная Опера, в 3-й декаде —Bees Jubilee, Балерина, Mevrouw Le Coultre, Mrs. George Jackman, William Kennett, Josefina, Никитский Розовый и др
Клематисы раннелетнего цветения В 1-й декаде июня зацветают сорта Jackmannil Alba, Ernest Markham, Victoria, Олимпиада 80, Стасик, сорта группы Integnfolia и некоторые сорта группы Viticella; во 2-й декаде — остальные сорта группы Viticella, в 3-й декаде — Бирюзинка
Клематисы летнего цветения Позже других зацветают сорта- Брызги Моря группа Heracliefoha, С puchen Torr & A Gray группа Viorna — во 2-й декаде июля В 1-й декаде сентября С serratifolia Rehder группа Tangutica
В Волгоградской области общая продолжительность цветения сортов и форм клематиса составляет более 4 месяцев (с мая по сентябрь), а у видов — свыше 7 месяцев (с апреля по ноябрь), что имеет значение при использовании их в озеленении
Многие виды клематиса отличаются высокой зимостойкостью При соблюдении правильной агротехники они переносят морозы до -30 ,-40 °С Визуальная оценка зимостойкости клематисов в течение ряда лет показала, что в Волгоградской области они практически не повреждаются низкими температурами, за исключением клематисов группы Montana и С cirrhosa var balearica (Rich) Willk & Lange, у которых в годы с экстремальными зимними температурами повреждались побеги
Особенности вегетативного размножения клематисов в условиях искусственного
тумана
В ходе экспериментов по вегетативному размножению методом зеленого черенкования были получены следующие результаты 100 % укореняемость получена у 47 сортов, что составляет 44% от общего числа сортов, используемых в эксперименте, 28 сортов - от 80 до 100% У 16 сортов - от 60 до 80% От 40 до 60% - у 9 % и только 6 % сортов показали укореняемость менее 40%
Максимальной способностью к ризогенезу характеризовались сорта Ранней крупноцветковой и Поздней крупноцветковой групп У сортов Franziska Mane, Minister, Гибрид Орлова, Махровый, Ernest Markham, Huldm через 3 недели установлена 100% укореняемость Также через 3 недели начинал укореняться сорт Emiha Platter группы Viticella Через 4 недели все сорта Ранней крупноцветковой группы имели 100% укореняемость, в то время как сорта Поздней крупноцветковой группы достигали такого же показателя только через 5 недель
Нами были установлены значительные отличия между сортовыми группами и по другим показателям У групп Atragene, Tangutica и Vitalba, несмотря на более позднее укоренение, отмечено максимальное количество корней 36,58, 43,17 и 59,00 соответственно У групп Tangutica и Vitalba отмечена наибольшая суммарная длина корней - 632,4 и 719,9 мм соответственно, что говорит об их высоком ризогенном потенциале
В ходе исследований проведен эксперимент по выявлению зависимости средней длины корней от массы черенка (рис 3)
Установлено, что с увеличением массы черенка увеличивается способность к корнеобразованию, что обусловлено эндогенным содержанием питательных веществ Можно предположить, что функциональная зависимость f(x), где х - масса черенка, f(x) суммарная длина корней является линейной на некотором интервале, т е имеет вид f(x)=kx+b
В периоды увеличения температуры выше критической (30°С) темпы ризогенеза заметно снижались, хотя процент укоренения черенков и достигал максимального
Отрицательное влияние на процесс ризогенеза оказывало и снижение среднедневной температуры ниже 25°С.
Масса черенка, г.
Рис. 3. Зависимость средней длины корней черенка от его массы.
Показана возможность успешного черенкования клематисов в условиях Волгоградской области на протяжении всего вегетационного периода.
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КЛЕМАТИСОВ
В качестве первичных эксплантов использовали конус нарастания (апекс) с листовыми примордиями и латеральные почки вегетиругощих побегов. Установлено, что оптимальным стерилизующим веществом для введения в культуру in vitro эксплантов клематиса, является 1%-ный раствор лизоформина при экспозиции 5 мин. При его использовании выход жизнеспособных эксплантов был максимальным и составлял около 80 %.
Установлено, что оптимальными сроками изоляции эксплантов клематисов является период после прохождения растениями органического покоя и фазы начала активного роста (апрель, май). Вероятно, что поведение изолированных эксплантов находится в тесной корреляционной зависимости с сезонными ритмами изменения баланса ингибиторов и регуляторов роста, определяющих регенерационную способность тех или иных органов (рис. 4).
январь- апрель- июнь- июль август- август- ноябрь
февраль май сентябрь (до сентябрь декабрь
обрезки) (после обрезки)
Срок изоляции экспланта
Рис.4. Зависимость жизнеспособности эксплантов от срока их изоляции
Одной из проблем успешного культивирования растительных тканей многих видов растений является окисление продуктами вторичного метаболизма (Запрометов, Загоскина, 2004). На первом этапе культивирования клематисов, происходит ингибирование ростовых процессов экспланта токсическими веществами. В результате, активируются ферменты, окисляющие фенолы растений (различные фенолазы). Продукты окисления фенолов подавляют деление и рост клеток экспланта и могут привести к их гибели. Нами доказана эффективность добавления в питательную среду аскорбиновой кислоты в количестве 30-50 мг/л, в качестве антиоксиданта, для повышения жизнеспособности первичных эксплантов и улучшения дальнейшего развития растений-регенерантов.
Правильный выбор модели размножения, состава питательных сред и условий культивирования позволяет свести к минимуму риск появления сомаклональных вариантов. Основной метод, используемый при размножении представителей рода Clematis - активация развития пазушных меристем. Он считается наиболее надежным для сохранения генетической стабильности размножаемых форм (Высоцкий, 1999).
На этапе размножения отчетливо проявились видовые и сортовые особенности клематисов, что выражалось в различном количестве дополнительно заложенных почек и развивающихся из них в последствии побегов. В некоторой степени особенности культивирования разных видов и сортов отражают эндогенное содержание ростовых веществ, которое является генетически обусловленным (Бутенко, 1999; Долгих, 2005).
Генотипом определяются пределы изменчивости регенерационного потенциала, что согласуется с аналогичными исследованиями на других культурах (Долгих, 2005;
Литовкин, 2006) Коэффициент размножения основных садовых групп представлен в таблице 1
Таблица 1
Коэффициент размножения разных садовых групп клематисов
Группа Коэффициент размножения
max mm
Early Large-flowered Group 5,5±0,34 1,6±0,16
Integnfolia Group 3,1 ±0,28 1,6±0,22
Late Large-flowered Group 4,6±0,22 1,6±0,22
Texensis Group 2,0±0,26 1,9±0,18
Tangutica Group 3,0±0,21 1,3±0,21
Viorna Group 2,6±0,16 2,0±0,26
Vitalba Group 3,1±0,28 1,4±0,27
Viticella Group 4,9±0,23 1,0±0,00
Коэффициент размножения изученных генотипов варьировал от 1,0 до 5,5 Его колебания в зависимости от генотипических особенностей были существенны и отличались более чем в 5 раз Наибольшей способностью к регенерации характеризовались представители L L Group, Е L Group, Viticella и Montana
На коэффициент размножения оказывали влияние не только генетические особенности Для поддержания устойчиво пролифелирующей культуры in vitro весьма существенным является правильный подбор и оптимальные соотношения регуляторов роста (цитокининов и ауксинов) В процессе исследования было выявлены наиболее оптимальные концентрации экзогенных гормонов на стадии размножения (табл 2)
Таблица 2
Влияние концентрации БАП и ИУК на коэффициент размножения сорта 'Multi Blue'
Концентрация БАП (мг/л) Концентрация ИУК (мг/л)
0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,0
0 1,0±0,00 1,0±0,00 1,0±0,00 1,0±0,00 1,0±0,00 1,0±0,00 1,0±0,00
0,1 1,2±0,13 1,2±0,20 2,2±0,29 1,2±0,13 1,0±0,00 1,0±0,00 1,0±0,00
0,5 4,2±0,20 4,2±0,29 2,8±0,25 3,4±0,27 3,2±0,25 4,0±0,21 2,0±0,26
1,0 5,4±0,22 5,6±0,40 5,4±0,22 4,8±0,29 4,2±0,20 4,2±0,13 1,4±0,27
2,5 6,3±0,21 7,0±0,21 6,5±0,31 5,2±0,33 6,6±0,22 3,6±0,27 3,4±0,27
5,0 4,4±0,16 4,0±0,21 4,0±0,21 5,0±0,13 4,8±0,29 4,4±0,16 4,2±0,29
Для многих видов растений было установлено увеличение регенерационного потенциала при культивировании на средах, сочетающих ауксины и цитокинины (Дмитриева, 1981; Тао ег а1., 1998; Высоцкий, Упадышев, 1992). Но в настоящем исследовании совместное использование БАП с ИУК в большинстве случаев не оказывало положительного влияния на коэффициент размножения по сравнению с одним БАП. Максимальный коэффициент размножения был на среде, содержащей БАП в концентрации 2,5 мг/л. Увеличение концентрации с 1 до 2,5 мг/л для большинства сортов приводило к увеличению коэффициента всего на 10-20% и к образованию витрифицированных побегов, которые впоследствии характеризовались пониженной способностью к укоренению. Дальнейшее увеличение концентрации БАП до 5 мг/л приводило к 100% витрификации регенерантов и снижению коэффициента размножения. Таким образом, оптимальная концентрация БАП на этапе микроразмножения с учетом совокупности данных по относительному приросту регенерантов и каллусогенезу составляет 1мг/л.
Концентрация БАП, мг(п
| » относительный прирострастений-регенерантов относительный прирост каллуса
Рис. 5. Зависимость процесса каллусогенеза и прироста растений-регенерантов от концентрации БАП
Сорта групп Р1атти1а, Бо^ел, НегасЫйНа требуют более тщательного подбора гормонального состава питательных сред, так как использование БАП недостаточно эффективно.
Учет комплекса факторов, влияющих на реализацию органогенного потенциала, позволяет наиболее полно использовать биологические возможности растений и получать регенеранты в максимальных количествах. У большинства исследуемых сортов было
обнаружено существенное положительное влияние увеличения температуры культивирования на регенерационную способность эксплантов (табл 2)
Таблица 2
Коэффициент размножения разных сортов Clematis в зависимости от температуры
культивирования
Сорт Коэффициент размножения
t24uC 116-20 "C
Jackmann Alba 3,0±0,21 2,3±0,15
Purpurea Plena Elegans 3,5±0,26 4,9±0,23
Jan Pawel II 2,8±0,29 1,9±0,18
Hakuookan 3,6±0,27 2,6±0,16
Multi Blue 6,1±0,21 3,6±0,27
Mevrouw Le Coultre 2,9±0,10 1,6±0,22
Akaishi 3,4±0,27 2,9±0,31
Princess Diana 2,9±0,31 1,9±0,10
Franziska Mane 2,5±0,22 1,9±0,18
Asao 2,2±0,29 2,9±0,31
Duchess of Edinburgh 2,5±0,22 2,4±0,16
Замечено, что темпы развития эксплантов клематисов существенно менялись в процессе культивирования На этапе введения в стерильную культуру и в первых субкультивированиях коэффициент размножения был ниже, чем в последующих пассажах
Необходимо также отметить, что при этом увеличение длительности пассажей позволило повысить качество получаемых растений Наибольшее количество хорошо развитых микропобегов было получено при длительности пассажа 45 дней, коэффициент размножения при этом варьировал от 3,9 до 5,0, при длительности пассажа 25 дней, коэффициент размножения изменялся от 2,8 до 3,6 При этом получали большое количество недоразвитых микропобегов
Результаты экспериментов по подбору сред на этапе укоренения показывают значительные отличия скорости укоренения в зависимости, как от генетических особенностей видов и сортов, так и концентрации ауксинов, применяемых для индукции ризогенеза.
Наиболее эффективными индукторами ризогенеза для представителей рода Clematis оказались ИУК и ИМК. При укоренении микрочеренков лучшие результаты были получены на питательной среде, содержащей Уг солей MS при концентрациях ИУК и ИМК 0,5 мг/л.
Повышению выхода укорененных микропобегов способствовало комбинированное использование ИУК и ИМК, которое увеличивало процент укоренения, а также число и длину образуемых корней по сравнению с их раздельным применением, что может быть объяснено эффектом синергизма.
Так процессы корнеобразования наблюдаются у сортов, относящихся к раннецветущей группе уже через 3 недели с начала культивирования. Сорта, относящиеся к группам Montana, Tangutica характеризуются высокой укореняемостью. Промежуточное положение занимает группа Vitalba и Viticella. Позже всех укоренялись сорта, относящиеся к группе Texensis. У сортов групп Flarnmula и Forsteri при использовании тех же концентраций ауксинов образования корней не наблюдалось.
Изучение динамики ризогенеза при использовании различных концентраций фитогормонов на примере сорта Балерина (рис. 6), показывает, что максимальной скоростью укоренения характеризуются регенеранты на средах с содержанием 1/2 солей MS. Процесс образования корней начинается через 3 недели культивирования. Через 4 недели начинается укоренение на средах с добавлением ИМК в концентрациях 0,2; 0,5 мг/л, еще позже - с добавлением ИУК.
so
^ 70 Ö4
ig 6°
0
1 50 к
| "О °
>, 30 ! 20 10 О
/ ✓ У
/' !! /У ' Г / /t
у / // //' /
ч// /у
/ S / ■ **/ У у/ W^t
У / /
три четыре пять шесть семь восемь девять десять одинадцать
Продолжительность культивирования, нед.
I. .....
Рис. ауксинов
-0,2 ИУК ■ 0,5 ИУК 1/2 MS - 2,0 ИМК
—t—0,5 ИУК —*—0,2 ИМК — »— 0,5 ИМК1/2 MS
-1,0 ИУК -0,5 ИМК -ИУК+ИМК
Ж 2,0 ИУК —* -1,0 ИМК
6. Динамика укоренения сорта Балерина при использовании различных концентраций
Наиболее ответственным моментом при клональном микроразмножении клематисов является перевод растений из асептической культуры в нестерильные условия, т е высадка регенерантов на почвенный субстрат Адаптацию проводили с применением пищевой полиэтиленовой пленки, с постепенным ее перфорированием, что позволило снижать влажность до 60-70% Выход адаптированных растений при этом составил 80 - 90% Затем растения переносили в теплицу
Разработка технологии клонального микроразмножения клематисов в основном завершена, однако дополнительные исследования продолжаются и будут вестись в направлении оптимизации этапов микроразмножения и укоренения, в отношении генотипов, вновь вводимых в культуру т vitro
В результате исследований было установлено, что реализация органогенного потенциала у представителей рода Clematis определяется генетическими особенностями исходных растений, типом экспланта, его физиологическим состоянием, составом питательных сред и условиями культивирования
Создан крупнейший в мире банк стерильных культур (более 110 генотипов) представителей рода Clematis В настоящее время создание таких банков является одним из перспективных направлений сохранения биоразнообразия растений
ДНК ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОЛЛЕКЦИИ КЛЕМАТИСОВ ГУ ВРБС
Так как клематис относится к генетически малоизученным объектам, первым шагом по его маркированию был выбран относительно простой в исполнении RAPD-анализ
Для RAPD-анализа сортов клематиса проводилась оптимизация методик выделения ДНК и условий амплификации
Необходимо отметить, что количество выделяемой ДНК зависело от фенофазы растения, с которого брался материал Наиболее благоприятным периодом было пробуждение почек и начало роста побегов, в этот момент концентрация выделяемой ДНК в среднем составляла 150 нг/мкл, а в отдельных случаях - 350 нг/мкл В ходе работы были выделены образцы ДНК 17 видов и 73 сортов
Следующим этапом работы являлся подбор праймеров, выявляющих полиморфизм. Для этого был проведен RAPD-анализ трех образцов ДНК с использованием 40 праймеров из серий OPA OPD ОРК OPN OPS и АК
При этом 9 из них оказались неактивными, 14 инициировали синтез одного - двух фрагментов или слабых по интенсивности продуктов, остальные давали четкие специфичные фрагменты Полученные результаты позволили определить набор праймеров, подходящих для RAPD- анализа клематисов
Для каждого из анализируемых сортов клематисов были получены индивидуальные спектры и выявлены специфичные для некоторых групп ЯАРВ фрагменты (рис. 7).
Ш
Ф
** "* ' - : • -в ,. fe- „■■
М I I 3 4 5 6 7 5 9 19X1 12 13 14 15 1« 17 18 15 30 21 22 23 24 23 2S 27 28 25 3D М
Рис. 7. RAPD спектры, полученнывпри использовании праймера OPD 3 Условные обозначения: 1. Atragene sibirica (L.) Mill 2. Сеянец №7 3. Сеянец №9 4. Jan Lindmark 5. Markham's Pink 6. Red Beetroot Beauty 7. Cecile 8. Blue Bird 9. Clematis cirrhosa var balearica (Rich.) Willk. & Lange 10. Clematis mandshurica Rupr. 11. Clematis recta L. 12. Clematis terniflora DC. 13. Clematis forsteri Gmel. 14. Pixie 15. Clematis integrifolia L. 16. Arabella 17. Hakurei 18. Аленушка 19. Zoin (Inspiration) 20. Clematis montana Buch.-Ham. ex. DC. 21. Брызги моря 22. Clematis florida Thunb. var. sieboldiana Morren 23. Clematis tangutica (Maxim.) Rorsh. 24. Clematis orientalis L. 25. Clematis serratifolia Rehder 26. My Angel 27. Lambton Park 28. Princess Diana 29. Gravetye Beauty 30. Clematispitcheri Torr. & A. Gray
Можно заметить, что сорта группы Integrifolia: Clematis integrifolia L., Arabella, Hakurei, Аленушка и Zoin (Inspiration) имеют специфичный фрагмент длиной 541 пн. Сорта группы Atragene: Atragene sibirica (L.) Mill, сеянец X°7, сеянец №9, Jan Lindmark, Markham's Pink, Red Beetroot Beauty, Cecile, Blue Bird фрагмент длиной 352 пн. Данные фрагменты после выделения, клонирования и секвенирования можно использовать для создания более надежных для сортовой идентификации SCAR маркеров. Установлено наличие специфичных фрагментов также для групп Viticella n Vitalba. Однако в группе Viticella у сорта Purpurea Plena Elegans данный фрагмент отсутствовал, что обусловлено либо сложным
таксономическим положением данного сорта (в литературных источниках имеются противоречивые данные о его происхождении), либо возможной ошибкой при отборе образцов.
В результате анализа полученных НАРР спектров только на трех праймерах: ОРБ 3, ОРО 4, ОРЭ 5 было выявлено 146 фрагментов, из которых 145 были полиморфными и использовались для дальнейшей работы. Уровень полиморфизма для разных сортовых групп варьировал от 67 % у группы АШ^епе до 94 % у группы Тш^ийса. Был проведен визуальный анализ ИАРЭ спектров на наличие - отсутствие компонентов, и получена матрица исходных данных, в которой присутствие компонента обозначалось 1, а его отсутствие 0.
На основе этой матрицы с использованием коэффициента Нея были рассчитаны генетические расстояния между различными образцами и построена матрица генетических расстояний (пакет программ ТЯЕЕССЖ). По ней был проведен иерархический кластерный анализ (иРвМА) и построена дендрограмма (рис. 8).
88 1_
-
87
Li'1
-C'lemaris tangutica (Maxim.) Rorsh.D
--Lambton FarkD
-Clematis serratifolla RehderO
-MyAngelD
-Clematis' orientalis L.D
-Clematis montana Buch.-Ham. ex. DC'.D
-PtxieD
-Clematis recta L.D
-Clematis terniflora DC.0
-Clematis clrrhosa var balearica (Rich.) Wtllk. & LangeD
-Markliam's PlnkD
-C'ecileD
-Red Beetroot Beauty□
-Atragene sibirica (L.) MillD
-Jan LindmarkD
„ЛI— Blue BirdD 98 [
64 г- Сеянец №70 L- Сеянец №9 □
-Clematis florfda Thunb. var. sieboldiana MorrenO
—-Princess Diana □
Clematis pitcher! Torr. & A. GrayO Gravetve BeautyO Arabella □
Clematis lutegrifolla L.D HakureiD AieH>TiiKaD Zoln (Inspiration) D Clematis mandshurica Rupr.D
Рис. 8. Дендрограмма генетического сходства представителей рода Clematis
Анализ полученной дендрограммы показывает четкую кластеризацию сортов, использованных в работе, в соответствии с их принадлежностью к сортовым группам Кроме того, внутри кластеров сорта группировались в соответствии с генетическим сходством, что наглядно видно из кластеризации группы Ай^епе
Экономические аспекты использования метода клонального микроразмножения клематисов и расчет себестоимости посадочного материала. В данной работе рассчитана рентабельность производства посадочного материала методом клонального микроразмножения Для этого были произведены расчеты возможной прибыли и затрат (на примере лаборатории биотехнологии ГУ ВРБС)
При расчете прибыли учитывался уровень мировых цен на аналогичную продукцию, максимальный объем производимой продукции для данной площади
При расчете затрат учитывали стоимость материальных затрат, фонд оплаты труда и начисления на заработную плату, стоимость коммунальных платежей, стоимость амортизационных отчислений на оборудование
Таблица 3
Стоимость затрат при производстве посадочного материала
Стоимость материальных затрат 186701,76 руб
Фонд оплаты труда с начислениями 416233,52 руб
Прочие затраты 81938,8 руб
Амортизационные отчисления 35612,9 руб
Итого 720486,98 руб
Общая сумма всех затрат за год составляет 720486,98 рублей Ежегодно лабораторией производится 60480 растений Таким образом, себестоимость 1 растения равна 11,91 рублям Рентабельным будет считаться производство при цене реализации выше себестоимости Учитывая сложившиеся цены на посадочный материал клематисов - стоимость укорененных черенков от 1 до 1,5$, можно сделать вывод, что производство посадочного материала декоративных растений на базе аналогичных лабораторий не только рентабельно, но и позволяет заниматься научными исследованиями на принципах самоокупаемости
Возможно снижение затрат на расходные материалы путем замены на более дешевые без потери качества Увеличение выхода продукции может быть осуществлено за счет повышения квалификации обслуживающего персонала Большой экономический эффект дает также прием хранения коллекции т vitro в условиях минимального роста
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Создание крупнейшей на территории бывшего СССР коллекции клематисов - 290 видов и сортов делает очень актуальной проблему ее эффективного использования Формирование и поддержание крупных сортовых коллекций, а также родовых комплексов вполне традиционно для ботанических садов Однако не всегда такие коллекции динамично востребованы в научном процессе В то же время, крупные сортовые коллекции являются бесценным генофондом, который нередко из-за отсутствия четкой программы по их использованию, просто утрачивается В ГУ ВРБС разработана и реализуется программа по комплексному изучению культуры клематисов с использованием как традиционных, так и современных методов Программа включает первичное сортоизучение, семенное и вегетативное размножение, определение относительной устойчивости клематисов к болезням и различным абиотическим факторам, разработку эффективных технологий клонального микроразмножения, изучение возможности длительного депонирования в культуре in vitro с целью создания генетического банка культуры ткани В результате проведенных исследований отработан метод выделения высокоочищенной геномной ДНК из листьев Clematis, подобраны эффективные праймеры и оптимизированы условия проведения ПЦР, адаптирован метод RAPD-анализа На основе результатов молекулярного генотипирования будет продолжена работа по созданию генетических паспортов данной культуры Изучение ДНК клематисов методами молекулярной биологии позволяет не только провести паспортизацию сортовых коллекций, контролировать генетическую стабильность образцов, использовать методы в целях геносистематики рода, но и глубже изучить структурные особенности генома и внести существенный вклад в направленную селекционную работу с клематисами
выводы
1 Впервые на территории России создана крупнейшая коллекция клематисов, содержащая 38 видов рода Clematis, 3 вида рода Atragene и 246 сортов отечественной и зарубежной селекции, показана возможность использования данной культуры в озеленении в условиях Волгоградской области
2 Разработана технология клонального микроразмножения на основе прямой регенерации растений путем активации пазушных меристем и создан крупнейший в мире генетический банк клематисов in vitro, содержащий 110 генотипов
3 Для введения в культуру т vitro клематисов оптимальным стерилизующим соединением следует считать 1%-ный раствор лизоформина при экспозиции 5 мин Оптимальными сроками для изоляции эксплантов является начальная стадия вегетации
4 Установлено, что оптимальной питательной средой на этапе микроразмножения является среда с добавлением БАП в концентрации 1,0-2,5 мг/л, на этапе укоренения - с добавлением ИУК и ИМК в концентрации 0,2-0,6 мг/л
5 Выявлено, что для уменьшения действия продуктов окисления фенолов в состав питательной среды в качестве антиоксиданта целесообразно добавлять аскорбиновую кислоту в концентрациях 30-50 мг/л, которая повышает жизнеспособность первичных эксплантов и улучшает рост растений-регенерантов
6 Разработана промышленная технология производства клематисов, сочетающая традиционные методы вегетативного размножения с биотехнологаческими и, позволяющая получать легко адаптируемый экологически чистый посадочный материал на 1,5-2 месяца раньше и в 2-3 раза дешевле, чем при обычной технологии
7 Проведенный RAPD-анализ 74 сортов и видов клематиса может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма Метод может быть также успешно использован для проверки генетической стабильности образцов, хранящихся в банке т vitro и паспортизации коллекций клематисов
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Коротков О И, Комарова И А Особенности укоренения сортовых групп клематисов в зависимости от их происхождения // Материалы IX Региональной конф молодых исследователей Волгоградской области (9-12 ноября 2004 г) Волгоград, 2004 С 27-28
2 Клинкова Г Ю, Коротков О И Деятельность Волгоградского регионального ботанического сада по сохранению и обогащению биоразнообразия декоративных растений // Материалы Междунар конф , посвященной 60-летию Главного Ботанического Сада им Н В Цицина «Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов» (5-7июля 2005 г) Москва, 2005 С 221-224
3 Коротков О И, Короткова О О , Миронова О Ю. Клематисы в культуре т vitro П Материалы Междунар науч конф Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия (19-23 сентября 2005 г) Вологда, 2005 С. 15
4 Клинкова Г Ю , Коротков О И, Лазарев С Е, Малаева Е В , Утц Ю Б Деятельность Волгоградского регионального ботанического сада по сохранению и обогащению биоразнообразия // Материалы Междунар научн конф посвященной 100-летию со дня рождения акад НВ Смольского «Современные направления деятельности ботанических садов и держателей ботанических коллекций по сохранению биологического разнообразия растительного мира» (27-29 сентября 2005 г) Минск, 2005 С 210-213
5 Коротков ОИ, Утц ЮБ, Миронова ОЮ Сохранение и воспроизводство в культуре т vitro редких видов растений, занесенных в Красную книгу // Материалы межрегиональной научно-практической конф «Мониторинг редких видов - важнейший элемент государственной системы экологическою мониторинга и охраны биоразнообразия», (6-7декабря2005г) Волгоград,2005 С 76-80
6 Коротков О И, Клинкова Г Ю Ломонос цельнолистный (Clematis integrifoha L ), Ломонос чинолистный (Clematis lathyrifolia Bess ex Reichenb ), Ломонос восточный (Clematis orientalis L), Ломонос прямой (Clematis recta LJ // Красная книга Волгоградской области Т 2 Растения и грибы, Волгоград 2006 С 177-180
7 Коротков О И Актуальность создания генетического банка клематисов в культуре in vitro /I Материалы Всероссийской научно-практической конф «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (24-25 августа 2006 г) Волгоград, 2006 С 45-47
8 Korotkov О, Korotkova О, Utz J Clematis in Volgograd // Clematis International London, 2006 P 96
9 Коротков О,И, Короткова О О , Утц Ю Б Формирование и изучение крупнейшей в России коллекции клематисов ГУ «Волгоградский региональный ботанический сад» //
Материалы V Междунар науч конф «Цветоводство без границ». (15-19 июля 2006 г) Харьков, 2006 С 46-48
10 Коротков О И Создание генетического банка клематисов в культуре in vitro II Теоретические и прикладные аспекты интродукции растений как перспективного направления развития науки и народного хозяйства Материалы междунар науч конф, посвященной 75-летию со дня образования Центрального ботанического сада HAH Беларуси (12-15 июня 2007) Минск, 2007 С 42-44
11 Молканова О И, Коротков О И Сохранение коллекций редких и ценных видов растений в генетических банках т vitro И Теоретические и прикладные аспекты интродукции растений как перспективного направления развития науки и народного хозяйства Материалы Междунар науч конф, посвященной 75-летию со дня образования Центрального ботанического сада HAH Беларуси (12-15 июня 2007) Минск, 2007 С 62-64
12 Мамаева Н А, Коротков О И, Молканова О И Возможность сохранения коллекций редких и ценных растений в генетических банках in vitro II Вестн КрасГАУ 2008 №2 С 27-34.
13 Коротков О И Актуальность создания в России национальной коллекции клематисов и сохранение ее в культуре ex situ // Бюллетень ГБС 2008 Вып 195 (в печати)
Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25 09 2000 г Подписано в печать 11.03.08 Тираж 100 экз Усл. п.л. 1,31 Печать авторефератов (495) 730-47-74,778-45-60
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коротков, Олег Игоревич
Список использованных сокращений.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Характеристика объекта.
1.1.1. Ботаническая классификация.
1.1.2. История интродукции клематисов.
1.1.3. Отечественная история интродукции и селекции клематисов.
1.1.4. Международная садоводческая классификация.
1.2. В егетативное размножение.
1.3. Клональное микроразмножение: достоинства, этапы, необходимые условия.
1.3.1. Факторы, влияющие на микроразмножение растений.
1.3.2. Трудности, возникающие при клональном микроразмножении растений.
1.3.3. Особенности культивирования клематисов в условиях in vitro.
1.4. Промышленное производство клематисов.
1.5. Методы, выявления полиморфизма ДНК.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
ГЛАВА 3. ФОРМИРОВАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ КЛЕМАТИСОВ
ГУ ВРБС.
3.1. Структура коллекции.
3.2. Первичное сортоизучение коллекции.
ГЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ ВЕГЕТАТИВНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КЛЕМАТИСОВ В УСЛОВИЯХ ИСКУССТВЕННОГО ТУМАНА.
4.1. Зависимость укоренения от сроков черенкования и температуры.
4.2. Зависимость укоренения-от принадлежности к сортовым группам.
4.3. Зависимость,укоренения от других факторов.
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО
РАЗМНОЖЕНИЯ КЛЕМАТИСОВ.
5.1. Изолирование и стерилизация первичных эксплантов;.835.2. Оптимизация состава питательных сред и.условий культивирования» на этапе размножения.
5.2.1. Подбор оптимальных концентраций фитогормонов.
5.2.2. Изучение влияния генотипа на коэффициент размножения.
5.2.3 Изучение влияния экзогенных факторов на коэффициент размножения.
5.3. Укоренение in vitro и адаптация регенерантов клематисов к условиям in vivo
5.3.1. Укоренение регенерантов клематисов in vitro.
5.3.2. Адаптация укорененных микропобегов.
ГЛАВА 6. ДНК ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОЛЛЕКЦИИ КЛЕМАТИСОВ
ГУВРБС.
ГЛАВА 7. ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ КЛЕМАТИСОВ И РАСЧЕТ СЕБЕСТОИМОСТИ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА.*.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Формирование и комплексное изучение коллекции клематисов (род Clematis L.): биотехнологические и молекулярно-генетические аспекты"
Актуальность проблемы. Селекционная работа с клематисами в бывшем СССР впервые начата в 1958 г. в Государственном Никитском ботаническом саду Александром Николаевичем Волосенко-Валенис (Бескаравайная, 1998). В
1985 г. коллекция, насчитывала 58 видов, 35 сортов иностранной селекции, свыше 100 новых сортов и гибридных форм селекции сада (Бескаравайная, Донюшкина, 1989). С 1979 г. работой по получению зимостойких и устойчивых к фитопатогенам сортов клематиса начал заниматься эстонский селекционер У.Я. Кивистик и его супруга А. Кивистик. Результатом их труда: стало появление более 150 сортов. В общей сложности в бывших республиках СССР было выведено более 360 сортов клематиса, что позволяло нашей стране занимать ведущие позиции в мировой селекции этой культуры. Только японские селекционеры вывели большее количество сортов - 630. На счету французской школы селекции 221 сорт, Швеции - 143, Голландии - 105, Великобритании - 97. Однако, после распада Советского Союза традиции отечественной школы селекции были утрачены. Последний сорт клематисов отечественной селекции зарегистрирован в международном регистре в 1989 г.
Кроме того, в течение последних лет были частично или полностью утрачены коллекции клематисов в различных ботанических садах на территории стран СНГ. Так, в Киевском ботаническом саду полностью утрачена уникальная коллекция, включающая 40 сортов селекции М. И. Орлова, в Ботаническом саду БИНа отсутствуют 16 сортов, зарегистрированных Международным обществом клематисоводов, селекции В. М. Рейнвальда. Коллекция сортов, выведенных селекционером любителем М.Ф. Шароновой (37 сортов), сохранена не полностью, некоторые сорта еще встречаются в ботанических садах и частных коллекциях, но требуют дополнительной идентификации. Никитский ботанический сад, к большому сожалению, также не смог сохранить, некогда крупнейшую коллекцию видов, сортов и гибридных форм в полном объеме. По; данным инвентаризации коллекционных фондов Российских ботанических садов, от 20 до 30 % сортов, выведенных отечественными селекционерами, утрачены безвозвратно.
Культура клематисов приобретает все большую популярность в мире. Традиционное вегетативное размножение (черенкование, отводки и др.) позволяет получить ограниченное количество посадочного материала, что препятствует распространению этой культуры. В России отсутствуют крупные хозяйства по производству посадочного материала клематисов. В то же время в странах Европы, США, Японии, в некоторых питомниках производят до 1 млн. саженцев клематисов в год, находящих своего потребителя и в нашей стране. Преодолеть подобные;трудностивозможно^ с применением метода клонального микроразмножения. О чем говорит наличие крупных биотехнологических фирм в таких странах как Индия, Канада, Италия, Голландия и др., производящих,, в том числе посадочный материал клематисов. Одним из направлений' биотехнологии растений является разработка ш внедрение: технологий клонального микроразмножения в производство-получение в условиях in vitro, неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растению. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
1) получение генетически однородного материала;
2) освобождение растений от вирусов, грибковых и бактериальных инфекций;
3) высокий коэффициент размножения (105-107 ед. - для травянистых, цветочных растении, Ю4-105 ед. - для кустарниковых, древесных);
4) сокращение продолжительности селекционного процесса;
5) ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
6) размножение медленно растущих и плохо размножаемых традиционными способами видов и сортов;
7) возможность проведения работ в течение всего года и экономия площадей, необходимых для выращивания маточного посадочного материала.
Технологии клонального микроразмножения представляют исключительную ценность для поддержания и сохранения коллекций клематисов ботанических садов, сохранения генофонда растений, особенно в тех случаях, когда вид или сорт представлен ограниченным числом экземпляров или находится под угрозой исчезновения.
Ситуация, сложившаяся с некоторыми коллекциями в ботанических садах, делает особенно актуальной проблему сохранения генофонда декоративных растений отечественной селекции и, в частности, культуры клематиса. Одним из наиболее эффективных методов сохранения является создание генетических банков in vitro. Хотя этот метод считается более дорогостоящим из-за необходимых капитальных затрат на строительство г лабораторий, тем не менее расчеты экономической эффективности содержания коллекций различных садовых культур in vitro показывают его неоспоримые преимущества. В связи с возрастающим спросом в России на посадочный материал клематисов, развитием озеленения, отсутствием питомников по производству посадочного материала, утратой коллекций, становится актуальной проблема их массового размножения.
Разработка эффективных методов микроклонального размножения является основой работ по сохранению генофонда клематисов, одним из перспективных направлений сохранения биоразнообразия.
Создание банков in vitro делает особо актуальной проблему сохранения генетической стабильности хранящихся образцов. Открытие методов, позволяющих выявить различия между объектами непосредственно в генетическом материале, дало большой скачок в картировании геномов растений. ДНК-маркеры обладают существенными преимуществами по сравнению с морфологическими маркерами: они позволяют выявлять полиморфизм в любом участке генома, дают возможность вести анализ по неограниченному числу локусов. (Малышев, Картель, 1997; Saliba-Colombani et al., 2000).
Цель и задачи исследования. Цель исследований - создание наиболее репрезентативной национальной коллекции клематисов (род Clematis L.), комплексное изучение биологических особенностей размножения и сохранение ex situ.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
- создание крупнейшей на территории России коллекции клематисов; отработка технологии вегетативного размножения в условиях искусственного тумана;
- усовершенствование системы производства посадочного материала с использованием методов биотехнологии;
- создание генетического банка клематисов in vitro',
- изучение возможности молекулярно-генетической идентификации сортов клематиса;
- расчет себестоимости посадочного' материала клематисов, полученного методом клонального микроразмножения.
Научная новизна. Впервые на территории России создана крупнейшая коллекция клематисов, содержащая около 290 видов и сортов отечественной и зарубежной селекции. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro различных сортовых групп клематиса; разработана универсальная технология клонального микроразмножения 110 сортов на основе прямой регенерации растений путем активации пазушных меристем. Впервые для стерилизации использовался препарат "Лизоформин", что позволило сделать метод клонального микроразмножения экономически более эффективным.
Впервые в России создан банк ДНК клематисов, представленный 90 образцами.
Проведен RAPD-анализ 74 видов и сортов клематиса, который может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма, что крайне актуально для малоизученных таксономических групп, к которым относится род Clematis. В дальнейшем метод может быть использован для проверки генетической стабильности образцов, хранящихся в банке in vitro, для исследования сомаклональной изменчивости, а также паспортизации коллекций клематисов.
Практическая ценность работы и реализация результатов исследований. Разработана промышленная технология производства клематисов, сочетающая традиционные методы вегетативного размножения с биотехнологическими методами, что делает ее экономически' более эффективной. Технология внедрена в производство на базе тепличного хозяйства в г. Волжский и отмечена золотой медалью «За научные/инновации года» на Международной выставке «Цветы 2006».
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Н.В. Смольского (Минск 2005), на Международной конференции «Цветоводство без границ» (Харьков 2006), на Всероссийской конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия» (Волгоград 2006), на IV Международной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург 2007), на II Семинаре по реинтродукции растений (Волгоград 2007). Научные разработки экспонировались на различных выставках, в том числе на Международной выставке «Зеленая неделя» в Германии, где были отмечены почетным дипломом и серебряной медалью выставки, были отмечены золотой медалью Международной выставки «Цветы 2006», серебряной медалью Международной выставки «Цветы 2007», золотой медалью выставки «Дача, сад, огород 2007».
Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Коротков, Олег Игоревич
ВЫВОДЫ
1. Впервые на территории России создана крупнейшая коллекция клематисов, содержащая 38 видов рода Clematis, 3 вида рода Atragene и 246 сортов отечественной и зарубежной селекции, показана возможность использования данной культуры в озеленении в условиях Волгоградской области.
2. Разработана технология клонального микроразмножения на основе прямой регенерации растений путем активации пазушных меристем, и создан крупнейший в мире генетический банк клематисов in vitro, содержащий 110 генотипов.
3. Для введения в культуру in vitro клематисов оптимальным стерилизующим соединением следует считать 1%-ный раствор лизоформина при экспозиции 5 мин. Оптимальными сроками для изоляции эксплантов является начальная стадия вегетации.
4. Установлено, что оптимальной питательной средой на этапе микроразмножения является среда с добавлением 6-БАП в концентрации 1,0-2,5 мг/л, на этапе укоренения - с добавлением ИУК и ИМК в концентрации 0,2-0,6 мг/л.
5. Выявлено, что для уменьшения действия продуктов окисления фенолов в состав питательной среды в качестве антиоксиданта целесообразно добавлять аскорбиновую кислоту в концентрациях 30-50 мг/л, которая повышает жизнеспособность первичных эксплантов и улучшает рост растений-регенерантов.
6. Разработана промышленная технология производства клематисов, сочетающая традиционные методы вегетативного размножения с биотехнологическими и, позволяющая получать легко адаптируемый экологически чистый посадочный материал на 1,5-2 месяца раньше и в 23 раза дешевле, чем при обычной технологии.
7. Проведенный RAPD-анализ 74 сортов и видов клематиса может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма. Метод может быть также успешно использован для проверки генетической стабильности образцов, хранящихся в банке in vitro и паспортизации коллекций клематисов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Создание крупнейшей на территории бывшего СССР коллекции клематисов — 290 видов и сортов делает очень актуальной проблему ее эффективного использования. Формирование и поддержание крупных сортовых коллекций, а также родовых комплексов вполне традиционно для ботанических садов. Однако не всегда такие коллекции динамично востребованы в научном аспекте. В то же время, крупные сортовые коллекции являются бесценным генофондом, который нередко из-за отсутствия четкой программы по их использованию, просто утрачивается. В ГУ «ВРБС» разработана и реализуется программа по комплексному изучению культуры клематисов с использованием как традиционных, так и современных методов. Программа включает: первичное сортоизучение, семенное и вегетативное размножение, определение относительной устойчивости клематисов к болезням и различным абиотическим факторам, разработку эффективных "'технологий клонального микроразмножения, изучение возможности длительного депонирования в культуре in vitro с целью создания генетического банка культуры ткани. В результате проведенных исследований отработан метод выделения высокоочищенной геномной ДНК из листьев Clematis, подобраны эффективные праймеры и оптимизированы условия проведения ПЦР, адаптирован метод RAPD-анализа. На основе результатов молекулярного генотипирования будет продолжена работа по созданию генетических паспортов данной культуры. Изучение ДНК клематисов методами молекулярной биологии позволяет не только провести паспортизацию сортовых коллекций, контролировать генетическую стабильность образцов, использовать методы в целях геносистематики рода, но и глубже изучить структурные особенности генома и внести существенный вклад в направленную селекционную работу с клематисами.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коротков, Олег Игоревич, Москва
1. Автономов А.Н. Биологические основы выращивания клематисов в условиях Марийского Нечерноземья // Тез. докл. Всесоюз. школы передового опыта. Рига: Б.и., 1984. - С. 4-13.
2. Абраменко Н.М. Применение метода культуры растительных тканей в фитопатологии: Дисс. канд. с.-х. наук. Кишинев, 1972. - 150 с.
3. Алехно Г.Д., Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение роз // Физиология и биохимия культурных растений. М., 1986. - Вып. 18. — № 5. -С. 489-493.
4. Аннотированный каталог клематисов коллекции Государственного Никитского ботанического сада / Бескаравайная М.А., Донюшкина Е.А. — Ялта, 1988.-49 с.
5. Бакун Т.В. Особенности микроклонального метода размножения земляники / Проблемы вегетативного размножения в садоводстве. — М.: ТСХА, 1985.-С. 122-128.
6. Барыкина Р.П., Чубатова Н.В. О типах прорастания и первых этапах онтогенеза в роде Clematis L. / Жизненные формы: Структура, спектры и эволюция. М., 1981. - С. 111-140.
7. Белинская Н.К. Новые виды и сорта вьющихся растений в Главном ботаническом саду // Тр. ботанических садов АН КазССР. Алма-Ата, 1972. -Т. 12.-С. 38-44.
8. Белинская Н.К., Шоково Р.И. Засухоустойчивость лиан из рода Clematis (Ranunculaceae) II Бот журн. 1977. - Т. 62. - № 9. - С. 1341-1345.
9. Бескаравайная М.А., Донюшкина Е.А. Новые гибридные формы клематиса селекции Никитского ботанического сада // Бюл. Гос. Никитск. бот. сада. Ялта, 1989. - Вып. 68. - С. 39-44.
10. Бескаравайная М.А., Левко Г.Д., Ярославцева З.П. Изучение изменчивости окраски цветков клематиса // Цитогенетические иэмбриологические исследования многолетних у астений: Сб. науч. тр. Никитск. бот. сада.-Ялта, 1983.-Т. 91.-С. 124-129.
11. Бескаравайная М.А., Новикова В.М. Соматический эмбриогенез в культуре in vitro у Clematis L. II Тез. докл. VIII съезда Укр. бот. о-ва. Ивано-Франковск: Киев, 1987. - С. 174-175.
12. Бескаравайная М.А., Ульянов В.В. Ускоренное выращивание клематиса // Цветоводство. 1979. - № 9. - С. 8-9.
13. Бескаравайная М.А., Ульянов В .В.* Размножение клематиса в Государственном Никитском ботаническом саду // Экспресс-информация «Озеленение населенных мест». М., 1980. - Вып. 2. - 11 с.
14. Бескаравайная М.А. Семенное размножение клематисов // Цветоводство. 1980. - № 2. - С. 15-16.г
15. Бескаравайная М.А. Клематисы лианы будущего. - Воронеж: Кварта, 1998. - 172 с.
16. Бескаравайная М.А. Клематисы. Киев: Урожай, 1989. - 144 с.
17. Бескаравайная М.А. Клематисы. -М., 1991. 191 с.
18. Бескаравайная М.А. Клематисы. М.: Фитон, 2002. - 207с.
19. Бескаравайная М.А. Биологические основы интродукции и селекции клематиса / Никитск. бот сад. Ялта, 1988. - 184 с.
20. Бескаравайная М.А. Селекция клематиса на Южном берегу Крыма // Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции. Д., 1975. - Т. 54, Вып. 2. - С. 273-279.
21. Бирюкова А.В. ДНК маркеры в селекции картофеля // Достижения науки и техники АПК. 2003. - № 10. - С. 38-41.
22. Богушявичюте А.Р. Итоги интродукции вьющихся видов ломоноса и княжика с целью использования их в зеленом строительстве Литовской ССР // Тр. АН ЛитССР Сер.В. 1965. -№ 3(38). - С. 27-38.
23. Бранденбург В. Л., Ван де Ворен Е. Г. Крупноцветковые клематисы: Виды, гибриды и культивары // Вклад селекционеров в развитие культуры клематиса / Бот сад АН ЛатвССР Рига, 1988. - С. 67-75.
24. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М., 1964. - 287 с.
25. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.
26. Бъядовский И.А. Оптимизация условий роста косточковых культур после микроразмножения: Автореф. дисс. . канд. с.-х. наук. М., 2007. - 24 с.
27. Вареник В.И. Вегетативное размножение клематисов в Центральном ботаническом саду АН БССР // Всесоюз, семинар-конференция по клематисагй. -Л., 1989.-С. 26-27.
28. Вахновская Н.Г. Мелкоцветковые клематисы в вертикальном озеленении и их размножение / Семенная продуктивность и вегетативное размножение цветочных растений. Кишинев, 1982. - С. 81-84.
29. Вечернина Н.А. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений. Барнаул: Алт. ун-та, 2004. - 205 с.
30. Вечернина Н.А. Сохранение биологического разнообразия редких, исчезающих видов, уникальных форм и сортов растений методами биотехнологии: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Новосибирск, 2006. - 33 с.
31. Высоцкий В.А. Действие некоторых регуляторов роста на изолированные меристематические верхушки черной смородины // Плодоводство и ягодоводство Нечерноземной полосы. М., 1979. - Т. 9. - С. 101-107.
32. Высоцкий В.А. Культуры изолированных тканей и органов плодовых растений: Оздоровление и микроклональное размножение // С.-х. биология. -1983,-№7.-С. 42-48.
33. Высоцкий В.А. Клоиальиое микроразмножение растений / Культура клеток растений и биотехнология. — М.: Наука, 1986. — С. 91-102.
34. Высоцкий В.А. О генетической стабильности при микроклональном размножении плодовых и ягодных культур // С.-х. биология. 1995. - № 5. — С. 57-63.
35. Высоцкий В. А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала плодово-ягодных культур: Автореф. дисс. . д-ра с.-х. наук. М., 1998. - 44 с.
36. Высоцкий В.А., Алексеенко JI.B. Клональное микроразмножение клематиса // Сборник научных трудов научно-практической конференции "Научные основы развития цветоводства России и проектирования садовых ландшафтов". 2006. - Т. 15 - С. 27-29.
37. Глазко В.И., Доманский Н.Н. и др. Современные направления использования ДНК технологий // Цитология и генетика. 1998. - Т. 32. — №*5. -С. 80-93.
38. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений // Генетика. — 1999. — Т. 35.-№ 11.-С. 1538-1549.
39. Деменко В.И. Микрокланальное размножение садовых растений / Учебное пособие. М.: ТСХА ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева, 2007.-56 с.
40. Дмитриева Н.Н. Проблема регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей растений. М., 1981. - 129 с.
41. Долгих Ю.И. Сомаклональная изменчивость растений и возможности ее практического использования (на примере кукурузы): Автореф. дисс. . д-ра биол. наук. -М., 2005. 45 с.
42. Донюшкина Е.А., Зубкова Н.В. Клематисы. М.: Кладезь-Букс, 2005. -96 с.
43. Донюшкина Е.А. Радуга Клематисов // Приложение к журналу "Новый садовод и фермер". М.: Периодика-ТС, 2002. - 46 с.
44. Дорофеева JI.M., Мамаев С.А. Декоративные сорта клематисов на Среднем Урале / Аннотированный каталог коллекции Ботанического сада. -Екатеринбург: УрО РАН, 2001. 31 с.
45. Дорофеева JI.M., Мамаев С.А. Ассортимент декоративных клематисов для озеленения Урала // Материалы III Международной конференции «Цветоводство сегодня и завтра». - М., 1998. - С. 99-100.
46. Дорохов Д.Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов // Генетика. 1997. - Т. 33. - № 4. - С. 443-450.
47. Дорошенко Н.П., Берникова Н.В., Арестова И.О., Соколова Г.В. Биотехнология для обеспечения устойчивого ведения виноградарства / Проблемы устойчивого ведения виноградарства. Новочеркасск, 2004. - С. 26 - 134.
48. Дрибноходова О.П., Кокаева З.Г., Гостимский С.А. Идентификация сортов, линий и мутантов гороха посевного с помощью RAPD-маркеров // Сельскохозяйственная биология. 2005. - № 5. — С. 61-65.
49. Жуковская Н.В. Клематисы у вас на даче. — Ростов на Дону.: Феникс, 2005.-256 с.
50. Зеленина Г.А. Морфогенез в культуре in vitro сегментов стебля, и клональное микроразмножение Arnica chamissonis Less. ssp. (Nutt.) Maguire: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Ялта, 2007. - 20 с.
51. Зленко В.А. Диагностика хозяйственно-ценных признаков и клональное микроразмножение винограда in vitro: Автореф. дисс. . канд. с.-х. наук. Ялта, 1991. - 24 с.
52. Иванов В. Промышлени технологии в ягодопроизводството. София, 1973.-86 с.
53. Игнатов А.Н. и др. RAPD-маркеры, сцепленные с локусом устойчивости к расе 4 возбудителя сосудистого бактериоза Xanthomonas campestris pv/campestris у Brassica rapa L. // Генетика. 2000. - Т. 36. - № 3. -С. 357-360.
54. Калоша Н.В., Полынцев В.М. Клематисы. Новосибирск, 2004.26с.
55. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980. — 272 с.
56. Капица О.С., Андреева Э.Н. Оздоровление вегетативно размножаемых растений от вирусных болезней / Экспериментальные работы по генетике микроорганизмов и вирусологии растений. М., 1965. - С. 35.
57. Катаева Н.В., Аветисов В.А. Клональное размножение в культуре ткани // Культура клеток растений. — М., 1981. — С. 98-112.
58. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. -М.: Наука, 1983.-236 с.
59. Катасонова А.А. Оптимизация технологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре in vitro: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Уфа, 2007. — 25 с.
60. Кивистик У.Я. Девять лет селекции клематисов / Вклад селекционеров в развитие культуры клематиса. Рига, 1988. - С. 36-42.
61. Кин Е.В., Митрофанова О.В., Донюшкина Е.А. Получение соматических зародышей в культуре тканей клематиса (Clematis L.) / Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда. — М., 1997. — С.135-136.
62. Клоконос Н.П. Получение безвирусного посадочного материала ягодных культур // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве. Мичуринск, 1989. — Вып. 54. -С. 23-25.
63. Ковалевский Н.А. Размножение клематисов укоренением отводков // Цветоводство. 1981. - № 2. - С. 40.
64. Ковеза О.В., Кокаева З.Г., Коновалов Ф.А., Гостимский С.А. Выявление и картирование полиморфных RAPD-маркеров генома гороха (.Pisum sativum L.) //Генетика. 2005. - Т. 41. - № 3. - С. 341-348.
65. Козыренко М.М. Генетическая изменчивость и взаимоотношения лиственниц Сибири и Дальнего востока по данным RAPD-анализа // Генетика. — 2004. Т. 40. - № 4. - С. 506-515.
66. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Петрова Т.В., Гостимский С.А., Троицкий, А.В. Генетический полиморфизм сортов, линий и мутантов гороха по данным RAPD-анализа // Генетика. 1998. - Т. 34. - № 6. - С. 771-777.
67. Костырко Д.Р. Оценка перспективности интродукции кустарниковых лиан в Донецком ботаническом саду // Бюл. Гл. бот сада. М., 1983. - Вып. 127. -С. 15-21.
68. Кочиева Е.З. Молекулярное маркирование сортов баклажанов (iSolarium melongena L.) / Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. М.: «Евразия+», 2000. - Т. 1. - С. 17-24.
69. Красильникова Т.А. Факторы оптимизации репродуцирования in vitro различных представителей рода Rosa L.: Автореф. Дисс. . канд. с.-х. наук. -М., 1999.-22 с.
70. Красная книга Волгоградской области / Комитет охраны природы Администрация Волгоградской области. Волгоград: Волгоград, 2006. — Т. 2. — 236 с.
71. Крашенинников И.М. Ломонос Clematis L. / Флора СССР. - М., 1937. -Т7.- С. 310-323.
72. Кудрявцев А. М. Создание системы генетических маркеров твердой пшеницы (7! durum Desf.) и ее применение в научных исследованиях и практических разработках: Автореф. дисс. . д-ра биол. наук. — М., 2007. — 47 с.
73. Кузнецова О.И., Аш О.А., Хартина Г.А., Гостимский С.А. Исследование растений-регенерантов гороха (Pisum sativum L.) с помощьюмолекулярных RAPD- и ISSR-маркеров // Генетика. — 2005. — Т. 41. — № 1. — С. 60-65.
74. Куликаускас И. Клематисы отводками // Цветоводство. — 1974. — №6. - С. 26.
75. Кутас Е.Н. Научные основы клонального микроразмножения растений на примере интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной: Автореф. дисс. . д-ра биол. наук. -М., 1997. 35 с.
76. Легкобит М.П., Хадеева Н.В. Особенности морфогенеза и появления вариаций при микроклональном размножении разных видов стахиса // Генетика. 2004. -Т. 40. - № 7. - С. 916-924.
77. Ломонос П.Н. Клематисы в вашем саду. — Минск, 1985. 112 с.
78. Любименко В. Список деревьев и кустарников, разводимых в Императорском Никитском саду и имеющих техническое или декоративное значение // Зап. Им-перат. Никит, сада. Ялта, 1909. - Вып. 3. - С. 31-32.
79. Малышев С.В., Картель Н:А. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений // Молекулярная биология. 1997. - Т. 31. - № 62. - С. 197-208.
80. Максимов В.А. Размножение японским методом // Цветоводство. -1993.-№4.-С. 34-41.
81. Максимов В.А. Клематисы. Л.: Лениздат, 1985. - 404 с.
82. Методические указания по определению и использованию клематиса / Бескаравайная М.А., Привалова Л.А. Ялта.: Гос Никит.бот.сад, 1977. - 46 с.
83. Методические рекомендации по культуре лиан для вертикального озеленения на южном берегу Крыма / Бескаравайная М.А., Слизик Л.Н. — Ялта.: Гос. Никит, бот. сад, 1981. 31 с.
84. Методические рекомендации по культуре, лиан для вертикального озеленения на южном берегу Крыма / Бескаравайная М.А., Зыков К.И., Глазурина А.Н., Чемарин Н.Г. Ялта.: Гос. Никит, бот. сад, 1981. - 40 с.
85. Методические указания по первичному сортоизучению клематисов / Бескаравайная М.А. Ялта.: Гос. Никит, бот. сад, 1975. - 36 с.
86. Методические указания по размножению крупноцветковых клематисов / Бескаравайная М.А., Ульянов В.В. Ялта.: Гос. Никит, бот. сад, 1981.-11 с.
87. Методические рекомендации по определению экономической эффективности научных достижений в садоводстве / Всероссийский селекционнотехнологический институт садоводства и питомниководства. — М., 2005.- 111 с.
88. Методические рекомендации по применению гамма-радиации в селекции декоративных растений / Бескаравайная М.А., Слизик JI.H. Ялта.: Гос. Никит, бот. сад, 1981.-31 с.
89. Методические указания по культуре декоративных древестных лианв Крыму / Бескаравайная М.А. Ялта: Гос.Нтктт.бот.сад, 1979. - 38 с.
90. Методические указания по культуре и подбору ассортимента крупноцветковых клематисов / Бескаравайная М.А., Тимошенко Н.М. — Ялта.: Гос. Никит, бот. сад, 1977. 36 с.
91. Методические указания по клональному микроразмножению винограда / Голодрига П.Я., Зленко В.А., Чекмарев JI.A., Бутенко Р.Г. и др. — Ялта.: НИИ «Магарач», 1986. 54 с.
92. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии / Методические указания. М.: МСХА, 1996. - 90 с.
93. Миронова О.Ю. Разработка и совершенствование технологий клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. М., 2004. - 22 с.
94. Митрофанова И.В., Галаев А.В., Сиволап Ю.М. Исследование молекулярно-генетической гетерогенности растений клематиса (Clematis L.), полученных путем органогенеза и соматического эмбриогенеза in vitro II Цитология и генетика. 2003. - № 6. - С. 12-16.
95. Моисеева Е.С. Биология и экология видов рода Clematis, интродуцированных Ботаническим садом АН УзССР: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ташкент, 1983. - 20 с.
96. Музыка Г. И. Влияние сроков черенкования на регенерационную способность черенков крупноцветковых клематисов // Интродукция и акклиматизация растений. 1991. — Вып. 13. — С. 59-61.
97. Муратова С.А., Янковская М.Б. Особенности клонального микроразмножения некоторых видов ягодных и декоративных культур // Пром. пр-во оздоровлен, посадоч. материала плодовых, ягод, и цветоч.-декоратив. культур.-М., 2001.-С. 145-147.
98. Муратова С.А., Янковская М.Б. Ускоренное размножение нетрадиционных садовых и декоративных культур // Состояние и перспективы развития нетрадиц. садовых культур. Воронеж, 2003. - С. 207-211.
99. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.Н., Прокофьев М.И. Основы с/х биотехнологии. М., 1990. - 224 с.
100. Невесенко З.И. Итоги интродукции деревянистых лиан в Днепропетровском ботаническом саду // Интродукция и акклиматизация растений в Днепропетровском ботаническом саду. Днепропетровск, 1969. — С. 8-18.
101. Невесенко 3. И. Цветение и плодоношение интродуцированных лиан // Интродукция растений в Днепропетровском ботаническом саду: Сб. науч. статей. Днепропетровск, 1971.
102. Немойкина A.JI. Влияние света и гормонов на морфогенез Юкки слоновой в культуре in vitro: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Томск, 2003. - 19 с.
103. Оганисян А.С., Кочиева Е.З., Рысков А.П. Маркирование видов исортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR / Генетика. 1996. - № 32(3) -С. 448-451.
104. Олстон Р.Е. Генетика фенольных соединений / Биохимия фенольных соединений / Харборн ДМ. -М., 1968.-Гл. 5.-С. 140-165.
105. Орлов М.И. Инструкция по размножению и выращиванию клематиса Жакмана. Киев: Наук, думка, 1960. - 14 с.
106. Орлов М.И. Клематисы. Киев, 1972. - 68 с.
107. Орлов М.И. Клематисы, их выращивание и размножение. — Киев: Экспресс информация УКРНИИТИ., 1980. Сер. 4. - 20 с.
108. Осипова Е.С., Кокаева З.Г., Троицкий А.В., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Гостимский С.А. RAPD-анализ сомаклонов кукурузы // Генетика. — 2001. — №37(1).-С. 91-96.
109. Осипова Е.С. и др. Выявление специфических RAPD и SSR фрагментов у сомаклонов кукурузы и создание на их основе SCAR маркеров // Генетика.-2003.- Т. 39. -№ 12.-С. 1664-1672.
110. Подорожный В.Н. Производство оздоровленного посадочного материала алычи и клоновых подвоев косточковых плодовых культур с использованием биотехнологических методов: Автореф. дисс. . канд. с.-х. наук. Краснодар, 1996. - 19 с.
111. Попов Ю.Г. Культура in vitro меристематических верхушек как метод оздоровления и размножения растений // Биологические науки. — 1976. -№6.-С. 13-24.
112. Попов Ю.Г., Попова И.В., Мишина А.П. К вопросу ускорения селекционного процесса земляники с помощью метода культуры изолированных меристематических верхушек // Сб. науч. работ НИЗИСНП. -М., 1977.-Вып. 10.-С. 149-153.
113. Попов Ю.Г., Высоцкий В.А. Культура стеблевых верхушек in vitro как метод ускоренного размножения плодовых и ягодных растений // Вестник с/х науки. — 1978. № 4. — С. 124-127.
114. Попович Е.А., Решетников В.Н. Адвентивный органогенез у клематиса гибридного // Тез. докл. VIII междунар. конф «The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology». Саратов, 2003. - С. 261.
115. Потапов С.И. К вопросу о зимостойкости деревянистых лиан Куйбышевского ботанического сада / Интродукция, акклиматизация, охрана и использование растений. Куйбышев, 1982. - С. 3-11.
116. Потапов С.И. Некоторые итоги интродукции рода Clematis в Куйбышеве // Вклад селекционеров в развитие культуры клематиса. Рига, 1988.-С. 46-50.
117. Путеводитель по Императорскому Никитскому ботаническому саду. Симферополь, 1878. - 58 с.
118. Риекстиня В.Э., Риекстиньш И.Р. Клематисы. Л.: Агропромиздат, 1990.-287 с.
119. Рогинский А.В. Анализ и перспективы интродукции видов рода Clematis L. флоры Советского Дальнего Востока: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 1988.-23 с.
120. Романова Г.С. Биологические особенности прорастания семян в условиях культуры in vitro II Бюл. Гос. Никитск. бот. сада. Ялта, 1975. - Вып. 26.-С. 53-57.
121. Савина Т.А. Предварительные итоги размножения клематисов зелеными черенками // Бюл. Ботанического сада Саратовского Государственного университета. Саратов: Научная книга, 2003. - Вып. 2. — С. 160-163.
122. Сальникова Е.Н., Сиушева А.Г. Влияние регуляторов роста на укоренение клематиса / Регуляторы роста и развитие растений в биотехнологиях. 2001. - С. 273.
123. Свитковская О. И. Клематисы. М.: Изд. Дом МСП, 2004. - 64 с.
124. Свитковская О.И. Интродукция клематисов в Центральном ботаническом саду НАН Беларуси // Материалы III Международной конференции «Цветоводство — сегодня и завтра». — М., 1998. — С. 245-246.
125. Свитковская О. И. Интродукция клематисов (Clematis L.) в центральном ботаническом саду НАН Беларуси // Материалы Международной неумной конференции, посвященной- 100 летию со дня рождения академика Н.В.Смольского. Минск: Эдит ВВ, 2005. - С. 145-148.
126. Связева О.А. Деревья, кустарники и лианы парка Ботанического сада Ботанического института им. В.Л.Комарова. СПб.: Росток, 2005. - 384 с.
127. Серов В.П. Система и конспект рода Clematis (Rununculaceae) во флоре СССР//Бот. Жур. 1988.- Т. 73.-№9.-С. 1737-1741.
128. Сиволап Ю.М.', Солоденко А.Е., Бурлов В.В. RAPD-анализ молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника (Helianthus annuus) // Генетика 1998. - Т. 34. - № 2. - С. 266-271.
129. Сиволап Ю.М. Идентификация генотипов кукурузы при помощи ПЦР-анализа // Цитология и генетика. 2001. - Т. 35. - № 3. - С. 14-21.
130. Станилова М. In vitro регенерация на блатно кокиче (Leucojum aestivum L.) от листай експланти // Bulg. J. Plant Physiol. 1994. - Вып. 20. -№1-4.-С. 89-94.
131. Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения // Успехи современной биологии. -2004.-Т. 124. -№3. С. 260-271.
132. Уланова К.П., Зайцева Н.М. Сравнительное исследование флавоноидов дальневосточных видов Clematis L. и Atragene L. // Растительные ресурсы. 1979. - Т. 15. - Вып. 2. - С. 35-42.
133. Фелтуэлл Д. Клематис и лианы. М.: ACT Астрель, 2006. - 159 с.
134. Фирсов Г.А. Находки Clematis orientalis ('Ranunculaceae) в Волгоградской области // Бот.Жур. 2002. - Т. 87. - № 11. - С. 109-112.
135. Фортэ А.В. и др. Применение RAPD-анализа для идентификации ДНК-маркера, сцепленного с признаком колоновидного роста на гибридной популяции яблони / Современные научные исследования в садоводстве. — Ялта, 2000.-С. 199-203.
136. Фортэ А.В. и др. Филогения видов яблони рода Malus на основе морфологических признаков и молекулярного анализа ДНК // Генетика. 2002. - Т. 38. -№ 10.-С. 1357-1369.
137. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве // Сельскохозяйственная биология. 1997. - № 5. - С. 3-19.
138. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технология создания новых сортов сельскохозяйственных культур // Сельскохозяйственная биология. 2003. - № 3. - С. 26-41.
139. Херш В. Клематисы во всем своем великолепии. М.: Лик пресс., 1998.-63 с.
140. Цыренов В. Ж. Основы биотехнологии: культивирование изолированных клеток и тканей растений. Улан-Удэ, 2003. - Ч. 2. —1123 с.
141. Чегамирза К. Молекулярно-генетическое картирование локусов качественных и количественных признаков у гороха: Диссер. . кан. биол. наук. М., 2004. - 22 с.
142. Шевелуха B.C. Методические указания к лабораторно-практическим занятиям по с.-х. биотехнологии. М., 1987. - 83 с.
143. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология / Шевелуха B.C. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. шк., 2003. - 469 с.
144. Шипчинский Н.В. Род ломонос, лозинка Clematis L. // Деревья и кустарники СССР. - М., Л., 1954. - Т. 3. - С. 26-43.
145. Albrecht С. Optimization of tissue culture media // Comb. Proc. Intern. Plant Propagators Soc. 1986. -T. 35. - P. 196-199.
146. Auld R.E., Carrall A. Growing Clematis jackmanii hybrids // Comb. Proc. Intern. Plant Propag. Soc. 1983. - Vol. 32. - P. 55-58.
147. Bracken M. Pros and cons of trees from tissue culture // Comb. Proc. Intern. Plant Propag. Soc. 1989. -T. 38. - P. 451-453.
148. Bracken M. The acclimation of tissue cultured plants // Comb.Proc.Intern.Plant Propag. Soc. 1992. - Vol.41. - P. 352-353.
149. Brandenburg W. A. The European Garden Flora / Cambridge University Press. 1989.-V. III.-P. 357-364.
150. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers // Biotechnology. -1991.-V.9.-No. 6.-P. 553-557.
151. Caetano-Annoles G. Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers / PCR Methods and Applications. 1993. - V. 3. - P. 85-94.
152. Dabski M., Parzymies M. Influence of cytokinins on the proliferation of Clematis integrifolia L. in vitro // Kwiaciarstwo w Polskiej nauce i gospodarce. — 2006.-Cz. l.-P. 119-125.
153. Dettori M.T., Palombi M.A. Identification of Feijoa sellowiana Berg, accessions by RAPD markers // Scien. Hort.- 2000. V.86. - №4. - P. 279-280.
154. Debergh P.C. E Maene L.J. A scheme for commercial propagation of ornamental plants by tissue culture // Scien. Hort. 1981. - № 14. - P. 335-45.
155. Evison R.J. The genus Clematis, past and present // Comb. Proc. Intern. Plant Propag. Soc. 1982. -V. 31. - P. 495-501.
156. Evison R.J. The Gardener's Guide to Growing Clematis. Portland, Oregon: Timber Press, 1998. - 154 p.
157. FiskJ. Clematis. The Queen of climbers. Cassell, 1994. - 160 p.
158. Fretwell В. Clematis as companion plants. London: Cassell Publishers, 1994. -56 p.
159. Fossard R.A. The horizons of tissue culture propagation // A Seminar directed by Dr. Fossard fo N.S.W. Association of Nurserymen Ltd. 1977. - 14 p.
160. Galande A.A., Tiwari R., Ammiraju J.S.S., Santra D.K., Lagu M.D., Rao V.S., Gupta V.S., Misra B.K., Nagarajan S., Ranjekar P.K. Genetic analysis of kernel hardness in bread wheat using PCR-based markers // Theor. Appl. Genet. 2001. -V.103.-P. 601-606.
161. Geneve R.L. Variation within a clone during tissue culture propagation // Comb. Proc. Intern. Plant Propag. Soc. 1990. - V.39. - P. 458-462.
162. Govil S., Gupta S.C. Commercialization of plant tissue culture in India // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1997. - V.51 -No.l. -P. 65-73.
163. Grey-Wilson. Clematis, the genus. Portland:Timber Press, 2000. - 224p.
164. Gunther H. Clematis. Berlin: Klettergeholze, 1974. - 78 p.
165. Guerin J.R., Sweeney S.M. The development of genetic database of identify olive cultivars // J. Av. Hortic. Sc. 2002. - V.127. - № 6. - P. 977-983.
166. Hare R. Clematis, the genus // Free Planters Notes. 1975. - V. 26. -No.4.-P. 38-39.
167. Hicks M., Adams D., O'Keefe S., Macdonald E., Hodgetts R. The development of RAPD and microsatellite markers in lodgepole pine (Pinus contorta var. latifolia) II Genome. 1998. -V. 41. - P. 797-805.
168. Howells J. Trouble free clematis the viticellas garden. England: Art press, 1998.- 191 p.
169. Hu J., Quiros C.F. Identification of brokkoli and cauli-flower cultivars with RAPD markers // Plant Cell Rep. 1991. - V. 10. - P. 505-511.
170. Huetteman C.A., Preece J.E. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1993. - V.33. - No. 2. - P. 105119.
171. Hughes K.W. Ornamental species in cloning agricultural crops via in vitro Technigues // Ed. B.V. Conger. Florida: C.R.C. Press, 1981. - P. 5-50.
172. Irzikowska L., Wolko В., Swi^cicki W.K. The genetic linkage map of pea {Pisum sativum L.) based on molecular, biochemical and morphological markers // Pisum Genetics.-2001.-V. 33.-P. 13-18.
173. Johnson M. The Genus Clematis L. Sweden: Plantskola AB. Sodertalje, 2001.- 156 p.
174. Jones O.P., Hopgood M.E., O'Farrel D. Propagation in vitro of apple root stocks 11 Hort. Sc. 1977. - V. 52. - No.2. - P. 46-53.
175. Jones O.P., Hopgood M.E. The succeful propagation in vitro of two root-stocks of Prunus, the plum rootstook Pixy (Pinsititia) and the cherry rootstock {P.avium) II Yiovl. Sc. 1979.-V. 54.-No. 1.-P. 35-39.
176. Komalavalli N. In vitro micropropagation of Gymnema elegans W. // Indian J. Exp. Biol. 1997. -V. 35. -№ 10. - P. 1088-1092.
177. Koshuchova S., Zoglauer K., Goung H. Loss function of guard cells of in v/Yro-cultured plants and its restitution: avoidans of vitrification and improvement of acclimatization // Humboldt Universitat zu Berlin. 1989. - №13. - P. 38-40.
178. Kuntze O. Monographie der Gattung Clematis / Verhandlungen des Botanischen vereins der Provinz Brandenburg Germany, 1885. P. 83-202,
179. Lane W.D. Regeneration of pear plants from shoot meristemtypes // Plant Sci. Letters. 1979. - № 16. - P. 337-342. ,
180. Lodhi M.A., Daly M.J., Ye G.N. A molecular marker based linkage map of Vitis II Genome. 1995. - V.38. - P. 786-794.
181. Lloyd C. Clematis. Deer Park, Wisconsin: Capability's Books, 1989.216 p.
182. Mandegaran Z., Sieber V.K. Somatic embryogenesis in Clematis integrifolia x C. viticella 11 Plant Cell Tissue Organ Cult. 2000. - V.62. - No. 2. -P.163-165
183. Markham E. The large and small flowered clematis and their cultivation in the open air. London, 1951. - 126 p.
184. Mitrofanova I.V., Yezhov V.N. Plants regeneration of Clematis L. through somatic embryogenesis in vitro // Bull, of the State Nikitsky Bot. Gardens. — 2002. — No. 86.-P. 16-19.
185. Mitrofanova I.V., Movchan O.P., Shishkin V.A., Mitrofanov V.I. Gene-pool collection in vitro in Nikitsky Botanical Gardens National Scientific Center // Bull, of the State Nikitsky Bot. Gardens. - 2002. - No. 85. - P. 30-33.
186. Moore Th., Jackman G. The Clematis as a garden flower / J. Murray. -London, 1872.-№8. -P. 160.
187. Murashige Т., Tones I.B. Cell and organ cultur methods in virus disease therapy // Asta Hort. 1974. - № 35. - P. 207-221.
188. Murashige I. Plant propagation thorough tissue cultures // Am. Rev. Plant Physiol. 1974. -No. 25. - P. 135-166.
189. Rehder A. Clematis L. / Manual of cultivated trees and shrabs. N.Y., 1956.-P. 206-220.
190. Saliba-Colombani V., Causse M., Gervais L., and Philouze J. Efficiency of RFLP, RAPD and AFLP markers for the construction of an intraspecific map of the tomato genome // Genome. 2000. - V. 43. - P. 29-40.
191. Sekowski B. Powojniki. Warszawa, 1987. - 199 s.
192. Shao L., Yu G. In vitro propagation of Clematis filamentosa // Department of Biology Zhaoqing College, Zhaoqing, Guangdong. 2005. - V. 28. - No.5. - P. 364-366.
193. Smith G.R., Cole A.J. Clematis in New Zealand // Australasian Plant Pathology. 2002. - V. 20. - No.2. - P. 67- 72.
194. Snoeijer W. A suggested classification for clematis / The Clematis. The British Clematis Society, 1992. - P. 7-20.
195. Spingarn J.E. The Large-Flowered Clematis Hybrids // The National Horticultural magazine. — 1935. P. 64-35.
196. Tamura, M. A classification of genus Clematis //Acta Phytotax. Geobot. — 1987. -V.38. -P. 38-44.
197. Toomey M., Leeds E. An illustrated Encyclopedia of Clematis / Published in association with the British clematis society timber press, 2005. 426 p.
198. Vaigla A. Elulongad. Tallinn: Valgus, 1982. - 111 p.
199. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Rejans M., van de Lee Т., Homes M., Fritjers A., Pot J., Peleman J., Kuiper M,, and Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucl. Acids Res. 1995. - V. 23. - P. 4407-4414.
200. Wang W.T. A revision of Clematis sect. Clematis (Ranunculaceae) // Acta Phytotax. Sin. 2003. - V. 41. - P. 1-62.
201. Wang, W.T. A revision of Clematis sect. Brachiatae (Ranunculaceae) // Acta Phytotax. Sin. 2004. V. 42. - P. 289-332.
202. Wang, W.T. A revision of Clematis sect. Aspidanthera s.l. СRanunculaceae) // Acta Phytotax. Sin. 2004. - V. 42. - P. 1-72.
203. Weising K., Nybom H., Wolff K., Meyer W. DNA fingerprinting in plants and fungi. Boca Raton: CRC Press, 1995. - 322 p.
204. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Research. 1990. -V. 18. - No. 22. - P. 6531-6535.
205. Wilkins C.P., Cabrera J.L., Dodds J.H. Tissue culture preparation of trees //Outlook on Agr.- 1985.- T. 14.-No. l.-P. 2-13.
-
Коротков, Олег Игоревич
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.05
- Эколого-ценотическая и биологическая характеристика видов рода Clematis L. Республики Северная Осетия-Алания
- Биоэкологические особенности видов рода Clematis L., интродуцированных в Крыму
- Биологические и молекулярно-генетические особенности дальневосточных видов рода Actinidia Lindl.
- Биолого-морфологические основы клонального микроразмножения некоторых представителей рода Rhododendron L.
- Особенности индуцированного морфогенеза и регенерации у различных типов эксплантов in vitro культиваров видов рода Iris L.
