Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Регенерация растений земляники и малины из эксплантов различного происхождения

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Регенерация растений земляники и малины из эксплантов различного происхождения"

• Российская академия сельскохозяйственных наук

СЕРОССИЙСКИЙ СЕЛЕКЦИОННО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ САДОВОДСТВА И ПИТОМНИКОВОДСТВА

На правах рукописи

ХАМУКОВА Фатима Нурбиевна

ЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ И МАЛИНЫ ИЗ ЭКСПЛАНТОВ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Специальность 06.01.07 - плодоводство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 1994

Работа выполнена во Всероссийском селекционно-технологиче ком институте садоводства и питомниководства /г.Москва/ в 19901994 г.г.

Научный руководитель - кандидат биологических наук

В.А.ВЫСОЦКИ

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных

наук, профессор И.В.ПОПОВА

кандидат сельскохозяйственных

наук Ю.Г.ПОПОВ

Ведущее предприятие - Московская сельскохозяйственная

академия им. К.А.Тимирязева

Защита состоится /-¿¿Л { 1994г. в 13 часов на заседаг Специализированного совета К 020.20.01 во Всероссийском селей онно-технологическом институте садоводства и питомниководства

Отзыв на реферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направить в Ученый совет по адресу: 115598, Москва, М-598, Загорье, ВСТИСП, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСТИСП.

Автореферат разослан 1994г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат с.-х. наук а.__Л.А.ПРИНЕВА

/

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время значительно возрос интерес с методам культуры тканей и клеток. Это связано как с увеличением юли клеточных культур в фундаментальных исследованиях, так и с юзможностями практического применения клеточных технологий в «лекции растений, в системах производства оздоровленного материа-ia и в генной инженерии. Селекционный процесс заметно ускоряется при использовании галоидных растений. Поэтому для многих зерновых и овощных культур >азработаны методики получения гаплоидов из изолированных пыль-1иков и пыльцы. В тоже время эффективность культивирования [ыльников и пыльцы большинства плодовых и ягодных растений стается достаточно низкой.

Одним из наиболее простых и эффективных методов генетической рансформации растений является перенос чужсрдных генов путем нкубации высечек из листьев в присутствии Agrobacterium tuinefacien, меющей плазмиду с необходимыми генами. Но для плодовых и годных культур возможности генной инженерии мало используются з-за отсутствия эффективных методов регенерации растений из ли-говых эксплантов.

Способы получения придаточных побегов из листьев можно приме-ять и в системах микроразмножения растений. Культивирование ли-гьев пробирочных растений позволило создать методики, обеспечи-1ющие высокую скорость размножения многих видов без возникно-:ния генетических нарушений.

На практике относительно мало используется размножение и оздо-эвление плодовых и ягодных растений через каллусную культуру, то связано с отсутствием надежных методов регенерации растений :их видов из каллуса. С другой стороны, возможность получения шкальных сомаклональных вариантов в культуре пыльников, каллу->в и листьев представляет несомненный практический интерес для лекционеров-плодоводов.

Отсутствие эффективных методов культивирования пыльников и )стьев плодовых растений in vitro объясняется эмпирическим харак-ром исследований в культуре тканей и органов. До последнего вре-:ни остаются непонятными механизмы регенерации, а также харак-р влияния различных факторов на морфогенетические процессы, птимальные для каллусо- и побегообразования факторы приходится :кать отдельно для каждого генотипа и типа экспланта.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы мы поставили изучение особенностей регенерации растений земляники и малины и листовых эксплантов, каллусов и пыльников, а также разработку эффективных и воспроизводимых методов регенерации этих видов растений в культуре изолированных листьев и пыльников.

Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. Оптимизировать с использованием методов математического пла нирования состав питательных сред:

а) для индукции каллусообразования в культивируемых пыльниках

б) для индукции органогенеза в каллусных тканях.

2. Изучить влияние гормональных составляющих питательных сред на морфогенез в культивируемых листовых эксплантах.

3. Оптимизировать гормональный состав питательных сред посредством регрессионного и дисперссионного анализов для получения максимального выхода регенерантов в культуре изолированных листьев.

4. Выявить наиболее эффективные способы предварительной обработки эксплантов в культуре листьев.

5. Изучить влияние физических факторов культивирования на реге нерационные процессы в культуре листьев.

6. Определить морфогенетический потенциал новых перспективны сортов земляники и малины, выведенных во ВСТИСП, при культив!^ ровании изолированных листьев и пыльников.

Научная новизна исследований. Выявлен характер морфогенетичес-ких реакций эксплантов земляники и малины в зависимости от куль тивирусмых in vitro органов ( листья, пыльники ), сортовых и видовь особенностей растений - доноров.

Определена последовательность смены гормональных условий кул! тивирования в культуре пыльников земляники, способствующая увеличению выхода регенерантов.

Выявлено значение источника углерода ( сахарозы, глюкозы и мальтозы ) в регуляции морфогенеза у культивируемых пыльников и каллусов земляники. Показана взаимосвязь между концентрацией уг леводоц в среде и морфогенетическими реакциями культивируемых пыльников.

В культуре изолированных листьев определена зависимость между характером повреждения тканей листа, морфогенетической реакцией экспланта и генотипом растения.

Показана эффективность предварительного замачивания листовых эксплантов малины в растворе 2,4-Д для увеличения частоты регенерации.

. Определено влияние различных режимов освещения на морфогенез в культуре листьев и выявлен характер связи между интенсивностью освещения листовых эксплантов и соотношением концентраций БАП и ИМ К в питательной среде.

Практическая значимость. В результате исследований создана воспроизводимая эффективная методика культивирования in vitro листовых эксплантов малины сорта Скромница, обеспечивающая частоту регенерации 70 - 80%, на которую подана заявка на изобретение.

Методика получения растений-регенерантов малины в культуре изолированных листьев передана для разработки модели генетической трансформации растений в Институт биоорганической химии РАН.

Мы также разработали методику культивирования пыльников земляники, которая позволила достичь высокого уровня регенерации. До 40% пыльников сорта Брайтон, 32% - сорта Боровицкая, 24% -сортов Зенит и Редгонтлет, 16% - сорта Триб мот сформировали от 1 до 20 побегов каждый в зависимости от сорта в первичных или пассируемых каллусах. Растения-регенеранты для дальнейшего наблюдения, изучения и использования в селекции земляники переданы в отдел генетики и селекции ВСТИСП.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых (ТСХА, г. Москва, 1993), на Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" ( г. Алматы, 1993 ), на заседаниях секции ученого совета ВСТИСП по ягодным культурам (1990-1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа итожена на 174 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждений, выводов, рекомендаций производству, приложений. Работа содержит 23 таблицы и 14 рисунков. Список использованной литературы состоит из 257 наименований, в том числе 188 - на иностранных языках.

Объекты и методика проведения исследований

Эксперименты проводились в лаборатории биотехнологии отдела размножения плодовых и ягодных культур ВСТИСП.

В эксперименты были включены районированные и перспективные сорта малины, свободные от вирусов: Бабье лето, Маросейка, Метеор,

Спутница, Скромница и Шоша, полученные в лаборатории вирусологии ВСТИСП, сорта земляники Пандора и Роксана, культивируемые в лаборатории биотехнологии, а также сорта земляники Боровицкая, Брайтон, Зенга-Зенгана, Маковка, Найдена, Надежда, Редгонтлег, Талка, Трибыот, Эстафета, любезно предоставленные нам д.б.н., профессором И.В. Поповой. Исходный материал для опытов в культуре листовых эксплантов был получен по стандартной методике клональ-ного микроразмножения в лаборатории биотехнологии.

Бутоны земляники и малины отбирали на лабораторном участке ВСТИСП в Измайлово.

В качестве питательной среды использовали модифицированную среду Мурасиге и Скуга (1962), обогащенную углеводами, различными витаминами, регуляторами роста ауксиновой и цитокининовой группы, которые добавляли в среду перед автоклавированием. Среду стерилизовали в течение 15-20 минут при давлении 1 атм.

В экспериментах изучали разные комбинации цитокининов ( 6-бензиламинопурин ( БАП ) и кинетин ) и ауксинов ( гндолилуксусная кислота ( ИУК ), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота ( 2,4-Д ), индолилмасляная кислота ( ИМК ), нафтилуксусная кислота ( НУК ) в диапазоне концентраций 0-10 мг/л.

Стандартные среды содержали 30 г сахарозы. В опытах по оптимизации состава питательной среды для индукции морфогенеза в культуре пыльников земляники в среду добавляли глюкозу или сахарозу в количестве 0,1 М, 0,2 М, 0,ЗМ, 0,4 М. Контролем служила среда без добавления углеводов.

Для определения влияния агара на процессы морфогенеза, пыльники земляники культивировали на среде, содержащей 3 г/л, 6 г/л, 9 г/л, 12 г/л агара, или на жидкой среде ( без агара ).

Для выявления зависимости между водородным показателем среды и органогенезом пыльники земляники инкубировали на культураль-ной среде с рН 5,0; 5,4; 5,8; 6,2 или 6,6, значение которого определяли перед автоклавированием.

Листовые экспланты инкубировали при различных условиях освещения. Интенсивность света составляла 0, 100, 2000, 6000 лк. Изучали влияние на частоту регенерации снижения интенсивности освещения ( до 100 лк ) в течение первых 5, 8, 10, 15, 20, 30 и 45 суток.

В опытах использовали схему полного 2 - 4-х факторного фактори-ального эксперимента (Максимов В.Н., 1980). Оптимизацию состава питательной среды в культуре пыльников осуществляли по матрице планирования шестифакторного эксперимента (Малышев В.П., 1977).

Каждый вариант, в зависимости от опыта, состоял из 2 - 10 повторений ( культуральных сосудов ) с 5 - 10 эксплантами в каждом, то есть имел 10-50 зависимых повторностей.

. Статистическую обработку данных проводили методом дисперссй-онного и регрессионного анализов с использованием компьютера.

Результаты исследований

1. Культура листьев.

С целью повышения выхода регенератов в культуре изолированных листьев мы испытали различные концентрации и комбинации регуляторов роста ауксинивого и цитокининового типа, способы механического и химического предварительного воздействия на экспланты, несколько световых режимов культивирования листьев in vitro. Возможность получения растений на листовых эксплантах, а также характер влияния перечисленных выше факторов на частоту регенерации зависели, в основном, от генотипа растения.

1.1. Генотип.

Исследования выявили существенное варьирование сортов земляники и малины по способности к формированию придаточных побегов на культивируемых in vitro листьях. Наибольшей частотой регенерации обладали изолированные листья малины сорта Скромница. Свыше 70% листовых эксплантов этого сорта регенерировали почки и побеги при соответствующих условиях культивирования ( табл. 1 ).

Существенно реже стеблевой органогенез наблюдали у листьев малины сорта Бабье лето ( 20% ) и земляники сортов Надежда и Роксана ( 10 - 15% ). У таких сортов малины как Маросейка и Шоша, а также сортов земляники Талка и Зенга-Зенгана только отдельные экспланты формировали адвентивные побега ( табл. 1 ). Не было ни одного случая регенерации у изолированных листьев малины сортов Метеор, Спутница и земляники - сортов Зенит, Найдена, Пандора. Сорт Зенит является прямым потомком сорта Редкоут, листовые диски которого обладают повышенной способностью к стеблевому органогенезу непосредственно из тканей экспланта (Nehra et al, 1989). В отличие от родительской формы, листовые экспланты сорта Зенит формировали голько рыхлый, пролифелирующий каллус.

Таблица 1,

Регенерация побегов в культуре листовых эксплантов земляники и

малины.

Сорт Частота регенерации, (%)

Целые пластинки Диски

Земляника

Зенга-Зенгана 10.0 0.0

Зенит 0.0 0.0

Надежда 12.5 4.2

Найдена 0.0 0.0

Пандора 0.0 0.0

Редгонтлет 0.0 0.0

Роксана 15.0 0.0

Талка 5.0 0.0

Малина

Бабье лето 20.0 20.0

Маросейка 10.0 6.7

Метеор 0.0 0.0

Скромница 20.0 30.0

Спутница 0.0 0.0

Шоша 5.6 11.1

Из включенных в эксперименты сортов, только у двух сортов малины Скромница и Бабье лето придаточные побеги формировались непосредственно из тканей листа без промежуточной фазы каллусообра-зования. На эксплантах других сортов вначале культивирования формировался каллус, в котором происходила дифференциация почек. Частота регенерации в каллусной культуре была достаточно низкой -от 4% до 15% в зависимости от сорта.

1.2. Регуляторы роста.

Для большинства испытанных сортов земляники и малины повышения частоты регенерации в культуре листьев удалось добиться посредством различных манипуляций с гормональным составом питательной среды. На частоту индукции стеблевого органогенеза влияли тип используемого регулятора роста и его концентрация, а также соотношение концентраций препаратов с цитокининовой и ауксиновой активностью в питательной среде.

3 культуре листовых эксплантов наиболее эффективно индуциро-ia стеблевой органогенез комбинация регуляторов ро-ИМК и БАП. Немного реже или с той же частотой вызывали рмирование побегов ИУК и БАП. 2,4-Д в сочетание с БАП доволь-редко стимулировала регенерацию, хотя листовые экспланты маш сорта Шоша несколько чаще формировали почки в присутствие к препаратов, по сравнению с другими комбинациями регуляторов гга группы ауксинов и цитокининов ( 11,1% и 5,6%, ггветственно ).

[асто побегообразование происходило и без экзогенных ауксинов, пичие в среде одного только БАП было достаточным для индукции эмообразовательных процессов у листовых пластинок и дисков Main сортов Скромница ( до 20% ), Маросейка ( до 6,7% ), Шоша ) 5,6% ) и земляники сорта Надежда (до 11,1% ). [очется отметить, что увеличение количества регуляторов роста в це выше 3-5 мг/л не приводило к заметному повышению частоты гнерации. Из литературных источников известно, что высокие [центрации БАП в питательной среде являются причиной плохой реняемости регенерантов (Batty et al, 1989). Кроме того, при этом ышается риск получения сомаклональных вариантов и побегов с ушенной морфологией. Поэтому мы считаем нецелесообразным ользование в культуре листьев регуляторов роста в концентрациях це 5,0 мг/л, если не преследуются специальные цели, астота регенерации в культуре листьев обычно повышалась при ичественном преобладании БАП над препаратами группы ауксина, таточно эффективным для образования почек и побегов было и гржание в среде одинаковых концентраций регуляторов роста с :иновой и цитокининовой активностью.

Подготовка экспланта.

олученные нами данные свидетельствуют о> том, что с помощью дарительных механических или химических обработок изолиро-ibix листьев можно регулировать регенерационные процессы. У >шинства сортов земляники ( Зенга-Зенгана, Роксана, Талка ), :обных к дифференциации почек в каллусных тканях, наиболее 1уктивными эксплантами были целые листовые пластинки, то есть шанты, не подвергавшиеся никаким предварительным воздей-[ям.

□ Диски

□ Надрезанные пластинки

100

о

5

К

V

м в № О Н Я

О

В £ о. «

и *

О. СП

2.0+0.5 2.0+1.0 2.0+2.0 3.0+2.0 3.0+3.0 5.0+3.0 БАП+ИМК, мг/л

6)

2.0+0.5 2.0+1.0 2.0+2.0 3.0+2.0 3.0+3.0 5.0+3.0 БАП+ИМК, мг/л

Рис. 6. Стеблевой морфогенез в культуре изолированных листьев малины сорта Скромница в зависимости от типа экспланта и концентрации регуляторов роста БАП и ИМ К.

а) частота регенерации;

б) среднее число регенерантов на одном экспланте;

Любое исследованное повреждение тканей листа ( выдерживание в растворе ауксина, обработка гидроударом, различные поранения пластинок ) приводило к ослаблению или ингибированию побегообразования и усилению формирования каллусных тканей.

С другой стороны, практически любые поранения листовой пластинки малины сорта Скромница, склонной к формированию почек непосредственно из тканей листа, стимулировали регенерацию побегов. Наиболее эффективным способом механического воздействия на ткани эксплантов этого сорта оказалось нанесение нескольких легких надрезов на пластинку вдоль центральной.жилки. Эта несложная операция позволила увеличить частоту регенерации в два раза ( до 77% ) и оказалась более эффективной, чем манипуляции с гор-

мональным составом среды ( рис. 1 ). Хочется отметить, что целые листовые пластинки регенерировали реже, по сравнению даже с дисками ( 20% и 30%, соответственно ).

К сожалению, этот феномен был характерен только для сорта Скромница. У другого сорта малины Бабье лето, также обладающего способностью к прямому органогенезу в культуре изолированных листьев, механическое повреждение тканей экспланта не отражалось заметным образом на регенерационных процессах. Независимо от наличия или отсутствия поранений, листовые экспланты регенерировали практически с одинаковой частотой ( 13 - 20% ).

Предварительное химическое воздействие на изолированные листья гоже способствовало увеличению частоты индукции стеблевого органогенеза. На 10% по сравнению с контролем ( 30% ) увеличилось количество регенерирующих листовых дисков малины сорта Скромница после выдерживания эксплантов в 0,0012% растворе 2,4-Д в течение 24 часов перед помещением на питательную среду. Было изучено \ препарата с ауксиновой активностью ( ИУК, ИМК, 2,4-Д и НУК ), 2 экспозиции ( 24 и 48 часов ) и 3 концентрации растворов ( 0,0004%, ),0008%, 0,0012% ). Мы считаем, совершенствование этой методики тозволит повысить частоту регенерации еще в большей степени.

1.4. Условия освещения

Повышения частоты регенерации листовых дисков малины сорта Скромница нам удалось добиться также с помощью подбора светового >ежима культивирования листовых эксплантов- Оптимальный для индукции регенерационных процессов уровень освещенности изолиро-(анных листьев зависел от соотношения, между экзогенными регуля-■орами роста в питательной среде.

При добавлении в среду 2,0 мг/л БАП'иД^мг/л ИМК более бла-оприятным для образования придаточных побегов было использова-[ие рассеянного света ( 100 лк ) в течение первых двух недель культи-ирования. После завершения периода детерминации'клеток - на что ребуется приблизительно 12 - 14 дней.С Моисеева H.A., 1991 ) - ин-енсивность освещения повышали до .2000 -3000 лк для ускорения азвития сформировавшихся точек роста, "Термин "детерминация" потребляется в отношении системы, которая способна пройти опре-еленный путь развития и достичь определенного фенотипического остояния в отсутствие стимула, побудившего ее развиваться в этом аправлении (Светлов А.Г., 1978). Повышение частоты регенерации о 50%, по-видимому, объясняется уменьшением фоторазрушеьия

ауксинов, которые необходимы для индукции процессов деления клеток, так как всего лишь 10% листовых дисков сформировали придаточные побеги при культивировании только в условиях сильной освещенности.

С другой стороны для комбинации регуляторов роста БАП - 2,0 мг/л и ИМК - 2,0 мг/л наибольшее количество регенерирующих эксплантов наблюдали в условиях достаточно высокой освещенности ( 2000 - 3000 лк ). А уменьшение интенсивности света приводило к снижению частоты регенерации более чем в два раза или к полному подавлению процесса образования придаточных побегов в зависимости от длительности периода с низкой интенсивностью освещения. По всей вероятности, при наличии в среде больших количеств ИМК ( 2,0 мг/л ), несмотря на фотоинактивацию, в среде остается достаточное для детерминации клеток количество этого препарата и нет необходимости в чередовании периодов с различной освещенностью эксплантов.

2. Культура изолированных пыльников

В культуре пыльников основное внимание мы уделили подбору оптимальных для увеличения выхода регенерантов условий культивирования, таких как состав и концентрация регуляторов роста, тип сахар; и его концентрация, уровень кислотности среды и содержание в ней агар-агара. Оптимальную стадию развития пыльников земляники и малины, а также способы предварительной обработки цветочных бутонов изучали наши предшественники Гаврикова Л.Н.(1986) и Упа-дышев М.Т. (1992).

Хараю.'ер влияния вышеперечисленных условий на регенерацион-ные процессы, происходящие в пыльниках и каллусах, зависел от сортовых и видовых особенностей растений.

2.1. Генотип

Из 10 включенных в эксперименты сортов земляники успешно формировали адвентивные почки и побеги изолированные пыльники сортов Боровицкая и Брайтон. 30 -40% высаженных на питательную среду эксплантов этих сортов образовали морфогенный каллус. Несколько реже ( 15 - 25% ) регенерировали изолированные пыльники сортов Зенит, Редгонтлет и Трибьют. Стеблевой органогенез с частотой менее 10% наблюдали у пыльников сортов Золушка, Маковка, Надежда, Найдена и Эстафета.

Культивируемые пыльники земляники, в основном, формировали каллусные ткани, в которых при определенных условиях происходила

дифференциация почек. В ряде случаев на изолированных пыльниках сортов Боровицкая и Брайтон, по-видимому, почки сформировались,, непосредственно из тканей экспланта.

2.2. Регуляторы роста

Наибольшего выхода регенерантов мы добились при правильном подборе типа и концентрации регуляторов роста с ауксиновой и ци-токининовой активностью для питательных сред, используемых на . разных этапах культивирования пыльников. 1 этап включал в себя получение каллусов ( на среде для каллусообразования ). На 2 этапе каллусные ткани переносили на среду, поддерживающую их рост ( среда для субкультивирования ). После достижения каллусами необходимого размера ( 5 - 6 мм в диаметре ) их помещали на среду для регенерации ( 3 этап ).

1 этап. Наибольшее значение для регенерационных процессоз имел состав среды для каллусообразования, так как эксперименты выявили тесную связь между условиями культивирования пыльникоа на 1 этапе и частотой регенерации, морфологией регенерантов на последующих этапах культивирования пыльников.

Предпочтительность использования в среде для каллусообразования какого-либо препарата из группы ауксинов определялась генотипом растения. У большинства сортов ИУК в сочетание с БАП достаточно часто ( до 40% ) стимулировала образование каллусов в культуре пыльников, способных к регенерации побегов ( Зенит, Брайтон, Надежда, Найдена).

2,4-Д или НУК совместно с БАП обычно индуцировали обильное каллусообразование у пыльников всех исследованных сортов земля-кики ( до 100% ) и быстрый рост каллусных тканей. Но на среде для эегенерации такие каллусы редко формировали побеги с нормальной лруктурой, несмотря на довольно высокую частоту формообразовательных процессов. Большинство адвентивных образований могло 5ыть классифицировано как листоподобные выросты. Это явление не )аспространялось на пыльники сортов Боровицкая и Редгонтлет, у соторых пассируемые каллусы регенерировали нормальные побеги, 1езависимо от типа ауксина, использованного на первом этапе куль-■ивирования.

Я ±

я 8 4

™ 5

о и

н 1

<я и

V 2 «1 о.

040.1

я

«я 4 на 4

о ее £

я в и

о. • I

-19

1.0 20 3.0 4.0

Ковдетрадоя ИУК, мг/л

в)

10

30

50

70

Концентрация сахарозы, г/л

Концентрация БАП, мг/л

§ «

«

н о н о и л я

V а

о с.

■ Надежда

■ Найдена

3

9

12

Ко1щетрация агара, г/л

Рис. 2. Оптимизация питательной среды для культивирования пыльников земляники сортов Надежда и Найдена по содержанию регуляторов роста ауксинового и цитокининового типа, сахарозы, агар-агара и водородному показателю по методике В.П.Малышева (1977): а) концентрация ИУК; б) концентрация БАП; в) концентрация сахарозы; г) концентрация агар-агара.

В зависимости от ауксина, добавленного в среду для каллусообразо-вания в качестве индуктора морфогенеза, мы наблюдали существенные различия в формообразовательных процессах у культивируемых пыльников земляники сортов Боровицкая и Брайтон. НУК и ИУК стимулировали образование каллусных тканей, в которых в дальнейших пассажах обычно формировалось 1 - 2 хорошо развитых побега высотой 20 - 40 мм, часто укореняющихся в этом же пассаже.

Народном каллусе, индуцированном 2,4-Д, могло образоваться 20-30

небольших, высотой 10-15 мм, побегов без корней.

Для получения на 1 этапе каллусных тканей; способных к дифференциации почек, мы проводили серию экспериментов по оптимизации среды для каллусообразования с использованием различных методов математического планирования.

Итоги модельного опыта по оптимизации пяти факторов культивирования пыльников сортов земляники Надежда и Найдена отражены та рисунке 2. Эти опьггы выявили оптимумы концентраций только шдолилуксусной кислоты. По остальным факторам мы наблюдали :ильное варьирование в зависимости от сортовых особенностей.

Кроме ИУК в модельные опыты была включена и 2,4-Д. Но этот грепарат вызывал только обильное каллусообразование, регенерации юбегов не отмечалось. Для формирования морфогенного каллуса у культивируемых пыльников земляники наиболее благоприятным было количественное пре-бладание ауксинового препарата над БАП в питательной среде рис. 2, табл. 3 ). В культуре пыльников сорта Зенит образование ридаточных почек в первичном каллусе наблюдали и при добавлении среду одинаковых количеств БАП и ИУК ( 2,4-Д ) ( табл. 3 ). Результаты этих экспериментов показывают, что наиболее эффектным для стеблевого органогенеза у пыльников ряда сортов землянки является добавление в среду для каллусообразования регулято-зв роста в следующем сочетании: БАП - 1,0 мг/л + ИУК - 2,0 мг/л ш БАП - 0,5 мг/л + 2,4-Д - 0,5 мг/л.

2 этап. Поиски эффективного для стеблевого органогенеза сочета-1Я регуляторов роста в среде для субкультивирования каллуса мы юводили в экспериментах по культивированию пыльников землями сорта Зенит. Из испытанных комбинаций фитогормонов сочета-1е 2,4-Д -1,0 мг/л и кинетина - 0,5 мг/л одновременно стимулиро-ло пролиферацию каллуса и дифференциацию почек ( табл. 3 ).

Таблица 3.

Влияние гормональных условий культивирования пыльников на каллусо- и побегообразование.

Регуляторы роста, мг/л Число пыльников (каллусов), шт Частота каллусообразования, % Средний диаметр каллуса, мм Каллусы, регенерировавшие побеги, %

1 этап ( среда для каллусообразования )

ИУК-0,5 + БАП-0,5 30 23.3 0.4 3.3

ИУК-1,0 + БАП-1,0 30 33.3 0.5 3.3

2,4-Д-0,5 + БАП-0,5 30 56.7 1.1 0.0

2,4-Д-1,0 + БАП-1,0 30 70.0 1.8 0.0

2 этап ( среда для субкультивирования )

2,4-Д-1,0 + БАП-0,5 98 5.1 0.0

2,4-Д-1,0 + БАП-1,0 84 - 5.9 1.8

2,4-Д-1,0+кинетин-1,0 76 - 5.0 10.7

3 этап ( среда для эегенерации )

ИУК-1,0 + БАП-0,5 95 - 8.2 35.7

2,4-Д-1,0 + БАП-0,5 96 - 14.1 22.9

2,4-Д-1,0+кинетин-0,5 91 - 9.6 4.8

3 этап. Неожиданным оказался факт, когда пассированные на среду для регенерации каллусные ткани, полученные на пыльниках земляники сортов Надежда и Найдена, были способны к образованию придаточных побегов только при преобладании количества ауксина над количеством цитокинина в среде ( ИУК - 2,0 мг/л + БАЛ - 1,0 мг/л или ИУК - 1,0 мг/л + БАП - 0,5 мг/л ). Ни значительное превышение концентрации БАП над концентрацией ИУК или НУК, ни полное исключение препарата с ауксиновой активностью из среды не позволило индуцировать побегообразование в этих каллусах (табл. А).

В каллусах, образованных пыльниками сорта Зенит, регенерация чаще происходила при аналогичном сочетании регуляторов роста ( ИУК - 1,0 мг/л + БАП 0,5 мг/л ).

Эти данные не согласуются с фактами, изложенными в научной литературе. Обычно в среду для регенерации добавляют больше цитоки-иина по сравнению с ауксином.

Таблица 4.

Регенерация побегов в пассируемых каллусах, развившихся в культуре пыльников земляники сортов Надежда и Найдена.

Регуляторы роста в среде *Число регенерировав-

для регенерации, ших каллусов, %

мг/л Надежда Найдена

БАП- 2,0 0 0

БАП- 0,5 + ИУК- 1,0 0 20

БАП- 1,0 + ИУК- 0,1 0 0

БАП- 1,0 + ИУК- 2,0 80 30

БАП- 5,0 + ИУК- 0,5 0 0

БАП- 1,0 + НУК- 0,5 0 0

БАП- 2,0 + НУК- 0,2 0 0

БАП- 5,0 + НУК- 0,1 0 0

* - общее число каллусов в каждом варианте равно 10.

.3. Углеводы

В культуре пыльников земляники повышения выхода каллусов, спо-обных к дифференциации почек, удалось добиться путем правиль-ого подбора типа и концентрации углевода в питательной среде. Наряду с фитогормонами сахара оказывали большое влияние на орфогенетические процессы.

Мальтоза чаще всего вызывала образование неморфогенного каллу-1 на пыльниках. Глюкоза обычно способствовала дифференциации очек в каллусах на среде для каллусообразования. Но при пассиро-шии каллусых тканей на них в основном формировались видоизме-енные побеги. Сахароза редко ( 0 - 8% ) стимулировала побегообра->вание в первичном каллусе. Но на среде для регенерации каллусы, ндуцированные этим углеводом достаточно часто ( до 40% ) форми-эвали придаточные побеги.

Эксперименты выявили явную зависимость между генотипом и эф-ективностью вводимого в питательную среду сахара при культивиро-1нии пыльников. Глюкоза чаще, чем остальные сахара стимулиро-ша образование побегов в каллусах из пыльников сортов Боровиц

а)

б)

я 5 Е? о 5 ¡- а

и « с« —

V £

и

К 4 0

я н к я а 30

20

а V о 10

<и и

с.

0.1М

0.2М

О.ЗМ

0.1М

0.2М

О.ЗМ

Концентрация углевода, моль

Концентрация углевода, моль

боровицкая брайтон зенит надежда редгонтлегг

Рисунок 3. Влияние концентрации сахарозы в среде для каллусообразования на способность каллусов к формированию побегов: а) на среде для каллусообразования; б) на среде для регенерации.

а)

0.1М 0.2М О.ЗМ 0.4М Концентрация углевода, моль

0.1М 0.2М О.ЗМ 0.4М Концентрация углевода, моль

-боровицкая -брайтон -зенит -надежда -редгонтлет

Рисунок. 4. Влияние концентрации глюкозы в среде для каллусообразования на способность каллусов к формированию побегов: а) на среде для каллусообразования; б) на среде для регенерации.

кая, Зенит и Надежда. У пыльников сорта Редгонтлет активнее индуцировала стеблевой органогенез сахароза. Частота регенерации в куль-гуре пыльников сорта Брайтон была высокой при использовании и :ахарозы и глюкозы.

• Содержание в среде недостаточного количества источника углерода '0-10 г/л ) полностью подавляло каллусо- и органогенез ( рис.2 ). "люкоза в концентрации 0,1 - 0,2М и сахароза - 0,1М стимулировали )бразование и рост каллусных тканей, а также дифференциацию в шх адвентивных почек. Но на среде для регенерации эти каллусы, tame всего, формировали листоподобные нитрифицированные обра-ования ( рис. 3, 4 ).Присутствие в питательной среде сахарозы в конспирации 0,2М и глюкозы ( 0,ЗМ ) индуцировало каллусо- и орга-гогенез на среде для каллусообразования несколько слабее, чем [еньшие концентрации этих веществ. Но пассированные на среду для егенерации каллусы чаще регенерировали ( до 40% ), в особенности е из них, которые образовались на средах с сахарозой. Более высокие концентрации углеводов ( 0,ЗМ - сахароза и ,4М - глюкоза ) сильно подавляли формирование каллусов и побегов а среде для каллусообразования. Но на среде для регенерации эти аллусы чаще всего были способны к дифференциации почек и побе-эв с нормальной морфологией ( рис. 3, 4 ). Хочется отметить еще ряд особенностей действия глюкозы на ылышки земляники. Во-первых, сочетание 0, IM глюкозы, 0 мг/л ИУК и 0,5 мг/л БАП стимулировало прямую регенерацию у 1-15% пыльников сортов Брайтон и Боровицкая. Во-вторых, на шлусах, индуцированных на средах с глюкозой, формировалось при-шзительно в 2 раза меньше побегов, по сравнению с сахарозой. К сожалению, нам не удалось индуцировать стеблевой органогенез у . лльников малины, хотя имело место образование каллусных тканей. 1же пыльники сорта Скромница не были способны к регенерации стений, несмотря на то, что у изолированных листьев этого сорта стота регенерации достигала 70%. О сложности индукции побегооб-зования в культуре пыльников малины указывал и М.Т. Упадышев.

Выводы.

1. Модель регенерации у изолированных пыльников, листовых дис-в и листовых пластинок земляники и малины in vitro определяется дом факторов, основными из которых являются генотип растения, пав питательной среды, строение и происхождение экспланта.

2. Среди испытанных сортов земляники и малины наибольшую способность к регенерации растений из листовых эксплантов обнару жили сорта земляники - Роксана, Надежда, малины - Скромница, Бабье лето. Сорта земляники - Талка, Зенит, Пандора, Найдена, Зен Зенгана, Редгонтлет и малины - Шоша, Метеор, Маросейка, Спутни ца характеризовались слабой потенцией к регенерации в культуре ли стовых эксплантов.

3. В культуре изолированных пыльников земляники наибольшая Ч1 стота регенерации отмечена для сортов - Брайтон, Боровицкая

( 30 - 40% ), наименьшая - для сортов - Найдена, Надежда, Золушка Эстафета ( 4 - 8% ). Такие сорта, как Маковка, Трибыот, Зенит и Ре, гонтлет занимали промежуточное положение ( 15 - 25% ). Пыльника изученных сортов малины характеризовались низкой регенерацион-ной способностью.

4. Поранения, наносимые на листовые экспланты изученных сорт земляники и малины, усиливают каллусо- или органогенез. Степень характер поранений следует подбирать в зависимости от видовых и сортовых особенностей растения.

5. Предварительное выдерживание листовых эксплантов в раствор 2,4-Д концентрацией 12 мг/л в течение 24 часов увеличиваеч частоту регенерации почек и побегов.

6. Листовые экспланты сортов земляники и малины, образующие адвентивные почки и побеги непосредственно из тканей листа, мин; фазу каллусогенеза, требуют обогащения питательных сред 6-бензиламинопурином в сочетании с индолилмасляной или индол* луксусной кислотой в диапазоне концентраций 1,0 - 3,0 мг/л. Соотношение ауксин : цитокинин, близкое к 1 : 1 или с некоторым прео ладанием цитокинина, является наиболее эффективным дли пндукц морфогенетичсских процессов.

7. Культивирование листовых эксплантов земляники и малины на первых этапах при пониженной освещенности ( 100 лк ) предотвращает фотоинакгивацию препаратов группы ауксинов, необходимых для индукции процессов морфогенеза, увеличивая, тем самым, част ту регенерации побегов. После возникновения меристематических очагов ( что происходит в течение 12 - 15 суток ) для получения не мальных побегов необходимо увеличить освещенность до 2000 лк и более.

8. Включение индолилуксусной кислоты в питательную среду для индукции каллусообразования в культуре пыльников земляники эф фективнее стимулирует регенерационные процессы по сравнению с

2,4-Д, особенно, в первичных каллусных тканях, хотя уступает последнему по такому показателю, как число побегов на каждом каллусе.

9. 6-бензиламинопурин в сочетании с ауксинами более эффективен в отношении индукции каллусообразования у пыльников земляники, дифференциации почек и стимуляции роста побегов по сравнению с кинетином. Однако пролиферация каллусов и образование меристе-матических зон усиливаются при переносе на 20 - 30 суток каллус-сных тканей, сформировавшихся в присутствии БАП и ИУК ( 2,4-Д ), на среды, содержащие кинетин и 2,4-Д.

10. Использование в качестве источника углеводов глюкозы в концентрации 0,1 - 0,2М в большей степени способствует морфогенети-ческим процессам по сравнению с сахарозой. В отличие от глюкозы, сахароза в концентрации 0,2М вызывает, в основном, формирование каллусов, регенерирующих с большей частотой при Последующих субкультивированиях на средах с более низкими концентрациями углеводов ( 0,1М ). На каллусах, индуцированных из пыльников в присутствии сахарозы, образуется большее количество регенератов по сравнению со средой, содержащей глюкозу.

11. В итоге оптимизации питательной среды с помощью методов математического планирования выявлен состав среды, обеспечивающий формирование морфогенного каллуса в культуре пыльников земляники. Полученная среда содержит макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге и Скуга, тиамин - 0,5 мг/л, миоинозит - 600 мг/л, БАП - 1,0 мг/л, ИУК - 1,0 - 2,0 мг/л, сахарозу - 60 - 70 г/л или глюкозу - 40 - 50 г/л, агар-агар - 8 - 9 г/л и имеет pH 5,4 - 5,5.

12. Выход регенерантов в культуре пыльников земляники существенно повышается под влиянием последовательной смены в питательной среде регуляторов роста по следующей схеме:

первый этап - БАП 1,0 мг/л + ИУК 1,0 - 2,0 мг/л

( или БАП 0,5 мг/л + 2,4-Д 0,5 - 1,0 мг/л ), второй этап - кинетин 0,5 - 1,0 мг/л + 2,4-Д 1,0 мг/л, третий этап - БАП 0,5 - 1,0 мг/л + ИУК 0.5 - 1.0 мг/л.

Рекомендации производству.

При получении растений-регенерантов из изолированных листьев малины и земляники в качестве эксплантов следует брать целые лиловые пластинки культуральных растений без черешков или листо-зые пластинки с несколькими надрезами вдоль центральной жилки в мвисимости от модели регенерации, присущей сорту.

Экспланты лучше высаживать адаксиальной поверхностью к среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге и Скуга, БАП - 1-5 мг/л, ИМК (ИУК) - 1-5 мг/л, миоинозит - 100 мг/л, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту - по 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту - 1,0 мг/л, глицин - 2,0 мг/л, сахарозу - 30 г/л, агар-агар -7-8 г/л. pH среды 5,6 - 5,8. Для культивирования изолированных листьев малины необходимо увеличить содержание железа в среде в 2 раза.

При получении растений-регенерантов из изолированных пыльников земляники в качестве инициальных эксплантов следует в период выдвижения бутонов брать пыльники длиной 1 - 2 мм, имеющие светло-зеленую окраску. Растительный материал необходимо промывать проточной водой в течение 40 - 60 минут, а затем последовательно простерилизовать в смеси 30% раствора перекиси водорода и 96% этилового спирта, взятых в объемном соотношении 1:1, в течение 3 минут и в 0,1% растворе диацида или сулемы в течение 6 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной водой.

Рекомендуется культивирование пыльников проводить в 3 этапа: первый этап: БАП 1,0 мг/л + ИУК 1,0 - 2,0 мг/л ( или БАП 0,5 мг/л + 2,4-Д 0,5 - 1,0 мг/л ), второй этап: кинетин 0,5 - 1,0 мг/л + 2,4-Д 1,0 мг/л, третий этап: БАП 0,5 - 1,0 мг/л + ИУК 0.5 - 1.0 мг/л, используя разработанные для каждого этапа питательные среды.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Высоцкий В.А., Хамукова Ф.М. Возможности регенерации растений земляники и малины из каллусов различного происхождения // Ягодоводство в Нечерноземье / Сб. Научных трудов ВСТИСГ1, М.-1993,- С.-19-24.

2. Хамукова Ф.М. Возможности регенерации растений земляники и малины из листовых эксплантов и пыльников //Деп. рукопись ВИНИТИ № 139/62 ВС-92.- 5 стр.

3. Высоцкий В.А., Упадышев М.Т., Хамукова Ф.М. Регенерация побегов земляники и малины в культуре каллусных тканей и листовых дисков // Биология культивируемых клеток растений и биотехнологи; /Тез. докл. 2 Международной конференции.- Алматы. 1993.- С.-49.

4. Visotskii V.A., Upadyshev М.Т., Khamukova F.M. Strawberry and raspberry shoots regeneration in callus tissue culture and by leaf discs // Biology of plants cell cultures and biotechnology / Abstr. of reports 2 Inter, confer.- Almaty.- 1993,- Part 1,- P.68.