Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Особенности размножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники IN VITRO

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Особенности размножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники IN VITRO"

Oil

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕНКО Лилия Владимировна

ОСОБЕННОСТИ РАЗМНОЖЕНИЯ НЕЙТРАЛЬНОДНЕВНЫХ И РЕМОНТАНТНЫХ СОРТОВ ЗЕМЛЯНИКИ IN VITRO

Специальность 06.01.07 - плодоводство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук.

Москва - 1998.

Работа выполнена во Всероссийском селекционно технологическом институте садоводства и питомниководства.

Научный руководитель - кандидат биологических наук

В. А. Высоцкий.

Официальные оппоненты : доктор сельскохозяйственных наук,

профессор И.В. Попова; кандидат сельскохозяйственных наук Т.Д. Никиточкина.

Ведущее придприятие - Главный ботанический сад им Н.В. Ци-цина Российской академии наук.

Защита состоится « Ч » U/ОНУ 1998 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 020.20.01 во Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства по адресу : 115598 , Москва, ул. Загорьевская, 4, ВСТИСП, диссертационный совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского селекционно-технологического института садоводства и питомниководства.

Автореферат разослан <<Л0 » Ctn^ot</iJ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат сельскохозяйственных наук

-JI.A. Припева.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы. На современном этапе важной задачей является выпивание экономически выгодных культур, конкурентоспособных в уСло-ях рынка, пользующихся высоким спросом.

Всем этим требованиям отвечает земляника - наиболее рентабельная среди )дных растений. Одной из проблем в настоящее время является продление юна потребления свежих ягод земляники и организация поставок внесезон-IX урожаев этой культуры. В связи с этим растет интерес к новым и перспек-вньиу! нейтральнодневным и ремонтантным сортам земляники. Нейтралънодневные сорта земляники созданы в Калифорнийском Универ-гете. Особенностью этих сортов является способность закладывать соцве-i независимо от фотопериода как на длинном, так и на коротком дне. По нным, полученным при изучении нейтральнодневных сортов в Калифорнии и уже в год посадки могут давать урожай до 28 т/га ( при плотности посадки тыс/шт га). В последующие годы пик цикла поступления продукции при-цится на каждые 6 недель с июня и далее. Нейтральнодневные сорта спо-5ны давать 2-3 урожая даже в условиях средней полосы России. Изучение вых сортов в ГБС РАН проводилось в 1985 - 1988 гг. Ценность их определяя величиной второго урожая в августе - сентябре. Сорта Тристар и ибьют были рекомендованы как для открытого грунта, так и для получения ащищенном грунте внесезонных урожаев земляники. В связи с этим встала облема получения достаточного количества посадочного материала дан-к сортов.

В настоящее время производство сертифицированного посадочного мате-ала невозможно без применения биотехнологических приемов. Метод кло-гсьного микроразмножения обеспечивает возможность получения оздоров-яного посадочного материала, ускоренное размножение в течение коротко-времени, планирование выпуска растений к определенному сроку, эффек-вное использование зимнего периода. Для земляники этот прием стал уже омышленным, однако особенности размножения ремонтантных и ней-альнодневных сортов in vitro изучены до сих пор не были. Необходимость точения клонального микроразмножения в систему производства посадоч-го материала нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники вы-ша так же тем, что в силу их биологических особенностей размножение иных сортов традиционным способом затруднено.

Цель и задачи исследовании . Цель исследований - изучение процессов онального микроразмножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов пляники, а так же разработка элементов рационального технологического

процесса, включаемого в систему производства исходных растений для 3í кладки оздоровленных маточных насаждений. - . Решались следующие задачи:

1. Изучить введение в культуру экспяантов различного строения нейтрал! нодневных и ремонтантных сортов земляники и определить режимы и стерилизации для дальнейшего эффективного культивирования.

2. Уточнить составы минеральных основ питательных сред наиболее подхо дящих для пролиферации пазушных почек и побегов нейтральнодневных i ремонтантных сортов земляники.

3. Определить возможность замены 6-бензиламинопурина другими препара тами с цитокининовой активностью с целью увеличения коэффициент; размножения.

4. Изучить реакцию микропобегов размноженных in vito нейтральноднев ных и ремонтантных сортов земляники при культивировании в условия) освещения светом различного спектрального состава.

5. Дать сравнительную оценку морфогенетическому потенциалу и способно сти к регенерации в культуре изолированных пыльников и листовых диско! ремонтантных и нейтральнодневных сортов земляники.

6. Оценить развитие растений - регенератов ремонтантных и нейтральнодневных сортов земляники после клонального микроразмножения в полевых условиях.

7. Разработать рекомендации по включению методов культуры in vitro в технологию ускоренного размножения посадочного материала нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники для закладки маточных насаждений.

8. Дать экономическую оценку технологического процесса размножения исходных растений земляники с использованием биотехнологических приемов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Определены оптимальные стерилизующие агенты, тип исходного экспланта и положительный эффект термообработки исходного материала горячей водой на этапе введения эксплантов нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники в культуру.

Выявлены лучшие питательные среды для микроразмножения изучаемых сортов, обеспечивающие наиболее высокий коэффициент размножения. Подтверждена высокая цитокининовая активность тидиазурона и отмечена целесообразность его применения на этапе микроразмножения данных сортов.

Изучено влияние спектрального состава света на процесс ризогенеза у икропобегов нейтральнодневных и ремонтантных сортов и показана воз-ожность сокращения этапа укоренения при культивировании эксплантов :мляники изучаемых сортов в условиях освещения лампами, имеющими реобладающий спектральный состав в областях синего и красного спектра.

Продемонстрирована возможность получения растений - регенерантов в улиуре листовых дисков и пыльников изучаемых сортов.

Проведена оценка вегетативной продуктивности размноженных in vitro астений ремонтантных и нейтральнодневных сортов земляники в полевых словиях.

Применение разработанных элементов технологии клонального микрораз-ножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники позволяет совершенствовать технологию их ускоренного размножения и получения оз-оровленного посадочного материала, повысить процент укореняемости мик-опобегов, сократить сроки культивирования in vitro, ускорить заготовку ма-ериапа для закладки маточных насаждений.

Апробация работы. Материалы исследований были доложены на IV Международной конференции : " Регуляторы роста и развития растений." г. Москва, 1997 ), на VII Международной конференций : " Биология клеток астений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда." (г. Москва, 1997), а заседаниях Ученого совета и секции ягодных культур Ученого совета 1СТИСЩ 1994 -1997 г.г.).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации публиковано четыре научных статьи.

Реализация результатов исследований. Растения земляники, полученное лаборатории биотехнологии in vitro использованы для закладки маточ-[ика нейтральнодневных и ремонтантных сортов на участке размножения 5СТИСП, а также переданы Санкт - Петербургскому опорному пункту для акладки маточника в совхозе " Северный плодовый питомник" и Крымской 1Пытно - селекционной станции ВИР.

Объем и содержание работы. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, структура диссертации традиционна и состоит из введения, трех глав, выводов и рекомендаций для практического применения, 'абота содержит 21 таблицу и 20 рисунков. Список использованной литера-гуры включает 218 наименований, в том числе 121 на иностранных языках.

Материалы, методика н условия проведения экспериментов.

Исследования проводились в 1994 - 1997 г.г. в лаборатории биотехнологии этдела размножения ВСТИСП.

з

Материал исследований включал нейтральнодневные сорта земляники : Тристар, Трибьют, Брайтон, ремонтантные сорта: Женева, Профьюжен, Ра-пелла. В качестве контроля использовали сорт стандартного сортимента - Ред-гонтлит.

На этапе введения в культуру испытывали следующие стерилизующие агенты : гипохлорит кальция (10 %), диацид (0,1% ), сулема ( 0,1 % ), смесь перекиси водорода с этиловым спиртом ( 15 % + 96 % ), раствор йода (0,01%).

На этапе микроразмножения использовали б композиций питательных сред, с различным составом макроэлементов по рецептам Ли и де Фоссарда (и ), Андерсона ( А ), Мурасиге - Скуга (МБ), Кноппа (К) и Готре ( Э ) (табл. 1), а также испытывали тидиазурон (ТОг) в концентрациях 0,01 мг/л, 0,1 мг/л, 0,5 мг/л. Контролем служила среда с концентрацией 6-бензилами-нопурина (6 - БАЛ) -1,0 мг/л.

Таблица 1

Состав макроэлементов питательных сред, используемых для тонального микро-

размножения земляники ( в мг на 1л).

Компоненты Питательные среды

Мурасиге-Скуга 1/2Мураси-ге Скуга Андерсона Лииде Фоссарда Киота Готре

МдБО* * 7\\0 370 185 370.4 369.54 250 125

№НгР04 * 2НгО - - 429.8 176.5 - -

СаС1г * 2НгО 440 220 440 294.006 - -

ШЭг 1900 950 480 1011 250 125

ЩЩ, 1650 825 400 800.4

Ма^ - - - 92.326 - -

Са(МО}^* 41-^0 - - - - 1000 500

КНгР04 170 85 - - 250 125

Среды для укоренения обогащали р-индолилмасляной кислотой ( ИМК ) в онцентрации 0,5 мг/л и Р-индолилуксусной кислотой ( ИУК ) в концентрами 1,0 мг/л.

В средах для индукции каллусообразования пьшьников испытывали раз-ичные сочетания регуляторов роста в концентрациях: БАП -1,0 мг/л, ИУК -,5 мг/л и БАП -1,0 мг/л, 2,4 - дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4 Д) - 0,75 [г/л.

На этапе субкультивирования пыльников в среду вводили кинетин 1,0 мг/л 2,4 Д-1,0 мг/л.

В опыте с листовыми дисками испытывали БАП - 1,0 мг/л и ИМК - 1,0 [г/л. ' -

Этап укоренения регенератов нейгральнодневных и ремонтантных сортов роводили в условиях освещения лампами, имеющими преобладающий спек-ральный состав в областях синего ( ЛС- 65 ), красного (ЛК-65 ), зеленого макетная лампа) спектра. Контролем служил белый свет (ЛД-80).

Каждый вариант в зависимости от опыта включал 10-30 культуральных эсудов. В опытах с листовыми дисками и пыльниками в каждом сосуде на-одилось по 5 эксплантов, число культуральных сосудов варьировало от 20 до 0. ;

В опыте по влиянию гиббереллина на вегетативную продуктивность ма-этных растений земляники число учетных растений колебалось по вариан-ш от 3 до 16. При снятии биометрических измерений на маточнике учеты 1имали с 25 учетных растений по каждому сорту. Статистическую обработку данных проводили методом дисперсионного тализа с использованием набора программ "81а^гарЬ", а также специально ззработанных оригинальных программ.

При анализе влияния спектрального состава света на укореняемость экс-пантов земляники нами был использован критерий знака ( Снедекор Дж., ?61 ) в модификации и на основе таблиц критических значений критерия гака, изложенных И. Е1алЛ.( 1964 ) с поправкой на двусторонний характер зитерия.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Влияние различных стерилизующих агентов на жизнеспособность и развитие эксплантов земляники при введении в культуру.

Как показали результаты наших экспериментов практически все испытание препараты оказались приемлемыми для поверхностной стерилизации зодимых в культуру апексов ремонтантных и нейгральнодневных сортов

земляники. Наименьший процент контаминации отмечен при стерилизацю ртутьсодержащими препаратами (диацидом и сулемой ), а также гипохлори том кальция.

Использование во втором субкультивировании после стерилизации среды обогащенной гидролизатом казеина ( 5 г/л ) способствовало выявлению скры той бактериальной инфекции и обеспечивало последующее надежное культи вирование " чистых " эксплантов.

Показано безусловное преимущество использования на этапе введения ; культуру меристематических апексов, изолированных из молодых, растущк " усов" и розеток, характеризующихся меньшей контаминацией сапрофитно] микрофлорой.

Для снижения общей зараженности вводимых в культуру эксплантов эф фективным приемом оказалась предстерилизационная промывка апексов зем ляники горячей водой при температуре 48 ± 0,5 °С в течение 15-30 минут.

Биологические особенности изучаемых нейтральнодневных и ремонтант ных сортов земляники обуславливают дефицит потенциальных эксплантов и ростовых почек, которые могут быть введены в стерильную культуру как дл процессов оздоровления, так и для клонального микроразмножения. В резуль тате экспериментов установлено, что для нейтральнодневных и ремонтантны: сортов земляники вполне допустимо использование в качестве дополнитель ных исходных эксплантов базальных участков цветковых почек, хотя в пер вом субкультивировании получение из этих структур нормальных побегов ] почек происходит медленнее, чем из апексов вегетативных почек (табл. 2 ).

Таблица 1

Среднее число дополнительных почек (штЛ образованных эксплантами разных сортов земляники в зависимости от происхождения к концу 4-ой недели культивирова-

ния ( объем варианта - 20 эксплантов ).

Ссрг Эатшгы гее

фетмъкгтиж ростаеьк гснек

Ерайгсн 1.4+0.3 2.1+02

Жнзвг 1.3+02 22+03

Пхфялен 1.2+01 1.8+02

РсГЁгта 0 1.0+01

ТрИэьог 1.5+02 20+0.2

Трипар 1.7+03 22+02

Влияние минеральных составов питательных сред на процессы микроразмножения ремонтантных и нейтралышдневных сортов земляники.

В наших экспериментах минеральный состав искусственных питательных ред оказывал существенное влияние на процессы клонального микрораз-ножения изучаемых сортов. Наиболее высокий коэффициент размножения обеспечивали среды, содер-:ащие макроэлементы по рецептам Ли и де Фоссарда, Андерсона, Мурасиге -:куга. Более бедные по минеральному составу питательные среды : Готре и азбавленная вдвое среда Мурасиге - Скуга, хотя и были пригодны для разви-ия эксплантов испытанных сортов земляники в меньшей степени способст-овали образованию дополнительных побегов.

Среди испытанных сортов наибольшим коэффициентом размножения ха-актеризовались экспланты нейтральнодневных сортов Тристар, Трибыот и емонтантного сорта Женева. Минимальный коэффициент размножения отечен у эксплантов ремонтантного сорта Рапелла. Сорта Профыожен и Ред-энтлит в отношении коэффициента размножения занимали промежуточное оложение (табл. 3 ).

Таблииа 3

Вреднее число дополнительных побегов, развившихся у эксплантов различных сортов земляники, в -зависимости от минерального состава питательных сред (шт).

Сорт Питательные среды

МЭ 1-Р А К 6 X

Тристар 45 325 625 66 525 35 49

Трибыот 475 375 593 4« 425 1,5 40

Рапелла 20 075 08 1,3 1,0 1,25 12

Профьюжен 36 33 33 44 26 28 33

Женева 4,4 375 зэз 34 46 25 37

Редгонтлит 4,3 28 4,0 368 325 20 33

"х" 39 29 39 39 35 23 -

Одним из показателей качества развившихся побегов является общий к размер. Более благоприятными для роста эксплантов земляники, как и да развития дополнительных побегов оказались питательные среды Мурасиге С куга, Ли и де Фоссарда и Андерсона. Наибольшая высота побегов была ха рактерна для нейтральнодневных сортов Тристар, Трибьют, ремонтантной сорта Женева и сорта Редгонтлит.

Отсутствие существенного взаимодействия между составом питательны: сред и сортовыми особенностями ( F ф < F теор.), при обработке получении данных методом двухфакторного дисперсионного анализа, косвенно под тверждает тот факт, что развитие эксплантов изученных нейтральнодневных i ремонтантных сортов земляники in vitro обуславливается главным образом ю генетическими особенностями и составом питательных сред, а не специфиче скими требованиями к Элементам питания.

Возможность замены 6 - бензиламинопурина на этапе микроразмножения ремонтантных и нейтральнодневных сортов тидиазуроном.

Одним из путей увеличения коэффициента размножения на этапе пролиферации является поиск новых эффективных препаратов для стимуляции бокового ветвления у культивируемых эксплантов. Изучение действия различных концентраций тидиазурона на пролиферацию побегов нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники показало, что тидиазурон в концентрации 0,5 мг/л обеспечивал примерно такой же коэффициент размножения как и 6 - БАЛ. Однако, в лучших вариантах на средах Мурасиге - Скуга и Андерсона для сорта Тристар и на среде Ли и де Фоссарда для сорта Трибьют коэффициент размножения существенно превышал таковой у контрольного варианта. Отмечено, что на средах Кноппа и Андерсона TDZ и в более низких концентрациях обеспечивал достаточно высокий коэффициент размножения, сравнимый с контролем (табл. 4).

Что касается влияния препарата TDZ на размер дополнительных побегов у культивируемых эксплантов, то здесь выявились следующие закономерности. В вариантах с включением TDZ в питательную среду в концентрациях 0,1 и 0,5 мг/л средняя высота побегов была приблизительно такая же, как в контрольном варианте, содержащем 1,0 мг/л 6 - БАЛ, хотя некоторая тенденция к снижению средней высоты побегов в вариантах с содержанием TDZ -0,5 мг/л прослеживалась.

Таблица 4

Среднее число побегов, развившихся у эксплантов различных сортов земляники в зависимости от состава питательных сред (штЛ

Среда <онценграци регуляторов роста, мг/л Сорт X

Тристар Редгонтлит Женева Трибьют

МЭ БАП-1.0 1.7 2.0 6.4 5.1 3.8

Т0г-0.01 1.6 1.5 1.9 1.3 1.6

Т02-0.1 2.5 1.7 1.6 1.6 1.9

тог-о.5 3.7 2.4 2.2 3.5 2.9

"х* 2.4 1.9 3.0 2.9

Лииде Фоссарда БАП-1.0 3.0 2.4 3,2 2.4 2.8

тог-оо1 2.2 1.7 2.3 1.6 1.9

тог-о.1 1.6 . 2.8 2.4 3.0 2.5

тог-о.5 3.1 3.2 3.5 3.8 3.4

7 2.5 2.5 2.9 2.7

Кноппа БАП-1.0 1.8 3.5 2.4 2.0 2.4

тог-о.о1 2.3 2.6 4.2 2.5 2.9

ТО2-01 2.6 1.9 2.7 2.6 2.5

Т02-0.5 2.0 1.1 1.1 0.7 1.2

X 2.2 2.3 2.6 1.9

Андерсон БАП-1.0 1.7 4.1 5.6 3.6 3.8

трг-о.о1 2.8 2.0 4.2 2.9 ■2.9

тог-о.1 3.8 3.5 3.1 1.9 3.1

тог-о.5 2.6 3.6 , 2.3 0.9 2.4

X 2.7 3.3 38 2.3

НСРП5Авс = 1.74 НСРо.авс = 2.29

Влияние различных факторов культивирования на укоренение побегов ремонтантных и нейтралыгодневных сортов земляники.

На этапе укоренения микроразмноженных побегов, помимо состава пита-гльных сред, изучали влияние освещения лампами, имеющими преобла-ающий спектральный состав в областях синего, красного и зеленого спектра

на процессы ризогенеза нейтрал ьнодневных и ремонтантных сортов земляники (табл. 5 ). Статистический анализ результатов был проведен с использованием непараметрического критерия знака При сравнении варианта с использованием белого света со всеми другими независимо от регулятора роста были установлены существенные различия по сорту Редгонтлит на 30 % , сорту Тристар на 26 % , по сортам Трибьют и Женева - на 20 % уровнях укореняе-мости. В вариантах с ИМК в качестве препарата с ауксиновой активностью по всем сортам оказались доказанными различия на 20 % , а в вариантах с ИУК на 10 % уровне укореняемости. Таким образом эти данные подтверждают положение о том, что на первых этапах укоренения ИУК обеспечивает более быстрое и стабильное укоренение по сравнению с ИМК.

Таблица 5

Влияние спектрального состава света на укореняемость эксплантов земляники, %.

14М0СШО Рбгугигф \Лщвзп Сорт

свела роста НЕ&КДЭ- но*, дм Вэдгнг-гиг Тр^ьюг Тр/сгар М%нева

ИМК 20 42 50 42 42

красный 56 92 75 75 75

ИУК 20 67 67 58 58

56 92 100 83 100

ИМК 20 50 50 50 50

синий 56 83 92 83 83

ИУК 20 83 58 75 67

56 100 92 92 92

ИМК 20 50 • 42 25 42

зеленый 56 100 83 67 100

ИУК 20 58 67 58 67

56 100 100 75 '100

ИМК 20 50 50 25 42

белый 56 100 75 83 100

ИУК 20 58 50 50 67

56 83 83 83 92

Анализ динамики корнеобразования выявил следующие закономерности. Как показали результаты экспериментов микроразмноженные побеги разных сортов требовали различного периода времени для укоренения 50 процентов от числа высаженных, в зависимости от спектрального состава света.

Для всех испытываемых сортов было выявлено преимущество синего и красного света в отношении интенсивности процесса ризогенеза. Укоренение 50 процентов высаженных эксплантов сортов Тристар, Профьюжен, Редгонт-лит происходило при освещении синим светом на 12 день культивирования, сортов Женева и Трибькя на 15 - 17 день соответственно ( рис. 1 ). На красном свету срок укоренения 50 процентов эксплантов наступал, в основном, на 15 день и лишь для побегов сорта Профьюжен на 13 день. Для эксплантов сорта Трибьют предпочтительнее оказалось культивирование в условиях освещения красным светом. Побега сортов Женева и Профьюжен на синем и красном свету укоренялись практически одинаково. В тоже время укоренение 50 процентов эксплантов испытываемых сортов при освещении белым светом наступало на 18 - 20 день. Разница составляла в зависимости от варианта от 3 до 8 дней, и только для сорта Женева была практически несущественной. Явление ускорения укоренения побегов ремонтантных и нейтральнодневных сортов в условиях определенного спектрального состава освещения может иметь непосредственное практическое применение. Варьируя спектральный состав света, можно ускорять получение необходимого количества материала.

Нами также установлено существенное влияние спектрального состава света на такие показатели развития корневой системы как длина и количество корней. Экспланты, культивируемые в условиях освещения синим и красным светом обычно превосходили по этим показателям экспланты в вариантах с зеленым и белым светом, однако влияние сортовых особенностей в этих экспериментах было весьма ощутимым.

£ Динамика укореняемости побегов земляники сорта Тристар в зависимости от спектрального

состава света

Поведение микроразмноженных растений земляники нейтрально-дневных и ремонтантных сортов в полевых условиях.

Изучение поведения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники после ¡тонального микроразмножения в полевых условиях показало, что наиболее высоким коэффициентом размножения в год посадки характеризовался сорт стандартного сортимента - Гедгонтлит. С одного маточного растения было получено 46,5 стандартных розеток. Этот сорт более чем в 2 раза превосходил по вегетативной продуктивности сорта Тристар, Трибьют, Брайтон и в 3 раза сорт Женева ( табл. 6 ). По - видимому, отмеченный факт связан с биологическими особенностями изучаемых сортов. Таким образом при расчете необходимого числа микроразмноженных растений земляники данных сортов для закладки маточных насаждений, следует исходить из реальных коэффициентов размножения, которые они способны обеспечить на каждом конкретном этапе.

Таблица б

Основные биометрические показатели растений земляники из культуры тканей к концу первого вегетационного периода в полевых условиях.

ССрг Оэдеегсхи-чвствороэетск' шг. Среднгйгп> вдьлсга, а/ С&дзягтю- ИЯфЛСГОВСЙ псвероностц а? Среднее слэ/тсгъеа, шт.

Женева 15.1 436 761.1 132

Тристар 20.0 432 729.2 17.4

Трибьют ' 21.1 44.7 1171.4 2В5

Редгонтлит 46.5 556 7333 131

Брайтон 20.7 45.9 576.9 128

Р = 222.35*** Р= 10.93***

Несмотря на позднюю посадку ( 20 июня ) основная масса растений нейтральнодневных сортов Тристар, Трибьют, Брайтон и ремонтантного сорта Женева зацвели в год посадки. Цветение и плодоношение нейтральнодневных

сортов проходило не только на материнских растениях, но и на розетках, что соответствует их биологическим особенностям. В меньшей степени это свойство проявлялось у ремонтантного сорта Женева. Опытные растения образовывали характерные для сорта плоды. Вторая волна цветения и начала созревания ягод отмечена в середине сентября. По среднему количеству генеративных образований на растение сорт Трибьют более чем в 2 раза превосходил сорта Тристар, Брайтон и Женева ( табл. 7 ).

Таблица 7

Среднее количество генеративных образований у растений земляники

ремонтантных и нейтральнодневных сортов, шт. ( на 15 сентября ).

Сорт Среднее количество генеративных образований, шт. Среднее количество цветоно-оав, шт.

Женева 22.36 2.8

Тристар 24.66 3.8

Трибьют 63.5 6.6

Редгонтлит - -

Брайтон 20.0 2.1

Таким образом, на основании полученных данных, считаем возможным предложить следующий технологический режим производства оздоровленного посадочного материала нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники.

Введение в культуру целесообразно проводить в августе в период активного роста " усов" и образования розеток.

На этапе собственно микроразмножения, при культивировании эксплантов нейтральнодневных и ремонтантных сортов на питательных средах с компо-

зициями макроэлементов по Ли и де Фоссарду, Андерсону и Мурасиге - Ску-гу, с учетом потерь при пересадках за 5 пассажей от 5 инициальных эксплан-тов можно получить 3125 регенератов (за 5 месяцев с сентября по январь).

Затем регенеранты пересаживаем на среду для укоренения ( февраль ). С учетом 80 % укореняемости к концу февраля можно рассчитывать на получение 2500 укорененных растеньиц земляники, готовых к переводу в нестерильные условия.

Пересадку в субстрат осуществляем в конце февраля - начале марта. Растения адаптируются к нестерильным условиям и затем содержатся в зимней теплице два месяца ( март - апрель ). При 80 % приживаемости к маю реально можем получить 2000 растений земляники с развитой корневой системой, готовых к высадке в открытый грунт для закладки маточника.

В полевых условиях от одного маточного растения к концу первого вегетационного периода получим не менее 20 стандартных розеток. Следует отметить, что такой коэффициент размножения зарегистрирован на маточнике, заложенном в поздние сроки - 20 июня. Мы рекомендуем проводить высадку растений из теплицы в открытый фунт в мае, что позволит увеличить количество полученного посадочного материала Таким образом, с учетом потерь при адаптации растений к полевым условиям и реального коэффициента размножения к концу первого сезона вегетации вполне возможно получить 28800 стандартных розеток нейтральнодневных и ремонтантных сортов.

Сравнительная оценка регенерациоиной способности нейтральнодневных и ремонтантный сортов земляники в культуре пыльников и листо-~ . выя дисков.

' В последние годы биотехнологические приемы находят ппфокое применение для создания новых форм растений. Среди плодовых и ягодных культур основное внимание уделяется возможности получения гаплоидов, отбору са-моклональных вариантов с хозяйственно ценными признаками и созданию трансгенных организмов. Все эти вопросы могут быть решены только при наличии надежных методов регенерации растений в культуре пыльников, каллусов, листовых дисков и других типов эксплантов.

В результате проведенных экспериментов индуцированы процессы образования морфогенного каллуса и регенерации в культуре пыльников сортов Брайтон, Тристар, Трибьют, Женева. Гормональный состав питательных сред на этапе каллусообразования определял ре генерационную способность пыльников данных сортов на последующих этапах культивирования. Показано, что

в качестве индукторов каллусообразования на 1 этапе более предпочтительным оказалось использование питательной среды, обогащенной сочетанием 6 - БАП и ИУК ( табл. 8 ). Наибольшее число регенерантов образовалось в культуре пыльников нейтральнодневных сортов Брайтон и Трибьют.

Таблица 8

Количество растений регенерантов разных сортов земляники, полученных во втором субкультивировании в зависимости от использован"Ых на I этапе регуляторов роста.

Регуляторы роста, используемые на 1 этапе, мг/л Сорт Число пересаженных каллусов, шт. среда М5 кинетин 1.0 мг/л 2.4 Д - 1.0 мгГп Число развившихся растений регенерантов, шт.

Тристар 64 1

БАП - 1.0 Трибьют 134 4

ИУК - 1.5 Женева 42 1

- Брайтон 118 12

- Тристар 84 0

БАП - 1.0 Трибьют 75 0

2.4Д - 0.75 Женева 40 0

Брайтон .92 2

При использовании в качестве экотлантов листовых дисков сортов Три-стар, Трибьют, Брайтон, Профьюжен, Женева, Рапелла и Редгонтлит индуцировано образование регенератов у всех испытываемых сортов. Наиболее высокий процент регенерирующих эксплантов отмечен для сортов Редгонтлит и .Брайтон, а наибольшее число побегов на один регенерирующий экс-

шинг для сорта Профьюжен (табл. 9 ). Продан регенерации при этом по всем испытанным сортам был сравнительно невысок.

Тем не менее, полученные нами данные свидетельствуют о принципиальной возможности использования культур пыльников и листовых дисков в

Таолм<а 9

Регенерационная способность листовых дисков нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники (среда МБ. БАП -1.0 мг/л. ИМК -1.0 мг/лУ

Сорта Число высаженных экс-плангов, шт. Число регенерирующих эксплангов, шт Процеот регенерирующих эксплангов Среднее число побегов 1И 1 регенерируют ий экспланг, шг

Рапелла 45 3 6.7' 2.0

Тристар 50 2 4.0 2.1

Трибьют 50 1 2.0 1.5

Редгонглиг 50 5 10.0 2.0

Профьюжен 50 2 4.0 3.0

Женева 50 3 6.0 1.7

Брайтон 50 4 8.6 1.2

различных программах по оздоровлешло и улучшению генотипов нейтральнодневных и ремонтантных сортов и необходимости продолжения исследований в этом направлении.

Выводы.

1. В результате проведенной работы усовершенствована технология клональ-ного микроразмножения ремонтантных и нейтральнодневных сортов земляники и показана целесообразность ее использования в системе подготов-

17

ки оздоровленного посадочного материала для закладки маточных насаждений.

2. На этапе введения в стерильную культуру инициальных эксплантов ней-тралыюдневных и ремонтантных сортов земляники, характеризующихся в силу своих биологических особенностей малым количеством вегетативных точек роста, допустимо использовать в качестве дополнительных эксплантов фрагменты цветочных почек.

3. Для стерилизации вводимых в культуру изолированных апексов нейтраль-нодневных и ремонтантных сортов земляники наиболее эффективными оказались ртутьсодержащие препараты ( диацид и сулема ), а так же гипо-хлорит кальция. Предстерилизационная промывка апексов земляники горячей водопроводной водой при температуре 48 ± 0,5 °С в течение 15 - 30 мин. обеспечивает снижение грибной и бактериальной контаминации.

4. Выделенные из активно растущих органов (апексы усов), экспланты характеризуются меньшей грибной и бактериальной контаминацией, по сравнению с эксплантами от маточных растений. Культивирование эксплантов на средах, содержащих гидролизат казеина, провоцирующих развитие микрофлоры, позволяет в короткие сроки отобрать неинфицированные экспланты для дальнейшего культивирования.

5. В качестве питательных сред на этапе микроразмножения наиболее пригодными оказались композиции питательных сред с включением минеральной основы по Ли и де Фоссарду, Андерсону и Мурасиге-Скугу, как обеспечивающие максимальный коэффициент размножения нейтральнод-невных и ремонтантных сортов земляники.

6. Среди испытанных сортов наибольшим коэффициентом размножения характеризовались экспланты нейтральнодневных сортов Тристар и Трибьют и ремонтантного сорта Женева. Минимальный коэффициент размножения отмечен у эксплантов сорта Рапелла. Сорта Профьюжен и Редгонтлит в отношении коэффициента размножения занимали промежуточное положение.

7. На этапе пролиферации при клоналыгом микроразмножении нейтральнодневных и ремонтантных сортов продемонстрирована возможность замены 6 - БАЛ тидиазуроном в концентрациях вдвое меньших по сравнению с оптимальной концентрацией б - БАЛ.

8. Инкубирование микропобегов изученных сортов земляники при освещении лампами, имеющими пики излучения в областях синего и красного спектра, позволяет ускорить развитие корневой системы. Для изученных сортов

земляники ИУК обеспечивала более быстрое укоренение по сравнению с ИМК.

9. Полученные in vitro растения ремонтантного сорта Женева и нейтральнод-невных сортов Тристар, Трибьют и Брайтон при выращивании в открытом фунте в первый вегетационный сезон обнаружили пониженную вегетативную продуктивность по сравнению с кошрольным сортом Редгонтлит. Периодичность развития генеративных образований у изученных сортов земляники после клонального микроразмножения оставалось примерно такой же как у материнских'растений.

Ю.Проведенная оценка экономической эффективности включения метода клонального микроразмножения в систему производства здорового посадочного материала для закладки маточных насаждений показала высокую рентабельность (до 600 %) этого приема при условии размножения в течение зимнего периода растений нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники до количества 2-3 тысяч с последующей адаптацией их в зимних теплицах и высадки в полевые условия в мае - июне.

Рекомендации для практического применения.

Для форсированного размножения и при дефиците исходного материала нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники использовать метод in vitro для получения 2-3 тысяч растений в осенне-зимний период с сентября по февраль с последующей адаптацией в зимней теплице и высадкой в полевые условия на маточник не позднее мая - июня.

Для введения в стерильную культуру использовать экспланты, вычленяемые из активно растущих столонов, при дефиците исходного материала базальные фрагменты цветочных почек, отмытые в течение 15-30 минут водой при температуре 48 ± 05 °С с последующей стерилизацией ртутьсодержащими препаратами ( диацид, сулема ) или гипохло-ритом кальция. Для провоцирования развития внутренней инфекции использовать питательные среды, содержащие гидролизат казеина в концентрации 5 г/л.

В процессе клонального микроразмножения культивирование эксплантов земляники нейтральнодневных и ремонтантных сортов проводить на питательных средах, используя минеральные композиции макроэлементов по рецепту Ли и де Фоссарда, Андерсона, Мурасиге-Скуга, с добавлением микроэлементов по Мурасиге-Скуга, сахарозы 30 г/л, тиамина, пиридоксина, никотиновой кислоты по 0.5 мг/л, 6-бензиламинопурина 1 мг/л, который может быть заменен тидиазуроном в концентрации 0.5 мг/л.

Для ускорения процесса укоренения использовать облучение

культивируемых эксплантов синим и красным светом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Алексеенко J1.B., Высоцкий В.А. Подбор питательных сред для кло-нального микроразмножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники. // Сб. труд. ВСТИСП. - М. - 1997. - С. 77-82.

2. Высоцкий В.А., Бурдейная Т.В., Алексеенко J1.B. Влияние тидиазуро-на на процессы органогенеза в культуре- листовых дисков и апексов плодовых растений. // Тезисы докладов IV Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений». М. - 1997.- С. 323324. . ■

3. Высоцкий В.А., Алексеенко J1.B. Клональное микроразмножение и получение растений-регенерантов ремонтантных и нейтральнодневных сортов земляники. // Тезисы докладов VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». М. - 1997. - С. 405-406.

4. Волков Ф.А., Высоцкий В.А., Приходько Ю.Н., Алексеенко J1.B., Цу-бера JI.B. Использование критерия знака в качестве оценки различий между вариантами. // Сб. докладов Международной научно-методической конференции «Методика исследований и вариационная статистика в научном плодоводстве». - Мичуринск. - 1998. - С- 76-79.