Особенности индуцированного морфогенеза и регенерации у различных типов эксплантов in vitro культиваров видов рода Iris L.

Тихомирова, Людмила Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности индуцированного морфогенеза и регенерации у различных типов эксплантов in vitro культиваров видов рода Iris L.
ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Особенности индуцированного морфогенеза и регенерации у различных типов эксплантов in vitro культиваров видов рода Iris L."

Тихомирова Людмила Ивановна

ОСОБЕННОСТИ ИНДУЦИРОВАННОГО МОРФОГЕНЕЗА И РЕГЕНЕРАЦИИ У РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ЭКСПЛАНТОВ IN VITRO КУЛЬТИВАРОВ ВИДОВ РОДА IRIS L.

Специальность 03.02.01 - «Ботаника»

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

12 МАЙ 2011 «'I' су"

Барнаул, 2011

4846125

Диссертационная работа выполнена в Государственном научном 'учреждении Научно-исследовательский институт садоводства Сибири имени М.А. Лисавенко Российской академии сельскохозяйственных наук (НИИСС)

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор

Долганова Зоя Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Седельникова Людмила Леонидовна,

кандидат биологических наук Алексеева Нина Борисовна

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО «Томский государственный

университет»

Защита диссертации состоится «27» мая 2011 г. в 10-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.005.10 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ГОУ ВПО «Алтайский государственный университет» по адресу: 656049, г. Барнаул, пр. Ленина, 61; тел. (3852) 36-81-55; факс (3852) 67-09-28, (3852) 36-30-77.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Алтайский государственный университет».

Автореферат разослан «26» апреля 2011 г.

Автореферат выставлен на сайте wmv.asu.ni 26 апреля 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент Н.В. Елесова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на имеющиеся экспериментальные работы в области изучения процессов морфогенеза и регенерации растений в условиях in vitro, до сих пор остаются не разработанными системы получения in vitro для большинства многолетних садовых культур. Это обусловлено отсутствием четких хорошо воспроизводимых методик, их трудоемкостью, а также недостатком знаний о морфогенетическом потенциале органов и тканей этих культур и способах управления морфогенезом.

Род Iris L. самый большой и наиболее сложный из семейства Iridaceae Juss. (Родионенко, 1988, 1996). Проблеме сохранения и изучения видов рода Iris посвящены работы многих российских и зарубежных авторов (Родионенко, 1961; Yabuya, 2004; Алексеева, 2005; Доронькин, 2006; Долганова, 2008; Миронова, 2008).

Изучение регенерационной способности эксплантов генеративных органов ириса в культуре in vitro представляет собой теоретический и практический интерес. Большая часть работ проводится в области эмбриокулыуры (Yabuya, 1981, 1985; Kawase et al., 1995; Ишмуратова, 1999; Болтенков, 2002; Полковникова, 2000; Вечернина и др., 2004; Мамаева и др., 2005, 2007, 2008; Noland et al., 2006; Jevremovic et al., 2006). Анатомического описания процессов регенерации в динамике развития в доступной нам литературе не обнаружено.

В связи с этим изучаемая проблема является актуальной и практически значимой.

Цель работы - выявить морфогенетические особенности развития различных типов эксплантов в культуре in vitro и сравнить их регенерационную способность для культиваров ириса (/. sibirica L„ I. ensata Thunb., I. hybrida hortj.

Задачи:

- изучить регенерационную способность почек вегетативного побега ириса;

- показать возможный способ устранения микробного загрязнения эксплантов;

- усовершенствовать метод эмбриокультуры для данных видов ириса;

- изучить особенности реализации морфогенетического потенциала эксплантов органов цветка через прямой органогенез;

- провести анатомо-морфологический анализ тканей эксплантов репродуктивных органов интактных растений;

- сравнить методами гистологического анализа особенности прохождения морфогенеза в динамике у различных типов эксплантов генеративных органов.

Предмет исследования. Пути реализации морфогенетического потенциала различных эксплантов изучаемой культуры, особенности получения растений в условиях in vitro.

Методы исследования. Морфологические, гистологические, микробиологические методы, методы культуры органов и тканей.

Основные положения, выносимые на защиту:

- формированию очага меристематической активности в эксплантах органов цветка ириса (трубка околоцветника, ось соцветий) предшествует изоляция инициальной клетки и образование полиады;

- трубка околоцветника - идеальный тип экспланта для клонального микроразмножения сортов и гибридов I. sibirica, I. ensata, 1. hybrida-,

- применение гистологического анализа позволит контролировать процессы на тканевом уровне, для того чтобы направлять морфогенез в нужном для исследователя русле.

Научная новизиа. Впервые проведен микробиологический контроль эксплан-тов почек вегетативного побега ириса, введённых в культуру in vitro, и определена чувствительность к антибиотиках! выделенных микроорганизмов. Доказана необходимость введения малотоксичного антибиотика в состав питательных сред до тех пор, пока инфекция не перестанет проявлять себя, чередуя среды с антибиотиком и без него.

Доказан позитивный эффект от введения в питательную среду L-глутамина и аденин сульфата на адвентивное побегообразование у зародышей ириса. Показано, что органы, развивающиеся у зародышей ириса в культуре in vitro, по своему анатомическому строению сходны с корневищем ириса, с несколько активизированными зонами эндогенного геммогенеза и ризогенеза.

Впервые показаны различные пути реализации морфогенетического потенциала (геммогенез, гемморизогенез, ризогенез) у соматических тканей органов цветка ириса в процессе прямой регенерации in vitro. Установлена высокая регенерационная способность трубки околоцветника в культуре in vitro у всех изученных культива-ров. Показано влияние расположения экспланта на питательной среде, концентрации фитогормонов на процесс прямой регенерации растений ириса.

Впервые проведён сравнительный анализ анатомического строения разных типов эксплантов у /. sibirica, I. ensata, I. hybrida, а также гистологический анализ динамики процессов органогенеза в культуре in vitro органов цветка. Выявлено, что формированию очага меристематической активности в эксплантах органов цветка ириса (трубка околоцветника, ось соцветий) предшествует изоляция инициальной клетки и образование полиады. Побеги образующиеся de novo эндогенного происхождения. Для I. hybrida характерно формирование гидроцитной системы.

Анатомически доказано, что адаксиальная и абаксиальная стороны трубки околоцветника у I. sibirica, 1. ensata, I. hybrida отличаются по своему строению. Адаксиальная сторона содержит адаксиапьную меристему, благодаря активности которой, побеги регенерируют только на данной стороне экспланта. Побеги, сформированные у эксплантов трубки околоцветника изученных видов ириса, имеют типичное строение для вегетативных побегов однодольных растений, а флоральные элементы развиваются на месте примордиев первых листьев.

Методами гистологического анализа выявлены сходства и различия в динамике прохождения этапов морфогенеза у разных видов ириса (/. sibirica, I.ensata, ]. hybrida) и разных типов экспланта (ось соцветия и трубка околоцветника).

Практическое значение полученных результатов. Впервые разработан способ прямой регенерации из разных типов эксплантов I. sibirica, 1. ensata, I. hybrida, позволяющий получать активно пролиферирующую культуру ириса.

Разработай метод введения в культуру in vitro почек вегетативного побега ириса, позволяющий получить стерильный материал, на основе микробиологического контроля, определения чувствительности выделенных микроорганизмов к

антибиотикам и введения малотоксичного антибиотика, из списка предложенных, в питательную среду для культивирования эксплантов.

Усовершенствован метод эмбриокультуры ириса: определён срок изоляции зародыша, подобраны питательные среды, проведено анатомо-морфологическое изучение регенерантов.

Усовершенствованна методика приготовления гистологических препаратов. Полученные данные анатомо-морфологических исследований предоставляют возможность целенаправленно изменять определённые факторы: гормональный состав питательной среды, тип экспланта, время культивирования для контроля морфогенеза в культуре in vitro.

Личный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены соискателем в лаборатории биотехнологии и цитологии ГНУ НИИСС им. М.А. Лисавенко (НИИСС). Микробиологические исследования и приготовление гистологических препаратов проведено совместно с сотрудниками лабораторий бактериологии и гистологии Краевой клинической больницы г. Барнаула.

Апробация работы.

Основные положения и результаты исследований были представлены на Восьмой международной научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010); V Международной научно-практической конференции «Аграрная наука сельскому хозяйству» (Барнаул, 2010); Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения З.И. Лучник «Декоративное садоводство Сибири: проблемы и перспективы» (Барнаул, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Ботанические сады. Проблемы интродукции» (Томск, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 научных статей, в том числе 3 статьи в рецензируемых изданиях, 5 - в сборниках материалов и тезисов конференций.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 187 границах; состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, 21 таблицы, 69 рисунков и приложения. Библиографический список включает 256 источников, в том числе 100 - на иностранных языках.

ГЛАВА 1. МОРФОГЕНЕТИЧЕСКНМ ПОТЕНЦИАЛ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

В зависимости от сочетания внутренних и внешних факторов, определяющих начальные условия развития экспланта, возможны разные морфогенетические сценарии в условиях in vitro (Батыгина и др., 1978; Hussey, 1982; Буте н к о, 1984, 1990, 1994; Ишмуратова и др., 1999; Дапкунене и др., 2004; Чуб, 2005; Зарипова, 2006; Крючкова, 2005; Мамаева и др., 2005, 2007, 2008; Журавлёв и др., 2008; Мошкин, 2008).

Методы гистологического анализа позволяют изучать морфогенез на тканевом уровне, а также управлять процессами регенерации в эксплантах в культуре in vitro. (Y. Vieth et al., 1992; Батыгина и др., 1992; Горбунова и др.,1992; Круглова и

др., 1997; Чурикова и др., 1991, 1994, 1995; Marcia et al., 2001; Барыкина и др., 2001; Набиева, 2008; Чурикова, 1993,2010).

Ряд учёных работает над проблемой ириса в культуре ткани (Randolph, 1945; Hussey et al., 1976; G. Laublin et al., 1991; Para et al., 1992; Leifert et al., 1992; Ka-wase end al., 1995; Shimizu et al., 1996; Hida et al., 1999; Jeknis et al., 1999; Полков-никова, 2000; Yabuya and el., 1983, 1991, 1992, 1993, 1997, 1998, 1999, 2002, 2003, 2004; Boltenkov et al., 2005; L. Radojevic, A. Subotic, S. Jevremovic, M. Trifunovic, 2007). На основании этих работ были сделаны выводы о необходимости более глубокого изучения морфогенетического потенциала эксплантов органов и тканей ириса различными методами, проведения исследований для выявления видовых различий в процессе культивирования, включив в работу также поиск наиболее эффективных регуляторов и активаторов основных этапов органогенеза, и разработки на основе полученных результатов способов введения в культуру in \itro трудноразмножаемых видов и сортов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Лабораторные исследования по культуре органов и тканей выполнены на базе лаборатории биотехнологии и цитологии НИИСС, согласно тематического плана научно-исследовательских работ.

В исследованиях в качестве модельных растений, использовали сорта зарубежной селекции и сорта и гибриды селекции НИИСС I. hybrida, I. ensata, I.sibirica (табл. 1).

Таблица 1

Объекты исследования из рода Iris L.

Виды, сорта, гибриды

1. hybrida I. ensata I. sibirica

Assignment - карликовый Усть-Катуиь Лаула

Jazzamatazz - карликовый Гибрид № 28-50-00 Кассандра

Гибрид 5-282-98- карликовый Гибрид №59-66-00 Сгерх

Гибрид 8-282-98- карликовый Гибрид 15-244-97 Гибрид 5-46-99

Ланцелот - среднерослый Гибрид 1-220-97 Гибрид 36-38-01

Latin Lover - высокий Гибрид24-81-03 Berlin Ruffles

Chardette - высокий Гибрид №8-91-97 Cambridge

Lilac Line - высокий Гибрид № 1-103-97 King of King

Гибрид 21-38-01

В работе придерживались общепринятых в биотехнологии методов (Бутенко, 1964). Асептическую работу проводили в ламинарных боксах. В зависимости от происхождения вводимого экспланта отрабатывались экспозиция и концентрация стерилизующего агента. Из стерилизующих средств использовали растворы этилового спирта 96% и 70%, сулемы 0,1%, сульфохлорантина 0,5%, 1% и 6%, перекиси водорода 3%, хлоргексидина 0,5 мг/л. В качестве фунгицида использовали 0,1% раствор тербинафина.

При исследовании морфогенетических потенций органов и тканей в условиях in vitro использовали стандартную питательную среду MS (Murashige, Skoog, 1962). В питательные среды вводили следующие фитогормоны: а) цитокининового типа

действия - 6-бензиламинопурин (БАП) Sigma, США 1-20 мкМ; б) ауксинового типа действия - а-нафтилуксусную кислоту (НУК) Sigma, США 3-5 мкМ.

Экспланты выращивали в культурапьной комнате, где поддерживалась температура 24-26 °С, 16-часовой фотопериод, интенсивность освещения - 2000 -4000 лк. Субкультивирование тканей и органов проводили через 15-30 суток. Каждый эксперимент был поставлен в 10-ти кратной повторности.

Изучали морфогенетические особенности развития различных типов экс-плантов: зародышей, соматических тканей репродуктивных органов, почек вегетативных побегов в культуре in vitro. Плоды были собраны через 30-90 суток после опыления, цветки - в фазе бутонизации при величине 20-30мм (VII этап органогенеза). Из бутонов 20 культиваров ириса были выделены следующие типы эксплантов: поперечные срезы оси соцветия и соединения околоцветник-завязь толщиной 1-2мм, фрагменты завязи (верхняя и нижняя доли), трубка околоцветника (фрагменты размером 5 х-5мм), тычиночные нити, пыльники, столбик и рыльце пестика.

Чувствительность к антибиотикам сопутствующей микрофлоры определяли методом дисков (Методические указания..., 2004).

Провели серии анатомических срезов в разные сроки культивирования эксплантов фрагментов цветка с частотой 3-5 дней. Было приготовлено 128 постоянных препаратов по общепринятым методикам (Барыкина и др., 2004) в нашей модификации. Препараты просматривали на микроскопе МБ - 30 do MPI - 5 made in Poland при увеличении 10x10, 10x40. Фотографии были выполнены цифровым фотоаппаратом Sanyo VPC - S600.

Статистический анализ проводили в MS Excel 2007 с использованием стандартных показателей (Зайцев, 1990).

ГЛАВА 3. РЕАЛИЗАЦИЯ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ИРИСА (IRIS L.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO ПУТЁМ ПРЯМОГО ОРГАНОГЕНЕЗА

3.1. Регенерационная способность почек вегетативного побега ириса Вегетативные почки ириса находятся в почве, и их стерилизация представляет определённую трудность. Были использованы дезинфицирующие средства из разных групп отдельно и в сочетании в пяти вариантах. Жизнеспособность эксплантов (гибридов I. hybrida 5-282-98, 8-282-98, I. sibirica 5-46-99,1. ensata 1-103-97) была высокая при всех испытанных способах стерилизации. Исключением явились вегетативные почки I. hybrida при использовании хлоргексидина и раствора этанола 70% в сочетании с 3% перекисью водорода. В данных вариантах опыта гибель экспланта наступала очень быстро по причине гнили почки. Инфицированность эксплантов I. ensata, I. sibirica в течение первых 7-10 дней была не высокая, что говорит о качественной поверхностной стерилизации, но в последующем времени достигала больших величин, вероятно за счет внутренней инфекции (табл. 2). Увеличение времени стерилизации больше 20 минут приводило к массовой гибели эксплантов.

Проведено изучение состава микроорганизмов выделенных из инфицированных эксплантов I. hybrida, I.ensata, I. sibirica, в сравнении с составом микрофлоры тканей корневищ интактных растений этих видов. Для I. hybrida в качестве ин-

фекционной микрофлоры эксплантов чаще всего выделялась Ervinia spp. Наличие данной бактерии в тканях корневищ интактных растений и время проявления в культуре in vitro (через 7-10 дней) говорит о том, что данная инфекция является внутренней и даже самые жёсткие способы стерилизации эксплантов для неё не эффективны. Для I. ensata, I. sibirica в качестве внутренней проявила себя грибная инфекция (табл. 3).

Таблица 2

Жизнеспособность и инфицированность вегетативных почек ириса в зависимости от способа стерилизации

Способ стерилизации Вид

I. Itybrida I. ensata I. sibirica

1 2 1 2 1 2

Хлоргексшши 0,5 мг/л 100 0 80 100 100 80

Сулема 0,2% р-р 80 50 60 100 70 100

70% этанол + 3% перекись водорода (1:1) 100 0 70 100 80 80

96%этанол 3% перекись водорода (1:1) 90 40 80 100 80 80

Сульфохлорантин 6% р-р 80 70 70 100 70 80

экспозиция 20 мин. 1 - инфицированность, %; 2 - жизнеспособность, %

Таблица 3

Микрофлора тканей корневищ I. hybrida, I. ensata, I. sibirica

Вид ириса Ткали интактных растений Ткани эксплантов введенных в культуру in vitro

I. hybrida Ervinia spp., дрояокеподобные грибы Ervinia spp, Pseudomonas spp., грибы рода Pénicillium

I. ensata Грибы рода Pénicillium Грибы рода Pénicillium

I. sibirica Bacillus spp, грибы рода Pénicillium и дрожжеподобные Bacillus spp., грибы рода Pénicillium

Для выделенных бактерий из родов Ervinia и Pseudomonas подобрана чувствительность к антибиотикам. Из 20 предложенных антибактериальных средств для введения в питательные среды отбирали менее токсичные антибиотики, и с высокой чувствительностью к ним микрофлоры.

При введении в культуру in vitro в питательные среды был добавлен антибиотик левомицетин в количестве 100 мг/л, контролем служила среда без антибиотиков. Для эксплантов культиваров I. ensata, I. sibirica процент инфицированности был на уровне контроля, что говорит о преобладании инфекции грибной этиологии. Для культиваров I. hybrida на средах с антибиотиком процент инфицированных эксплантов снизился до 20. Вероятно, для данного вида ириса более характерно наличие бактериальной микрофлоры.

При появлении грибной микрофлоры, использовали препарат фунгицидного действия тербинафин. Для инфицированных побегов I. hybrida, I.ensata, I. sibirica в концентрации 250 мг/л данный препарат оказался малотоксичным и эффективным.

Для выяснения зависимости регенерационных процессов от сезона, введение в культуру in vitro проводили в разные сроки: вынужденного покоя - ноябрь, активного роста - апрель, окончания роста - август. Влияние сезонных колебаний на увеличения числа побегов на эксплант отмечено не было, из одного экспланта

развивался только один побег. Согласно нашим наблюдениям, использование вегетативных почек в качестве эксплантов не эффективно ввиду их высокой контаминации сопутствующей микрофлорой, и как следствие низкой регенерационной способности.

3.2. Эмбриокультура ириса

Для ириса характерно замедленное развитие и дифференциация зародыша (Родионенко, 1961). Вьивлено, что оптимальным сроком изоляции зародышей являются 50-80 суток после опыления цветка. После 80 суток развития семян, эндосперм становился очень плотным, что затрудняло вычленение зародыша.

После поверхностной стерилизации плодов, зародыши вычленяли из семени и помещали на поверхность искусственной питательной среды MS с различным сочетанием гормональных и не гормональных стимуляторов роста. Лучшей питательной средой для введения зародышей явился вариант с содержанием бмкМ БАП 5мкМ НУК+ 100 мг/л L-глутамина + 100 мг/л аденинсульфата. Размноженные регенераты переносили для укоренения на среды, не содержащие гормональные добавки. Таким образом, за 4 месяца культивирования от одного зародыша в среднем было получено I. sibirica, гибрид 36-38-01 - 35 шт., I. hybrida, Lilac Line - 37 шт., I. ensata, гибрид 24-81-01- 13 шт. растений-регенерантов, пригодных для дальнейшего укоренения и адаптации к нестерильным условиям.

Была проанализирована серия поперечных анатомических срезов. Показано, что органы, развивающиеся у зародышей ириса в культуре in vitro, очень похожи по своему анатомическому строению на корневища ириса, с несколько активизированными зонами эндогенного геммогенеза и ризогенеза.

Метод эмбриокультуры позволяет значительно сократить время получения селекционного материала ириса и размножить его в достаточном количестве в короткие сроки. Но, к сожалению, метод не пригоден для размножения сортов.

Учитывая вышесказанное, в качестве первичных эксплантов были использованы органы цветка.

3.3. Морфогенез и регенерация фрагментов цветка видов ириса

Для успешной регенерации важным моментом явилась стадия развития цветков на момент введения в культуру ткани. Для выявления лучшего способа стерилизации бутонов было заложено 8 вариантов опыта. Только один вариант обеспечивал высокую стерильность органов цветка, одновременно с их высокой жизнеспособностью. Стерилизацию материала проводили в два этапа. На первом этапе бутоны, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигали в пламени спиртовки. Следующий этап обеззараживания проводили в 0,1% растворе сульфохлорантина в течение 30 минут. Подобный способ обеспечивал на 95% стерильность материала при 100% его жизнеспособности.

Были использованы культивары I. sibirica — Лаула, Кассандра, Стерх, Berlin Ruffles, Cambridge, King of King, гибрид 21-38-01,1. ensata - Усть-Катунь, гибриды № 28-50-00, 59-66-00,15-244-97,1-220-97, 8-91-97,1, hybrida - Assignment, Jaz-zamatazz, Ланцелот, Latin Lover, Chardette.

В первые две недели культивирования in vitro все экспланты (кроме пыльников) увеличились в размерах и приобрели зелёную окраску. Далее тип морфогене-тической реакции у эксплантов культиваров I. hybrida, 1. ensata, I.sibirica зависел

от количества и соотношения ауксинов и цитокининов, введённых в питательную среду, а также от типа первичного экспланта, каллусообразования не наблюдали.

Завязь 1. sibiríca и I. ensata, на питательных средах с 4-8 мкМ БАП и 3-5 мкМ НУК способна была регенерировать только корни, у I. hybrida регенерация отсутствовала.

Для культуры in vitro от генеративных побегов брали участки между кроющим листом и цветком. В качестве фитогормонов использовали 1-20мкМ БАП и 3-5мкМ НУК. У I. sibirica на питательных средах с 4 мкМ БАП, 4 мкМ НУК (1:1) и 4 мкМ БАП, 5 мкМ НУК (1:1,25) ответной реакцией было корнеобразование. На средах, где содержание цитокининов превышало содержание ауксинов в 1,2 раза и более, начиная с 6 мкМ БАП, фрагменты оси соцветия образовывали побеги. У культива-ров I. ensata, I. hybrida на всех испытанных средах наблюдали геммогенез.

Особый тип морфогенетической реакции в кулыуре in vitro мы наблюдали, используя в качестве эксплантов фрагменты трубки околоцветника. Из ткани экспланта развивались структуры похожие на доли околоцветника. Со временем эти структуры приобретали характерную для цветков данного сорта окраску. Экс-планты располагали на питательной среде адаксиальной стороной. При помещении эксплантов на поверхность среды абаксиальной стороной, признаков регенерации не наблюдали за всё время культивирования. На всех испытанных питательных средах при культивировании эксплантов трубки околоцветника отмечали 100% геммогенез с флоральными элементами. В качестве контроля использовали питательную среду содержащую 1мкМ БАП и 1мкМ НУК. На данной среде все экспланты в 0 пассаже увеличились в размерах, но в дальнейшем погибли в результате некроза тканей.

При использовании в качестве эксплантов рылец, столбиков и пыльников никаких морфогенетических изменений отмечено не было в течение всего периода культивирования (70 суток). Эти экспланты в 0 пассаже увеличились в размерах, но в дальнейшем погибли в результате некроза тканей. Регенерационная активность у эксплантов тычиночной нити и столбика пестика была отмечена в единичных случаях, не представляющих возможность для выявления закономерностей.

ГЛАВА 4. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭТАПОВ МОРФОГЕНЕЗА В ЭКСПЛАНТАХ ОРГАНОВ ЦВЕТКА ИРИСА В УСЛОВИЯХ IN VITRO

4.1. Этапы морфогенеза в эксплантах органов цветка видов ириса

Изучение анатомического строения оси соцветия I. sibirica сорта Berlin Ruffles и I. ensata гибрид 28, I. hybrida сорта Jazzamatazz (VI-VII этапы органогенеза) показало следующее. Генеративный побег покрыт эпидермой, образованной одним слоем клеток с кутикулой. Эпидермальные клетки плотно сомкнуты, имеют таблитчатую форму. Антиклинальные стенки клеток ровные. Клетки эпидермиса I. sibirica содержат пигмент в клеточном соке, у I. ensata и I. hybrida пигмента в клетках не обнаружено.

Первичная кора оси соцветия 1. ensata состоит из 15 слоев паренхимных клеток. Эти клетки имеют почти сферическую форму с тонкими целлюлозными стенками. УI. sibirica 11-12 слоёв клеток изодиаметрической формы. Цитоплазма клеток первичной коры I. ensata содержит продукты обмена веществ, вероятно крахмальные зёрна, пигментных включений не наблюдается. Напротив, I. sibirica со-

держит пигментные включения также и в клетках паренхимы первичной коры, зёрна крахмала не обнаружены. Общим для этих видов является содержание очагов интеркаллярной меристемы между паренхимными клетками первичной коры.

При малом увеличении (10x10) хорошо видно кольцо клеток, представляющее собой многорядный перицикл. У I. sibirica перицикл состоит из 4 клеточных слоёв. Под этим слоем располагаются проводящие пучки центрального цилиндра. У I. ensata перицикл имеет форму многогранника, состоит из 2-3 клеточных слоёв, в котором располагаются сплошной линией проводящие пучки (рис. 1). У L hybrida сорта Jazzamatazz под эпидермисом располагаются 12 слоёв паренхимы первичной коры. Клетки изодиаметрической формы, плотно сомкнуты. Между клетками первичной коры отмечены проводящие пучки.

Центральный цилиндр представлен клетками перицикла, основной паренхимой и закрытыми коллатеральными пучками. Клеток склеренхимы на данном этапе развития генеративного побега не обнаружено. Вся внутренняя осевая часть генеративного побега состоит из основной паренхимы, среди которой повсюду рассеяны закрытые проводящие пучки. Проводящие пучки располагаются в беспорядке. На периферии их больше, но они мелкие, в центре оси соцветия их меньше, но они крупнее. Центральный цилиндр у I. sibirica, I. ensata и I. hybrida имеет сходное анатомическое строение.

а) б)

Рис. 1. Анатомическое строение оси соцветия I. ensata гибрид 28 (Vi ~ VII этапы органогенеза); а) первичная кора и многорядный перицикл. (Увел. 10 х10), б) очаг интеркапярной меристемы. (Увел. 10 *40).

4.2. Сравнительный анализ гистогенеза и органогенеза в эксплантах генеративных органов культиваров I. hybrida, 1. ensata, I. sibirica

При гистологическом исследовании установлено, что морфогенетические процессы в эксплантах осевой природы (цветоносах) в культуре in vitro культиваров /. hybrida, l. ensata, I. sibirica проходят однотипно, что подтверждает близость на родовом уровне данных видов ириса.

Способность к дедифференциации и восстановлению меристематической активности в цветоносах ириса проявляют, прежде всего, клетки перицикла и нескольких прилегающих к нему внутренних слоёв первичной коры. Клеточные деления постепенно распространяются центробежно и центростремительно, вовлекая в этот процесс все слои клеток первичной коры, а также клетки обкладок проводящих пучков. По всей видимости, это особенность рода Iris. У гиацинта и нар-

циеса, описанных ранее О. А. Чуриковой (2005), меристематическую активность в начале процесса регенерации проявляют клетки неповреждённого субэпидер-мального и нескольких прилегающих к нему наружных слоев первичной коры.

Первые деления клеток эксплантов I. ensata и I. sibirica отмечали спустя 7 суток после помещения их на питательную среду. Этому предшествовала изоляция инициальной клетки, и в результате нескольких делений образование по-лиады (рис. 2). Экспланты I. hybrida обладают большей регенерационной активностью, первые полиады наблюдали на 4 сутки культивирования, а первые визуальные признаки геммогенеза - после 14 суток культивирования на данных питательных средах. Это на несколько дней раньше, чем у I. ensata и I. sibirica.

а) б)

Рис. 2. Анатомическое строение экснлантов оси соцветия I. sibirica сорт Berlin Ruffles на 10-е сутки культивирования: а) образование меристематического пояса (увел. 10*10); б) возникновение полиад (увел. 10x40)

Формирование гидроцитной системы было выявлено только в эксплантах I.hybrida, у I. ensata и 1. sibirica не наблюдали. Подобные васкулярные элементы отмечены ранее для гиацинтов, нарциссов, лилий (Чурикова, 2005; Набиева, 2008). Вероятно, это связано с местом обитания данных видов и условиями произрастания. I. hybrida способен расти в условиях повышенной сухости верхних горизонтов почвы. Его ткани запасают воду при помощи проводящей системы. Произрастание 1. ensata и 1. sibirica исторически связано с переувлажнёнными почвами, и делать запасы воды в тканях нет необходимости.

Побеги, развившиеся на эксплантах оси соцветия I. hybrida, I. ensata и Lsibirica имели исключительно эндогенное происхождение (рис. 3).

а) б) _

Рис.3. Эксплант оси соцветия /. куЬпс1а сорт .(аггап^агг на 22 сутки культивирования: а) внешний вид, б) анатомо-морфологическое строение (поперечный срез) (вел, 10x10)

Нами установлено, что регенерационной способностью обладала только адаксиальная сторона трубки околоцветника. При гистологическом анализе отмечен разный уровень регенерационной активности тканей внешней и внутренней стороны трубки околоцветника 1. hybrida, I. ensata, I. sibirica (рис. 4).

Рис. 4. Анатомическое строение трубки околоцветника I. ensata гибрид 28 на VI—VII этапах органогенеза; а) абаксиальная, б) адаксиальная сторона экспланта (увел. 10 х10)

В субэпидермальных слоях адаксильной стороны клетки паренхимы не утратили способности к меристематической активности. Именно здесь возникали по-лиады, из которых формировались множественные очаги деления и закладывались вегетативные побеги. На испытанных вариантах питательных сред с содержанием 4-8 мкМ БАП и 3-5мкМ НУК, отмечен геммогенез у всех культиваров данных видов ириса (рис. 5).

а) б)

Рис. 5. Анатомическое строение трубки околоцветника I. ensata гибрид 28 на 12 сутки развития; а) многочисленные полиады, б) усиление меристематической акгивности вдоль проводящих пучков (увел. 10 хЮ)

У 100% сформированных побегов вместо примордиев первых листьев развивались структуры похожие на доли околоцветника. Отмеченный феномен циклического воспроизводства генеративных структур может быть интерпретирован как результат экспрессии регуляторных генов, запускающих определённые мор-фогенетические процессы, что представляет, несомненно, теоретический интерес в изучении биологии развития цветковых растений (рис.6,7).

При сравнении динамики прохождения этапов гистогенеза и органогенеза в эксплантах трубки околоцветника у культиваров /. hybrida, I. ensata, I.sibirica в основном была отмечена их синхронность и однотипность.

а) б) в)

Рис. 6. Анатомо - морфологическое строение экспяанта трубки околоцветника /. sibirica сорт Berlin Ruñes на 25 сутки культивирования; а) внешний вид экспланта б) венчиковидный вырост, сформированный с!е novo, продольный срез (увел. 10x40), в) устьице (увел. 10 х40)

" II

t i

а) б) в)

Рис. 7. Флоральные элементы: а) 1. sibirica, б) I. ensata, в) I. hybrida

При дальнейшем культивировании эксплантов трубки околоцветника с целью получения активно пролиферирующей культуры, необходимо было изменить гормональный состав питательных сред, определяющим в этом являлось содержание цитокининов. Для /. sibirica содержание БАП должно быть в пределах 5-7,5мкМ, для I. ensata - 15-17,5мкМ, для /. hybrida - 2,5мкМ. Отличием также явилось заложение гидроцитной системы у эксплантов I.hybrida сорт Jazzamataz. У I. sibirica сорт Berlin Ruffles и I. ensata гибрид 28 подобного явления не наблюдали.

4.3. Морфогенез и регенерационная способность эксплантов околоцветник - завязь сортов и гибридов I. sibirica, /. ensata и I. hybrida

В целях микроклонального размножения I. ensata, К. Kawase (1995) первым использовал соединение околоцветник - завязь в качестве эксланта. В формировании пограничной зоны между венчиком и завязью принимают участие различные морфологические структуры: столбик пестика, трубка околоцветника, завязь, и на всём протяжении эта зона имеет неоднородную гистологическую структуру. В зависимости от того, какие именно её фрагменты использовали в качестве эксплантов, могут проявляться и различные особенности морфогенетической реакции последних.

Уже на 4-е сутки после введения в культуру in vitro отмечены очаги регене-рационной активности с образованием полнад. Далее формирование и развитие меристематических зон у экспланта околоцветник-завязь происходило аналогично таковому у трубки околоцветника.

Сформированные побеги несли флоральные элементы, что подтверждает их происхождение из тканей трубки околоцветника, её базальной части (рис. 8).

Рис. 8. Регенерация побегов с флоральными элементами у экеплантов околоцветник-завязь I. sibirica сорт Стерх на питательной среде MS с 4мкМ БАЛ и ЗмкМ НУК.

ВЫВОДЫ

1. Использование вегетативных почек I. hybrida, I. ensata, I. sibirica в качестве экеплантов не эффективно ввиду их высокой контаминации сопутствующей микрофлорой и низкой регенерационной способности. Для I.hybrida в качестве инфекционной микрофлоры экеплантов чаще всего выделялась Ervinia spp., для I. ensata и I. sibirica в качестве внутренней проявляла себя грибная инфекция.

2. Для получения стерильной активно пролиферирующей культуры необходимо провести микробиологический контроль экеплантов вегетативных почек введённых в культуру, определить чувствительность к антибиотикам выделенных микроорганизмов и добавлять малотоксичный антибиотик в состав питательной среды до тех пор, пока инфекция не перестанет проявлять себя, чередуя среды с антибиотиком и без него.

3. Оптимальный срок введения в культуру in vitro для зародышей ириса (I. hybrida, í. ensata, I. sibirica) - 50-80 суток после опыления. Лучшей питательной средой явился вариант с содержанием MS + бмкМ БАП +5мкМ НУК+ 100 мг/л L-глутамина + 100 мг/л адеиинсульфата.

4. Завязь у культиваров I. sibirica и /. ensata на питательных средах MS с 4-8 мкМ БАП и 3-5 мкМ НУК способна регенерировать только корни, у культиваров I. hybrida регенерация отсутствовала. У всех изученных видов ириса, при использовании в качестве экеплантов рылец, столбиков и пыльников никаких мор-фогенетических изменений на вышеописанных средах не отмечено.

5. Из всех типов экеплантов наибольшим регенерационным потенциалом обладали ось соцветия, трубка околоцветника, соединение околоцветник-завязь, не зависимо от видовой принадлежности растения.

6. На питательных средах MS с 4-8 мкМ БАП и 3-5 мкМ НУК фрагменты оси соцветия культиваров I. ensata, I. hybrida формировали только побеги. Тип мор-

фогенетической реакции у I. sibirica, зависел от количества и соотношения экзогенных фитогормонов. На питательных средах MS с 4 мкМ БАП, 4 мкМ НУК (1:1) и 4 мкМ БАП, 5 мкМ НУК (1:1,25) ответной реакцией было корнеобразова-ние, в вариантах, где содержание БАП превышало содержание НУК, регенерировали побеги.

7. Репродукция de novo элементов цветка устойчиво сохранялась у эксплан-тов трубки околоцветника всех изученных генотипов ириса не зависимо от концентрации фитогормонов в пределах опыта. Сформированные побеги имели строение типичное для вегетативных побегов однодольных растений.

8. Формированию очага меристематической активности во всех эксплантах органов цветка предшествует изоляция инициальной клетки и в результате нескольких делений образование полиады. Побеги образующиеся у всех типов экс-плантов имеют эндогенное происхождение.

9. Морфогенетические процессы в эксплантах осевой природы (в цветоносах) в культуре in vitro I. hybrida, /. ensata, I. sibirica проходят однотипно, что подтверждает близость на родовом уровне данных видов ириса. При этом у эксплан-тов I. hybrida первые полиады наблюдали на 4 сутки культивирования, а первые визуальные признаки геммогенеза - после 14 суток культивирования на данных питательных средах, это на несколько дней раньше, чем у I. ensata и I. sibirica. Формирование гидроцитной системы было выявлено только в эксплантах I. hybrida.

10. Адаксиальная и абаксиальная стороны трубки околоцветника у I. sibirica, /. ensata, I. hybrida на VI-VII этапах органогенеза отличаются по анатомическому строению. Адаксиальная сторона содержит адаксиальную меристему, вероятно, благодаря активности которой, побеги регенерируют только на данной стороне экспланта.

11. Синхронность и аналогичность прохождения этапов гистогенеза и органогенеза в эксплантах трубки околоцветника у I. hybrida, I. ensata, I. sibirica была отмечена при сравнении их динамики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В питательные среды для введения в культуру in vitro вегетативных почек ириса, необходимо добавлять малотоксичный антибиотик из списка предложенных на основе определения к ним чувствительности микроорганизмов - контами-нантов, выделенных у эксплантов.

2. Стерилизацию бутонов (на VI—VII этапах органогенеза) необходимо проводить в условиях ламинар-бокса в два этапа. На первом этапе бутоны, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, следующий этап обеззараживания проводят в 0,1% растворе сульфохлорантина в течение 30 минут. Это обеспечивает 95% стерильности фрагментов цветка при 100% их жизнеспособности.

3. Экспланты фрагментов трубки околоцветника в культуре in vitro необходимо располагать адакси&тыюй стороной на поверхности питательной среды, со-

держащей 4-8 мкМ БАП и 3-5 мкМ НУК, для активации регенерационных процессов.

4. Для приготовления постоянных гистологических препаратов органов цветка ириса, необходимо в качестве фиксатора использовать 10% формалин, а для проводки использовать ацетон.

5. Анатомо-морфологическое исследование эксплантов и изучение морфогенеза в динамике на тканевом уровне обязательно для выбора регенерационноспо-собных эксплантов и контроля прохождения этапов морфогенеза.

6. Разработанный способ прямой регенерации ириса рекомендуется использовать для получения активно пролиферирующей культуры ценных сортов и гибридов в условиях in vitro.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ СТАТЕЙ

1. Тихомирова Л.И. Особенности морфогенеза Iris sibirica L. в культуре in vitro. // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии. Материалы восьмой международной научно-практической конференции - Барнаул, 2009. - С. 364-369.

2. Тихомирова Л.И. Особенности введения в культуру in vitro ириса сибирского (/. sibirica L.). // Аграрная наука сельскому хозяйству. Сборник статей V Международной научно - практической конференции - Барнаул, 2010. - Книга 2. -С. 380-383.

•3. Тихомирова Л.И. Получение растений-регенерантов ириса из изолированных зародышей в условиях in vitro // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2010. - № 7 (69). - С. 45-49.

4. Тихомирова Л.И. Смирнов C.B. Морфогенез в культуре генеративных органов ириса сибирского и его гистологические аспекты. // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира. Сборник статей по материалам III Всероссийской научно-практической конференции. - Волгоград, 2010. - С 276-282.

5. Тихомирова Л.И. Смирнов C.B. Эмбриокультура ириса сибирского (I. sibirica L.). // Декоративное садоводство Сибири: проблемы и перспективы. Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения З.И. Лучник - Барнаул, 2010. - С. 188-192.

6. Тихомирова Л.И. Особенности микроклонального размножения сортов и гибридов ириса сибирского (/. sibirica L.) // Труды Томского государственного университета. Сер. биологическая. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2010. - Т. 274. -С. 377-381.

•7. Тихомирова Л.И. Получение стерильной активно пролиферирующей культуры ириса в условиях in vitro I ! Достижения науки и техники АПК. 2010. - № 8. -С. 37-40.

•8. Тихомирова Л.И. Особенности индукции морфогенеза из различных фрагментов цветка ириса в культуре in vitro //Turczaninowia. 2010. -№ 3 (3). - С. 147-151. • - журналы рекомендованные ВАК.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ гемморизогенез - образование корней и побегов; геммогенез - образование почек;

гидроциты - крупные клетки с сетчатым или спиралевидным утолщением клеточной стенки;

пассаж - время между двумя субкультивированиями; полиада - группа клеток под одной оболочкой;

пролиферация - новообразование тканей и клеток путём размножения; регенерант - растение, возникшее in vitro из соматических тканей; регенерационная способность - сумма признаков, проявляющихся на изолированном органе in vitro: каллусообразование, ризогенез, геммогенез (Лутова и др.,1994);

субкультивирование - перенос клеток в другой культуральный сосуд на свежую питательную среду.

Подписано в печать 22.04.2011 г. Формат 60x84/16. Бумага для множительных аппаратов. Печать ризографная. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №15.

Издательство АГАУ 656049, г. Барнаул, пр. Красноармейский, 98 62-84-26

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тихомирова, Людмила Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ IN VITRO.

1.1. Морфогенез растений in vitro.

1.1.1. Особенности протекания морфогенеза in vitro.

1.1.2. Гистологический анализ в культуре органов и тканей.

1.2. Факторы регуляции процессов морфогенеза.

1.3. Основные методы регенерации растений in vitro.

1.4. Ирис как объект биотехнологических исследований.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Исходный растительный материал.

2.2. Условия асептики и стерилизация растительного материала.

2.3. Методы исследования.

ГЛАВА 3. РЕАЛИЗАЦИЯ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ИРИСА (IRIS L.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO ПУТЁМ ПРЯМОГО ОРГАНОГЕНЕЗА.

3.1. Регенерационная способность почек вегетативного побега ириса.

3.2. Эмбриокультура ириса.

3.3. Морфогенез и регенерация фрагментов цветка видов ириса.

3.3.1.1, sibirica.

3.3.2.1, ensata.

3.3.3.1, hybrida.

ГЛАВА 4. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭТАПОВ МОРФОГЕНЕЗА В ЭКСПЛАНТАХ ОРГАНОВ ЦВЕТКА ИРИСА В УСЛОВИЯХ IN VITRO. 103 4.1. Этапы морфогенеза в эксплантах органов цветка видов ириса.

4.1.1.1. sibirica.

4.1.2.1, ensata.

4.1.3./. hybrida.

4.2. Сравнительный анализ гистогенеза и органогенеза в эксплантах генеративных органов культиваров I. hybrida, I. ensata, /. sibirica.

4.3. Морфогенез и регенерационная способность эксплантов околоцветник-завязь сортов и гибридов I. sibirica. I. ensata и I. hybrida.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности индуцированного морфогенеза и регенерации у различных типов эксплантов in vitro культиваров видов рода Iris L."

Растительные системы in vitro являются удобными моделями для исследования сложных механизмов, лежащих в основе пролиферации, клеточной дифференцировки, гистогенеза, органогенеза, соматического эмбриогенеза и регенерации целого организма из культивируемых клеток, обладающих тотипотентностью. В прикладном аспекте на основе знаний о биологии клетки in vitro разрабатываются, меристемные технологии, эмбриокультура, гаплоидные технологии, клеточная селекция, генная и клеточная инженерия (Круглова, 1997; Высоцкий, 1998; Митрофанова, 2007; Журавлёв, Омелько, 2008). Регенерация растениш и морфогенез in vitro являются основополагающими моментами: всей методологии культуры клеток и тканей; в том числе и клонального микроразмножения (Бутенко, 1999).

Род Iris L. самый большой и* наиболее сложный; из семейства Iridaceae Juss. (Родионенко, 1988; Родионенко, Тихонова, 1996), виды которого произрастают в Европе, Азии, Северной Америке, Северной Африке. Разнообразие и богатство окрасок цветков этих растений по праву сравнивается с красивейшим явлением природы. Проблеме сохранения и изучения видов1 рода Iris посвящены, работы многих российских и зарубежных авторов (Родионенко, 1961; Yabuya et al., 2004; Алексеева, 2005; Доронькин, 2006; Долганова, 2008; Миронова, 2008),

В ГНУ НИИСС им. М.А. Лисавенко создан большой коллекционный, фонд этой культуры. Возникающие трудности при традиционном размножении, в процессе селекции и сохранения генотипов ирисов, заставляют ученых обращаться к современным методам биотехнологии растений. Известны работы по размножению in vitro видов (/. sibirica L., I. ensata Thunb., I. hybrida hort/рода Iris- L. (Yabuya, 1981, Yabuya et al., 1991; Kawase et al., 1995; Ишмуратова, 1999; Болтенков, 2002; Полковникова, 2000; Вечернина и др., 2004; Ветчинкина, Мамаева, 2005, Ветчинкина и др., 2007, Мамаева, 2008).

Несмотря на имеющиеся экспериментальные работы в области изучения процессов морфогенеза и регенерации растений в условиях культуры тканей, для ириса до сих пор остаются недостаточно разработанными системы получения растений in vitro. Это обусловлено отсутствием четких, хорошо воспроизводимых методик, их трудоемкостью, недостатком знаний о морфогенетическом потенциале органов и тканей, а также способах управления морфогенезом для этой культуры.

Изучение поведения эксплантов генеративных органов ириса в культуре in vitro представляет теоретический и практический интерес. Большая часть работ проводится в области эмбриокультуры, а регенерационная способность соматических тканей генеративных органов остаётся сравнительно слабо изученной. В гистологическом плане культура органов и тканей цветочно-декоративных, плодовых и ягодных растений мало описана. Анатомического описания процессов регенерации в динамике развития в доступной нам литературе не обнаружено.

В связи с этим изучаемая проблема является актуальной и практически значимой.

Задачи:

- изучить регенерационную способность почек вегетативного побега ириса;

- показать возможный способ устранения микробного загрязнения эксплантов путём микробиологического контроля, определения чувствительности к антибиотикам выделенных микроорганизмов-контаминантов и введения антибиотиков в питательную среду;

- усовершенствовать метод эмбриокультуры для данных видов ириса; изучить особенности реализации морфогенетического потенциала эксплантов органов цветка через прямой органогенез; провести анатомо-морфологический анализ тканей эксплантов репродуктивных органов интактных растений;

Основные положения, выносимые на защиту:

- трубка околоцветника - идеальный тип экспланта для клонального микроразмножения сортов и гибридов I. sibirica, I. ensata, I, hybridan

- применение гистологического анализа позволяет контролировать процессы на тканевом уровне, для того чтобы направлять морфогенез в нужном для исследователя русле.

Научная новизна. Впервые проведен микробиологический контроль эксплантов почек вегетативного побега ириса, введённых в культуру in vitro, и определена чувствительность к антибиотикам выделенных микроорганизмов. Доказана необходимость введения малотоксичного антибиотика в состав питательных сред до тех пор, пока инфекция не перестанет проявлять себя, чередуя среды с антибиотиком и без него.

Доказан позитивный эффект от введения в питательную среду L-глутамина и аденин сульфата на адвентивное побегообразование у зародышей ириса. Показано, что органы, развивающиеся у зародышей ириса в культуре in vitro, по своему анатомическому строению сходны с нативным корневищем ириса, с несколько активизированными зонами эндогенного геммогенеза и ризогенеза.

Впервые показаны различные пути реализации морфогенетического потенциала (геммогенез, гемморизогенез, ризогенез) у соматических тканей органов .цветка ириса в процессе прямой регенерации in vitro. Установлена высокая регенерационная способность трубки околоцветника в культуре in vitro у всех изученных культиваров. Показано влияние расположения экспланта на питательной среде, концентрации фитогормонов на процесс прямой регенерации растений ириса.

Впервые проведён сравнительный анализ анатомического строения- разных типов эксплантов у I. sibirica, I. ensata, I. hybrida, а также гистологический анализ динамики процессов органогенеза в кулыуре in vitro органов цветка. Выявлено, что формированию очага меристематической активности в эксплантах органов цветка ириса (трубка околоцветника, ось соцветий) предшествует изоляция инициальной клетки и образование полиады. Побеги образующиеся de novo эндогенного происхождения. Для I. hybrida характерно формирование гидроцитной системы.

Анатомически доказано, что адаксиальная и абаксиальная стороны трубки околоцветника у I. sibirica, I. ensata, I. hybrida отличаются по своему строению. Адаксиальная сторона содержит адаксиальную меристему, благодаря активности которой, побеги регенерируют только на данной стороне экспланта. Побеги, сформированные у эксплантов трубки околоцветника изученных видов ириса, имеют типичное строение для вегетативных побегов однодольных растений, а флоральные элементы развиваются на месте примордиев первых листьев.

Методами гистологического анализа выявлены сходства и различия в динамике прохождения этапов морфогенеза у разных видов ириса (/. sibirica, I. ensata, I. hybrida) и разных типов экспланта (ось соцветия и- трубка околоцветника).

Практическое значение полученных результатов. Впервые разработан способ прямой регенерации из разных типов эксплантов I. sibirica, I. ensata, L hybrida, позволяющий получать активно пролиферирующую культуру ириса.

Разработан метод введения в культуру in vitro почек вегетативного побега ириса, позволяющий получить стерильный материал, на основе микробиологического контроля,, определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам и введения малотоксичного антибиотика, из списка предложенных, в питательную среду для культивирования эксплантов.

Усовершенствован метод эмбриокультуры ириса: определён срок изоляции зародыша, подобраны питательные среды, проведено анатомо-морфологическое изучение регенерантові

Усовершенствованна методика приготовления гистологических препаратов. Полученные данные анатомо-морфологических исследований- предоставляют возможность целенаправленно изменять определённые факторы: гормональный состав питательной среды, тип экспланта, время культивирования для' контроля морфогенеза в культуре in vitro.

Личный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены соискателем в лаборатории биотехнологии и цитологии ГНУ НИИСЄ им. М.А. Лисавенко (НИИСС). Микробиологические исследования и приготовление гистологических препаратов проведено совместно с сотрудниками лабораторий бактериологии и гистологии Краевой клинической больницы г. Барнаула.

Апробация работы.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 научных статей, в том числе 3 статьи в рецензируемых изданиях, 5 — в сборниках материалов и тезисов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах; состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, 21 таблицы, 69 рисунков и приложения. Библиографический список включает 256 источников, в том числе 100 - на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Тихомирова, Людмила Ивановна

ВЫВОДЫ

1. Использование вегетативных почек I. hybrida, I. ensata, I. sibirica в качестве эксплантов не эффективно ввиду их высокой контаминации сопутствующей микрофлорой и низкой регенерационной способности. Для I. hybrida в качестве инфекционной микрофлоры эксплантов чаще всего выделялась Ervinia spp., для I. ensata и /. sibirica в качестве внутренней проявляла себя грибная инфекция.

2. Для получения стерильной активно пролиферирующей культуры необходимо провести микробиологический контроль эксплантов вегетативных почек введённых в культуру, определить чувствительность к антибиотикам выделенных микроорганизмов и добавлять малотоксичный антибиотик в состав питательной среды до тех пор, пока инфекция не перестанет проявлять себя, чередуя среды с антибиотиком и без него.

3. Оптимальный срок введения в культуру in vitro для зародышей ириса (/. hybrida, I. ensata, I. sibirica) - 50-80 суток после опыления. Лучшей питательной" средой явился вариант с содержанием MS + бмкМ БАЛ +5мкМ НУК+ 100 мг/л L-глутамина +100 мг/л аденинсульфата.

4. Завязь у культиваров /. sibirica и I. ensata на питательных средах MS с 4-8 мкМ БАЛ и 3-5 мкМ НУК способна регенерировать только корни, у культиваров I. hybrida регенерация отсутствовала. У всех изученных видов ириса, при использовании в качестве эксплантов рылец, столбиков и пыльников никаких морфогенетических изменений на вышеописанных средах не отмечено.

5. Из всех типов эксплантов наибольшим регенерационным потенциалом обладали ось соцветия, трубка околоцветника, соединение околоцветник-завязь, не зависимо от видовой принадлежности растения.

6. На питательных средах MS с 4-8 мкМ БАЛ и 3-5 мкМ НУК фрагменты оси соцветия культиваров I. ensata, I. hybrida формировали только побеги. Тип морфогенетической реакции у I. sibirica, зависел от количества и соотношения экзогенных фитогормонов. На питательных средах MS с 4 мкМ БАЛ, 4 мкМ НУК (1:1) и 4 мкМ БАЛ, 5 мкМ НУК (1:1,25) ответной реакцией было корнеобразование, в вариантах, где содержание БАЛ превышало содержание НУК, регенерировали побеги.

7. Репродукция de novo элементов цветка устойчиво сохранялась у эксплантов трубки околоцветника всех изученных генотипов ириса не зависимо от концентрации фитогормонов в пределах опыта. Сформированные побеги имели строение типичное для вегетативных побегов однодольных растений.

8. Формированию очага меристематической активности во всех эксплантах органов цветка предшествует изоляция инициальной клетки, и в результате нескольких делений образование полиады. Побеги образующиеся у всех типов эксплантов имеют эндогенное происхождение.

9. Морфогенетические процессы в эксплантах осевой природы (в цветоносах) в культуре in vitro I. hybrida, I. ensata, I. sibirica проходят однотипно, что подтверждает близость на родовом уровне данных видов ириса. При этом у эксплантов I. hybrida первые полиады наблюдали на 4 сутки культивирования, а первые визуальные признаки геммогенеза - после 14 суток культивирования на1-данных питательных средах, это, на несколько дней раньше, чем у 7. ensata и 7. sibirica. Формирование гидроцитной системы было выявлено только в эксплантах 7. hybrida.

10. Адаксиальная и абаксиальная стороны трубки околоцветника у 7. sibirica, I. ensata, I. hybrida на VI-VII этапах органогенеза отличаются по анатомическому строению. Адаксиальная сторона содержит адаксильную меристему, вероятно, благодаря активности которой, побеги регенерируют только на данной стороне экспланта.

11. Синхронность и аналогичность прохождения этапов гистогенеза и органогенеза в эксплантах трубки околоцветника у 7. hybrida, 7. ensata, 7. sibirica была отмечена при сравнении их динамики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В питательные среды для введения в культуру in vitro вегетативных почек ириса, необходимо добавлять малотоксичный антибиотик из списка предложенных на основе определения к ним чувствительности микроорганизмов — контаминантов, выделенных у эксплантов.

2. Стерилизацию бутонов (на VI — VII этапах органогенеза) необходимо проводить в условиях ламинар-бокса в два этапа. На первом этапе бутоны, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, следующий этап обеззараживания проводят в 0,1% растворе сульфохлорантина в течение 30 минут. Это обеспечивает 95% стерильности фрагментов цветка при 100% их жизнеспособности.

3. Экспланты фрагментов трубки околоцветника в культуре in vitro необходимо располагать адаксиальной стороной на поверхности питательной среды MS, содержащей 4-8 мкМ БАП и 3-5 мкМ НУК, для активации регенерационных процессов.

5. Анатомо-морфологическое исследование эксплантов и изучение морфогенеза в динамике на тканевом уровне обязательно для выбора регенерационноспособных эксплантов и контроля прохождения этапов морфогенеза.

6. Разработанный способ прямой регенерации ириса рекомендуется использовать для получения активно пролиферирующей культуры ценных сортов и гибридов в условиях in vitro. t f

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тихомирова, Людмила Ивановна, Барнаул

1. Абу Камиль Ахмед. Создание высокоэффективной системы микроклонального размножения генетически стабильных растений гладиолуса. Автореф. дис. .канд. биол. наук. Москва, 2000. - 23 с.

2. Алаторцева Т.А., Лобанова Л.П., Еналеева Н.Х. Морфогенетические преобразования неопыленных завязей и семяпочек табака в культуре in vitro II Репродуктивная биология, генетика и селекция, 2002. С. 76-82.

3. Алексеева Н.Б. Виды рода Iris во флоре России: Проблемы охраны в природе и интродукции. Дис. .канд. биол. наук. Санкт-Петербург, 2005. - 230 с.

4. Алешина E.H. Культивирование можжевельника сибирского (Juniperus sibirica В.) в условиях in vitro и получение биологически активных веществ на его основе. Автореф. дис. .канд. технич. наук. Красноярск, 2006. - 20 с.

5. Алехно Г.Д., Высоцкий В.А. Биотехнология в, цветоводстве. Клональное микроразмножение роз // Цветоводство, 1986. №1 - С. 16-17.

6. АС №1685323 МПК5 А 01 Н4/00. Способ выращивания растений in vitro.

7. Бабикова A.B., Горпенченко Т.Ю., Журавлёв Ю.Н. Растения, как объект биотехнологии // Комаровские чтения, 2007. Вып LV. - С. 184-211.

8. Байбурина Р.К., Мухаметвафина A.A., Миронова Н. Н.Особенности регенерации гибридов азиатских лилий из фрагментов соцветий в культуре in vitro II Сельскохозяйственная биология. Сер. Биология растений, 2006. №1. - С.80-85.

9. Байбурина Р.К., Мухаметвафина A.A. Опыт культивиривания некоторых видов Lilium L. in vitro II Раститительные ресурсы, 2004. № 1. - С. 82-89.

10. Байбурина Р.К., Ахметова А.Ш., Миронова Л.Н., Шаяхметов И.Ф Эмбриокультура тюльпанов. // Вестн. Башк. ун-та, 2007. Т. 12. - №4. - С .33-35.

11. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. М.: МГУ, 2004. - 312 с.

12. Барыкина Р.П., Чурикова O.A. Особенности морфогенеза некоторых видов Scilla L. II Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология, 2004. № 1. - С. 20-23.

13. Батыгина Т.Б., Всильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vitro и in vivo. Эмбриогенез у покрытосеменных растений // Бот. журнал, 1978. Т. 63. — №1.-С. 87-110.

14. Батыгина Т.Б. Пыльник как модель изучения морфогенетических потенций и путей морфогенеза // Всесоюз. симп. "Развитие мужской генеративной сферы растений (морфофизиологические аспекты)": Тез. докл. Симферополь, 1983. - С. 9-10.

15. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Л.: Наука, 1987. - 103 с.

16. Батыгина Т.Б., Круглова H.H., Горбунова В.Ю. Культура изолированных пыльников злаков с позиции экспериментальной эмбриологии растений (методологические аспекты). Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. - 32 с.

17. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения новая категория способов размножения цветковых растений // Тр. Ботан. ин-та им. В.Л.Комарова. - СПб, 1993. - Вып. 8. -С. 15-25.

18. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений. СПб.: С-Петерб. унта, 2002. - 232 с.

19. Батыгина Т.Б., Брагина Е.А., Ересковский A.B. Островский А.Н. Живорождение у растений и животных: беспозвоночных и низших хордовых. -С.ПбГУ, 2006.- 134 с.

20. Биологическая энциклопедия. Применение антибиотиков в растениеводстве.-2010. hhh;//academic/ru.

21. Болтенков Е.В., Лабецкая Н В., Журавлев Ю.Н. Введение в культуру ткани in vitro Iris oxipetala Bunge продуцента пигментов // Физиол. раст. - наука 3-го тысячелетия. Материалы Междунар. конф. - Москва, 1999. - С. 98-100.

22. Болтенков Е.В., Лабецкая Н В., Журавлев Ю.Н. Получение и культивирование каллусной ткани Iris setosa Pall, ex Link // Биотехнология, 2000. № 5. - С. 47-51.

23. Болтенков Е.В. Культура клеток — альтернативный способ сохранения и использования дальневосточных видов Iris L. // Докл. 2 Всероссийской конференции «Проблемы региональной экологии». Томск, 2000 - С. 150.

24. Болтенков Е.В., Рыбин В.Г., Куликов Д.В. Культура тканей Iris ensata Thunb. перспективный источник новых антиоксидантов флавоноидной природы // Тезисы докладов 6 Международной конф. «Биоаксиданты». - Москва, 2002. - С. 677-678.

25. Болтенков Е.В. Изучение особенностей культивирования in vitro тканей дальневосточных видов рода Iris L. (Iridaceae) для использования в биотехнологии. Автореф. дис. .канд. с.-х. наук. — Владивосток, 2002. 19 с.

26. Болтенков Е.В., Рыбин, В.Г., Зарембо Е.В. Особенности культивирования каллусной ткани Iris ensata Thunb. // Прикладная биохимия и микробиология, 2004. Том 40. - № 2. - С. 244-252.

27. Болтенков Е.В., Зарембо Е.В. Регенерация и каллусогенез в культуре in vitro тканей органов цветка видов рода Iris L. (Iridaceae) II Изв. РАН Сер. биол, 2005. — №2.-С. 174-179.

28. Болтенков Е.В., Миронова JI.H., Зарембо Е.В. Влияние фитогормонов на регенерацию в1 каллусной культуре Iris ensata Thunb. // Изв. РАН Сер. биол, 2007. -№5. С. 539-544.

29. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. - 272 с.

30. Бутенко Р.Г. Дифференциация и морфогенез в культуре тканей, клеток и протопластов/ Биология развития растений. М.: Наука, 1975. - С 48-65.

31. Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре . тканей растений. Гормональная регуляция онтогенеза растений. М., 1984. - С. 42-54.

32. Бутенко Р.Г. Состояние и перспективы изучения морфогенеза растений // Всесоюз. об-во физиологов раст, 1990. Вып. 8. - С. 5-8:

33. Бутенко Р.Г. Клеточные и молекулярные аспекты морфогенеза растений in vitro /УЧайляхяновские чтения. Пущино, 1994. - С. 7-26.

34. Бутенко Р.Г. Биология клеток растений in vitro и биотехнология на их основе. -М.: ФБК-ПРЕСС, 1999: 160 с.

35. Васильева О.Г., Александрова М.С. Биологические основы клонального микроразмножения и регенерации интродуцированных видов рододендрона in vitro!! Бюллетень главного ботанического сада. Академия наук СССР, 1999. Вып. 189.-С. 44-52.

36. Васильев А.Е., Воронин Н.С., Еленевский А.Г., Серебрякова Т.И. Ботаника. Анатомия и морфология растений. М.: Просвещение, 1978. - 478 с.

37. Вечернина H.A., Таварткиладзе O.K., Клементьева Л.А., Долганова З.В. Особенности регенерации и размножения растений рода Iris (Iridaceae) in vitro II Раст. ресурсы, 2004. T.40.,- Вып.4. - С. 56-64.

38. Вечернина H.A. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений. Барнаул: изд-во Алт. ун-та, 2004. - 205 с.

39. Вихристова Г.И. Культура изолированных зародышей нарцисса // Цветоводство, 1981. -№ 6. С. 11.

40. Деменко В.И. Особенности пролиферации боковых побегов при микроклональном размножении садовых растений // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2007. №1. - С.9-14.

41. Джигадло М.И. Использование биотехнологических и биофизических методов в селекции и сорторазведении плодовых и ягодных культур. Автореф. дис. . .канд. с.х. наук. — Москва, 2003. 19 с.

42. Дмитриева H.H. Проблема регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей растений. Культура клеток растений. - М.: Наука, 1981. -С.113-123.

43. Долганова З.В. Биология и интродукция цветочно-декоративных корневищных многолетников в Западной1 Сибири. Новосибирск, 2002. - 232 с.

44. Долганова З.В. История интродукции и селекции ириса в Алтайском крае // Современные тенденции развития промышленного садоводства. Материалы Международной научно-практической конференции Барнаул, 2008. - 438 с.

45. Доронькин В.М. Систематика рода Iris L. {Iridaceae Juss.) Азиатской России // Роль ботанических садов < в сохранении ^ биоразнообразия растительного мира Азиатской России: настоящее и будущее. Новосибирск, 2006. - С. 101-103.

46. Журавлёв Ю.Н., Омелько A.M. Морфогенез у растений in vitro. II Физиология растений, 2008. Т. 55. - № 5. - С. 643-664.

47. Зарипова A.A. Разработка технологии клонального микроразмножения пиона уклоняющегося: Paeonia anómala L.: Дис. . .канд. биол. наук. — Уфа, 2006. 181 с.

48. Зайцев F.H. Математика в экспериментальной ботанике. М.: Наука, 1990. -296 с.

49. Ишмуратова М.М. Особенности культивирования in vitro растений различных экологических групп на примере видов рода Iris L. // Растительные ресурсы, 1999. -№4.-С. 67-74.

50. Ишмуратова М.М., Рахимова А.Ф. Использование культуры in vitro для размножения гибридов Iris L. //Растительные ресурсы. 1999. - № 4. - С.74-78.

51. Калеженкова М., Аш О., Лоскутова Н. Хоста: размножение in vitro. II Цветоводство, 2003. №6. - С. 10.

52. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры в физиологии и биохимии растений. — Киев, 1980. 488 с.

53. Каляева М. Бегония in vitro II Цветоводство, 2001. №4. -С.12. Каменецкая, И.И. Органогенез в культуре изолированных тканей луков // Вестн. АН КазССР, 1982. - № 9. - С. 43-47.

54. Катаева Н.В. Клональное микроразмножение растений. М. Наука, 1983.97с.

55. Катаева Н.В. Культура тканей и органов фрезии // Физиология растений, 1981. -Т.28, вып.5. С. 1062-1064.

56. Коваленко О.В. Генетические аспекты морфогенеза растений//Успехи соврем. Биологии, 1993. Т. 113. - Вып. 3. - С. 269-285.

57. Козицкий Ю.Н. Культура тканей в цветоводстве // Цветоводство, 1981. №5. -С.16.

58. Константинова Т.Н., Аксенова Н.П., Сергеева Л.И., Чайлахян М.Х. Взаимное влияние света и гормонов на регуляцию морфогенетических процессов в культуре in vitro И Физиология растений, 1998. Т. 34. - № 4. - С. 795-802.

59. Корнацкий С.А. О проблеме роста регенерантов при клональном микроразмножении // Повышение эффективности садоводства в современных условиях. Материалы Всероссийской научно-практической конференции -МичГАУ, 2003. Т.2. - С. 330-335.

60. Коротков О.И. Формирование и комплексное изучение коллекции клематисов (род Clematis L.): биотехнологические и молекуляро-генетические аспекты. Автореф. дис. . .канд. биол. наук. — Москва, 2008. — 20 с.

61. Кравец B.C., Колесников Я.С., Кузнецов В.В., Романов Г.А. Регуляторы роста растений: внутриклеточная гормональная регуляция и применение в аграрном производстве // Физиология растений, 2008. — Т.55. С. 629-640.

62. Кренке Н. П. Хирургия растений (травматология). М.: «Новая деревня», 1928.-182 с.

63. Кренке Н.П. Фeнoгeнeтичecкaя^ изменчивость. — М.: Изд-во Биологического института им. К.А.Тимирязева, 1933-1935. Т.1. - 500с.

64. Кренке Н.П. Теория циклического старения и омоложения растений.- М.: Сельхозгиз, 1940. - 133 с.

65. Кренке Н.П. Регенерация растений. Л.: Изд-во АН СССР, 1950. - 674 с.

66. Крючкова В.А. Биотехнологические приёмы оптимизации микроклонального размножения и адаптации генотипов сирени (Syringae vulgaris L.): Дис. .канд. биол. наук. Москва, 2005. - 240 с.

67. Круглова H.H., Горбунова В.Ю. Каллусогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков //Успехи соврем. Биологии, 1997. Т. 117., Вып. 1.- С. 83-94.

68. Кузьмина H.A. Основы биотехнологии, http: www.biotechnolog.ru 2008.

69. Кулаева О.Н. Физиология растений. М.: Наука, 1962. - С. 229.

70. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции. М.: Наука, 1973. -105 с.

71. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК й белка. М.: Наука, 1982. - 159 с.

72. Кулаева О.Н. Физиология растений. М.: Наука, 1995. - С. 661.

73. Куперман М.Ф. Морфофизиология растений. Морфофизиологический анализ этапов органогенеза различных жизненных форм покрытосеменных растений. -М.: Высш. школа, 1973. — 256 с.

74. Лапинская М.П. Клональное микроразмножение промышленных сортов гладиолуса. Автореф. дис. . .канд. с.-х. наук. М., 1998. - 19 с.

75. Лунева Л.С. Размножение ирисов (Iridaceae) методом культуры апикальных меристем in vitro //Ботанический журнал, 1977. Т. 62. - С. 416-421. "

76. Лунева Л.С. Строение и биология вегетативных почек ириса (.Iridaceae) //Ботанический журнал, 1977. Т. 62 - С. 563-568.

77. Лутова Л.А., Верзина И.И. Наследование способности к каллусо- и корнеобразованию у изолированных семядолей редиса в условиях асептической культуры //Генетика, 1984. Т. XX. - № 10. - С. 1663-1670.

78. Лутова Л.А., Бондаренко Л.В., Бузовкина И.С., Левашина Е.А., Тиходеева О.Н., Ходжайкова Л.Т., Шарова Н.В., Шишкова С.О. Влияние генотипа растения на регенерационные процессы //Генетика, 1994. Т. 30. -№ 8. - С. 1065-1074.

79. Мамаева H.A. Сравнительный анализ морфологических и биологических признаков сортов бородатых ирисов. Автореферат дис. .канд. биол. наук. -Москва; 2008. 20 с.

80. Мамаева С.Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток. Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. — С. 78 — 98.

81. Митрофанова O.B. Биотехнология в цветоводстве. Производство на безвирусную основу // Цветоводство, 1986. №1. - С. 15-16.

82. Митрофанова О.В., Иванова H.H. Получение безвирусных клонов луковичных цветочных культур // Бюлл. Никитского бот. сада, 1987. Вып. 62. -С. 37-41.

83. Мозафари Али Акбар. Оптимизация' технологии ускоренного размножения ценных генотипов земляники in vitro. Автореф. дис. . .канд. с.-х. наук. Москва, 2004.-20с.

84. Молчанов Е.Ф., Соболева Л.Е., Митрофанова О.В. Микроразмножение редких декоративных растений // Цветоводство -1984. №5. - С. 13-14.

85. Мошкин Е.В., ЛукаткинА.С. Влияние регуляторов роста на морфогенез Лангифлорум-Азиатик гибридов лилии в культуре in vitro П Агрохимия, 2005. — № 3. С.55-59.

86. Мошкин Е.В., Лукаткин A.C. Масс-клональное размножение гладиолуса in vitro II Биотехнология, 2005. № 1. - С. 19-26.

87. Мошкин Е.В. Морфофизиологические особенности клонального микроразмножения in vitro различных сортов лилий (Lilium L.) и гладиолусов {Gladiolus L.). Дис. .канд. биол. наук. Саранск, 2005. - 155 с.

88. Мухаметвафина A.A. Регенерация in vitro Lilium regale Wils. II Актуальные проблемы биологии и экологии. Тезисы докладов 9 Молодежной научной конференции. Сыктывкар, 2002. - С. 102-103.

89. Набиева А.Ю. Преимущества использования методов культуры ткани при размножении новых сортов лилии // Садоводство и цветоводство на современном этапе. Сборник научных трудов юбилейной конференции. Новосибирск, 2005. -С. 203-207.

90. Набиева А.Ю. Сохранение и размножение в культуре in vitro генотипов редких видов лилий азиатской части России: Дис. .канд. биол. наук. -Новосибирск, 2008. 152 с.

91. Нам И.Я. Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro: Дис. .д-ра. биол. наук. Москва, 2004. - 314 с.

92. Нескородов Я.Б., Мишуткина Я.В., Гапоненко А.К., Скрябин К.Г. Метод регенерации in vitro побегов подсолнечника {Heliantus annuus L.) из асептических семян, как эксплантов для генетической трансформации // Биотехнология, 2007. -№6. -С. 27-33.

93. Николаенко Н.П. Жизнь корневища ириса // Цветоводство, 1962. № 2. -С.16-18.

94. Патент США № 5952231 МПК6 С12 N 5/00/ 3. № 08/931661 Mikcropropagation of rose plants.

95. Патент США № 6168952 МПК7 С12 Т 5/00, А 01В 79/00/ 3. № 09/128666/ Method for producing flovering orchids in vitro.

96. Патент США. № 6323394 МПК7 A01H 1/00, C12N 15/82/ 3. №09/263485 Tissue culture process for producing a lagre number of viable mint plants in vitro.

97. Патент США № 6492174. МПК7 C12 N 5/00, C12 N 5/02. 3. №09/685338 Метод инициации эмбриогенных культур в растениях.

98. Патент СССР, а.с. № 1695854 МПК5 А01Н 4/00. Способ размножения гладиолуса.

99. Патент РФ № 2102870 МПК5 А01Н4/00, С Способ выращивания растений in vitro.

100. Патент РФ № 2152150 МПК7 А01Н 4/00. Способ получения оздоровленного invitro посадочного материала Gerbera jamesonii bolus.

101. Патент РФ № 2286053 МПК А 01Н 4/00, А 01Н 5/00. Способ размножения гладиолуса in vitro.

102. Патент РФ № 2290786 МПК А 01Н 1/04, A 01G 7/00, С12 N 5/04. Способ микроклонального размножения листовой бегонии.

103. Поздняков И.А. Особенности микроклонального размножения шиповника и декоративных сортов рода Rosa L. Автореф. дис. '.канд. с.-х. наук. Москва, 2007. - 20 с.

104. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. - 248 с.

105. Полковникова Л.А. Перспективы культивирования ириса в условиях лесостепи Алтайского края: Дис. канд. с.-х. наук. Барнаул, 2000. - 154 с.

106. Родин А.Р., Калашникова Е.А. Использование методов клеточной и генной инженерии для получения посадочного материала древесных пород. М.: МГУЛ, 1993.- 90 с.

107. Родионенко Г. И. Ирис. М.: Изд-во Минкомхоз. РСФСР, 1961. - 60 с.

108. Родионенко Г. И. Ирисы. Л.: Агропромиздат. Ленинград, отд-ние, 1988. -159 с.

109. Родионенко Г. И., Тихонова М.Е. Ирисы (наиболее пригодные для северных районов и для оформления водоемов повсюду). Информсервис, ЛТД, 1996. — 105с.

110. Родионенко Г. И. Систематические обзоры и новые таксоны // Ботанический журнал. 2009.- №3.- С. 423-433.

111. Романов Г.А., Медведев С.С. Ауксины и цитокинины в развитии растений. Последние достижения в исследованиях фитогормонов // Физиология растений. -2006.- Т. 53.-С. 309-319.

112. Ростовцева З.П. Верхушечная меристема. М.: МГУ, 1969. - 80 с.

113. Румынии В.А., Слюсаренко А.Г. Масс-клональное размножение лилий // Бюллетень главного ботанического сада. Академия наук СССР, 1989. Вып. 153. -С. 61-69.

114. Румынии В.А., Агаджанян И.В., Слюсаренко- А.Г. Масс-клональное размножение гладиолусов // Бюллетень главного ботанического сада. Академия наук СССР, 1990. Вып. 156. - С. 68-72.

115. Смоленская С.Е. Регенерация у растений: теоретические и методические аспекты // Повышение эффективности селекции и семеноводства сельскохозяйственных растений. Доклады и сообщения VIII генетико-селекционной школы. Новосибирск, 2001. - С. 95-98.

116. Слюсаренко А.Г. Проблемы масс-клонального размножения растений // Бюллетень главного ботанического сада. Академия наук СССР, 1989. Вып. 153. -С. 57-61.

117. Соколова М.А., Пугачева Г.М. Клональное микроразмножение лилий: введение в культуру in vitro И Интродукция нетрадиционных и редких растений. Материалы VIII Междунар. науч.-метод. конф. Мичуринский госагроуниверситет, 2008. — Т.З. - С. 78-82.

118. Терещенков А. Сибирские ирисы. // В мире растений. 2002. - №2. - С. 32-36.

119. Тихомирова Л.И. Особенности микроклонального размножения сортов и гибридов ириса сибирского (/. sibirica L.) // Труды Томского государственного университета. Сер. биологическая, 2010. С 377-381.

120. Турецкая P. X. Физиология корнеобразования у черенков и стимуляторы роста. -М.:, 1961. 156 с.

121. Химина Н. Безбородые ирисы альтернативный вариант // Цветоводство, 2004.-№5.- С.48-50.

122. Чайлахян М.Х. Гормональная регуляция роста и развития высших растений // Успехи соврем. Биологии, 1982. Т. 95. Вып. 1. — С 70-75.

123. Чочуа Т.А., Заяц Т.В. Морфогенез ириса Кемпфера в Абхазии. // Бюллютень Главного Ботанического сада, 1978. Вып. 110 - С. 65-69.

124. Чуб В.А. Власова Т.А., Бутенко Р.Г. Каллусогенез и морфогенез в культуре генеративных органов весеннецветущих видов Crocus L. // Физиология растений. -1994.-Т. 41.- Вып. 6.-С. 815-820.

125. Чуб В.А. Рост и развитие растений. 2003. - http: herba.msu.ru/russian.

126. Чурикова O.A., Румынии В.А., Барыкина Р.П.,Слюсаренко А.Г. Некоторые особенности морфогенеза in vitro при масс-клональном размножении лилий // Бюллетень главного ботанического сада. Академия наук СССР, 1991. Вып. 159 — С.43-49.

127. Чурикова O.A. Морфогенетические процессы при масс-клональном размножении некоторых декоративных луковичных и клубнелуковичнных растений. Автореф. дис. .канд. биол. наук. Москва, 1993. - 25 с.

128. Чурикова O.A., Румынии В.А., Барыкина Р.П. Морфогенетические процессы в луковичных чешуях некоторых видов лилий в условиях масс-клонального размножения in vitro II Бюл. ГБС РАН, 1994 Вып. 169. - С. 105-111.

129. Чурикова O.A., Барыкина Р.П. Регенерационная способность некоторых луковичных и клубнелуковичных однодольных in vitro. Морфогенетический аспект // Вест. Моск. у-та. Сер. Биология, 1995. № 2. - С. 58-66.

130. Чурикова O.A. Морфогенетические аспекты микроклональиого размножения гиацинта // Физиол. раст. наука 3-го тысячелетия. Тез. докл Междунар. конф. -М., 1999.-С. 736.

131. Чурикова O.A., Молканова О.И. Изучение морфогенетических особенностей некоторых представителей семейства Liliaceae при размножении in vitro II Сборник научных трудов международной научно-практической конференции. -Москва, 2004. С. 246-249.

132. Чурикова O.A. Особенности микроклональиого размножения и морфогенез in vitro некоторых представителей семейства Liliaceae. II Труды Томского государственного университета. Сер. биологическая. — Томск: Изд-во Том. ун-та, 2010. Т. 274. - С. 429-432.

133. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии. Методические указания. М.: МСХА, 1996 -80с.

134. Шумихин С.А. Оптимизация отдельных этапов микроклональиого размножения георгины культурной: стерилизация эксплантов // Вестн. Перм. унта, 2004. -№ 2. С. 61-63.

135. Эсау К. Анатомия растений. М.: Мир, 1969. - 564 с.

136. Agnieszka Wojtania, Joanna Pulawska, Eleonora Gabryszewska. Identification and elimination bacterial contaminantes from Pelargonium tissue cultures //Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 2005. Vol. 13. - P.l01-108.

137. Ahmad Al-gabbiesh, Dhia S. Hassawi, Fatma U. Afifi. In vitro propagation of Endagered Iris Species //Journal of Biological Sciences, 2006. № 6 (6). - P. 10351040.

138. Bach Anna, Warchol Marzena, Glogowska-Szwiec Magdalena. Индукция соматического эмбриогенеза и регенерация растений в культуре каллуса (польский) // Hyacinthus orientalis. Poznaniu. Ogrod, 2000. № 29. - P. 5-9.

139. Boltenkov E.V., Rybin V.G, Zarembo E.V. Flavones from callus tissue of Iris ensata II Chem. Nat. Compd, 2005. -№ 41.-P. 539-541.

140. Bottcter I., Goring H. Die Vitrifikation der Pflanzen bei In-vitro-kultur als Infiltrationsproblem //Biol. Rdsch, 1987. Bd 25. - P. 191-193.

141. Bottcter I., Zoglauer K., Goring H. Induction and reversion of plants cultured in vitro II Phisiol. Plant, 1988. Vol. 72. - P. 560-564.

142. Carelli B.P., Echeverrigaray S. Animproved system for the in vitro propagation of rose cultivars II Sei. hort. (Neth.), 20021 Vol. 92. - № 1 - P. 69-74.

143. Castillo В., Smith M. Direct comatic embryogenesis from- Begonia gracilis explants: Abstr.World Congr. In vitro Biol,. Calif., In vitro Cell, and Dev. Biol. Anim. -San Francisco, 1996. Vol. 32. - № 3. - Pt 2. - P: 94.

144. Charlebois D., Richer C. Multiplication in vitro de syringe vulgaris Katherine Havermeyer et Charles Joli. Can. // J. Plant Sei, 2004. Vol. 84. - № 1. - P. 219-21%.

145. De Oliveira Paiva Duarte, Pasqual Moacir, Paiva Renato. Влияние концентрации агара и уровня pH на размножение хризантемы in vitro I I Rev. ceres. Univ. fed. Vicosa. 1999. - Vol. 46. - № 264. - P. 141-148.

146. Denkova Stojka, Kondakova V. Regeneration and in vitro propagation of Pelargonium peltatum II Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources. International symposium. Yalta, 2002. - P. 29.

147. Gamborg О. Z., Wilier R.A., Gima K. Nitrient requirement of suspension cultures of soybeant root cells // Exp. Cell Res, 1968. Vol. 50. - № 1. - p. 151-158.

148. Gangaprasad A., Latha P.G., Seeni S. Micropropagation of terrestrial orchids, Anoectochilus sikkimensis and Anoectochilus regalis II Indian J. Exp. Biol, 2000. Vol. 38.-№2.-P. 149-154.

149. Gordienko N.Y. Clonal micropropagation with preservation of decorative characters of Saintpaulia cultivars. // Бюлют. Гос. Никит. Ботан.сад, 2002. № 86. -P. 38-40.

150. Hida A., Shimizu K., Nagata R., Yabuya Т., Adachi T. Plant regeneration from protoplasts of Iris hollandica //Hort. Euphytica, 1999. Vol. 105. - P. 99-102.

151. Hussey G. Cloning higher plants from aseptically cultured tissues and cells // J. Exp. Bot, 1975. V. 26. - № 12. - P. 253-262.

152. Hussey G. In vitro release of axillary shoots from apical dominance in monocotyledonous plantlets // Ann Bot London, 1978. Vol. 25. - P. 1323-1325.

153. Hussey G. Propagation of some members of the Liliaceae, Iridaceae and Amaryllidaceae by tissue culture // Petaloid Monocotyledons. New York: Academic Press, 1980.-P. 33-42.

154. Hussey, G. In vitro propagation of monocotyledonous bubles and conns // Plant tissue culture. Tokyo: Marzuzen, 1982. - P. 677-680.

155. Jana B. Callus tisse // Indian Hortic, 1981. Vol. 25- № 4. - P. 11-13.

156. Jehan H., Courtois D., Ehrey C., Lerch K., Petiard V. Plant regeneration of Iris pallida Lam. And Iris germanica L. via somatic embryogenesis from leaves, apices and young flowers// Plant Cell Reg. 1994. - Vol.13. - P. 671-675.

157. Jeknic Z., Lee S.P., Ernst R.C., Chen Т.Н. Genetic transformation of Iris germanica mediated by Agrobacterium tumefaciens!7 J. Am. Soc. Hortic. Sci, 1999. Vol. 124. -P. 575-580.

158. Jevremovic S., Radojevic L., Subotic A. In vitro morphogenesis of dwarf irises // Floriculture, Ornamentals, and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. -2006a. Vol. II. - P. 551-557.

159. Jevremovic S. Subottic A., Radoejevic L. In vitro plant regeneration in zygotic embryo culture of Iris reichenbachii И Acta Hort., 2006 b. Vol. 725 - P. 169-173.

160. Jevremovic S. Subottic A., Trifunovic M., Nikolic M. Plant regeneration of southern Adriatic iris by somatic embryogenesis // Arch. Biol. Sci. Belgrade, 2009. — Vol.61 (3).-P. 413-418.

161. Jiang Yuan, Liu Si-yan, Wang Jing, Eang Yi, Zhang Mei-ping. Изучение быстрых методов неполового размножения ширококолокольчика крупноцветкового (на кит. яз) // Jilin nongye daxue xuebao. J. Jilin agr. Univ., 2004. - Vol.26. - № 5. - P. 526528.

162. Kawase K, Mizutani H, Yoshioka M, Fukuda S. Shoot formation on floral organs of Japanese iris in vitro II Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 1995.-Vol.64.-P.143-8.

163. Kevers C., Goldberg R., Gaspar T. Composition of the walls of stemand leaves of vitrifying carnation //Biol. Plant, 1988: Vol. 30. - P. 219-223.

164. Kubova A., Kamenicka A. Magnolia soulangiana plantlets to ex vitro condition during adaptation period // Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources. International symposium Yalta, 2002. — P. 34-35.

165. Fey, Liu Bagging, Liu Yuba, Zhang belong, Bauhaus Wang. Культура ткани и технология быстрого размножения Gardenia jasminoides// J.Beihua. Univ. Natur. Sci, 2000. Vol. 1. - № 6. - P. 533-535.

166. Marcia О. Murilo M., Appezzato-da-Gloria В. Histological Analysis of the Callogenesis and organogenesis from: Root Segments of Curcuma zedoaria Roscoe. // Brazilian Archives of Biologi and Technology, 2001. Vol. 44. - P. 235-241.

167. Mitrofanova I.V., Yezhov V.N. Plant regeneration of Clematis L. through somatic embryogenesis in vitro II Bull. State Nikitsky Bot. Gardens, 2002. № 86. - P. 16-19.

168. Murashige Т., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassaya with:

169. Tobacco Tissue cultures // Physiol. Plants 1962. V. 15. - № 4. - P. 473.

170. Nakano Masaru, Niimi Yoshijiv Kobayashi Daisuke, Watanabe Atsuhiro. Adventitions shot regeneration and' micropropagation of hybrid' tuberous begonia. (Begonia x tyberhybrida Voss). I I Sci. hort. (Neth.), 1999. №3. - P.79.

171. Noland H. Martin, Amy C. Bouck, and Michael L. Arnold. Detecting Adaptive Trait Introgression Between Iris fulva and /. brevicaulis in Highly Selective Field // Conditions. Genetics; 2006; Vol: 172(4). - P: 2481424891

172. Nanda R., Rout G.R. In vitro somatic embryogenesis and plant regeneration in Acacia arabica IIPlant Cell, Tissue and Organ Cult, 2003. Vol. 73, № 2. - P: 131-135.

173. Ohki Shizuka,. Sawaki Satochi. The effects of inorganic salts and growth regulators on in vitro shoot proliferation and leaf chlorophyll content of Delphinium cardinal II Sci; Hort. (Neth.), 1999.-№81.-P. 149-158.

174. Paek, J. Ecological and: morphological features of clonal micropropagation of hyacinth // Plant Tissue Cult, 1982. P. 713-714.

175. Paques M., Boxus P., «Vitrification»: Reviewof literature //Acta hort. 1987. -Vol. 212.-P. 155-166.

176. Paek J/ Ecological und morphological features of a clonal micropropagation of hyacinth//Plant Tissue Cult, 1982. P; 713-714.

177. Pavingerova D., Prenerova- E. Размножение in vitro: Rhododendron spp. из цветочных почек // Rostl vyroba, 2000: Vol. 46. - № 6. - P. 281-283.

178. Pelkonen Veli-Pekka, Kauppi Anneli. The effect of light and auxins on the regeneration of lily (Lilium regale Wil.) cells by somatic embryogenesis and organogenesis // Int. J. Plant Sci, 1999. Vol.160. - № 3. - P. 483-490.

179. Popkova L.L. Biotechnological aspects of cultivations of ornamental Crimean species of orchids // Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources. Abstracta International symposium Yalta, 2002. — P. 38.

180. Popowich E.A., Koslova O.N. Clematis and Gipsophila adventitious shoot regeneraton // Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources. Abstracta International symposium. — Yalta, 2002. — P. 45.

181. Qiu Yin-Qing, Lin Xiong. Культура ткани и быстрое размножение Anthurium worocqueanum // J. S. China Norm. Univ. Natur. Sci, 2001. № 4. - P. 101-102.

182. Radojevic L., Sokic O., Tucic B. Somatic embryogenesis in tissue culture of iris (Irispumila L.) // Acta Hort, 1987. Vol. 212. - P. 719-723.

183. Radojevic L., Subotic A. Plant regeneration of Iris setosa Pall. Through somatic embryogenesis and organogenesis // J Plant physiol. 1992. Vol. 139. - P. 690-696.

184. Randolph L.F. Embryo culture of Iris seed. // Bull Am Iris Soc. -1945. Vol. 98. -P. 33-45.

185. Reinert, I. Applied and fundamental aspects of plant cell tissue and organ culture. // Springer. 1977. - 803 p.

186. Romanciuc Gabriela. Cercetarea proceselor de dezvoltare si multiplicare microclona in vitro la Actinidia chinensis Planch: Teza de doctor in biologie. -Chisinau, 2009. 152 p.

187. Rout G.R., Debata B.K., Das P. Somatic embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrida L. cv. Landora // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1991. - Vol. 27. - P. 6569.

188. Samyn G., Schepper S., Van Bockstaele E. Adventitious shoot regeneration and appearance of cports in several azalea cultivars. // Plant Cell. Tissue and Organ Cult. 2002. Vol. 70, № 2. - P. 223-227.

189. Schmulling Т., Schafer S., Romanov G. Cytokinins as Regulators of Gene Expression//Physiol. Plant. 2007. Vol. 100. - P. 505-517.

190. Shibli R., Aijlouni M. Somatic embryogenesis in the endemic black iris. // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2000. Vol. 61. - P. 15-21.

191. Shimizu K., Yabuya Т., Adachi T. Plant regeneration from protoplasts of Iris germanica L. // Euphytica. 1996. Vol. 89. - P. 223-227.

192. Skoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro //Sympos. Soc. Exp. Biol. 1957. — Vol. 11. — № 2. P. 118.

193. Sreekumar S., Mukunthaku-mar S., Seeni S. Morphogenetic responses of six Philodendron cultivars in vitro //Indian J. Exp. Biol. 2001. Vol. 39. - № 12. - P. 1280-1287.

194. Tabuchi Т., Hiramatsu N. Morphological characterization in the perianth of wild Japanese iris in lowland Hokkaido in Japan. 2006. www.actahort.org/books.

195. Tamura. S. Variations in clonal propagation. // J. Japan Soc. Hort. Sci. 1978. Vol. 464.-№7.-P. 501-508.

196. Vieth J., Laublin G., Morisset C., Cappadocia M. Multiplication in vitro de quelques iris a partir: aspects histologiques de embryogenese somatique // Can. J. Bot. -1992. 70 (9). - P. 1809-1814.

197. Witomska Maria. Влияние различных факторов на размножение ин витро Fritillaria imperialis L. — Warszawa, 2002. 110 p.

198. Wojtania Agnieszka, Joanna Pulawska, Eleonora Gabryszewska. Identification and elimination bacterial contaminantes from Pelargonium tissue cultures. // Journal of Fruit and Ornamental Plant Research. 2005. Vol. 13. - P.101-108.

199. Yabuya Т., Yavagata. Embryo growth and Cultural Condition in Iris ensata Thumb. // Japan J. Breed. 1981. Vol. 31 (4). - P. 377-382.

200. Yabuya T. Pollen storage of Iris ensata Thunb. in organic solvents and dry air under freezing // J. Japan. Breed. 1983. Vol. 33(3). - P. 269-274.

201. Yabuya T. Chromosome associations and crossability with Iris ensata Thunb. induced amphidiploids of I. laevigata fisch x I. ensata H Euphytica. 1991. - Vol. 55. — №1. — P. 85-90.

202. Yabuya T, Ikeda Y., Adachi T. In vitro propagation of japanese garden iris iris ensata Thunb. // Euphytica. 1991. Vol. 57. - P. 77-82.

203. Yabuya T, Kikugawa H, Aiko I, Adachi T. Cytological Studies of Hybrids between Aneuploid and Eu-Diploid Japanese Garden Iris I. ensata Thunb. // Cytologia (Tokyo). 1992. Vol. 57. - P. 253-270.

204. Yabuya T, Nakamura M, Yamasaki A. P-coumaroyl glycosides of cyanidin and peonidin in the flowers of Japanese garden iris, Iris ensata Thunb. // Euphytica. 1993. — Vol. 74.-P. 47-50.

205. Yabuya T, Aiko Y, Adachi T. Factors affecting the velvety outer perianths of Japanese garden iris (Iris ensata Thunb.) I I Cytologia (Tokyo). 1993.' Vol. 58. - P. 4751.

206. Yabuya T; Iwashina T, Kamenosono K. Isolation and identification of flavonoid and related compounds as co-pigments from the flowers of Iris ensata II Journal of Japanese Botany. 1996. Vol. 71. - P. 281-287.

207. Yabuya T, Nakamura M, Iwashina T, Yamaguchi M, Takehara T. Anthocyanin-flavone copigmentation in bluish purple flowers of Japanese garden iris (Iris ensata Thunb.) // Euphytica. 1997. Vol. 98. - P. 163-170.

208. Yabuya T, Kihara S, Yoshino H, Ohba A. Behavior of NOR-bearing telosomes in Japanese garden iris (Iris ensata Thunb.) // Cytologia (Tokyo). 1997. Vol. 62. - P. 4751.

209. Yabuya T MG, Minamitani Y, Shimizu K. Variation in the nucleolar organizing regions in regenerated plants of Japanese garden iris (Iris ensata Thunb.) // Cytologia (Tokyo). 1997. Vol. 62. - P. 249-252.

210. Yabuya T. Nöda L. The characterization of autoallotetraploid hybrids between I. ensata Thunb. andL. laevigata fisch. //Euphytica. 1998. P. 325-328.

211. Yabuya Т., Shimizu К., Miyabe Y., Nagaike H., Adachi T. Production of somatic hybrid plants between Iris ensata Thunb. and I. germanica. // Euphytica. 1999. - Vol. 107, №2.-P. 105-113.

212. Yabuya T, Yamaguchi M-A, Imayama T, Katoh K, Ino I. Anthocyanin 5-0-glucosyltransferase in flowers of Iris ensata // Plant Science (Shannon). 2002. Vol. 162.-P. 779-784.

213. Yabuya Т., Imayama T. Characterization of anthocyanins in flowers of Japanese garden iris, Iris ensata Thunb. II Cytologia (Tokyo). 2003. Vol. 68. - P. 205-210.

214. Yabuy Т., Inoue K., Kato Т., Kunitake H. Efficient Production of Polyploid Plants via Protoplast Culture of Iris fulva II Cytologia. 2004. Vol. 69. - №. 3. - P. 327-333.

215. Yu Xieo-ying, Wu Tie-ming, Ni Pei, Yang Meng-ling, Peng Jin-hui, Ding Jing-nan. Культивирование незрелых зародышей лилии и регенерация растений in vitro (на кит. яз.) // J. Hunan Agr. Univ. 2000. Vol. 26. - № 4. - P. 286-288.

216. Yuan Ling-wei, Yuan Zheng-fang, Zhang Su-feng. Исследования по культуре ткани и быстрому размножению бегонии (Begonia elatior) (на кит. яз.) // J. Xinyang Teach. Coll Natur. Sci. Ed. 2002. Vol. 15. - № 2. - P. 219-221.

217. Zhang Yan-long, Xu Yan, Li Feng Luo Jia, Fan Ming. Установление регенерационной системы луковиц от Lilium brownie (на кит. яз.) // Xibei zhiwu xuebao. Occiklent Sin. 2004. Vol. 24. -№ 7. - P. 1315-1318.

218. Zhao Xing-bing, Yuan Zheng-fang, Zhangsu-feng, Fan Si-feng, Qin Gou-qiang, Liu Wei. Исследования по быстрому размножению in vitro Lilium davidi var. unicolor (на кит. яз.) // J. Xinyang Teach. Coll Natur. Sci. Ed. 2001. Vol. 14. - № 3. - P. 319321.

219. Ziv M. Organs and plantlets regeneration of Gladiolus thorough tissue culture // Ann. Bot. 1970. Vol. 34. -№ 1. - P. 671-676.

220. Ziv M. Transplanting Gladiolus plants propagated in vitro. II Sci. hort. 1979. Vol. ll.-№ 3. — P. 257-260.

221. Ziv M., Lilien-Kipnis H. Bud regeneration from inflorescence exsplants for rapid propagation of geophytes in vitro II Plant Cell Reports. 2000. Vol. 19. - P. 845-850.

222. Ziv M., Naor V. Flowering of geophytes in vitro. II Propagation of Ornamental Plants. 2006. Vol. 6. -№ 1. - P. 3-16.

Информация о работе

Тихомирова, Людмила Ивановна
кандидата биологических наук
Барнаул, 2011
ВАК 03.02.01

Диссертация

Особенности индуцированного морфогенеза и регенерации у различных типов эксплантов in vitro культиваров видов рода Iris L. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Особенности индуцированного морфогенеза и регенерации у различных типов эксплантов in vitro культиваров видов рода Iris L. - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы