Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

СИСТЕМА ОЗДОРОВЛЕНИЯ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ ОТ ВИРУСОВ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "СИСТЕМА ОЗДОРОВЛЕНИЯ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ ОТ ВИРУСОВ"

Мті

На правах рукописи

БЕЛОШАПКИНА ОЛЬГА ОЛЕГОВНА

СИСТЕМА ОЗДОРОВЛЕНИЯ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ ОТ ВИРУСОВ

Специальность 06.01.11. - защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук

МОСКВА 2006

Работа выполнена в Российском государственном аграрном университете - МСХА имени КА. Тимирязева

Официальные оппоненты:.

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Метлнцкий Олег Зусьевич доктор биологических наук, профессор Доброе Евгений Николаевич доктор биологических наук Перевертни Кирилл Александрович

Ведущая организация - Государственное научное учреждение "Всероссийский институт защиты растений"

Защита диссертации состоится Я О 2006 г. в 13 час

на заседании диссертационного совета Д 006.&35.01 в ГНУ "Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства" по адресу: 115598, г. Москва, Загорье, ул. Загорьевская, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСТИСП.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На долю земляники садовой приходится 2/3 общемирового производства ягод, а средние урожаи достигли 25-40 и болеет/га [Метлицкий, 2003]. Одной из основных предпосылок резкого увеличения ее продуктивности за рубежом явилось производство сертифицированного, чистосортного, свободного от комплекса наиболее опасных вредителей и болезней посадочного материала только в строго контролируемых специализированных питомниках.

За последние полтора десятилетия в РФ подобное производство было практически свернуто. Это привело к снижению продуктивности земляники, потере сортовой чистоты и распространению опасных групп фитопатогенов, Среди них особое значение имеют вирусы, вызывающие хронические и латентные болезни земляники. Их крайне сложно выявлять на фоне острых микозов, тотального повреждения вредителями, стрессов абиотической природы и плохой агротехники. Вирусные болезни не излечимы в полевых условиях, вызывают потерн урожая до 38-75%, а также вырождение хозяйственно ценных сортов [Fulton, 1977; Бутенко, 1982; Соколова, 1986].

К 80-м годам XX века отечественная наука и практика достигли заметных успехов в диагностике вирозов земляники и мер борьбы с ними. Но широкое внедрение для тестирования имму-ноферментного анализа ограничило круг выявляемых вирусов и почти полностью вытеснило универсальный метод прививки на растениях-индикаторах. Вследствие этого стали упускать из виду. специфичные дня земляники ацидофильные вирусы, возбудители "вырождения" культуры в основных регионах ее возделывания. Впоследствии была нарушена целостность и последовательность процессов оздоровления и защиты безвирусных клонов от повторного заражения.

В связи с этим возникла необходимость мониторинга существующего видового состава вирусов земляники, совершенствования методов их диагностики с использованием современных молекулярно-генетнческих методов. Столь же актуальными стали оптимизация и внедрение в практику высокопроизводительных биотехнологических приемов получения оздоровленных от вирусов клонов, а также методов зашитц рт реинфекпии внруса-

ми, основанных на стимуляции естесгёШ&ОД'^&ЗДйчивостн { тений. имени К.А. Тимирязева

; ЦНБ имени Н.И. Железное»

ас-

Цель исследований. Теоретически обосновать н экспериментально усовершенствовать систему защиты земляники садовой от комплекса вирусных и фитоплазменных заболеваний на основе оптимизации производства оздоровленного посадочного материала.

Задачи: - определить распространенность и видовой состав вирусов земляники в Нечерноземном Центре РФ, их взаимоотношения с патогенами другой этиологии;

- усовершенствовать и стандартизировать методы диагностики вирусов земляники с помощью растений-индикаторов для практического тестирования, повысить их достоверность, снизить влияние факторов окружающей среды;

- апробировать и оптимизировать молекулярно-генетические методы для диагностики вирусов при производстве посадочного материала земляники;

- повысить эффективность оздоровления земляники от вирусов за счет применения экологически безопасных средств и способов, включая антивирусные препараты и активизацию защитных механизмов растений;

- оптимизировать режимы клонального микроразмножения современного сортимента и гибридного материала садовой земляники с использованием препаратов, различных по происхождению и механизмам действия;

- оценить значимость оздоровления земляники на разных этапах селекционного процесса;

- обосновать и разработать современную отечественную технологию получения оздоровленного посадочного материала земляники, отвечающую требованиям мировых стандартов.

Научная новизна результатов исследований. Предложена концепция оздоровления земляники от вирусов и разработана технология производства оздоровленного посадочного материала земляники в соответствии с современными условиями и принципами экологической безопасности. Научно обоснована и экспериментально доказана целесообразность оздоровления от вирусов в селекционном процессе не только новых сортов земляники, но и исходных родительских, гибридных и элитных форм.

Установлен существующий видовой состав вирусов земляники в Нечерноземном Центре РФ, показаны его изменения за последние 20-25 лет. Выявлен характер взаимоотношений смешанных микозно-вирусных инфекций и их влияние на оценку устойчивости к болезням. Описано новое для региона фитоплазмен-

ное заболевание земляники, установлена его этиология и рекомендованы меры профилактики.

Предложена методология комплексной диагностики вирусных н фитоплазменных заболеваний земляники, повышающая достоверность их обнаружения. Выявлены и апробированы новые растения-индикаторы, предложен новый экономичный способ прививки с использованием в качестве привоев отдельных отрезков черешка листа, экспериментально обоснованы минимальный возраст тестируемых растений и сроки проведения вирусологического теста. Доказана целесообразность применения усовершенствованного молекулярно-генетического метода диагностики вирусов - полимеразной цепной реакции (ПЦР) для универсального тестирования земляники. Дана экономическая оценка разных методов диагностики вирусов.

Повышена экологическая безопасность оздоровления земляники от вирусов в питомниководстве при введении антивирусных препаратов и иммуномодуляторов в питательную среду in vitro. Впервые выявлен ряд эффективных химических и биологически активных препаратов для защиты от комплекса вирусов, а также для повышения адаптационной способности микрорастений земляники при переводе их из пробирочной культуры в почвенный субстрат.

Основные положения, выносимые па защиту:

1. Методология комплексной диагностики вирусных и фитоплазменных заболеваний земляники, основанная па совершенствовании системы индикаторов и применении новейших методов тестирования (ДНК-зонды, ПЦР, электрофорез).

2. Современная система тестирования земляники и дифференцированный подход в зависимости от состава патогенов, их вредоносности и взаимоотношений в ценозе.

3. Система оздоровления и клонального мнкроразмножения земляники базируется на использовании новых направлений в оздоровлении от вирусов (сочетание культуры тканей с иммуно-модуляторами и антивирусными препаратами) и оптимизации параметров культивирования in vitro и в период адаптации in vivo.

4. Обоснована значимость оздоровления земляники от вирусов на всех этапах селекционного процесса.

Практическая значимость и реализация результатов. Разработана новая система оздоровления посадочного материала земляники на безвирусной основе для питомниководства и селекции.

Предложенная методология диагностики вирусов земляники позволяет повысить надежность выявления заболеваний и получения безвирусных базисных клонов. Выделенные новые индикаторные растения F. resca f. semperjlorens, сортов Рюген и Роте Золемахер используются для тестирования растений земляники на зараженность вирусами в лаборатории плодоводства РГАУ-МСХА. Предложенный способ прививки отдельными отрезками черешка листа в качестве привоев позволяет в 3-4 раза снизить количество отбираемых листьев и избежать ослабления тестируемых растений. Установленные оптимальные возраст микрорастений н период индикаторного теста повышают достоверность вирусологической проверки. Выявлена высокая эффективность использования ПЦР в качестве основного метода вирусологического тестирования в системе оздоровления посадочного материала земляники.

Культивирование верхушечных меристем в сочетании с химическими (ААТ, ДГТ) н биологически активными препаратами (иммуноцитофит) in vitro, а также обработка растений-доноров меристем ретардантамн (пиксом, культаром, хлорхолинхлори-дом), обеспечивают увеличение выхода здоровых клонов земляники. Показано улучшение адаптационных свойств микрорастений земляники при обработке их и почвенного субстрата биологически активными препаратами: никфапом, симбионтом, имму-ноцитофитом, триходермином, планризом, и путем введения в субстрат цеолитов и гидрогелей.

Для ускорения и интенсификации селекционного процесса доказана необходимость оздоровления н клоналыюго микроразмножения не только новых сортов, но н исходных родительских, гибридных и элитных форм земляники.

Усовершенствованные и разработанные новые элементы технологии производства безвирусного посадочного материала земляники используются в лаборатории плодоводства, в курсе лекций, практических занятий и в учебных пособиях РГАУ-МСХА.

Личный вклад автора. Постановка проблемы, цели и задач исследований, разработка программы и методологии исследований, экспериментальные работы, а также анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором. Некоторые разделы диссертации, учитывая ее многоплановый характер, выполнены в сотрудничестве (доля участия автора не менее 75%) с профессорами И.В. Поповой, В.А. Высоцким, г.н.с. Ю.Н. При-ходько (ВСТИСП); с.и.с Т.И. Волковой (ГБС); с.н.с. Н.В. Арша-

вой (ВНИИСБ); профессорам и |В. А. Шмыглёй]. В.В. Фаустовым, с.и.с. Г.П. Епишиной.1И.В. Жарковой!. м.н.сТЕ.Р. Батрак, аспирантом Н. Захави, студентами-дипломниками РГАУ-МСХА.

Апробация результатов работы. Основные положения диссертации доложены на научных конференциях МСХА (декабрь 1981, 1984,1985,1987, 1988, 1989, 1996, 1998,2003,2004 гг,), совещании по защите плодовых и ягодных культур (Чехия, Головоусы, 1991), Всесоюзной конференции ВАСХНИЛ по биотехнологии (Москва, 1986), Всесоюзной конференции по садоводству (Махачкала, ДГУ, 1991), Всероссийской конференции по защите плодовых и ягодных культур от вредных организмов (Москва, ВСТИСП, 1997), II Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 2005), III международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995), II международной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве н ветеринарии" (Москва, 2000), IV международном симпозиуме по землянике (Финляндия, Тампере, 2000).

Публикации. Основные результаты исследований по диссертации опубликованы в 35 научных статьях, из них 13 - в ведущих рецензируемых научных журналах, монографии, а также в соответствующих разделах учебника "Защита растений от болезней" и учебного пособия "Практикум по сельскохозяйственной фитопатологии", в справочнике "Защита растений от болезней в теплицах".

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 370 страницах машинописного текста, содержат 54 таблицы, 35 рисунков; библиография включает 598 источников,. из которых 250 - зарубежной литературы.

Диссертационная работа состоит из введения, б глав (23 разделов), включающих: обзор литературы, объекты п методы исследований, результаты и их обсуждение (4 главы), а также выводов, рекомендаций для практического использования, библиографического списка и приложения.

Глава 1. ВИРУСНЫЕ И ФИТОПЛАЗМЕННЫЕ БОЛЕЗНИ ЗЕМЛЯНИКИ, СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ДИАГНОСТИКИ И ЗАЩИТНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

На основе литературных данных и материалов собственных исследований приведены сведения о распространенности и вредоносности вирусов, поражающих землянику в мире и в России. Приведена характеристика основных вирусов и фитоплазм, патогенных для земляники. Дан критический анализ основных методов исследований и выявления вирусов и фитоплазм земляники и факторов, ограничивающих чувствительность методов и достоверность их результатов. Отмечено, что методы тестирования для серийной диагностики в настоящее время неудовлетворительны, необходимо их совершенствование и внедрение новых, по возможности экспресс-методов, отвечающих современным требованиям вирусологической науки и практики.

Защита земляники от вирусных болезней базируется на получении исходного безвирусного посадочного материала и последующей защите посадок от повторных заражений. В этой связи проанализирован опыт мировой пауки и практики по защите растений от вирусов (селекционные достижения, методы оздоровления от вирусных болезней с помощью термотерапии, культуры меристем, химиотерапии) для биологического и технологического обоснования и разработки современной системы оздоровления земляники.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, УСЛОВИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований в зависимости от поставленных целей был» верхушечные меристемы, боковые и верхушечные почки, конгломераты микропобегов, м и крора стен и я, а также взрослые растения более 120 сортов и элитных сеянцев земляники с различной степенью зараженности вирусами. Инфицированные вирусами образцы земляники получены в процессе тестирования, а также в 1981 году - из Молдавского НИИ плодоводства (г. Кишинев), в 1991 году - из НИИ садоводства г. Головоусы (Чехия). Пробы для выявления распространенности вирусных и фи-топлазменных заболеваний земляники и идентификации патоге-

нов отбирали при маршрутных обследованиях посадок земляники различного назначения в Московской, Тульской, Калужской, Владимирской, Тверской, Ярославской областях, а также в сор-тообразцах, поступавших из селекционных центров, госсортоучастков, репродукционных и карантинных питомников разных регионов России.

Диагностику и идентификацию вирусов земляники проводили следующими методами: визуальной оценки; биологическим тестированием на растениях-индикаторах (инокуляцией соком и прививкой по Frazier, 1974, Белошапкина, 1986); иммунофермен-тным анализом (ИФА) - прямым сэндвич-вариантом [Clark, Adams, 1977; Гиутова, 1993] на базе лаборатории вирусологии ВСТИСП с использованием диагностических наборов, предоставленных ВСТИСП и Молдавским НИИ плодоводства; методом ПЦР па базе ВНИИСБ с использованием вырожденных прай-меров (Синтол, г. Москва) [Morozovet al, 1995; Maaron, Zavriev, 20021, выделение РНК проводили в основном методом Хомчинс-кого [Chomczynski, Mackey, 1995], реакцию обратЕюй транскрипции (ОТ-ПЦР) и полимеразную цепную реакцию [PCR Protocols, 1990] осуществляли на приборе "Терцик" фирмы "ДНК-Технологии" с последующим электрофорезом продуктов.

Растения земляники лесной и виргинской, предоставленные Т.И. Волковой (ГБС), были оценены в качестве новых растений-индикаторов на вирусы морщинистости и крапчатости земляники способом их искусственного заражения. Влияние температуры на результаты индикаторного тестирования исследовали в остекленной теплице, используя показания термографа.

Для выявления фитоплазм использовали растение-индикатор Caiharafithus roseus, реакцию на антибиотик тетрацикл и нового ряда - окситетрациклин и метод ДНК-зонда, специфичного для класса ЛfoUicutes (в лаборатории молекулярной генетики Казанского института биохимии и биофизики РАН) [Борхсениус и др., 1987].

В основу используемых методик оздоровления от вирусов подопытного материала земляники методом культуры верхушечных меристем т vitro, а также его клоналыюго микроразмножения были положены стандартные технологии [Бутенко, 1964; Попов, 1976; Биотехнология растений..., 1989]. Для снижения зараженности микрофлорой питательной среды использовали антибиотик доксициклин гндрохлорид. Для повышения эффективности оздоровления испытывали препараты ААТ (анплнно-

адамантил-тиадиазол), ДГТ (2,4-дио кс и гексаги др о -1,3,5-тр и а-зин), нео-ДГТ (химический аналог ДГТ), L-333 (фешш-аллил-ти-. омочевина), предоставленные проф. Г. Шустером (ГДР), а также иммуноцитофит (д.в. арахидоновая кислота) способом введения в питательную среду. Антивирусное действие ретардантов (хлор-холинхлорида, культара, л икса) оценивали, обрабатывая ими растения-доноры меристем. Фитотоксичность и мутагенные свойства препаратов проверяли на модельном растении Arabidopsis thaliatta (L.) Heynh. [Усманов, Мюллер, 1970; Янушевич, 1977]. Определение содержания хлорофилла в листьях микрорастений земляники проводили по стандартной методике [Гроздинский, Гроздинский, 1973] на спектрофотометре "Specol".

Фертильность пыльцы определяли методом окрашивания ацетокармином и подсчетом пыльцевых зерен под микроскопом.

Для улучшения адаптации микрорастений земляники при пересадке их в почвенный субстрат были испытаны препараты: три-ходермин (на основе гриба Triehodertna ligttorwn), планриз (из бактерий Pseudomonasßuorescetis), никфан, симбиоит-3 (на основе эндофитных грибов-симбионтов).

Для оптимизации почвенного субстрата для микрорастений земляники использовали полимерные гидрогели, цеолит (с размером частиц 1-2 мм) и перлит. Доращивание микрорастений и укоренение розеток в теплицах проводили в гончарных вазонах или торфяных кассетах, а затем пересаживали в пластиковые контейнеры в торфоперлитовый субстрат при стандартной агротехнике выращивания [Солнцева, 1984].

Целесообразность применения гамма-излучения (при распаде радиоактивного кобальта) оценивали на облученных конгломератах почек, полученных из верхушечных меристем in vitro и однолетних растениях-донорах эксплантов.

Статистическая оценка полученных результатов проведена с помощью дисперсионного анализа с оценкой достоверности различий между вариантами с помощью t-критерия Стьюдента, многократного критерия Дункана; использовали критерий согласия X2, метод кластерного анализа [Доспехов, 1985], критерий X [Лакни, 1980], компьютерные программы Microsoft Excel и STRAZ.

Глава 3. АНАЛИЗ ОСОБЕННОСТЕЙ ПАТОГЕНЕЗА ПРИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЯХ ЗЕМЛЯНИКИ

3.1. Распространенность вирусных болезней земляники

Подавляющее большинство (90-95%) визуально обследуемых растений земляники в посадах различных типов Нечерноземного Центра России не имели вирусоподобных симптомов и в основном были заражены латентно. По результатам тестирования на растениях-индикаторах, ИФА и ПЦРот7до 100% сортов были носителями вирусов. Согласно ИФА 22% растений и 32% проверенных сортов содержали вирус черной кольцевой пятнистости томата tomato black ring virtts (ВЧКТ). Распространенность вируса латентной кольцевой пятнистости земляники strawberry latent ringspot virus (ВЛКПЗ) составила 13%, при поражении 16% сортов, а 4% растений и 10% сортов были инфицированы вирусом мозаики резухи arabis mosaic virus (BMP). Выявлены закономерности зараженности растений вирусами в зависимости от возраста и состояния посадок, отмечены сорта, наиболее пораженные и не пораженные данными вирусами. Растения некоторых сортов были одновременно инфицированы двумя и даже всеми тремя вирусами (ВМР+ВЧКПТ, ВЛКЗП+ВЧКПТ, ВМР+ВЛКЗП+ +ВЧКПТ).

В результате индикаторного тестирования по симптомам с большой долей вероятности были выявлены вирусы крапчатос-ти strawberry mottle virus, морщинистости strawberry crinkle virus и слабого пожелтения краев листьев земляники strawberry mild yellow edge virus, распространенность которых составила от 14 до 60% в зависимости от сортимента и агроценоза. При проверке с использованием метода ПЦР был выявлен вирус ложного слабого пожелтения краев листьев strawberry pseudo mild yellow edge virus, и вирус слабого пожелтения краев листьев strawberry mild yellow edge virus.

Установлено, что видовой состав вирусов земляники претерпел за последние 20-25 лет [Помазков, 1969, 1975] некоторые изменения. В частности, увеличилась встречаемость полигосталь-ных вирусов (BMP, ВЧКПТ, ВЛКПЗ). Вирусы крапчатостн земляники и мозаики резухи характеризуются как широко распространенные с середины прошлого века и по настоящее время. Вирус окаймления жилок земляники отсутствовал в основных хозяйствах Московской области и соседних с ней, начиная с 80-го-

дов XX в. Не было достоверных сообщений о наличии вирусов слабого пожелтения краев листьев и ложного слабого пожелтения краев листьев земляники. Вирус морщинистости земляники получил широкое распространение в последние годы, что связано с увеличением количества интродуцированпых из разных стран сортов. Большую распространенность получила латентная форма вирусных заболеваний и смешанные инфекции, вызванные комплексом разных вирусов.

3.2. Изучение этнологии нового заболевания земляники

Постоянное обновление сортимента земляники из различных регионов, расширение ареалов возбудителей болезнен, смена растений-хозяев и переносчиков приводит к изменению состава вирусных и подобных патогенов, появлению заболеваний, ранее не встречавшихся на землянике в определенных зонах.

В 1998 году была обнаружена новая для Московского региона болезнь земляники в условиях защищенного грунта лаборатории плодоводства МСХА, сходная по патогенезу с внрозами. Характерными симптомами были: ланцетовидность и редукция зубчатости долей листьев, межжилковый хлороз, деформация цветков и плодов, угнетение роста, отмирание точки роста побегов. Этиологией выявленного заболевания являлся комплекс "патоген - неблагоприятные факторы среды".

Данное заболевание земляники: - не передается прививкой на индикаторные клоны земляники, не выявляется методом ИФА на основные сокопереносимые вирусы;

- передается прививкой па стандартное растение-индикатор на фитоплазмы - барвинок розовый СшИагапОшз го$ет\

- выявляется методом ДНК-зонда, специфичного для класса МоШсШез;

- обратимо подавляется под влиянием антибиотиков группы тетрациклина;

- на интенсивность проявления его симптомов влияют условия окружающей среды (главным образом температура и интенсивность освещения) и агротехники;

- отмечены сортовые различия земляники по устойчивости к нему.

3.3. Особенности патогенеза при смешанных мнкозно-вирусных инфекциях па землянике

На естественном и искусственном инфекционном фоне сравнивали развитие грибных болезней: мучнистой росы, белой и бурой пятнистости листьев земляники, верти циллезного увядания на оздоровленных от вирусов и зараженных вирусным комплексом морщинистости и крапчатости растениях земляники ряда сортов. При таких смешанных инфекциях первичными фитопа-тогенами были вирусы, а грибы являлись вторичными патогенами, поражающими уже зараженные растения.

Выявлена тенденция, что зараженные вирусами растения сильнее поражались грибными патогенами, являющимися факультативными паразитами на примере возбудителей белой {МусозркаегеИа /га$аг1ае) и бурой {ЫрЪсатроп еагИапа) пятнисто стей листьев (рис.1) и возбудителя вертициллеза {УетНсИИит а1Ьо'Шгши). Имела место существенная зависимость степени поражения 43 сортов земляники белой пятнистостью »1 бурой пятнистостью листьев от наличия в растениях вирусной инфекции (Х}ф~ 35,72 > Л" т = 9,2! при р = 0,01).

Патогенные грибы с облигатным типом паразитизма примерно в одинаковой степени поражали зараженные вирусами и здоровые растения земляники, что было показано на примере возбудителя мучнистой росы {ЯрИаегогЬеса таси1аш).

ШОздоровленные 1933 В Оздоровленные 1984 Ш Вирусные 1983 ■ Вирусные 1984

Рис. 1. Интенсивность поражения грибными заболеваниями оздоровленных и зараженных комплексом вирусов растений земляник»

На интенсивность поражения облигатными паразитами и факультативными паразитами, близкими к иекротрофам, повли-, яли в большей степени сортовые особенности растений, генетически предопределяющие устойчивость, а не зараженность вирусами. Грибы - факультативные паразиты с мало выраженными некротрофньгми свойствами, существенно сильнее зависели от зараженности растения вирусами, чем от сортовых особенностей. Смешанные микозно-вирусные инфекции могут влиять на оценку распространенности и интенсивности поражения сортов земляники грибными болезнями, искажая степень устойчивости, на селекционных участках и госсортоучастках, куда поступает посадочный материал с разной степенью оздоровлен ия.

Глава 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА, СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ ЗЕМЛЯНИКИ

Одним из важнейших этапов технологии получения здорового посадочного материала является ранняя и точная диагностика, позволяющая оценить состояние растений, своевременно выявить и выбраковать пораженные вирусами и отобрать для дальнейшего размножения и селекции здоровые растения, в том числе исходных и гибридных форм.

4.1. Оптимизация диагностики вирусов земляники индикаторным методом

4.1.1. Влияние возраста тестируемых растений на достоверность результатов

Полученные клональным микроразмножением растения земляники разного возраста, инфицированные комплексом вирусов морщинистости и крапчатостн, тестировали с помощью прививки на индикаторных клонах земляники лесной.

Установлено, что самым ранним возрастом тестирования растений земляники, прошедших оздоровление и размножение в культуре тканей in vitro, обеспечивающим достоверные результаты, можно считать срок более четырех месяцев вегетации в почвенном субстрате в условиях теплицы (таблЛ). В процессе культивирования in vitro происходило подавление вирусов на каком-то этапе их жизнедеятельности.

Таблица 1 - Выявление комплекса вирусов морщинистостн и крапчатости индикаторным методом в зависимости от возраста тестируемых растений, полученных in vitro от зараженных доноров

меристем

Тестируемые растения Количество дней после пересадки, сут. Количество, тест-растений, шт. % гибели трансплантатов через 7 дней % зараженности вирусами

ЕМС 1 IS 50,0 44,4

клон F, vesca 30 12 27,7 50,0

90 12 20,8 66,7

120 12 9,2 100

Фестивальная 1 20 50,0 15,0

30 14 23,3 42,8

120 14 7,5 85,7

150 10 8,3 100

Пропорционально длительности вегетации концентрация вирусов в растительных тканях возрастала. Это позволяло выявить их на индикаторах. Кроме того, раннюю диагностику микрорастений затрудняла быстрая некротизация тканей черешков листьев. Она препятствовала транспортировке вирыонов из тестируемых растений в индикаторные.

4.1.2. Влияние температуры на результаты тестирования в условиях тегыиц

На эффективность диагностирования вирусов с помощью растений-индикаторов существенное влияние оказывают условия окружающей среды, в частности температуры воздуха. Летом в дневные часы температура в остекленной теплице поднималась до 38 -40°С, создавая режим, близкий к суховоздушной термотерапии. При тестировании сортообразцов прививкой на индикаторах в период с апреля по Ш декаду ноября в течение трех месяцев отмечали действие завышенных естественных положительных температур, при этом выявили только 45,5% достоверных растений-носителей латентной вирусной инфекции и 22,7% растений, вирофорность которых требовала уточнения. Всего выбраковали 68,2 % растений, зараженных вирусами.

При повторном тестировании этих же растений, начатом в конце августа и законченном в марте (когда не было высоких тем-

32%

□ вирусы не обнаружены

■ Вирусы обнаружены

□ Нестабильные результаты

45%

23%

Тест 2 -август-март 14%

□ Вирусы не обнаружены I Вирусы обнаружены о Нестабильные результаты

63%

Рис. 2. Слияние высоких летних температур в теплице па результаты тестирования вирусов земляники

ператур в теплице), установили 86,4% растений, подлежащих выбраковке (рис.2). Кроме того, в результате 1-го тестирования 20% заведомо зараженных комплексом вирусов растении был» приняты за свободные от инфекции. Вероятно, под влиянием естественных высоких температур в теплице происходило снижение концентрации и торможение синтеза термолабильных вирусов до величин, не выявляемых с'помощью биотестов. Это и искажало результаты индикаторной диагностики. Поэтому тестирование следует проводить в теплице в условиях умеренных температур воздуха, как можно раньше до наступления высоких летних температур.

4.1.3. Совершенствование способа прививки для тестирования земляники на зараженность вирусами

Для сокращения количества листьев, отбираемых для тестов на зараженность вирусами (что особенно важно для проверки единичных экземпляров сортообразцов), нами предложен метод прививки отрезками черешка листа длиной 1,5-2,5 см. При этом из одного черешка тестируемого растения земляники в зависимости от его длины получали не менее трех-четырех привоев.

Результаты тестирования зараженных вирусами образцов земляники стандартной прививкой черешком листа с частью листовой пластинки и модифицированным способом полностью совпадали (табл.2). Первоначальное местоположение привоя на черешке не имело значение. При новом способе прививки в 3-4 раза сокращался расход используемых в качестве привоев листьев тестируемых растений.

Таблица 2 - Сравнение разных способов прививки на индикаторы для тестирования земляники на зараженность вирусами

Тестируемы« растения (возраст), их количество, шт. Способ прививки Расход листьев для прививки, шт. Количество прививок, шт. Инкубационный период, дней Выявлено зараженных растений, шт. <%>"

ЕМС вирусные, 5 А* 30 30 20 5(100)

Б 10 30 20 5(100)

Фестивальная А 30 30 24 5(100)

вирусные, 5 Б 10 30 24 5(100)

Фестивальная А 72 72 32 5(41,6)

микрорастения ви-

русные (1 мес), 12 Б 24 72 32 5(41,6)

Фестивальная А 72 72 29 10(83,3)

микрорастения ви-

русные (3 мес), 11 Б 24 72 29 10(83,3)

Редгонтлит мик- А 84 84 32 6(42,9)

рорастения вирус -

ные(1 мес), 14 Б 28 84 32 6(42,9)

Редгонтлит мик- А 84 84 30 12(85,7)

рорастения вирус

ные{3 мес), 14 Б 28 84 30 12(85,7)

Фестивальная, 20 А 120 120 30 8(40,0)

Б 40 120 30 8(40,0)

Продолжение табл. 2

Редгонтлит, 20 А 120 120 32 4(20,0)

Б 40 120 32 4(20,0)

Зенит, 20 А 120 120 30 3(15,0)

Б 40 120 30 3(15,0)

Примечание. * А - стандартная прививка черешком с листовой пластинкой, Б - прививка отрезками черешка; " % выявленных зараженных растений от общего количества тестируемых растений.

4.1.4. Выявление новых растений-индикаторов

Целесообразно выявление новых индикаторов на смену старым, теряющим со временем свою чувствительность. В связи с этим была поставлена задача выделить растения F. vesca и F. virginiana из имеющейся в Главном ботаническом саду АН коллекции, которые можно использовать в качестве индикаторов на вирусы земляники.

Таблица 3 - Оценка растений рода Fragaria для диагностики вирусов крапчатости и морщинистости

Испытываемые растения | Проявление симптомов

F. virginiana spp. platypetala (Rydb.) Staudt. + -

F. virginiana spp. glauca, N4 + -F. virginiana spp. glauca, N5 F. virginiana spp. glauca, N6 F. virginiana spp. glauca, N7

F. vesca spp. vesca f. alba Duch. +

F. vesca spp. vesca f. rosaijlora Boulay +

F. vesca / semperfiorens сорт Рюген + +

F. vescaf semperfiorens сорт Роте Золемахер + +

F. vesca f semperfiorens Duch. + +

F. vesca clon UC - 5 + +

F. vesca clon EMK + +

F, vesca clon. Alpina ___+ +_

Примечание. Знак - обозначает отсутствие симптомов, + - нечеткие симптомы, проявляются не на всех растениях, + симптомы достаточно четкие, + + симптомы четкие, проявляются на всех растениях.

Испытываемые растения по-разному реагировали па заражение комплексом вирусов морщинистости и крапчатости земляники (табл.3). Наиболее четкие вирусные симптомы были обнаружены па растениях F. vesca разновидности semperflorens сортов Роте Золемахер и Рюген. Их можно рекомендовать в качестве системно-восприимчивых растений-индикаторов для тестирования земляники на зараженность вирусами крапчатости н м орщинистости.

4.2. Сравнение эффективности методов индикаторного и серологического (ИФА) для выявления вирусов земляники

Распространенность вирусных болезней, выявленная с помощью индикаторного метода, заметно выше, чем в случае выявления ее методом ИФА. Так, в ЗАО "Ильинское Усово" распространенность вирусных болезней земляники (только из непогруп-пы), выявленная методом ИФА, составила 19%, а индикаторным, обнаруживающим весь комплекс вирусных болезней, - 26%. Такая же закономерность отмечена в НПО "Фитогенетнка" и в "Совхозе им. Ленина": с помощью ИФА широко распространенные BMP, ВЛКПЗ и ВЧКТ не были обнаружены, а посредством метода прививки на индикаторные клоны земляники вирусная инфекция была выявлена в 22% обследованных растений. На индикаторах кроме сокопереносимых вирусов были обнаружены и соконепереносимые, такие как вирус морщинистости, слабого пожелтения краев листьев и крапчатости земляники.

Высокая чувствительность ИФА общепризнанна, но позволяет диагностировать только вирусы с хорошими антигенными свойствами и сохраняющими инфекционные свойства в соке. Индикаторный метод, являясь универсальным, в отличие от серологического, позволяет диагностировать практически все вирусы земляники. Достоверность результатов и чувствительность метода соизмеримы с модификацией серологического метода (ИФА) при диагностике сокопереносимых вирусов с хорошими иммуногенными свойствами.

4.3. Выявление зараженности земляники вирусами методом ПЦР

При производстве оздоровленного безвирусного посадочного материала особый практический интерес представляет тестирование растений на отсутствие не отдельных вирусов, а по воз-

можности всех. Поэтому исследовали возможность диагностики методом ПЦР групп вирусов земляники. Достоверность метода . оценивали сравнением его результатов с полученными при индикаторном тестировании и ИФА.

Трудности возникали при выделении тотальной РНК из-за большого количества ингибиторов реакции обратной транскрипции ОТ ПЦР и (или) ПЦР, что объясняется биохимическими особенностями тканей земляники. В результате отобрали методику П. Хомчинского (1995) и после модификации (выделенную РНК переосаждали повторно) использовали ее в работе.

На этапах ОТ ПЦР и амплификации для каждого рода вирусов при использовании конкретных реактивов и праймеров оптимизировали режимы температуры, так как расчетные режимы оказались неподходящими. При тестировании образцов земляники на зараженность карлавирусами оптимальными были следующие условия проведения ПЦР: предварительная денатурация при 94°С - 3 мин, 35 циклов, состоящих из денатурации при 94» С - 1 мин, отжига праймеров при 50°С - 4 мин и синтеза фланкируемого праймерами участка кДНК при 72°С - 3 мин. Повышение температуры на 5°С на этапе отжига праймеров дало лучшие результаты. Был выявлен вирус, относящийся к роду карла-вирусов, вероятно, вирус ложного слабого пожелтения краев листьев в образцах земляники зарубежных сортов Брайтон и Дукат (рис. 3).

Рис. Результаты ОТ ПЦР-аналнза сортообразцов земляники с использованием вырожденных праймеров для детекции труппы карла вирусов: 1 - Редгонтлит №7, 2 - Надежда №1, 3 - НаПдеиа №3, 4 -Троицкая №15, 5 - Брайтон № 7,6 - Дукат№11,7-Богота №8,8 -Эстафета №6, -К -отрицательный контроль (здоровое растение), +К - положительный контроль (картофель, ннфішнрованньїґі М вирусом). Размер амплифнцнруемого продукта 240 п,н.

1 2 34 56 78 -К+КМ

Экспериментально были определены условия постановки ПЦР для диагностики рода потексвирусов, позволившие в ряде образцов земляники сортов Богота и Эстафета выявить вирус этой группы, вероятно, слабого пожелтения краев листьев земляники (рис. 4).

123 4 56 7 8 -К+КМ

Рис. 4, Результаты ОТ-ПЦР-анализа сортообразцов земляники с использованием вырожденных праймеров для детекции группы потексвирусов:

I - Редгонтлит №7, 2 - Надежда №1. 3 - Найдена №3, 4 - Троицкая №15, 5 -Брантол№7,6-Дукат №11,7 - Богота №8,3 -Эстафета №6, -К-отрицательный контроль (здоровое растение), +К - положительный коптороль (картофель, инфицированный X вирусом). Размер амплнфицирусмого продукта 1350 п.и.

Была подтверждена методом ПЦР установленная ранее зараженность сортообразцов земляники вирусом кольцевой пятнистости малины из непогруппы.

Сортообразцы земляники, представленные для выявления в них вирусов карла- и потекс-группы методом ПЦР, были параллельно протестированы прививкой на индикаторных клонах земляники лесной (табл. 4). Индикаторный метод выявил большее количество образцов, зараженных вирусной инфекцией. Но ПЦР оказался более чувствительным методом. Так, в образце Дукат №11 индикаторным методом наличие вирусов ставилось под сомнение, но анализ ПЦР достоверно выявил в нем наличие карла-вирусов.

Таблица 4 - Сравнение результатов диагностики комплекса вирусов крапчатости и морщинистости земляники методами ПЦР _ и индикаторным _

Сортообразец

ПЦР

карла в »русы | потсксвкрусы

Индикаторный

Редгонтлит №7 - + - ++

Надежда № 1 - - +

Найдена ЛеЗ - - +

Троицкая №15 .+ - + - +

Брайтон №7 ++ + - +

Дукат №11 ++ - + -

Богота №8 - ++ ++

Эстафета №6 - ++ +

Примечание. ++ достоверное наличие вирусов, + - недостоверное наличие вирусов, - отсутствие вирусов.

Метод ПЦР является перспективным, позволяющим выявлять отдельные вирусы и их роды; его можно считать эталонным методом тестирования в системе производства оздоровленного посадочного материала. Сдерживающим моментом для широкого распространения метода ПЦР может быть его относительно высокая стоимость - по нашим расчетам примерно 220 рублей за тестирование одного образца. Диагностика методом ИФА дешев-лев 13 раз, но, как отмечалось, многие вирусы, поражающие землянику не являются иммуногенамн, и проверка на основной спектр вирусов невозможна. Стоимость вирусологического тестирования индикаторным методом дешевле ПЦР лишь в 1,3 раза и составляет 175 рублей за один образец, но длится не менее шести месяцев и требует значительной площади в обогреваемых теплицах, что приводит к большим затратам электроэнергии, расходам на отопление и водоснабжение, предполагает работу с пестицидами. При массовом тестировании растений земляники на зараженность вирусами остается востребованной система диагностики вирусов с обязательным использованием разных методов, сочетание которых определяется видовым разнообразием, инфекционным состоянием патогенов, механизмами устойчивости растений-хозяев, условиями окружающей среды и экономики.

Глава 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В СИСТЕМЕ ОЗДОРОВЛЕНИЯ ЗЕМЛЯНИКИ ОТ ВИРУСОВ

Надежным методом, достоверно позволяющим снизить концентрацию большинства вирусов в растении до неощутимого уровня вредоносности, является культивирование верхушечных меристем in vitro и последующее их клоналыюе микроразмпоже-ние, которое и само по себе может обеспечить частичное освобождение от вирусов.

5.1. Анализ технологичности н эффективности оздоровления сортов земляники методом культуры меристем

5.1.1. Сортовая реакция земляники на культивирование верхушечных меристем in vitro

Приживаемость у различных сортов и элитных форм колебалась в широких пределах - от 17 до 65%, при этом обнаруживались некоторые закономерности, определяемые их генотипом. Так, межвидовые гибридные формы, полученные с участием третьего поколения чилийской земляники и северо-американских сортов, имели меньшую приживаемость и коэффициент размножения по сравнению с внутривидовыми гибридами, выведенными с участием комплексного донора сорта Маковка и отечественного сорта Самарянка. Они имели приживаемость эксплан-тов в среднем 54%, укореняемость на уровне 76%,

5.1.2. Изучение длительного клонирования земляники в культуре in vitro

Вопрос об оптимальной кратности пассажей при клональном микроразмножении и, как следствие, количестве полученного однородного материала представляет большой интерес для практики.

Полученные из апикальных меристем 0,3-0,5 мм, выделенных из пазушных почек двулетних растений земляники сорта Зенит, экспланты подвергали 12-кратным пассажам на среде с цитоки-нииом. При этом боковые и пазушные почки адаптировались к развитию на питательной среде. После 7-го пассажа снижалось число образующих конгломерат почек, но сохранялся высокий уровень их приживаемости (рис. 5). Морфологических изменений у растений выявлено не было.

1 234567 85 10 11 12 Кол ич* el «о пасс«ж ай

■Коэффициент размножения -При жцваоноег ь

Рис. 5. Приживаемость и коэффициент размножения экснлантов земляники сорта Зенит при длительном клонировании in vitro (МСХЛ,

1989-1999 гг.)

При клональном м и кроразмножешш земляники целесообразно практиковать 8-9 пассажей на питательных средах, но избегать превышения предельно допустимых концентраций фитогор-монов. Это позволяет получать не менее 60-70 качественно однородных растении. Можно предполагать, что при многократных пассажах эксплантов происходит их частичное освобождение от наиболее лабильных вирусов.

5.1.3. Эффективность оздоровления различных сортов земляники методом культуры меристем

В результате тестирования прививкой на индикаторы растений 24сортов земляники, полученных при культивировании апикальных меристем in vitro, констатировано оздоровление 80-85% из них от комплекса вирусов.

Установлен существенный коэффициент корреляции между регенерационноЙ способностью апексов исследуемых сортов и выходом безвирусных растений при оздоровлении их методом культивирования верхушечной меристемы in vitro, г = 0,931. Сорта земляники можно разделять методом кластерного анализа на группы, различающиеся по эффективности оздоровления, выделяя наиболее и наименее пригодные для оздоровления от комплекса вирусов. Наибольший процент (выше 81%) безвирусных

растений после оздоровления был выявлен у таких сортов, как Зефир, Марышка, Спасская, Талка, Царскосельская, Эстафета (I группа оздоровления). Сорта Боровицкая, Женева, Зенит, Чен-длер, Фестивальная, Холидей, имели среднюю эффективность оздоровления и отнесены к II группе (61-80%). К III группе (менее 60% оздоровления) относили сорта Пурпуровая, Талисман.

5.2. Улучшение адаптации мнкрорастеинн земляники к нестерильным условиям

Уязвимым звеном при оздоровлении in vitro и клональпом микроразмножении земляники является пересадка микрорастений из стерильной питательной среды в почвенный субстрат. При этом из-за возникающей стрессовой ситуации может погибать до 90% растений отдельных сортов.

5.2.1. Оптимизация почвенного субстрата для микрорастений земляники С целью подбора субстрата, обеспечивающего оптимальное развитие микрорастений земляники, к верховому торфу добавляли цеолит и перлит, а также влагонабухающий агрогель на основе полиакрил амида. Значительно лучшее развитие растащи было в субстратах с цеолитом, особенно в присутствии агрогеля (табл.5).

Таблица 5 - Биометрические показатели микрорастений земляники сорта Зенит на различных почвенных субстратах перед посадкой (I) _и через 40 дней (II)_

Поуячяте-п,

Вариант количество корней, шт. общая длина количество диаметр

Г 11 активных корней, мм листьев, рожка, мм

всего II гт.

активных 1 1 П г 1 11 I I 11

Торф+ 4,0 6,0 4,06 86,0а 35,56 4,0 5,0 2,0 2,1

перлит (контроль) Торф 4,0 4,0 Оа 98,Ов 0а 4,0 5,0 2,0 Расте-

+перлит+ агрогель Торф + 4,0 5.0 5,0бв (37,2г 151,Ов 4,0 7,0 ния погибли 1,9 13

цеолит Торф + 4,0 6,0 6,0в 95,26 278,4г 4,5 9,0 2,0 2,1

цеолит +

агрогель

Примечание. Одинаковые буквенные литеры указывают на отсутствие существенных различий между вариантами при р=0,05.

Цеолиты и влагонабухающий гель пол и а крнл а м ида при добавлении к торфу улучшают физические свойства субстрата, в том числе его плотность и полевую влагоемкость. Такой субстрат оптимизирует рост микрорастении и позволяет длительные сроки обходиться без их полива.

5.2.2. Использование биопрепаратов и антибиотиков при клональпом микроразмножснии земляники

Для улучшения адаптации при пересадке в почвенный субстрат использовали кратковременное замачивание, а затем 1-2 полива микрорастений земляники сортов Надежда, Трубадур и элитного сеянца 515-14-7 грибным (триходермин) и бактериальным (планриз) препаратами, соответственно в концентрациях 0,5% и 0,1%. По сравнению с контролем существенно снизилась гибель микрорастений после обработки их триходермином и еще больше - планризом (на 30-40%), увеличилась приживаемость. Планриз увеличивал высоту растений и количество листьев. Оба препарата интенсифицировали зеленую окраску листьев растений, способствовали увеличению в 2 раза и более количества всасывающих придаточных корней второго порядка и их дл1шу по сравнению с контрольными.

В культуре ш vitro имеют место ухудшение развития и гибель значительной части эксплантов из-за загрязнения питательной среды бактериальной, реже грибной микрофлорой. Добавление в питательную среду антибиотика широкого спектра действия -доксицнклипа шдрохлорида - в концентрации 40-80 мг/л существенно снижало инфицированность эксплантов земляники сап-ротрофной микробиотой; при этом следовало учитывать его фи-тотокснчность для отдельных сортов.

5.2.3. Эффективность применения биорегуляторов-

симбионтов для повышения адаптационной способности микрорастений земляники

По той же схеме, что и в случае планриза и симбионта при переводе в нестерильные условия были использованы препараты никфан (10 s%) и снмбионт-3 (10_т%) на основе продуктов эн-дофнтных грибов-симбионтов. Они существенно повысили приживаемость микрорастений двух сортов, длину их корней II и Ш порядков, ускорили начало роста, сократили период адаптации (табл. 6).

Таблица 6 - Влияние препаратов-симбионтов на развитие микрорастений земляники (через 30 дней после посадки)

Вариант

Приживаемость, %

Количество листьев, штУраст.

Длина корней общая, _см/раст.

Никфан

Симбионт

Контроль

Никфан

Симбионт

Контроль

71,6* 80,0* 68,3

56,6* 56,6* 48,3

Дукат 3,8 3,5 3,0

Зенга Зенгана 3,4 3,3 3,0

2,7 2,1 1>7

33* 2,3* 1,5

Примечание. * отличия от контроля существенны при р=0,05.

После обработки препаратами общее содержание хлорофилла возрастало в 1,2-1,7 раза (табл.7). Все это способствовало высокой жизнеспособности микрорастений в нестерильных почвенных субстратах.

Таблица 7 - Влияние препаратов-симбионтов на содержание хлорофилла (мг/г/%) 1 в листьях микрорастений земляники (МСХА, _1994 г.) _

Вариант

Содержание хлорофилла

В

I

общее, А+В

Симбионт 3,22/ 106 Никфан 3,33/110 Контроль 3,01 /100

Дукат 1,10/143 4,32/114 1,15/ 150 4,48* / 119 0,77/100 3,78/100

Зенга Зенгана

Симбионт

Никфан

Контроль

3,42/158 3,28/152 2,16/100

1,21/172 1,15*/164 0,70/ 100

4,63*/ 160 4,43*/ 153 2,86/100

Примечание.' Сырое вещество в числителе дано в мг/г, а в знаменателе— в %; * отличия от контроля существенны при р=0,05.

5.3. Использование ингибиторов вирусов при оздоровлении земляники методом культуры верхушечных меристем

Учитывая опыт успешного применения химиотерапии в культуре меристем табака и картофеля in vitro [Hildebrandt, 1958; Жук идр., 1970; Борнсенко и др., 1984], мы впервые использовали этот подход для освобождения растений земляники от вирусов. В питательную среду для выращивания мер «схематических верхушек размером 1,0-2,0 мм и 0,3-0,5 мм добавляли аналоги нуклеиновых и пиримидиновых оснований.

Таблица 8 • Влияние ингибиторов вирусов на регенерационную способностьэксплантов (1,0-2,0 мм) земляники сорта Фестивальная _in vitro_

Вариант | Высажено эксплантов, шт. | Выход растетш-perei lepairro в, %

L-333 400 3,0 в

ДГТ 500 23,6 6

нео-ДГТ 480 22,9 6

ААТ 300 34,7 а

Контроль I 160 36,2 а

Примечание. Одинаковые буквенные литеры указывают'на отсутствие существенных различий между вариантами при р=0,05.

Все испытанные препараты, за исключением ААТ снижали выход растений-регенерантов в сравнении с необработанным контролем (табл. 8). Однако ДГТ и нео-ДГТ стимулировали мно-горожковосгь.

Наличие в растениях земляники смешанной инфекции вирусами морщинистости и крапчатостн определяли методом прививки на индикаторных клонах. Увеличение размера эксплантов до 1,0-2,0 мм ускоряло в среднем на 25-30 дней процесс образования здоровых растений-регенерантов, готовых к пересадке в субстрат. При этом ДГТ, нео-ДГТ и ААТ вызывали инактивацию или значительное снижение концентрации вирусов, сравнимое с культивированием эксплантов размером 0,3-0,5 мм (контроль II) (табл.9).

Добавление в питательную среду препаратов ДГТ и ААТ в концентрации 100 мг/л до и после выделения эксплантов (0,30,5 мм) существенно повышало выход свободных от вирусов растений-регенерантов земляники по сравнению с оздоровлением только методом культуры меристем (табл.10).

Таблица 9 - Эффективность оздоровления от вирусов морщинистости и крапчатости земляники сорта Фестивальная при добавлении ингибиторов вирусов в среду для культивирования __ меристем (экспланты 1,0-2,0 мм)_

Вариант Протестировано растений, шт. Формирование мнкрора степи К % оздоровления

период регенерации, дне Л количество

листьев корней рожков

L-333 10 55 3,5 3,0 1,0 15 а

ДГТ 28 50 5,5 5,5 2,5 64,3 в

нео-ДГТ 27 50 3,5 4,0 1,5 55,66

ААТ 32 45 3,5 4,0 1,5 59,4 в

Контроль I 20 45 3,5 4,5 1,5 15а

Контроль II 20 75 3,5 3,5 U0 50

Примечание. Одинаковые буквенные литеры указывают на отсутствие существенных различий между вариантами при р=0,05.

При оздоровлении земляники многих других сортов было отмечено, что даже при однократном введении в питательные среды препаратов ААТ н ДГТ повышался выход безвирусных растений, так как они действуют на уже синтезированные вирусные частицы в клетках растений.

Таблица 10 - Эффективность оздоровления от вирусов морщинистости и крапчатости земляники сорта Фестивальная при добавлении ингибиторов вирусов в среду для культивирования меристем (экспланты 0,3-0,5 мм) _

Вариант Протестировано растении, и гг. Формирование мнкрора стени й % оздоровления

период регенерации, дней количество

листьев корней рожков

ААТ 14 75 3,5 3,5 1,0 78,46

ДГТ 14 78 5,5 5,0 2,0 71,46

Контроль II 20 75 3.5 3,5 1.0 50а

Примечание. Одинаковые буквенные литеры указывают на отсутствие существенных различии между вариантами при р=0,05.

Сочетание культуры меристем с антивирусными препаратами повышает выход оздоровленных регепераптов при обычном размере эксплантов (0,3-0,5 мм), а при увеличении нх размера до

1,0-2,0 мм сокращает сроки регенерации. Опрыскивание исходных растений-доноров меристем препаратами ААТ и ДГТ не было эффективным против вирусных патогенов земляники.

Хотя антивирусные препараты и не вызывают полного удаления вирусов, они замедляют процесс репликации вирусных частиц и тем самым увеличивают безвирусную зону в активно делящихся верхушечных меристемах. Выход безвирусных растений зависит от генотипа сортов, а также от типов комбинаций вирусов при смешанной инфекции.

5.4. Результаты изучения антивирусных свойств ретардантов

на землянике

Проведено изучение антивирусных свойств некоторых ретардантов, применяемых на землянике, и их последействие в культуре in vitro после опрыскивания растений-доноров меристем. Предварительная обработка хлорхолинхлорндом (хлормекватхлорит), культаром (паклобутразол) и пиксом (мепикватхлорид) растений-доноров сорта Редгонтлит и, в меньшей степени, Зенита увеличила выход безвирусного материала.

Ретарданты, изменяя габитус растений, благоприятствуют общему повышению жизнеспособности растений, снижению чувствительности к неблагоприятным воздействиям биотических и абиотических стрессов.

Таблица 11 — Выход (%) оздоровленных растений земляники, полученных в культуре in vitro с предварительной обработкой _ретардантами растений-доноров эксплантов_

Вариант Сорт

Зенет 1 Релгонтлит

Контроль 20,0 а 20,0 6

Хлорхолинхлорид 60,0 аб 80,0 а

Культар 60,0 аб 60,0 аб

Пике 40,0 аб 80,0 а

Примечание. Одинаковые буквенные литеры указывают на отсутствие существенных различий между вариантами при р=0,05.

Действие их было более интенсивным на сортах с комплексной устойчивостью. .

5.5. Результаты изучения антивирусных свойств иммуноцитофнта

Добавление иммуноцитофнта в питательную среду для культивирования апикальных меристем, выделенных из растений здоровых или зараженных вирусами морщинистости и крапчатос-ти, практически пе повлияло на рост и развитие эксплантов, а также па приживаемость, рост и развитие микрорастений в нестерильных условиях.

Таблица 12 - Влияние иммуноцитофита на выход (%) растений _земляники оздоровленных от вируса крапчатости_

Вариант, концентрация имуноцитофнта, %

Зскга Зенгана

FV-72 Клоп F. resca

Контроль

105 10"6 10-' 5x10-'

35,7 12,5

Введение в питательную среду

42,9* 31,25*

35,7 25,0 35,7 18,8 35,7 18,8

Сочетание введения в питательную среду и обработки микрорастений 10 * 50,0* 43,8*

I0-' 42,9* 37,5*

Примечание. ф отличия от контроля существенны при р=0,05.

При добавлении иммуноцитофита в питательную среду для эксплантов в сочетании с последующей обработкой им микрорастений земляники лесной и садовой отмечено ингибирующее влияние на вирус крапчатости земляники (табл. 12), обычно локализующийся в цитоплазме пораженных клеток. На выход оздоровленных от вируса морщинистости растений земляники лесной и сорта Зеига Зенгана иммуноцитофит не повлиял, что связано с локализацией этого вируса в перинуклеарном пространстве, куда арахидоновая кислота, по-видимому, не способна проникать.

Противовирусное защитное действие иммуноцитофита связано, вероятно, с его механизмом действия, а также со строением и местонахождением вирусных частиц в клетке растения-хозяина.

5.6. Выявление мутагенных свойств у антивирусных препаратов

Одновременно с изучением антифитовирусной активности испытываемых препаратов оценивали уровни фитотоксичности и возможные мутагенные свойства некоторых из них для стандартных модельных растений Arabidopsis tItaliana, а также в ходе развития растений земляники в культуре in vitro и in vivo. Препарат L-333 был высоко токсичным, из-за чего не был использован в испытаниях мутагенных свойств.

Установлено, что частота мутаций, возникающих под влиянием препаратов, была выше таковой при спонтанных мутациях.

Регулярные визуальные обследования (в культуре ш vitro, при высадке на маточник, через месяц после посадки, в период появления усов, перед выборкой усов) растений земляники, выращенной с применением ААТ, ДГТ и нео-ДГТ не выявили никаких фенотипических отклонений на протяжении трех вегетативных поколений.

Учитывая высокую технологичность метода оздоровления от вирусов культивированием меристематических верхушек в сочетании с антивирусными препаратами, его можно широко использовать на практике, но необходим контроль чнстосортности и продуктивности полученных растений-регенерантов и их потомства.

5.7. Оценка перспективы использования понтирующего излучения в производстве посадочного материала земляники

Применение облучения гамма-лучами исходных растений-доноров и выделенных из них эксплантов в целях получения мутаций, повышающих эффективность клонального микроразмпо-жения освобожденных от вирусов растений земляники, а также устойчивость селекционного материала к болезням и абиотическим стрессам, не дало положительных результатов.

Глава 6. РАЗРАБОТКА НОВЫХ ЭЛЕМЕНТОВ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ

ПРОЦЕССОВ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ОЗДОРОВЛЕННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В СЕЛЕКЦИИ И ПИТОМНИКОВОДСТВЕ

г 6.1. Необходимость Ii преимущества оздоровления земляники

для селекции

i Все испытываемые приемы оздоровления, размножения и ди-

агностики вирусов земляники апробировали па многообразном селекционном материале - не только на сортах, но и гибридном фонде, элитных и родительских формах. Применение биотехнологических методов оздоровления в сочетании с клональным микроразмножением обеспечивало получение растений, свободных не только от вирусов и фитоплазм, но и от подавляющего большинства видов нематод, клещей, грибных и бактериальных патогенов. Здоровые растения в полной мере раскрывали свой биологический потенциал урожайности, что повышало объективность и эффективность селекции. Реализация вновь созданных сортов земляники в освобожденном от вирусов состоянии является одним из ключевых требований мировой практики [Метлиц-кий и др., 2005].

Микроклональное размножение оздоровленного селекционного материала широко используется за рубежом [Graham, 1997} для ускорения селекционного процесса и обеспечения необходимого объема материала для массовой и достоверной оценки биологических и хозяйственных признаков. Нами впервые использован этот прием в отечественной практике. Это способствовало сокращению длительности селекционного процесса с 12 до 7 лет, расширяло возможности скрещиваний и отборов. Завязываемость и всхожесть гибридных семян увеличивались на 70-80% по сравнению с неоздоровленными клонами, количество крупных, наиболее пригодных для опыления цветков возрастало на 20%. Лучше развивались пестики и особенно пыльники, увеличивался выход фертилыюй пыльцы.

Оздоровление обеспечивало объективность иммунологической оценки сортообразцов и соблюдение требований евростан-дартов, благодаря устранению смешанной инфекции вирусами, грибами и других регламентируемых вредных организмов.

В результате проведенной совместно с селекционерами ВСТИСП работы выведена группа скороплодных элитных форм (в т.ч. 515-14-7,515-16-3,514-16-3), доноров с комплексной устойчивостью (Маковка, Веснянка, Торос, 188-16-25 и др.), сортов земляники, включенных в программу селекционных исследовании, а также районированных в Северо-Западном, Волго-Вятском, Северном, Центральном, Восточно-Сибирском, Дальневосточном регионах (Зенит, Золушка, Надежда, Найдена добрая, Эстафета, Коррадо, Боровицкая, Троицкая).

6.2. Совершенствование технологии производства

оздоровленного посадочного материала земляники

В итоге проведенных исследований обоснована, детально разработана, внедрена и много лет используется лабораторией плодоводства РГАУ-МСХА принципиально новая технология производства оздоровленного посадочного материала земляники, адаптированная к условиям НЧЗ РФ (рис.6). Не основными звеньями являются 1) подавление вирусов и при необходимости других вредных организмов с помощью культуры апикальных меристем в сочетании с химиотерапией с использованием конкретных экологически безопасных препаратов (различающихся по активному веществу, механизму и спектру действия) после предварительной обработки растений-доноров эксплаптов ретардантами; 2) клоналыюе микроразмножение in vitro (3-7 пассажей на протяжении З-б месяцев) на среде с добавкой антибиотика, подавляющего загрязнение грибами и бактериями; 3) адаптацию микрорастений к переводу в нестерильные условия путем обработки различными биопрепаратами и высадке в специальный торфяной субстрат с добавкой цеолитов и гидрогелей; 4) дора-щивание полученных клопов в гончарных вазонах в боксах стеллажной отапливаемой теплицы с последующей закладкой весной базисного маточника в другой стеллажной теплице; 5) прочистки и выбраковка клонов по результатам вирусологического тестирования, общего фитосанитарного мониторинга и отбора на продуктивность при обеспечении изоляции от резерваторов >1 переносчиков вирусной инфекции.

Ход технологического процесса контролируется регулярным вирусологическим тестированием растений (как минимум предварительное - до проведения терапии и основное - после дора-щивання исходных растений). Оно осуществляется с помощью оптимизированного и стандартизированного нами (с учетом воз-

_«І--^^-Г-— »- Для питомяиководства Для селекщш

Растения традиционных сортов, выращиваемые в маточниках в изоляторах Продуктивные, чистосортные растения из коллекций и с плодоносящих участков Интродуцированные новые сорта Гибридные формы Родительские формы

Оздоровление от вирусов методой культуры апикальных меристем іп \itro с добавлением

Югональное миштаазмножепие ¥ в течение 3-7 пассажей - 3-6 мес)

і >

Адаптация микроралекнй к пересадке из пробирочной культури в почвенный суйстріт -0.5-1 мес (лаборатория. теплиш>> '

«Генбанк» • хранение конгломератов потек, микрорастений Прн 2-;"С Ы4-ДЛЛ)

Доращнвание полученных клонов в гончарных вазонах ваксах теплицы -3-4 мес

земляники лесной и виргинской в сочетании с ИФА н/илн ПЦР. Окончательный результат через 6-7 мес (к I декаде августа)

Вирусологическое тестирование прививкой индикаторных клонов) Заиіадка маточника в

контейнерах на стеллажах теплипы -1 декада марта

Поэтапная выбраковка зараженных растений -

Высадка оздоровленных растений па коллекционный участок для контролі сорточистщы її продуктивности

Клепальное мтфораэ-множение бсзвирусных базисных клопов

Вегетативное размножение отобранных безвирусных базисных клонов в контейнерном маточнике (2 срезки с июля; укоренение розеток)

Реализация оздоровленного посадочного материала питомника», селекционерам, частникам

Рис. 6. Технологическая схема производства оздоровленного от вирусов посадочного материала

земляники

раста проверяемых растений и условий окружающей среды, совершенствования способа прививки, подбора новых эффективных индикаторных клонов) метода прививки на индикаторные клопы Fragaria vesca в сочетании с ИФА или, в крайнем случае, с недостаточно эффективным тестом на травянистых растениях-индикаторах. В перспективе эти методы тестирования будут вытеснены экспресс-методами на основе ПЦР, обладающими наивысшей чувствительностью и пригодными для идентификации самых различных вирусов и фитоплазм.

Наш многолетний опыт доказывает экономическую нецелесообразность и фитосанитарную опасность занятия тепличной площади растениями с неустановленной зараженностью патогенами и заселенностью вредителями.

Разработанная технологическая схема обладает рядом преимуществ в сравнении с традиционной, использующей термотерапию, культуру меристем, неоптимизированпое тестирование ца индикаторах в сочетании с ИФА. Культивирование меристем in vitro с использованием химиотерапевтантов и посадкой эксплаи-тов размером 1-2 мм увеличивает выход здоровых растений на 40-45%, снижает трудоемкость выделения апексов и сокращает сроки их регенерации на 20-30 дней.

Включениевмикроклональное размножение обработок микробиопрепаратами и антибиотиками, использование при переводе в нестерильные условия субстратов на основе торфа, цеолитов и гидрогелей обеспечивает снижение загрязнения сапротроф-ными микроорганизмами культуральной среды на 20-40%, сокращение периода адаптации на 15-20 дней при существенном улучшении приживаемости, роста и развития микрорастений.

Оптимизированная методика индикаторной диагностики сокращает на 20-40% ошибочные оценки вирусологического тестирования и на 15 дней сроки адаптации проверяемых растений (после удаления листьев). Использование ПЦР обеспечивает универсальную высокочувствительную диагностику вирусов всего лишь за 1-2 дня.

Предложенная технология снижает затраты труда (на 1,6 чел,/ дн.) и средств (па 322 руб) на получение 1 безвирусного базисного клона земляники в сравнении с традиционной системой. За период работы произведено более 7000 оздоровленных клонов различных сортообразцов земляники.

выводы

1. Разработана и научно обоснована современная система оздоровления земляники для пнтомннководсгва и селекции, базирующаяся па комплексной диагностике, новых экологически безопасных, энергосберегающих приемах защиты от вирусных патогенов с учетом их видового состава и вредоносности.

2. Подтверждено широкое распространение в Нечерноземном Центре РФ садвавирусов крапчатости и латентной кольцевой пятнистости земляники, циторабдовируса морщинистости земляники, неповирусов черной кольцевой пятнистости томата и мозаики резухи. Впервые достоверно установлена массовая встречаемость потексвнруса слабого пожелтения краев листьев земляники. Выявлен ранее не известный в России карлавнрус ложного слабого пожелтения краев листьев земляники. Подавляющее большинство сортов является скрытыми носителями вирусов. Преобладала смешанная инфекция двумя и более вирусами (ВЧКТ+ВМР+ВЛКПЗ, ВЧКТ+ВМР, ВЧКТ+ВЛКПЗ). Видовой состав внрозов земляники измененнлся за последние 2025 лет.

3. Выявлено новое для обследованного региона заболевание земляники фитоплазменной этнологии, доказана его связь с комплексом абиотических факторов, описана симптоматика, рекомендованы меры профилактики.

4. Изучены разные типы взаимодействия патогенов при смешанной микозно-вирусной инфекции в зависимости от особенностей облигатных и факультативных паразитов, генотипа растения-хозяина, условий внешней среды. Возбудитель мучнистой росы земляники практически с равной интенсивностью поражал свободные от вирусов и инфицированные растения земляники; степень поражения вирозных растений 43 сортов земляники белой и бурой пятнистостями листьев была существенно выше, чем у оздоровленных растений (Д^ф=35,72 > Д^т=9,21 при р=0,01).

5. Методологически обоснована и усовершенствована комплексная диагностики вирусов земляники за счет применения для индикаторной диагностики прививки отрезками черешка листа, новых клонов растений-индикаторов, учета температуры окружающей среды и возраста тестируемых растений, а также использования метода полимеразной цепной реакции. Впервые в России отработана методика пробоподготовки и ОТ ПЦР для диагностики карла-, потеке- и неповирусов в растениях земляни-

кн. Проведены сравнения технической и экономической зффек-. тивности методов диагностики (индикаторного, ИФА, ПЦР).

6. Для оптимизации биотехнологнческих приемов производства безвирусного посадочного материала земляники следует сочетать культивирование меристем in vitro с введением в питательную среду антивирусных препаратов (ААТ, ДГТ, нео-ДГТ) и иммуномодуляторов (иммуноцитофит), обработкой растений-доноров эксплантов ретардантами (культар, пике, хлорхолинх-лорид) с учетом установленных комбинаций вирусов, механизма действия препаратов и генотипов растений.

7. Оптимизацию микроклонального размножения сортов и гибридов садовой земляники и адаптации полученных микрорастений при пересадке их в почвенный субстрат обеспечивают добавление в питательную среду антибиотика докенциклина, снижающего загрязнение микрофлорой эксплантов при их культивировании in vitro, обработки микрорастений регуляторами роста (никфан, симбнонт-3), микробиопрепаратами (трихо-дермнн, планрнз) и добавление к торфяному субстрату цеолитов и агрогелей.

8. Подтверждены целесообразность и эффективность рекомендуемых в мировой практике обязательного оздоровления и кло-нального микроразмножения не только сортов, но и исходных и гибридных форм земляники для селекционной работы.

9. Установлена зависимость эффективности оздоровления от генотипа растений земляники, оценен регенерационный потенциал (составляющий от 17 до 80%) более 120 образцов сортов и элитных сеянцев, полученных в результате внутривидовых и межвидовых скрещиваний; оценена пригодность сортов и гибридов для клоиального мнкроразмножения и оздоровления методом культуры меристематических верхушек in vitro.

10. Доказана целесообразность иммунологической оценки сортов и гибридного материала земляники, предварительно освобожденных от вирусов и других регламентируемых вредных организмов.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

Специализированным научно-исследовательским учреждениям предлагается оптимизированная система производства посадочного материала земляники высших категорий качества для питомниководства и селекционной работы, основанная на использовании экологически безопасных и энергосберегающих

средств и способов оздоровления земляники от вирусных и Других патогенов.

Первоначально следует проводить комплексное оздоровление с последующим клональным микроразмножением отобранных растений-кандидатов в базисные клопы и селекционного материала, а затем - их вирусологическую проверку. Применять комплексное тестирование на вирусы с использованием ПЦР и оптимизированного индикаторного метода с использованием прививки отрезками черешка листа, новых растений-индикаторов Fragaria vcsca f. semperjlorens (сорта Роте Золемахер и Рю-геи); проводить тестирование растений, полученных in viíro, после 4-5 месяцев выращивания их в почвенном субстрате, при умеренных температурах воздуха.

Для повышения эффективности оздоровления от вирусов следует сочетать культуру меристем in vitro с использованием препаратов с антивирусной активностью (ААТ, ДГТ, нео-ДГТ), им-муномодулятора иммуноцитофит, предварительно опрыскивать растения-доноры меристем ретардантами (пнксом, культаром, хлорхолинхлоридом), учитывая виды вирусов п сортовую реакцию земляники. Для улучшения адаптации микрорастений на этапе пересадки в почвенный субстрат использовать обработки биологически активными микробиопрспаратамн (планриз, три-ходермин, никфан, симбионт), добавлять в торфяной субстрат цеолиты и полиакриламидные гидрогели.

Оценку устойчивости сортов и гибридов земляники к грибным болезням необходимо проводить на растениях с одинаковой степенью оздоровления от вирусов, во избежании искажающего влияния смешанных микозно-вирусных инфекций, а также других вредных организмов.

Список основных публикаций по теме диссертации

L Белошапкина, О.О. Использование ингибиторов вирусов при оздоровлении земляники методом культуры верхушечных меристем / О.О. Белошапкина, В.А. Шмыгля // Известия ТСХА. - 1986. -N5.-C. 116-118.

2. Белошапкина, О.О. Влияние температуры на результаты тестирования земляники в условиях теплицы / О.О. Белошапкина II Известия ТСХА. - 1990. - N3. - С. 176-179.

3. Белошапкина, 0.0. Результаты изучения антивирусных свойств ретардантов на землянике / О.О. Белошапкина, В.В. Фаустов, Н. Захаип // Известия ТСХА. - 1991. -N 4. - С. 171-175.

4. Фаустов В. В, Анатомо-морфологнческие особенности развития микрочеренков земляники в культуре in vitro / В.В. Фаустов, О.О. Белошапкнна // Известия ТСХА. - 1995. - N 1. - С. 127-138.

5. Белошапкина, О.О. Особенности поражения грибными заболеваниями оздоровленных от вирусов растений земляники / О.О. Белошапкина // Известия ТСХА. - 1997. - Вып. 2. - С. 113-120,

6. Белошапкина, О.О. Реакция земляники на обработку гамма-лучами / О.О. Белошапкина // Известия ТСХА. - 1998. - Вып. 3. -С.156-161.

7. Белошапкина, О.О. Использование биопрепаратов н регуляторов роста при защите земляники от вертициллеза / О.О. Белошапкина, Д.Н. Говоров // Известия ТСХА,- 2000. - Вып. I. -С. 116-128.

8. Белошапкина, О.О. Здоровый посадочный материал земляники-основа успеха / О.О. Белошапкина, И.И. Ханжпян, Е.Р. Батрак И Защита н карантин растений. - 2001, -N 8. - С. 23-24.

9. Белошапкина, О.О. Защита земляники в питомнике высших репродукций / О.О. Белошапкина, JI.B. Безобразное а // Защита и карантин растений. - 2001. - N 9. - С.42-43.

10. Белошапкина, О.О. Вредители и болезни земляники / О.О. Белошапкина, Е.Р. Батрак // Защита и карантин растений. - 2002. -N5. - С. 54-55; N 6. - С. 42-44.

П. Белошапкина, О.О. Использование метода полнмеразной цеп-нон реакции для диагностики некоторых групп вирусов земляники /О.О. Белошапкнна, Н.В. Аршава // Известия ТСХА. - 2004.- Вып. 2.-С. 60-67.

12. Белошапкина О.О. Обзор методов диагностики вирусных заболеваний земляники / О.О. Белошапкина// Известия ТСХА,- 2002.-Вып.2.- С. 177-183.

13. Белошапкина О.О. Совершеиствованпетехнологических процессов производства оздоровленного посадочного материала земляники / О.О. Белошапкина, И.И. Ханжпян // Известия ТСХА. -2004,- Вып. 4. -С. 126-130.

14. Белошапкина О.О. Биологические и технологические основы оздоровления посадочного материала земляники от вирусов / О.О. Белошапкина / М.: МСХА. - 2005. - 162 с.

15. Белошапкина, О.О. Влияние ингибиторов вирусов на частоту появления эмбриональных легален у Arabidopsis thaliana / О.О. Белошапкнна, В.А. Высоцкий, J1.M. Хайбулнна // Сб. науч. трудов ТСХА, Проблемы интенсификации плодоводства. М. - 1987. - С. 48-52.

16. Белошапкина, О.О. Тестирование земляники методом прививки отрезками черешка / О.О. Белошапкнна П Сб. науч. трудов.

Интенсификация возделывания ягодных культур. - Л.: ЛСХИ. -1989. - С. 45-49.

17. Белошапкина, О.О. Возможные растения-индикаторы на вирусы земляники / О.О. Белошапкина, Т.И. Волкова //Сб. науч. трудов ТСХА. Проблемы интенсификации садоводства в НЧ зоне РСФСР. - М. - 1989. - С. 77-80.

18. Артюшии, A.M. Цеолиты и гидрогели при микроклональ-ном размножении земляники / A.M. Артюшнн, О.О. Белошапкина, Г.П. Епишина, Л.К., Пржевальская, Т.М. Бычкова // Достижения науки и техники АПК. - М.: Агропромизд. - 1991. - N 9. - С. 19-20.

19. Белошапкина О.О. Изучение длительного клонирования земляники в культуре in vitro/О.О. Белошапкина, Н. Захави /Сб. докл. всесоюз. конф. - Махачкала: ДГУ. - 1991. - С. 47-48.

20. Белошапкина О.О. Эффективность применения природных биорегуляторов-симбионтов для повышения адаптационной способности мнкрорастешш земляники / О.О.Белошапкина / Сб. докл. 3 Междупарод, конф. Регуляторы роста и развития растений. - М.: МСХА. - 1995. - С. 139-140.

21. Попова II.B. Особенности третьего и четвертого поколений межвидовых гибридов и новых исходных форм в селекции земляники на высокую адаптационную способность / И.В. Попова, С.М. Резник, Е.Д. Шаталова, А.Ф. Константинова, О.О. Белошапкина // Плодоводство и ягодоводство России.-М.: РАСХН.-1995.-С. 70-84.

22. Попова И.В. Исходные формы в селекции земляники на пригодность к замораживанию/И.В. Попова, А.Ф. Макарова, Е.Д. Шаталова, А.Ф. Константинова, О.О. Белошапкина // Плодоводство и ягодоводство России. - М: РАСХН. - 1996. - С. 4J-51.

23. Белошапкина. О.О. Вирусологическое тестирование в системе производства посадочного материала земляники / О.О. Белошапкина / Актуал. вопр. теории и практики защиты плодовых и ягодных культур от вредных организмов в условиях многоукладности сельского хоз-ва. - М.: ТСХА - 1998. -С. 284-286. •

24. Белошапкина, О.О. Распространенность вирусных болезней земляники в Московской области / О.О. Белошапкина // Сб. науч. трудов ТСХА. - 1999. - Вып. 271. - С.41-49.

25. Белошапкина О.О. Определение фнтоплазм в растениях земляники с использованием ДНК-зондов / О.О. Белошапкина, В.М. Чернов, A.A. Вапькова, Е.Р. Батрак / Материалы II международ, конф. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. - М. - 2000. - С. 134-135.

26. Белошапкина. О.О. Применение культуры изолированных меристем в селекции земляники на высокую адаптивность и продуктивность / О.О. Белошапкина, И.В. Попова / Материалы II меж-

дународ. конф. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. - М. - 2000, - С. 166.

27. Белошапкина, О.О. Генетические источники позднецветущей земляники садовой и подготовка их для селекционной работы с применением культуры изолированных меристем / О.О. Белошапкина, И.В. Попова // Плодоводство и ягодоводство России. - 200 К -Т. 8.-С. 71-78.

28. Белошапкина, О.О. Использование биопрепаратов при кло-нальном микроразмножении земляники / О.О. Белошапкина, И.В. Жаркова//Сб. науч. трудов ТСХА. - 2001. - Вып. 273, Ч. 2,-С. 284-289.

29. Шкаликов В.А. Практикум по сельскохозяйственной фитопатологии. Учебное пособие/В.А. Шкаликов, Ю.М. Стройков, Ф.С. Джалнлов, О.О. Белошапкина и др. Ред. В.А. Шкаликов / М.: КолосС. - 2002. - 206 с.

30. Ахатов А.К. Защита растении от болезней в теплицах. Справочник/А.К. Ахатов, Ф.С. Джалилов, О.О. Белошапкина идр. Ред. А.К. Ахатов / М.:Товарищество науч. изд. КМК.~ 2002. - 464 с.

31. Шкаликов В.А. Защита растений от болезней. Учебник, 2-е изд., неправ, и дополн. / В.А. Шкаликов, О.О. Белошапкина, Д.Д. Букреев и др. Ред. В.А. Шкаликов / М.: КолосС. - 2003. - 255 с.

32. Белошапкина О.О. Распространенность вирусных .болезнен земляники в Нечерноземной зоне / О.О. Белошапкина / Фитосани-тарное оздоровление экосистем. Материалы II Всероссийского съезда по защите растений. - СПб. - 2005. - Т.!. - С. 14-16.

33. Белошапкина О.О. Сравнение экономической эффективности вирусологического тестирования земляники разными методами / О.О. Белошапкина / Фитосанитарное оздоровление экосистем. Материалы II Всероссийского съезда по защите растении. — СПб. — 2005. - ТII. - С.463-465.

Объем 2,5 печ. л. Зак. 493. Тир. 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44