Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ДИАГНОСТИКА ВИРУСОВ ЗЕМЛЯНИКИ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЕЕ ОЗДОРОВЛЕНИЯ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ДИАГНОСТИКА ВИРУСОВ ЗЕМЛЯНИКИ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЕЕ ОЗДОРОВЛЕНИЯ"

.J|:-2SSW

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи МАЛЫХИН Петр Михайлович <

УДК 634.75 :632.38

і

ДИАГНОСТИКА ВИРУСОВ ЗЕМЛЯНИКИ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЕЕ ОЗДОРОВЛЕНИЯ

Специальность: 06.01.11—защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1987

Работа выполнена на кафедре фитопатологии Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева. .

Научный руководитель —' кандидат биологических наук, доцент В. А. Шмыгля.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Ю. И. Помазков; кандидат биологических наук, ст. н. с. Л. Т. Харчен ко.

Ведущее предприятие — Научно-исследовательский зональный институт садоводства Нечерноземной полосы.

Защита диссертации состоится «.-// •» УЫ&Л/ 1987 г. в /ІТ час. 3& мин. на заседании Специализированного совета К-120.35.03 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, ул. Тимирязевская, 49, Ученый совет ТСХА.

С. диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан «/Р > &и/0е-А*&/ 1987 г.

Ученый секретарь Специализированного совета —

доцент Н. К. Торя некая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Оздоровление исходного материал а — главное звено в системе защиты земляники от вирусных болезней. Существующая методика оздоровления, включающая отбор, термотерапию, культуру апексов и их сочетания," имеет ряд недостатков, в их числе: большие затраты времени,' значительный отход исходного материала, невысокий процент оздоровления, длительность тестирования оздоровленных клонов. Поэтому важно постоянно совершенствовать методы оздоровления и проверки посадочного мате- . риала земляники с целью повышения их эффективности, сокращения материальных и трудовых затрат.

Кроме того,- необходимо обоснование целесообразности оздоровления сортов от вирусов; в латентной форме, определение эффективности оздоровления при различной: исходной зараженности.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований было изучение вредоносности основных заболеваний и эффективности оздоровления в условиях. Московской области, совершенствование методов оздоровления и. тестирования растений. При, этом- были поставлены следующие задачи:.

1. Получить данные о распространенности и вредоносности основных вирусных болезней земляники в Нечерноземной зоне: морщинистости, крапчатости, слабого пожелтения краев листьев. Сравнить урожайность и вегетативную продуктивность оздоровленных от вирусов, и неоздоровленных растений.

2. Определить - эффективность - одно- и - двукратного - применения некоторых синтетических антивирусных препаратов (АВГГ)-* в оздоровлении земляники от вирусов методом культуры апексов; при различных размерах эксплантатов. Изучить вероятность побочного действия АВП на вегёта- л тивную продуктивность оздоровленных, клонов земляники.

3. Сравнить эффективность применения АВП и предварительной- термообработки при оздоровлении, земляники от вирусов методом культуры апексов.

Ц«:траль»ал Пеучьаа Ьи5л»«ик»

1 -*. :*. л. 1ли;алпе

4. Сравнить чувствительность индикаторных клонов лесной земляники к вирусам морщинистости и крапчатости, определить оптимальный их набор для серийного тестирования регенерантных клонов и оптимальные сроки тестирования.

В ходе работы.по теме возникли дополнительные вопросы исследования: о природе и свойствах ранее не изученного заболевания земляники — листовидных выростов цветоложа; о возможности оздоровления земляники от пестро; листности; о возможности, передачи вирусов морщинистости на. травянистые индикаторы.

Научная новизна. Проведена визуальная оценка сортов и сортообразцов на пораженность вирусными и* вирусоподобными заболеваниями: земляники: в Московской области. Впервые описано новое заболевание земляники—листо-видные выростьицветоложа у с. Редгонтлит.

Показана целесообразность и экономическая эффективность оздоровления от вирусов посадочного материала земляники.

Изучено действие АВЦ, ранее не изучавшихся в культу-ре-апексов. Показано впервые, что эффект от применения АВП в культуре in- vitro .при««<. оздоровлении земляники от вирусов не уступает сочетанию термотерапии- и культуры апексов или превосходит его.

-Показана возможность передачи вирусов морщинистости на травянистые тест-растения способом трансплантации ткани.

Практическая ценность; работы. Разработана методика применения некоторых АВП в культуре in vitro при оздоровлении земляники от вирусов. Добавление АВП в питательную среду до и после выделения эксплантатов позволяет увеличить размер последних до 0,9—1,2 мм при достаточно высоком проценте безвирусных растений. Сокращаются сроки'регенерации растений и облегчается процесс выделения эксплантатов.

Оздоровлен и передан на Саратовскую опытную станцию садоводства перспективный сорт земляники-Жемчуж-ница. Результаты испытания АВП использованы при разработке рекомендаций по выращиванию здорового посадочного материала земляники.

Предложены клоны лесной земляники, наиболее чувствительные- к широко распространенным и экономически важным вирусам земляники.

Апробация. Основные материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых в НИИСХ Северного Зауралья (г. Тюмень, апрель 1985 г.), на научных конференциях ТСХА (июнь, декабрь 1986 г.), на Всесоюзной конфе-• 2

ренции по биотехнологии, июнь 1986; г. (пристендовое сообщение).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.

Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, и рекомендаций производству. Библиографический список включает 247 источников, из них 116 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы, 1 рисунок и 14 фотографий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Дана краткая характеристика значения культуры земляники и обоснована необходимость дальнейшего совершенствования методики оздоровления и проверки исходного материала.

В главе I—«Обзор литературы» — рассмотрена и обсуждена отечественная и зарубежная литература по изучавшимся вопросам. Изложены современные сведения о распространенности, вредоносности вирусных болезней, методах их.диагно-стики и способах оздоровления земляники от вирозов..При-ведены данные об использовании ингибиторов вирусов в борьбе с вирусными болезнями растений и методах их применения.

Глава 2 — «Условия, материал и методы исследований». Опыты проводили в 19S4—1986 гг. на кафедре фитопатологии и в лаборатории защиты растений ТСХА, а также в совхозе «Память Ильича» Пушкинского района Московской области. Использовали сорта Редгонтлит, Зенга Зенгана, Жемчужница, Ясная заря, а также клоны лесной земляники UC-5'и Лльшша, зараженные на 100% вирусами крапчатости, морщинистости и пожелтения краев листьев.

Диагностику и идентификацию вирусов в пораженных растениях проводили индикаторным методом на клонах лесной земляники: UC-1, UC-2, UC-5, EMK, Лльпнна (усовая) и барвинке розовом (Vinca rosea L.).

Электронно-микроскопические исследования проводили на электронном микроскопе ЭМВ-100 БР и BS-613 «Tesla». Ультратонкие срезы пораженных растений готовили по обще-принятой-методике. Препараты сока больных растений готовили по методу погружения (Brandes J., 1964).

Риккетсиеподобние бактерии (РПБ) выделяли на модифицированной среде, разработанной Ю. П. Садовским в Укр. НИИ орошаемого садоводства (1986).

Токсининдуцирующую способность РПБ изучали на че-тырехсуточных культуральных фильтратах. Модельными объ-

сктами, на которых проверялось действие токсинов, служили семена гороха и кукурузы (Дудка И. Л. и др., 1982).

Влияние эффективности оздоровления на урожай и выход посадочного материала изучали в полевых условиях. Сравнивали оздоровленные безвирусные растения с искусственно зараженными прививкой (вирусным комплексом — вирусами морщинистости, крапчатости, пожелтения краев листьев), а также с неоздоровленным контролем (с. Редгонтлит). У с. Фестивальная сравнивали два варианта—оздоровленные растения с неоздоровлешшми. Схема посадки плодоносящей земляники 0,8x0,2 м, маточной — 1,0X0,7 м. Повтор-ность опытов 4- и G-краткая, но 60 растений в каждом варианте.

Оздоровление подопытного материала проводили методом культуры in vitro в модификации Ю. Г. Попова (1979). В качестве ингибиторов вирусов использовали АВП природного происхождения (РНК-аза, интерферон) и синтетические соединения: 2-тиоурацил, цианогуанидин, Ro-1-l (алкенсуль-фонат), ДГТ (2,4-диоксогексагидро-1,3,5-трназин). Три последних препарата любезно переданы для исследований проф. Г. Шустером (Университет им. К. Маркса, Лейпциг, ГДР).

Другие ЛВП: Ф-348 (бициклогепта-5-СН-2метилксантоге-нат натрия), Ф-428 (бис-фенил-гидразид фенилтиофосфоновой кислоты), Ф-429 (бис-гидразид фенилтиофосфоновой кислоты) для испытания были получены из ВНИИ фитопатологии, а МК-1, МК-5, МК-9 (олигоизоадеиилаты) —из Института молекулярной биологии АН СССР.

В вариантах с однократным применением ЛВП высаживали эксплантаты размером 0,5—0,7 мм, а в вариантах с двукратным применением ЛВП (до и после выделения) —0,9— 1,2 мм, т. е. в 2—3 раза большего сравнению с обычно выделяемыми (0,3—0,5 мм). Это делалось для того, чтобы выявить увеличение безвирусной зоны в апексах под действием АВП.

Воздушную термотерапию проводили при t 37—38°С в течение 3 недель при влажности G0—70%, освещенности 6—' 8 тыс. л к с продолжительностью 16 часов в сутки.

Проверку полученных растений проводили методом прививки на клоны лесной земляники через два месяца после высадки их из пробирок. Тест продолжался 6 месяцев. Зараженность полученных в культуре iv vitro клонов лесной земляники (UC-5, Лльпина) оценивали визуально в течение 8— 12 месяцев.

Последействие синтетических ЛВП (цианогуанидин, Ro-1-l, 2-тиоурацил) изучали на маточниках сорта Редгонтлит

и Зенга Зенгана в полевом опыте. Повторность 4-кратная, схема посадки 1,0X0,7 м.

Сравнение чувствительности индикаторных клонов лесной земляники: иС-1, ИС-2, иС-5, ЕМК, БУ-72, БУ, ЕМС, Лльпина (усовая) к вирусному поражению проводили в стеклянной теплице с соблюдением строгой изоляции. Па каждое индикаторное растение прививали по одному инфекционному листочку. Цветоносы, усы и непривитые листья удаляли (Бга21егК. 1974).

Математическую обработку данных проводили методом дисперсионного анализа (Доспехов Б. Л., 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ

3. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ И ВРЕДОНОСНОСТЬ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИИ ЗЕМЛЯНИКИ В МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

3.1. Распространенность вирусных и вирусоподобных заболеваний земляники и поражаемость сортов

В результате проведения маршрутных обследований выявлено 8 вирусных и вирусоподобных заболеваний земляники: морщинистость (до 29%), крапчатость (до 5,5%), пожелтение краев листьев (до 3,0%), воронковидность, полосчатость и посветление жилок (единичные растения), рассечен-ность (до 6,9%), пестролистность (до 12,2%).

Морщинистость обнаружена у всех обследованных сортов, процент пораженных растений колебался от 0,6 до 29. Наиболее сильно поражались сорта Гренада (29%), Кокин-ская ранняя (26,1%), 594-223 (26,5%), Бадербилл (21,8%). При этом процент пораженных растений в течение вегетации оставался относительно стабильным.

Относительной полевой устойчивостью из 59 обследованных сортов и сортообразцов ко всему комплексу вышеупомянутых заболеваний обладали сорта: Роксана, Бадсрглоу, Ма-риева Махерауха, Алый парус, Ранняя плотная, Дочь Награды, Руслан, Пенелопа, Вымпел, Сюрприз Олимпиады и ряд селекционных образцов.

2.2. Диагностика и идентификация вирусов индикаторным методом в пораженных растениях

Тестирование растений земляники сортов Зенга Зенгана и Фестивальная с признаками морщинистости показало, что на лесной землянике проявлялись (через 21—71 день) разнообразные симптомы вирусного поражения (морщинистость, эпн-настия, крапчатость.-угловатое искривление долей листьев,

чашсвидность долей листьев, краевой хлороз). Такое разнообразие патологических признаков, по-видимому, связано с присутствием комплекса вирусов или штаммов в образцах данных сортоп. По литературным данным, такие симптомы свойственны вирусам крапчатости, латентному — Л морщинистости и слабого пожелтения краев листьев (Меллор Ф., Фрезьер II., 1975, Фрезьср Н., Меллор Ф., 1975).

В результате передачи признака пожелтения краев листьев с растений сорта Пурпуровая на индикаторах через 1 — 1,5 месяца отмечено три типа симптомов. На молодых листочках появлялись небольшие хлоротическис пятна (2—3 мм), разбросанные по всему' листу. Этот признак свойствен вирусу крапчатости. Два других —краевой хлороз и чашсвид-ность листочков— характерны для вируса слабого пожелтения краев листьев. -

Прививки листьев с симптомами псстролистности (с. Ясная заря) не воспроизвели данную патологию на индикаторных клонах лесной земляники и барвинке розовом, но в отдельных опытах выявлена латентная вирусная инфекция — вирусы морщинистости и крапчатости.

Прививки листьев с симптомами рассеченности и полосчатости на клоны лесной земляники не дали положительных результатов. Это связано, возможно, с присутствием в этих растениях слабых штаммов вирусной инфекции или агентов другой природы.

При механической инокуляции травянистых тест-растений (марь киноа, фасоль) с целью выявления НЕПО-вирусов получен отрицательный результат во всех сериях опытов.

3.3. Листовидные выросты на цветоложе сорта Редгонтлит

На растениях сорта Редгонтлит, полученных методом культуры апексов, нами обнаружены на. цветоложе листовидные выросты, которые формировались вместо семянок. Такие патологические признаки в литературе ранее не описаны. Вирусы и микоплазмоподобные организмы в больных растениях не обнаружены методами электронной микроскопии, прививками на индикаторные клопы лесной земляники, оздоровленные культурные сорта земляники и растения барвинка розового (Vinca rosea L.). Из больных растений выделили микроорганизмы, сходные с бактериями. Они подавляют всхожесть семян кукурузы и гороха и оказывают токсическое действие на их проростки, чувствительны к антибиотикам и в особенности к.левомицетину. На обычных бактериальных средах микроорганизмы не выделялись, но легко выделялись на модифицированной среде, разработанной в Укр. ШШОС Ю. П. Садовским для культивирования риккетсий. Это дало

б

нам основание отнести выделенные микроорганизмы к риккет-сиеподобным бактериям (РПБ). РПБ (0,2—0,3X0,8—1.4 мкм) в ультратонкнх срезах обнаруживали лишь у больных растений, тогда как эпизодические высевы на питательную среду происходили и из внешне здоровых.

Листовидные выросты на цветоложе постоянно обнаруживались у части растений в периоды недостаточного освещения, когда растения были ослаблены. В полевых условиях подобные симптомы не наблюдались.

Пока нет достаточных оснований говорить о причастности РПБ к данной патологии, хотя можно предположить, что у ослабленных растений с. Редгонтлит активность РПБ повышается, вызывая описанную аномалию. Возможно, РПБ присутствуют у растений и других сортов, в контрольных растениях лесной земляники они не обнаружены, но растения сорта Редгонтлит оказались более чувствительными к продолжительному выращиванию в условиях защищенного грунта.

3.4. Эффективность оздоровления посадочного материала земляники в условиях Московской области „

В литературе по поводу вредоносности вирусных болезней и эффективности оздоровления земляники от вирусов имеются противоречивые данные. Это, по-видимому, вызвано следующим: а) не все сорта реагируют на вирусы одинаково, то

Таблица 1

Сравнение продуктивности оздоровленных от вирусов и неоздоровленных растений земляники (среднее за 1985—19*6 гг.)

Кол-во Урожай

цветков на от одного

растении растения

Вариант

Средняя масса одной ягоды.

5 о

с. Редгонтлит

1. Неоздорозленный (контроль) 24,0 100,0

2. Оздоровленный, затем искусственно зараженный , . . „ . £0,8 86,7

3. Оздоровленный..........29,8* 124.2

с. Фестивальная

135.5 96,4 177,9» 126,6

7.6 8.5

о о око.

140,5 100,0 1 7,2 100,0

1. Неоздоровлснный (контроль) 36.6 100,0 178.3 100,0 5.3

2 . Оздоровленный ..'... 40.0 109.3 226,5* 127,0 7,2*

105,5 118.1

100,0 135,8

есть среди них имеются относительно устойчивые и сильно поражаемые сорта; б) состав вирусов и их штаммовые различия в зоне возделывания не всегда одинаковы; в) на степень проявления заболеваний и их вредоносность большое влияние оказывают почвенно-климатические условия.

В нашем опыте бессимптомная вирусная инфекция оказала значительное влияние на урожай растений и массу ягод (табл. 1). Так, оздоровленные, а затем искусственно зараженные растения с. Рсдгонтлпт вирусным комплексом (вирусами крапчатости, морщинистости, пожелтения краев листьев) снизили урожай с куста более чем на 30% по сравнению с оздоровленными. А средняя прибавка урожая оздоровленного материала сортов Редгонтлит и Фестивальная за два года превысила неоздоровленный контроль на 26,6 и 27,0% соответственно. Увеличение урожайности у оздоровленных растений происходило за счет образования большего количества цветков, а также вследствие увеличения средней массы ягоды.

Результаты опытов показывают также достоверное увели; Таблица 2

Экономическая эффективность использования оздоровленного от вирусов посадочного материала земляники

Категория посадочного

материала . 2-й вариант Пок:азатели 1 _ ж - 2 в %к

ровленный р2о_ензный контролю (контроль) ровленный

Плошадь, га ...:»».. 10.0 10,0

Урожайность, ц/га............99,6 126,4 126,9

Сбор валовой продукции, ц . . 996 1264 126,9 Стоимость валовой -продукции,

руб.......................229578 291352 126,9

Себестоимость ед. продукции, руб. 62,1 58,47 94,1

Производительность труда, 77,48 82,5 106,5

руб./чел-день.............77,48 82,5 106,5

Затраты труда, чел.-день/ц . . . ,^77229!;8 21744,'69 по 6

Чистый доход, руб./га •..........Ю772.6 21744,6 Ш,6

Дополнительная' прибыль с 1 га,

РУб 4972,0

рРУбб "■" ■ %...... 271 294 .+23

Рентабельность, % .....

Окупаемость, раз ........

Маточники.

Плошадь, га.....Ь 1,0

Выход розеток, тыс. шт. . . • , 600

Стоимость продукции, тыс. руб 33,0

Чистый доход, тыс. руб. .... 20,9 Дополнительная прибыль, тыс

•руб. .

> р

1,0

47,6 30,1

9,2

144,2 144,2 144,0

« I. >

ченне вегетативной продуктивности оздоровленных растений с. Редгонтлнт: число розеток увеличилось на 44%, масса розеток с одного куста — в 1,5 раза, они были более крупными (на 28%). Экономические расчеты показали эффективность возделывания земляники на безвирусной основе (табл. 2).

Исходя из показателей таблицы 2,' полученных расчетным путем, можно заключить,, что возделывание земляники на безвируснон основе дает значительный экономический эффект, т. к. производительность труда возросла на 6,5%, затраты труда на единицу продукции снизились на 6,4%, а чистый доход с Г га возрос на 29,6% в сравнении с первым вариантом. Рентабельность во втором варианте на 23% выше, при этом себестоимость единицы продукции снизилась на 6% (3,63 руб.). Продуктивность маточников в выпуске элитной рассады повышается в результате оздоровления более чем на 40%, а дополнительная:прибыль с 1га составляет 9,2 тыс. РУб.

4. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ОЗДОРОВЛЕНИЯ ОТ ВИРУСОВ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ЗЕМЛЯНИКИ

4.1. Однократное применение ингибиторов в сочетании с культурой меристематических верхушек-

Добавление АВП в среду позволило значительно увеличить процент оздоровления в сравнении с контролем в 1,8 и 1,7 раза у сорта Редгонтлнт и в 2,4 раза у сорта Зенга Зенга-. на (табл. 3). Ингибиторы вирусов могут несколько снижать приживаемость эксплантатов и их регенерационную способу ность. Так, например, на с. Редгонтлнт без добавления АВП при 81,7% приживаемости эксплантатов получено 374 регене-ранта. При добавлении в среду цианогуанидина и циано-гуаиидина в сочетании с Яо-1-і процент приживаемости был 73,3 и 76,0, а число регенераитов 327 и 234 соответственно. Некоторое снижение количества регенераитов на среде с АВП полностью перекрывается повышением выхода безвирусных растений в 1,9—2,5 раза в зависимости от ингибитора и сорта.

При оздоровлении лесной земляники (клон иС-5) от вирусов крапчатости и морщинистости с применением 2-тисдл»цила (4 мг/л) получено в 1,8 раза больше растений без симптомов вирусной патологии, чем в контроле. Причем, этот препарат более эффективно подавлял вирус крапчатости (на 96%), чем морщинистости (на 77%).

Таблица

Влияние однократного применения синтетических ЛВП на результаты оздоровления земляники, зараженной суровой-морщинистостью (размер эксплантатов 0,5—0,7 мм, высажено по 60 эксплантатов), 1984—19S5 г.

Результаты тестирования Выход здоровых растений

Вариант всего тестировано клоноз, шт. из них оказалось здоровых, пт. % оздоровления 1' &: контролю

с. Редгонтлит

Контроль, без АВП . . 49 17 34,7 117 31,3 ЮО.0

Цианогуанидин, 100 мг/л 44 27 61,4 194 59,3 189,4

Цианогуанидин+ К&-1 — 1,

50 + 50 мг/л .... 38 22 57,9 183 78,2 249,8

HCPos.......; 12,7

с. Зенга Зенгана

Контроль, без ЛВП 2-тиоурацил, 4 мг/л HCPos .....

47 44 29,8 111 30,2 100.0

52 37 71,1 193 72,8 241,0

9,2

4.2. 2-кратное применение ингибиторов в культуре in vitro

Методика применения ЛВП на этом этапе работы была несколько изменена. Сначала на среде с ЛВП в течение 3—5 недель культивировали почки рожков величиной 0,3—0,5 см, а затем из них выделяли эксплантаты величиной 0,9—1,2 мм и помещали на свежую питательную среду того же состава. Ингибиторы, таким образом, воздействовали на растения дважды: до выделения эксплантатов и при последующем их культивировании в стерильной культуре. Мы предположили, что обработка растений ЛВП до выделения эксплантатов позволит увеличить размер последних и более достоверно оценить влияние АВП на эффективность оздоровления.

' Данные, приведенные в таблице 4, показывают, что все ингибиторы способствовали.увеличению выхода безвирусных клонов по отношению к контролю.

Цианогуанидин оказался более эффективным препаратом, чем 2-тиоурацил и Ro-1-l. Наибольший процент выхода безвирусных клонов (6G%) получен от комбинированного применения АВП (цианогуанидин + Ro-l-I). РНК-аза не оказала существенного влияния на выход безвирусных клонов. Следо-

Таблица 4

Влияние 2-кратного применения ЛВП на результаты оздоровления земляники сорта-Редгонтлит, зараженного суровой морщинистостью; (размер эксплантатов 1 мм), 1984—1985 гг.

Результаты тестирова! 1ИЯ

всего из лих

Вариант тестировано клонов, шт. оказалось здоровых, шт. % оздо-ровле-ния % к контролю

45 14 31,1 100,0

47 29 61,7 65.9 198,4 212,0 153.4 194.5 126,0

Цианогуанидин+ Яо—1 — 1, 44 29

44 21 47.7 60.5 39,1 11.8

2-тиоурацил. 4 мг/л.....'. РНК-аза, 100 мг/л....... 88 46 • 23 18

вательно, можно предположить, что данный препарат снижал концентрацию вирусов, тогда как остальные АВП (цианогуа-нидин, Яо-1-1, 2-тиоурацил) ингибировали репликацию вирусов в меристематических тканях апексов,

Сравнение данных опытов по сопоставимым вариантам (табл. 5) показывает, что двукратное применение ЛВП до и после выделения эксплантатов позволило увеличить безвирусную зону до 1 мм, что не привело к снижению выхода безвирусных растений,-а также позволило повысить процент приживаемости эксплантатов от 12 до 21% (в опытных вариантах) и сократить время регенерации более чем на две недели.

Таблица

Сравнение эффективности одно- и двукратного применения АВП-при оздоровлении земляники, зараженной суровой морщинистостью (с. Редгонтлит)

Вариант

Контроль, без АВП

Цианогуанидни

Цианогуанидия + Яо—1—1

Применение АВП

1-кратное

2-кратнсе

1-кратное

2-кратное

Размер эксплан-татоз, мм

> й га ш о я 5 т к 2 3 е*

* л <- ~ <и Я

5.8 2 3°^

= 8 в ~1 8 о-

0,5—0,7 1,0 0,5-0.7 1.0 0,5—0,7 • 1,0

81,7 90,0 73,3 91.0 70.0 88,0

80 62 78 59 75 60-

Выход здоровых клонов

% к контролю

34,7 31,1 61.4

61,7 57,9 65,9

100.0 100.0 177,0 193.4 167,0 212,0

Двукратное применение ЛВП мы также изучали на клоне лесной земляники Лльпнна, зараженном пожелтением краев листьев. Среди испытанных препаратов наиболее эффективными оказались цианогуанидин, 2-тиоурацил и Ro-1-l, которые способствовали увеличению выхода безвирусных растений в 1,8—2,5 раза по сравнению с контролем (без ЛВП).

Испытание новых синтезированных в СССР ЛВП (МК-1, МК-5, МК-9, Ф-348, Ф-428, Ф-429), в культуре in vitro при оздоровлении от вирусов крапчатости и морщинистости клона UC-5 лесной земляники (размер эксплантатов 0,9—1,2) показало, что некоторые из них, в особенности МК-5 (240 мг/л) и Ф-348 (100 мг/л), обладали высокой антивирусной активностью. Их эффективность оказалась примерно на уровне циано-гуанидина:.51,8 и 66,7% (выход здоровых растений), в варианте с цианогуанидином выход здоровых растений составил 56%, тогда как в контроле (без ЛВП) здоровых растений не получено. ......

4.3. Сочетание термо- и химиотерапии с культурой. апикальной ткани

Сравнивали эффективность культуры апексов в сочетании с термотерапией и химиотерапией. Опыты проведены на с. Жемчужница, растения которого поражены вирусами морщинистости и пожелтения краев листьев, и на индикаторном клоне UC-5 Fragaria vesca, пораженном суровой морщинистостью.

Во всех опытных вариантах процент выхода оздоровлен--

Таблица 6

Влияние АВП и термотерапии 'в сочетании с культурой апексов на результаты оздоровления земляники с. Жемчужница от вирусов морщинистости и пожелтения краев листьев (размер эксплантатов 1,0 мм), 1985—1986 гг.

Вариант

£">5

| S.5S Е S В

о 5 ■

i- ta 5

h-a і

2 = S

Ежи

пожелтения краев листьев

1—Контроль, без АВП и термотерапии ...........

2 — Цианогуанидин, 100 мг/л.. '.

3 — Цианогуанидин+ДГТ,

50 + 50 мг/л........

4—Термотерапия, 37—38°С,

3 неделя.....ш . . .

НСРсє • • • .і ..*.., .

а« % клонов, свободных

от вирусов

всего здоровых

86,2 89,6 21 43 33,3 53,5 47,6 67,4 23,8 48,8

77,4 24 62,5 75,0 53,3

74,4 32 59,4 87,5 56.3 14,9

ных растений по сравнению с контролем значительно выше (на 25—35%), что подтверждается математической обработкой данных (табл. 6).

Различия между вариантами 2, 3 и 4 несущественны. Как термотерапия, так и ЛВП в сочетании с культурой меристс-матических верхушек довольно легко элиминировали вирусы, -вызывающие пожелтение краев листьев. Метод термотерапии в сочетании с культурой верхушечных меристем оказался более эффективным в борьбе с пожелтением краев листьев. В этом варианте безвирусных растений получено на 12— 20% больше по сравнению с применением АВП.

Анализируя влияние ЛВП на оздоровление от морщинистости, можно отметить, что сочетание цианогуанидина с ДГТ лучше подавляет вирусы, чем один цианогуанндин. Комбинация двух ингибиторов действует так же, как и термотерапия.

Данные по оздоровлению от вирусов лесной земляники подтверждают в основном результаты, полученные на с. Жемчужница. Сочетание культуры in vitro с применением АВП (цианогуанндин+ДГТ, 50+50 мг/л) было более эффективным (% оздоровления — 66,7), чем сочетание термотерапии с культурой апексов (% оздоровления — 44,0). Если же учесть значительный отход исходных растений в процессе термотерапии (в наших опытах 1/3), затраты на ее проведение и подготовку растений, то можно утверждать, что целесообразна замена термотерапии на химиотерапию.

4.4. Влияние оздоровления методом культуры апексов и синтетических АВП на продуктивность маточников

Антивирусные вещества, как известно из литературных данных, повышают выход безвирусных растений. Наши эксперименты подтвердили такую закономерность и на землянике.

Влияние АВП, вводимых в питательную среду при культивировании апексов, на вегетативную продуктивность полученных маточников в последующий период их выращивания в открытом грунте ранее не изучалось.

Мы заложили специальный опыт в 7 вариантах на с. Ред-гонтлит и в 2-х — на с. Зенга Зенгана. В него были включены не только здоровые маточные растения, но и те, которые при тестировании на растениях-индикаторах выявили признаки вирусного поражения.

Во всех вариантах, где использовались АВП (цианогуа-нндин, цианогуанидии + Ro-l-l, 2-тиоурацил), показатели продуктивности были более высокими, чем у иеоздоровлен-ных и не прошедших через стерильную культуру растений. Тенденция повышения продуктивности сохраняется почти по всем показателям, в большинстве случаев эти различия яв-

ляются существенными. Так, масса усов с розетками даже у больных растений, прошедших через культуру in vitro, повышалась на 14—24%, а у здоровых — на 9—27%, масса розеток— с больных растений на 20—59%, со здоровых — на 47— 72%, выход розеток — с больных на 15—29%, со здоровых на 29—51% в сравнении с контролем (с. Редгонтлит).

Повышение продуктивности прошедших через культуру in vitro растений, вероятно, связано не только с подавлением вирусной инфекции, но и сообщен активацией физиологических процессов в растениях, при этом последняя иногда преобладает. Сравнивая варианты, где применялись ЛВП, с аналогичными вариантами, где они не применялись, следует отметить, что ЛВП не влияют на вегетативную'продуктивность, нет ни угнетения, ни стимуляции развития.

5. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ ЗЕМЛЯНИКИ

5.1. Изучение чувствительности клонов лесной земляники к вирусным заболеваниям, распространенным в Московской области *

Вирусные болезни земляники: морщинистость, крапчатость и пожелтение краев листьев нами выявлены в Московской области при обследовании плантаций и коллекционных посадок. Сорта, зараженные этими болезнями, поступают на оздоровление, поэтому мы изучали чувствительность ряда индикаторных клонов лесной земляники к вирусам-возбудителям.

В результате сравнительных опытов выявлены наиболее чувствительные к вирусам морщинистости и краичатости клоны лесной земляники UC-5, ЕМК и FV-72, характеризующиеся высокой вероятностью заражения и достаточной интенсивностью проявления симптомов. Весенняя прививка оказалась более эффективной (передача 100%, инкубационный период составил 27—48 дн.), чем зимняя (передача 88—100%, инкубационный период составил 21—79 дн.).

Для выявления вирусов, вызывающих пожелтение краев листьев, наиболее пригодными оказались индикаторные клоны ЕМК и UC-1. Эти вирусы имели на указанных клонах самый короткий инкубашганый.период-(35—51 дн.), наибольший процент заражения и высокую интенсивность проявления симптомов. Таким образом, тестирование клонообразовате-лей на отсутствие вирусов этой группы можно проводить на клонах лесной земляники UC-1 и ЕМК, FV-72 и UC-5, используя по одному индикаторному растению из каждой пары. Продолжительность теста составляет два месяца при весенней прививке и три— при зимней.

5.2. Испытание метода-трансплантаций при диагностике специфических вирусов земляники на однолетних травянистых индикаторах -

Передать специфические вирусы земляники на травянистые тест-растения механическим путем, как правило, не удается. В связи с этим возник вопрос об испытании метода трансплантации для передачи вирусной инфекции с земляники на однолетние травянистые индикаторы. Такая передача, в. случае успеха, позволила бы избежать длительного тестирования оздоровленных растений на клонах лесной земляники.

Используя различные способы трансплантации и виды травянистых индикаторов, мы обнаружили, что некоторые из них, такие как петуния гибридная, обыкновенный дурман и клейкий табак, не реагировали на заражение вирусами морщинистости и крапчатости, тогда как другие — марь киноа и в особенности.фасоль проявляли хорошо заметные симптомы (куполовидность листьев, системный краевой точечный некроз, системная междужидковая мозаика, искривление листочка, эпинастия, пузыревидные вздутия, морщинистость — на фасоли). Трансплантация лишь способом бутылочной прививки оказалась удачной на фасоли, а на мари киноа получены единичные положительные результаты только от трансплантации вприклад. Из четырех сортов фасоли (Сакса, Бук-тифул, Пинто, Редкидни) сорт Сакса оказался более восприимчивым к вирусному поражению. Первые признаки поражения фиксировались через неделю. Средний инкубационный период составил 13 дней. Для выращивания растений фасоли, пригодных для инфицирования, требуется небольшое время (8—12 дней); растения удобны для трансплантации, т. к. стебель сочный и устойчивый, диаметр его 3—5 мм. Наибольший процент положительных результатов наблюдал -ся в периоды декабрь—февраль (64%), март-май (40%), тогда как в сентябре—ноябре всего лишь 21%. а в период с июля ^ август он был равен нулю.

Однако значительный процент положительных результатов при заражении растений фасоли методом трансплантации позволяет считать, что могут быть найдены условия для получения достоверных результатов, близких к 100%.

Выводы

♦ 1. При обследованиях посадок земляники в Московской области выявлено и описано восемь вирусных и вирусопо-" добных заболеваний: морщинистость (0,6—29%), крапча-тость (до 5,5%), пожелтение краев листьев, воронковидность, рассеченность долей листьев, полосчатость и посветление жи-

лок (на отдельных сортах до 7%), пестролистность (на двух сортах до 12%).

2. В растениях с. Зеига Зенгана с симптомами морщинистости прививкой на клоны Fragaria vesca подтверждено присутствие вируса крапчатости (mottle virus) n латентного вируса А морщинистости (latent virus Л crinkle), а в растениях с. Фестивальная — вируса слабого пожелтения краев листьев (mild yellow-edge virus) и морщинистости; с симптомами пожелтения краев листьев у растений с. Пурпуровая — вируса слабого пожелтения краев листьев и крапчатости.

3. Латентный вирусный комплекс морщинистости, крапчатости и пожелтения краев листьев земляники снижал урожайность у растений с. Редгонтлит на 15,6% в первый год и на 36,8% во второй .год возделывания по сравнению с оздоровленными растениями.

Средняя прибавка урожая оздоровленного материала сортов Редгонтлит и Фестивальная за два года превысила не-оздоровленный контроль на 26,6 и 27,0% соответственно. Оздоровление повышало и вегетативную продуктивность растений с. Редгонтлит: выход розеток на 44%, а их массу с маточного куста в 1,7 раза в сравнении с неоздоровденным контролем.

4. Показана возможность повышения эффективности оздоровления земляники от вирусов методом культуры апикальной меристемы путем применения АВП при их добавлении в питательную среду.

Наиболее эффективными в оздоровлении земляники от вирусов оказались АВП: цианогуанидии, 2-тиоурацил, Ro-1-l, МК-5, Ф-348. Сочетание двух ингибиторов (цианогуа-нидина с Ro-1-l, цианогузнидина с ДГТ) усиливает их влияние на результаты оздоровления земляники от вирусов.

5. Двукратное применение АВП до и после выделения эксплантатов позволило увеличить размер последних до 1 мм, что не вызвало снижения выхода безвирусных растений в сравнении с однократным применением АВП при размере эксплантатов 0,5—0,7 мм. Это облегчает работу по выделению эксплантатов; повышает процент их приживаемости и сокращает время регенерации на 2—3 недели.

6. Эффект от применения АВП в культуре in vitro при оздоровлении земляники от вирусов не уступает в зависимости от сорта и состава вирусов сочетанию методов термотерапии и культуры апексов или превосходит его. Применение ингибиторов вирусов в оздоровлении земляники методом ме-ристематических верхушек при двукратном воздействии позволяет отказаться от предварительной термотерапии, вызывающей отход исходных растений.

7. Антивирусные препараты (цианогуанидин, цианогуани-дин +Ro-l-l,2-THoypamu) не влияли на биологическую продуктивность маточных растений, вышедших из культуры in vitro при дальнейшем их выращивании.

8. Наибольшей чувствительностью к вирусам морщинистости и крапчатости обладают клоны лесной земляники UC-5, ЕМК и FV-72, а к вирусам пожелтения краев листьев— UC-1 и ЕМК. Тестирование целесообразно проводить при зимней прививке с продолжительностью теста три месяца, при весенней—два месяца.

9. Впервые описано новое заболевание земляники — листовидные выросты на цветоложе у растений с. Редгонтлит, прошедших культуру апексов. Выросты формировались вместо семянок. Симптомы проявлялись в позднеосеннии, зимний и ранневесенний периоды и только в условиях теплицы. Заболевание не удалось передать прививкой на здоровые растения земляники. В больных растениях путем посева на'селек-тивную среду и с помощью 'электронной микроскопии.в ультратонких срезах корней обнаружены риккетсиеподобные бактерии (РПБ), обладающие фитотоксичностью и чувствительные к антибиотикам,особенно к левомнцетину.

10. Пестролистность распространена в основном на двух сортах земляники — Ясная заря (12,2%) и Весенняя (5,5%). Индикаторным методом инфекционная природа этого заболевания не установлена, но в отдельных опытах выявлена латентная вирусная инфекция — вирусы морщинистости и крап-чатости. Сеянцы из семян.от больных растений были поражены пестролистностью на 71%. От пестролистности растения можно освободить методом культуры апексов при размере эксплантатов не более 0,5 мм.

11. Показана возможность передачи " способом прививки специфических вирусов земляники на травянистые растения-индикаторы. Среди индикаторов наибольшей чувствительностью обладала обыкновенная фасоль с. Сакса.

12. Расчетная дополнительная прибыль от оздоровления на плодоносящей плантации составила 4,9 тыс. руб/га, на элитном маточнике — 9,2 тыс. руб/га.

Рекомендации производству

На основании проведенных исследований рекомендуется научно-исследовательским учреждениям и питомниководче-ским хозяйствам но культуре земляники:

— закладывать маточники и производственные плантации только оздоровленным материалом класса «Л»,

—использовать в оздоровлении земляники от вирусов методом культуры апексов цианогуанидин, 100 мг/л; 2-тиоура-

П

цил, 4 мг/л; а также циаиогуанидин в сочетании, с ДГТ, 50 + 50 мг/л; циаиогуанидин в сочетании с алкенсульфонатом, 50 + 50 мг/л;

— целесообразно применение АВП в питательной среде .до и после выделения эксплантатов;

— размер вычленяемых эксплантатов при этом "может быть увеличен до 0,9—1,2 мм в целях сокращения отхода, затрат труда и времени на получение оздоровленных растений;

— тестирование оздоровленных клонов целесообразно проводить в весенний период на клонах лесной земляники иС-1 и ЕМК, БУ-72 и иС-5, используя по одному индикаторному растению из каждой пары, продолжительность теста — два месяца.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы

1. Малыхин П. М., Вишшкая О. П., Шмыгля В. А., Шустер Г. Оздоровление земляники методом культуры апексов при использовании синтетических ингибиторов вирусов//Изве-стня ТСХА. — 1986. — К» 3. С. 135—137.

2. Малыхин П. М. Усовершенствование методов оздоровления от вирусов исходного материала земляники//Тр. научн. конф. молодых ученых 3—6 июня 1986 г. (Московская сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева.— М. 1986. С. 509—519 (рукопись деп. во ВНИИТЭИ агропрома 31.10.1986 г. Кя 444/57 ВС-86 Деп.).

3. Малыхин П. М., Виницкая О. П., Шмыгля В. А. Эффективность ингибиторов в оздоровлении земляника/Плодоовощное хозяйство.— 1987. — № 1. — С. 37—38.

4. Виницкая О. П. Малыхин П. М., Шмыгля В. А. Эффективность оздоровления посадочного материала земляни-ки//Плодоовощное хозяйство.— 1987. — №.3. С. 42—43.

Л 85322 23/Ш—87 г. Объем 1>Д п. л. Заказ 774. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирявевская ул., 44