Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности морфогенеза и размножения in vitro некоторых представителей рода Rhododendron L.

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Особенности морфогенеза и размножения in vitro некоторых представителей рода Rhododendron L."

На правах рукописи

ЗАЙЦЕВА Юлианна Геннадьевна

ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕЗА И РАЗМНОЖЕНИЯ IN VITRO НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА RHODODENDRON L.

03.02.01 - «Ботаника»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з о СЕН 2015

005562772

Новосибирск - 2015

005562772

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центральном сибирском ботаническом саду Сибирского отделения Российской академии наук.

Научный руководитель — доктор биологических наук

Новикова Татьяна Ивановна.

Официальные оппоненты: Третьякова Ираида Николаевна

доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, ведущий научный сотрудник;

Мочалова Ольга Владимировна доктор биологических наук, с.н.с., ФГБНУ «НИИ садоводства Сибири им. М.А. Лиса-венко», зав. лабораторией.

Ведущая организация — ФГБУН Ботанический институт им. B.JI. Комарова

Защита состоится 27 октября 2015 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 003.058.01 при ФГБУН Центральном сибирском ботаническом саде СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, ул. Золотодолинская, 101.

Факс: (383) 330-19-86.

E-mail: botgard@ngs.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУН Центрального сибирского ботанического сада СО РАН. Сайт в Интернете: http://www.csbg.nsc.ru.

Автореферат разослан 15 сентября 2015 г.

РАН.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Ершова Эльвира Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Представители рода Рододендрон (Rhododendron L.) семейства вересковых (Ericaceae) насчитывают около 1000 видов (Chamberlain et al., 1996) и множество сортов, гибридов и форм. Благодаря высочайшим декоративным свойствам рододендроны широко используются в озеленении и ландшафтном дизайне в Европе и Северной Америке, однако невысокая морозоустойчивость многих сортов ограничивает их культивирование в суровых климатических условиях Западной Сибири. Во флоре Сибири и Дальнего Востока встречаются 16 видов рододендронов, включая Rhododendron dauricum L., R. sichotense Pojark и R. schlippenbachii Maxim., которые не только отличаются высокой декоративностью, но и характеризуются морозоустойчивостью и способностью произрастать на слабокислых почвах. Кроме того, значительный интерес представляют вечнозеленые сорта, например, североамериканский гибрид R catawbiense «Grandiflorum», как перспективный источник признаков устойчивости к низким температурам и высокой инсоляции. Указанные генотипы рододендронов могут быть не только рекомендованы для выращивания в сибирских условиях, но и служить исходным материалом для дальнейшей селекции и получения новых сортов на их основе.

Наиболее эффективным методом массового воспроизводства рододендронов в настоящее время является клональное микроразмножение (Briggs, 1988; Preece, Immel, 1991; Hsia, Korban, 1997; Pavingerova, 2009). Однако для большинства дикорастущих видов Сибири и Дальнего Востока эти технологии не разработаны. Применение протоколов, используемых для микроразмножения вечнозеленых видов и сортов, может быть неэффективно из-за генотипических различий этих растений.

Морфогенез растений in vitro является ключевым процессом как для разработки протоколов клонального микроразмножения ценных генотипов, так и для познания фундаментальных основ биологии развития растений. Несмотря на значительное количество публикаций по микроразмножению рододендронов (Ееск-haut et al., 2010), имеющиеся единичные данные гистологических исследований не дают представления о процессах клеточной детерминации и морфологической дифференциации, связанных с побегообразованием de novo.

Цель и задачи исследования. Цель работы - выявить особенности органогенеза побегов in vitro морозоустойчивых видов и сортов рододендронов и разработать эффективные технологии их клонального микроразмножения. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• создать системы регенерации побегов из проростков, листовых и флораль-ных эксплантов с использованием различных регуляторов роста;

• исследовать влияние тидиазурона на процессы инициации морфогенеза в культуре in vitro;

• установить тип и последовательность этапов морфогенеза из листовых эксплантов на основе морфогистологического анализа;

• разработать протоколы клонального микроразмножения морозоустойчивых видов и сортов рода Rhododendron, включающие эффективные приемы укоренения и адаптации регенерантов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Инициация процессов регенерации побегов de novo в культуре листовых эксплантов R sichotense и R catarwbiense «Grandiflorum» происходит в эпидер-мальном слое адаксиальной стороны основания листовой пластины, при этом видовые различия проявляются на дальнейших этапах морфогенеза: появлению почек у R sichotense предшествует образование протуберанцев на поверхности листовых эксплантов, а органогенез у R catawbiense «Grandiflorum» проходит через формирование эмбриоидоподобных структур.

2. Предкультивирование флоральных эксплантов R dauricum и К sichotense на безгормональных средах с последующим переносом на индукционные среды, содержащие регуляторы роста, позволяет ускорить получение морфогенного ответа и увеличить частоту регенерации.

Научная новизна работы. Впервые проведена оценка морфогенетического потенциала различных типов эксплантов в зависимости от действия регуляторов роста и генотипов рододендронов. Установлена эффективность использования синтетического регулятора роста - тидиазурона, путем импульсной обработки или при внесении в среды для стимуляции побегообразования в культуре in vitro. Впервые проведен гистологический анализ хронологической последовательности этапов морфогенеза при регенерации побегов из листовых эксплантов R sichotense и R catawbiense «Grandiflorum».

Практическая значимость. Разработаны протоколы клонального микроразмножения с использованием различных типов эксплантов высоко декоративных морозоустойчивых представителей рода Рододендрон: R dauricum, R sichotense, R schlippenbachii, R catawbiense «Grandiflorum» и R «Pohjola's Daughter», включающие получение стерильных культур, разработку и оптимизацию состава индукционных сред для запуска процессов прямого органогенеза, укоренение и адаптацию регенерантов к условиям ex vitro. Использование импульсной обработки регуляторами роста, а также предкультивирование на безгормональных средах позволяет существенно сократить продолжительность некоторых этапов клонального микроразмножения. Оптимизирован процесс укоренения и адаптации регенерантов к условиям ex vitro. Созданная эффективная система регенерации из листовых эксплантов является основой для дальнейшего получения новых форм и сортов рододендронов.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на I Всероссийской научно-практической конференции «Ботаническое образование в России: прошлое, настоящее, будущее» (Новосибирск, 2013); Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы сибирского садоводства» (Барнаул, 2013); Всероссийской молодежной конференции с участием иностранных ученых «Растительный мир Северной Азии: проблемы изучения и сохранения биоразнообразия» (Новосибирск, 2013); X Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Казань, 2013); Международной научной конференции по биологии и биотехнологии растений (Ал-маты, 2014); III(V) Всероссийской молодежной конференции с участием иностранных ученых «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы и приложения. Библиографический список включает 214 источников, из них - 159 на иностранных языках. Работа изложена на 128 страницах, содержит 15 таблиц и 26 рисунков.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю д.б.н. Новиковой Татьяне Ивановне за оказанную помощь и руководство в процессе выполнения и написания диссертации. Выражаю призна-ельность д.б.н. проф. Вере Алексеевне Черемушкиной за консультации и обсуж-ение результатов, с.н.с. Красникову Александру Анатольевичу за помощь и технические консультации при работе с микроскопическим оборудованием ЦКП ЦСБС, а также благодарю всех сотрудников лаборатории биотехнологии за поддержку и ценные советы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе представлен анализ современных литературных данных, касающихся систематики рода Rhododendron, и эколого-биологических особенностей исследуемых видов и сортов. Рассмотрены возможности размножения представителей рода при помощи традиционных методов и обсуждены преимущества биотехнологического подхода. Теоретические основы морфогенеза в культуре in vitro обсуждены с позиции современной концепции о компетенции и детерминации (Christiansen, Warnik, 1983, 1984, 1985). Проанализировано влияние тидиазурона (ТДЗ) на реализацию регенерационного потенциала эксплантов. Приведены современные литературные данные о способах клонального микроразмножения представителей рода Rhododendron с использованием различных типов эксплантов, включая листовые и флоральные. Обоснована необходимость создания реге-нерационных систем дикорастущих рододендронов Азиатской России на основе исследования морфогенетического потенциала различных типов эксплантов. Показана необходимость проведения морфогистологического анализа для уточнения особенностей регенерации исследуемых видов, поскольку выявление путей морфогенеза in vitro имеет теоретическое значение и вносит вклад в понимание фундаментальных основ биологии развития древесных культур.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования использовали 3 дикорастущих вида рода Rhododendron (семена 2011 г. сбора предоставлены Ботаническим садом-институтом ДВО РАН): R. dauricum L., R sichotense Pojark, R. schlippenbachii Maxim, и 2 сорта: R. catawbiense «Grandiflorum» и R. «Pohjola's Daughter».

Семена. Семена R. dauricum и R. schlippenbachii стерилизовали в 20 %-ном растворе «Доместоса», в течение 20 минут. Асептический материал промывали 3-кратно в стерильной дистиллированной воде. Стерильные семена помещали по 60 штук в чашки Петри на поверхность водного раствора агара (0,6 %). Семена проращивали на свету.

В качестве эксплантов использовали проростки с удаленными корешками, которые переносили на агаризованные среды Андерсона (AM), дополненные различными регуляторами роста: зеатином (1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 мкМ), сочетанием 5,0 мкМ зеатина с 5,0 мкМ индолилуксусной кислоты (ИУК) и 1,0 мкМ ТДЗ. Через 8 недель инокуляции эксплантов на питательные среды определяли частоту морфогенного ответа, коэффициент размножения и длину побегов. Подсчет числа побегов на эксплант, полученных под действием ТДЗ, был возможен только после элонгации на безгормональной питательной среде (AMO).

Листовые экспланты. В качестве эксплантов использовали верхнюю первую пару листьев с черешком (листовые экспланты), изолированные от микроклонов R sichotense и R catawbiense «Grandiflorum». Для индукции морфогенеза листовые экспланты помещали на поверхность AM адаксиальной стороной вверх. Для исследования влияния ТДЗ на регенерационную способность и морфогенез использовали два способа обработки: 1) непосредственное культивирование эксплантов на AM, дополненной ТДЗ (0,1; 0,5; 1,0; 5,0 и 10,0 мкМ); 2) импульсную обработку листовых эксплантов в течение 4 часов в водном растворе 30,0 мкМ ТДЗ с последующим культивированием на безгормональной AM. Время культивирования — 15 недель. Полученные конгломераты укороченных побегов переносили на AMO для элонгации. Через 8 недель подсчитывали число побегов (h > 5 мм) на эксплант.

Флоральные экспланты. Стерилизацию бутонов, изолированных в начале цветения, проводили в несколько этапов: 1) погружение на 2 минуты в 70 %-ный этиловый спирт; 2) замачивание на 15 минут в 5 %-ном растворе «Доместоса»; 3) стерилизация в 0,1 %-ном растворе AgN03 в течение 15 минут. Асептический материал промывали 3-кратно в стерильной дистиллированной воде. Из стерильных бутонов извлекали пестик с цветоножкой (флоральный эксплант) и помещали горизонтально на питательные среды.

Флоральные экспланты R. «Pohjola's Daughter» помещали на поверхность AM, содержащей ТДЗ (1,0; 2,5 мкМ) в комбинации с 73,8 мкМ 2-изопентил-аденина (2-iP) с 15,0 мкМ индолил-3-уксусной кислоты (ИМК). Время культивирования —12 недель.

Флоральные экспланты R dauricum помещали на поверхность AM, содержащей ТДЗ (1,0-5,0 мкМ), а также комбинации ТДЗ (1,0-5,0 мкМ) с 73,8 мкМ 2-iP + 15,0 мкМ ИМК или 2,5 мкМ зеатина. Время культивирования - 11 недель. Для оптимизации системы регенерации часть флоральных эксплантов R dauricum предкультивировали на AMO в течение 4 дней. Затем экспланты инокулировали на AM, содержащую 2,5 мкМ зеатина в сочетании с ТДЗ (1,0-5,0 мкМ).

Флоральные экспланты R sichotense предкультивировали на AMO в течение 4 дней. Затем экспланты переносили на AM, содержащую либо только 1,0 мкМ ТДЗ, либо 1,0 мкМ ТДЗ в сочетании с 2,5 мкМ зеатина Время культивирования — 8 недель.

Для вытягивания регенеранты R. «Pohjola's Daughter», R dauricum и R sichotense переносили на AMO для элонгации и через 6 недель подсчитывали высоту и число побегов на эксплант.

Укоренение и адаптация регенерантов. Регенераты, полученные из различных типов эксплантов, укореняли в условиях in vitro или ex vitro. Для стиму-

ляции ризогенеза использовали два подхода: 1) непосредственное культивирование на AM, дополненной 25,0 мкМ ИМК; 2) 4-часовую импульсную обработку в растворе 148,0 мкМ ИМК. После импульсной обработки регенераты культивировали либо на AMO в условиях in vitro, либо высаживали ex vitro в смесь торфа и песка (в соотношении 1:1), или помещали в гидропонную установку.

Морфогистологический анализ процессов регенерации in vitro. Морфоги-стологический анализ процессов регенерации исследуемых генотипов рододендронов проводили на базе ЦКП ЦСБС СО РАН. Исследование морфологии полученных регенерантов проводили с помощью стереомикроскопа Carl Zeiss Stereo Discovery V 12 (Carl Zeiss, Германия). Локализацию начальных этапов морфогенеза и его последующих стадий определяли с помощью гистологического анализа. Постоянные препараты готовили по общепринятой цитологической методике (Паушева, 1988). Гистологический анализ проводили с помощью микроскопов Axioplan 2 imaging и Axioskop-40 (Carl Zeiss, Германия), фотосъемку - камерой AxioCam MRc5 с использованием программы AxioVision 4.8.

Статистическую обработку и анализ полученных данных проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel 7.0 и Statistica 8. Данные представлены в виде средних значений и стандартных ошибок (М ± т). Для сравнения средних значений независимых выборок использовали многоранговый тест Дункана (однофакторный дисперсионный анализ).

ГЛАВА 3. МОРФОГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ СЕМЯН НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА RHODODENDRON В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

3.1. Прорастание семян

Прорастание семян R. dauricum и R. schlippenbachii наблюдали через 4-6 дней после инокуляции. Формирование проростков из семян исследуемых видов отмечено после 10 дней культивирования, причем все проростки имели нормальное строение и окраску.

Длительность прорастания семян в среднем составила 22 дня. Массовая всхожесть семян R. dauricum наблюдалась на 11-й день, а семян R. schlippenbachii на 12-й день. Общая всхожесть семян R schlippenbachii была на уровне 96 %, энергия прорастания - 43 %. У семян R. dauricum аналогичные показатели ниже: всхожесть - 74 %, энергия прорастания - 32 % (рис. 1). По полученным нами данным семена R. dauricum и R schlippenbachii проросли при освещенности 40 мкМоль м"2 " с"1 и фотопериоде 16/8, без дополнительной обработки. Следовательно, для семян исследуемых видов характерен неглубокий физиологический тип эндогенного покоя (тип ВО, согласно классификации М.Г. Николаевой (1985).

3.2. Особенности регенерации побегов под действием различных регуляторов роста

Проростки с удаленными корешками инокулировали на среды, содержащие различные регуляторы роста. Уровень регенерации эксплантов R. schlippenbachii под действием зеатина оказался выше, чем у эксплантов R. dauricum. На среде, дополненной 1,0 мкМ зеатина, 80 % эксплантов К dauricum проявили морфоген-

ную активность, при этом у 25 % эксплантов отмечена закладка адвентивных почек, которые дифференцировались из тканей гипокотиля проростков. В ходе исследования действия различных концентраций зеатина 100 %-ный уровень регенерации Я зсИИррепЬасИИ получен в присутствии 2,5 мкМ этого цитокинина, причем у 20 % проростков сформировались адвентивные почки. Однако превышение оптимальных концентраций зеатина в индукционной среде приводило к снижению доли эксплантов, способных к морфогенному ответу. При этом сократилась и частота образования адвентивных почек и у исследуемых видов.

Дни учета

■ R. schlippenbachii —л—R. daurícum Рис. 1. Динамика всхожести семян R. daurícum и R. schlippenbachii (данные в виде М ± т).

В присутствии 1,0 мкМ ТДЗ в питательной среде у 100 % эксплантов R. daurícum и R. schlippenbachii наблюдали различные морфогенные реакции. Установлено, что присутствие ТДЗ в среде не только эффективно снимало апикальное доминирование, но и вызывало адвентивное побегообразование на гипокоти-ле у 50 % эксплантов R daurícum и у 90 % R schlippenbachii. Влияние ТДЗ на адвентивное побегообразование был существенно выше, чем индукция этого процесса низкими концентрациями зеатина. Различия в регенерационной способности проростков исследуемых видов указывают на видоспецифичность морфоген-ного потенциала.

3.3. Элонгация побегов на безгормональных средах

Максимальное число как пазушных, так и адвентивных побегов на эксплант исследуемых видов получено под действием 1,0 мкМ ТДЗ. Для R daurícum этот показатель составляет в среднем 5 пазушных и 40 адвентивных побегов на эксплант, для R schlippenbachii - 4 и 23 побега, соответственно. Из испытанных концентраций зеатина наиболее эффективной для микроразмножения R daurícum и R. schlippenbachii является 2,5 мкМ (рис. 2, а, б). Следует отметить, что под влиянием ТДЗ формируются укороченные побеги, которые требуют дополнительной элонгации. При дальнейшем культивировании таких конгломератов на AMO через 8 недель побеги приобретали нормальное строение и были способны к укоренению и адаптации.

□ активация пазушных меристем ■ инициация адвентивных почек

□ активация пазушных меристем м инициация адвентивныхпочек

1.0 икМ 2.5 мкМ 5.0 икМ 10.0 5.0 мкМ 1.0 шМ контр. Зеа Зеа Зеа мкМ Зеа 5.0 ТДЗ Зеа икМ ИУК

a

1.0 икМ 2.5 икМ 5.0 икМ 10.0 шМ 5.0 шМ 1.0 шМ контр. Зеа Зеа Зеа Зеа Зеа 5.0 ТДЗ икМИУК

б

Рис. 2. Влияние регуляторов роста на интенсивность образования боковых и адвентивных побегов из проростков R. dauricum (а) и Я schlippenbachii (б). Данные представлены в виде М ± т.

Таким образом, разработан протокол клонального микроразмножения R. dauricum и R. schlippenbachii. Показано, что семена перспективны в качестве источника эксплантов для введения в культуру in vitro, поскольку они имеют неглубокий тип покоя и высокую всхожесть. Полученные данные свидетельствуют о том, что ТДЗ не только эффективно снимает апикальное доминирование, но и является эффективным триггером для дедифференциации клеток и приобретению компетенции к дальнейшему морфогенезу. Полученные адвентивные почки имели значительно больший потенциал для размножения, чем пазушные меристемы.

Культура изолированных листовых эксплантов - перспективная система не только для массового размножения, но и для изучения фундаментальных основ морфогенеза в условиях in vitro, т.к. отсутствие апикальных меристем у листа дает возможности индуцировать широкий спектр морфогенных реакций клеток экспланта (Woo et al., 2008). ТДЗ - один из сильнейших триггеров различных путей морфогенеза. Влияние этого индуктора на морфогенный потенциал листовых эксплантов R. catawbiense «Grandiflorum» отчасти изучен (Tomsone, Gertnere, 2003; Pavingerova, 2009), однако исследования в этой области с листовыми эксплантами R sichotense не проводились.

4.1. Влияние различных концентраций и способов обработки тидиазуроном на регенерацию побегов R. catawbiense «Grandiflorum» и R. sichotense

На поверхности листовых эксплантов R. sichotense после 14 дней культивирования на AM, содержащей ОД; 0,5 и 1,0 мкМ ТДЗ, наблюдали формирование выпячиваний. Регенерация происходила на адаксиальной стороне листовых эксплантов в области черешка (рис. 3, а). Число выпячиваний в этой зоне увеличивалось на протяжении всего культивирования (рис. 3, б). При этом конгломераты адвентивных почек сформировались только после 8 недель в культуре, а конгломераты побегов наблюдали к 15-й неделе культивирования (рис. 3, в).

ГЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ ПОБЕГОВ DE NOVO ИЗ ЛИСТОВЫХ ЭКСПЛАНТОВ

Рис. 3. Влияние ТДЗ (1,0 мкМ) на морфогенез побегов в культуре листовых эксплангов Я sichotense: а - формирование выпячиваний после 14 дней культивирования; б - развитие выпячиваний и формирование зачатков почек на 21-й день культивирования; в - конгломерат видоизмененных укороченных побегов, сформировавшихся к 15-й неделе; г - конгломерат побегов после 8 недель элонгации на AMO.

Процесс регенерации из листовых эксплантов R. sichotense носил асинхронный характер. Максимальный процент регенерации побегов (93 %) получен на среде, содержащей 1,0 мкМ ТДЗ. Увеличение концентрации ТДЗ до 5,0 мкМ вызвало снижение частоты регенерации и сопровождалось образованием каллуса.

Стереомикроскопические наблюдения процессов регенерации из листовых эксплантов R. catawbiense «Grandiflorum» показали покраснение тканей основания листовой пластины через 10-12 дней после импульсной обработки 30,0 мкМ ТДЗ и при непосредственном культивировании на AM, дополненной 0,1; 0,5 или 1,0 мкМ ТДЗ. Через 4 недели в этой области дифференцировались почки, которые дали начало видоизмененным укороченным побегам (рис. 4, а, б). Возникновение новых почек и интенсивное развитие побегов de novo привело к формированию шарообразных конгломератов укороченных побегов на черешке и основании листа (рис. 4, д). Увеличение концентрации ТДЗ до 5,0 мкМ способствовало уменьшению частоты регенерации и замедлению темпов морфогенеза. Происходила прямая регенерация эмбриоидопо-добных структур по всей поверхности листовой пластины на адаксиальной стороне (рис. 4, в). Через 15 недель культивирования регенеранты, полученные под действием 5,0 мкМ ТДЗ, представляли собой почки высотой около 2 мм. Конгломераты, полученные под действием 0,1-1,0 мкМ ТДЗ и импульсной обработки, напротив, состояли из видоизмененных укороченных побегов. Максимальный процент регенерации побегов R. catawbiense «Grandiflorum» получен после импульсной обработки 30,0 мкМ ТДЗ (89 %) и при культивировании на AM, содержащей 1,0 мкМ ТДЗ (85 %).

Рис. 4. Морфогенез в культуре листовых эксплантов R. caíawbiense «Grandiflorum»: а - формирование почек и эмбриоидоподобных структур на 35-й день на среде 0,5 мкМ ТДЗ; б - формирование конгломерата укороченных побегов через 48 дней после импульсной обработки 30 мкМ ТДЗ; в - эмбриоидоподобные структуры, возникающие на среде 5,0 мкМ ТДЗ на 33-й день; г - конгломерат почек после 15 недель на среде 5,0 мкМ ТДЗ; д - конгломерат укороченных побегов после 15 недель культивирования на среде, дополненной 0,5 мкМ ТДЗ; е - конгломерат побегов после элонгации в течение 8 недель на AMO.

4.2. Особенности элонгации и развития побегов на безгормональных средах

Длительное культивирование листовых эксплантов R. sichotense и R. caíawbiense «Grandiflorum» на средах, содержащих ТДЗ, способствовало развитию анатомических и морфологических нарушений в строении побегов de novo, для преодоления этих аномалий регенеранты перенесли на AMO. Число удлиненных побегов (h > 5 мм) в конгломератах после элонгации в течение 8 недель, зависело от концентрации ТДЗ в регенерационной среде (табл. 1). Удлиненные побеги R. sichotense были получены только после культивирования на средах с низкими концентрациями ТДЗ (0,1-1,0 мкМ), в то время как удлиненные побеги R. caíawbiense «Grandiflorum» удалось получить как после импульсной обработки, так и после культивирования на средах, содержащих ТДЗ.

Таблица 1

Интенсивность побегообразования, индуцированного ТДЗ, после элонгации на АМО

Концентрация ТДЗ, мкМ Число побегов на эксплант, шт.

R. catawbiense «Grandiflorum» R. sichotense

0,1 8,2 ± 1,6 с 14,6 ± 2,3 b

0,5 36,0 ±8,3 а 23,5 ±3,8 a

1,0 25,0 ± 4,8 ab 24,6 ± 2,9 a

5,0 23,2 ±2,1 abc 0

10,0 - -

Импульсная обработка 30,0 (4 часа) 13,2 ± 1,9 be 0

Примечание: данные представлены в виде М ± ш; значения, за которыми следуют одинаковые буквы, не имеют значимого отличия друг от друга в соответствии с тестом Дункана при р = 0,05.

Отметим, что удлиненные регенеранты R. catawbiense «Grandiflorum», полученные посредством импульсной обработки 30,0 мкМ ТДЗ, отличались большей высотой и имели более крупные листья, что является важным критерием для дальнейшего успешного укоренения и адаптации.

4.3. Гистологический анализ процессов морфогенеза в культуре листовых эксплантов

В эпидермальном слое листовых эксплантов R. sichotense на 10-й день происходят антиклинальные и периклинальные деления одной или группы клеток (рис. 5, б). Деления наблюдали только в эпидермисе черешка и основания листовой пластины. Дальнейшая пролиферация этих клеток приводит к образованию протуберанцев на 14-й день (рис. 5, в). В верхних слоях протуберанцев формируются меристематические центры, в толще выпячиваний начинают дифференцироваться клетки прокамбия (рис. 5, г). На 35-й день культивирования из группы делящихся клеток на поверхности выпячиваний начинают дифференцироваться апексы, а затем и почки с листовыми примордиями, проводящая система которых связана с проводящей системой экспланта (рис. 5, д).

Гистологический анализ подтверждает асинхронность процессов морфогенеза R. sichotense индуцированного ТДЗ, т. е. одновременно на листовом эксплан-те можно наблюдать структуры, находящиеся на разных этапах развития: дедиф-ференциацию клеток, развитие протуберанцев, начало дифференциации почек и хорошо сформированные почки. Полностью сформированные почки наблюдали на 8-й неделе эксперимента. У почек de novo отмечены аномалии строения и развития: формирование множества листовых примордиев, ранняя активация роста пазушных меристем и укорочение междоузлий (рис. 5, е).

Начальные этапы морфогенеза R. catawbiense «Grandiflorum» сходны с таковыми у R. sichotense. Однако развитие протуберанцев на поверхности эксплантов, предшествующих формированию почек как у R. sichotense, не происходило.

Рис. 5. Гистологический анализ формирования адвентивных почек из листовых эксплантов Л. угсйо/егае при культивировании на АМ, содержащей 1,0 мкМ ТДЗ: а) поперечные срез исходного экспланта (0 дней); б) продольные срез, первые клеточные деления эпидермиса на адаксиальной стороне листового экспланта (10 дней); в) образование выпячиваний на адакси-альной стороне листового экспланта, поперечный срез (14 дней); г) закладка меристематиче-ских центров на поверхности выпячиваний; д) продольный срез через дифференцирующуюся почку, закладка листовых примордиев (35 дней); е) формирование множества зачатков почек через 8 недель в культуре. Условные обозначения: Аб — абаксиальная сторона, Ад — адаксиаль-ная сторона, Ап - апекс почки, Зп — закладка почки, Лп — листовые примордия, Мц — меристе-матический центр, П - почка, Пп - проводящий пучок, Пр - протуберанцы.

Органогенез из листовых эксплантов R. catawbieme «Grandiflorum» проходил через регенерацию эмбриоидоподобных структур на адаксиальной стороне (рис. 6, а, б). Гистологические исследования подтверждают связь этих структур de novo с тканями исходного экспланта через проводящую систему. Наряду с закладкой и развитием апекса почки, корневые апексы не дифференцировались, и формирование биполярной структуры у регенерантов R. catawbiense «Grandiflorum» не происходило (рис. 6, в, г).

Рис. 6. Морфогенез в культуре листовых эксплантов R. catawbiense «Grandiflorum» под действием ТДЗ: а - начало дифференциации эмбриоидоподобных структур на среде, дополненной 0,5 мкМ ТДЗ (12 дней); б - развитие эмбриоидоподобной структуры на среде, дополненной 0,5 мкМ ТДЗ (35-й день); в - меристематическая эмбриоидоподобная структура на поверхности экспланта, находящегося на среде с 5,0 мкМ ТДЗ; г - почка, развившаяся под действием 5,0 мкМ ТДЗ.

ГЛАВА 5. РЕГЕНЕРАЦИЯ ПОБЕГОВ DENOVO ИЗ ФЛОРАЛЬНЫХ

ЭКСПЛАНТОВ

Флоральные экспланты рододендронов имеют ряд преимуществ перед другими типами эксплантов, главными из которых являются низкий уровень контаминации и более продолжительный временной интервал для изоляции бутонов от растений, произрастающих в открытом грунте. Высокая эффективность использования ТДЗ, установленная при регенерации побегов из листовых эксплантов R. sichotense и R. catawbiense «Grandiflorum», способствовала развитию дальнейших исследований по действию этого регулятора роста на морфоге-нетический потенциал флоральных эксплантов таких полиморфных видов, как R. dauricum и R sichotense.

5.1. Введение в культуру флоральных эксплантов R. «Pohjola's Daughter»

Морфогенный ответ флоральных эксплантов R «Pohjola's Daughter» был полу-ен на AM, содержащей 74 мкМ 2-iP, 15 мкМ ИМК и 2,5 мкМ ТДЗ. Уже на -й день отмечали увеличение размеров цветоножки. На 8-й неделе культивирования 50 % эксплантов наблюдали формирование выпячиваний. Появление структур в иде почек и укороченных розеточных побегов было отмечено на 12-й неделе куль-вирования. Морфогенез побегов из флоральных эксплантов протекал асинхронно, оскольку одновременно происходило как развитие уже дифференцированных за-штсов почек, так и формирование новых выпячиваний и почек. После переноса экс-:антов R «Pohjola's Daughter» на среды для элонгации (AMO) были получены побе-с нормальным строением (в среднем 26,21 побегов на эксплант).

5.2. Система регенерации побегов из флоральных эксплантов R. daurícum

Культивирование флоральных эксплантов R dauricum на AM, содержащей 73,8 сМ 2-iP и 15,0 мкМ ИМК в сочетании от 1,0 до 5,0 мкМ ТДЗ, не привело к регенера-щ побегов de novo, как в экспериментах с вечнозеленым сортом R «Pohjola's aughter». Попытки стимулировать регенерацию побегов из флоральных эксплантов dauricum на средах, содержащих только ТДЗ в концентрациях от 1,0 до 5,0 мкМ, токе не дали результатов. В связи с этим дальнейшие эксперименты были направле-.1 на поиск эффективных регуляторов роста для инициации процессов морфогенеза

Оптимальной средой для индукции процессов регенерации оказалась AM, ополненная 1,0 мкМ ТДЗ и 2,5 мкМ зеатина. Цветоножки флоральных эксплан-ов увеличивались в размерах через 3 недели культивирования на этой среде, ормирование почек на цветоножках наблюдали через 8 недель, а через 11 недель 45 % флоральных эксплантов отмечено формирование конгломератов адвентив-1ых почек. При повышении концентрации ТДЗ до 2,5 мкМ только у 10% экс-1антов наблюдали появление морфогенного ответа, а в присутствии 5,0 мкМ ДЗ геммогенеза не происходило (табл. 2).

Таблица 2

Влияние различных регуляторов роста н предкультивирования на регенерацнонный потенциал флоральных эксплантов R. dauricum

Регуляторы роста растений мкМ, Частота регенерации, %

без предкультивирования с предкультивированием

1,0 ТДЗ + 2,5 зеатина 45 87,5

2,5 ТДЗ + 2,5 зеатина 10 12,5

5,0 ТДЗ + 2,5 зеатина 0 0

Для повышения регенерационного потенциала флоральные экспланты . dauricum предкультивировали на AMO в течение 4 дней, затем экспланты пере-осили на индукционные среды, содержащие зеатин и ТДЗ в разных концентра-иях. Отмечено увеличение частоты регенерации в присутствии 1,0 и 2,5 мкМ ДЗ (см. табл. 2) и скорости морфогенеза. Так, уже через 4 недели после начала ксперимента наблюдали появление морфогенного ответа на цветоножках фло-альных эксплантов, культивировавшихся на этой среде, развитие почек происхо-ило после 6 недель, а формирование конгломератов укороченных побегов отме-ено через 8 недель после начала эксперимента (рис. 7), что на 3 недели раньше,

чем в эксперименте без предкультивирования. Повышение концентрации ТДЗ в питательной среде до 2,5 мкМ привело к значительному снижению уровня регенерации, в присутствии 5,0 мкМ ТДЗ регенерации не происходило.

Вновь образованные конгломераты укороченных побегов Я dauricum переносили на AMO для элонгации. Однако удлиненные побеги (h > 0,5 см) сформировали только те регенераты, которые были получены под действием 1,0 мкМ ТДЗ с 2,5 мкМ зеатина. Предкультивирование не оказало влияния на коэффициент размножения Я dauricum, который составил в среднем 7,03-7,33 побега на эксплант.

Рис. 7. Регенерация побегов de novo из фло-ральных эксплантов R. dauricum с предкуль-тивированием в течение 4 дней на AMO и последующем культивировании на AM, содержащей 1,0 мкМ ТДЗ и 2,5 мкМ зеатина: а - начальные этапы морфогенеза побегов на цветоножке флоральных эксплантов через 4 недели культивирования; б - конгломераты укороченных побегов; в - побеги, полученные после 6 недель элонгации на AMO.

5.3. Регенерация побегов из флоральных эксплантов Я. $1ско1ете

Поскольку К. ьчсксМете и К. dauricum близкородственные виды, то можно предположить, что концентрации и комбинации ТДЗ с зеатином, вызвавшие индукцию процессов регенерации из флоральных эксплантов Я. dauricum, окажут такое же воздействие и на ткани флоральных эксплантов Я ¿гс/го^егае.

Результаты экспериментов показали, что прием предкультивирования на безгормональной среде оказался эффективным и для флоральных эксплантов Я. 51ско1ете. Установлено, что компонентный состав индукционной среды в данном случае не повлиял на частоту регенерации и число побегов Я $1сЪо1ете на эксплант, в то время как высота этих побегов зависела от комбинации регуляторов роста (табл. 3). Регенерационный потенциал флоральных эксплантов Я. ягсИо-(егое оказался выше, чем у Я dauricum: для индукции морфогенеза из флоральных эксплантов Я. $1сУю1ете достаточно использовать только ТДЗ без других регуляторов роста, что объясняется большей способностью к пролиферации тканей флоральных эксплантов данного вида по сравнению с Я. dauricum.

Таблица 3

Влияние ТДЗ и зеатина на регенерационный потенциал флоральных эксплантов Д. «сйо/е/ие

Регуляторы роста растений, мкМ Частота регенерации, % Число побегов на эксплант, шт. Высота побегов, мм

1,0 ТДЗ 1,0 ТДЗ+ 2,5 зеатина 100 100 17,14 ±3,53 а 17,40 ±3,07 а 10,57 ±0,93 а 7,70 ± 0,45 b

Примечание: см. пояснения к табл. 1.

0,5 mm

10 mm

ГЛАВА 6. УКОРЕНЕНИЕ И АДАПТАЦИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ К УСЛОВИЯМ EX VITRO

Объектами на этом этапе исследования стали R sichotense, R dauricum, R schlippenbachii и Rcatawbiense «Grandiflorum», а также красивоцветущие морозостойкие сорта Л. «Helsinki University» и R «Haaga». Первоначальной задачей было подобрать оптимальный способ аппликации ИМК: 1) непосредственное культивирование на AM, дополненной 25,0 мкМ ИМК или 2) 4-часовая импульсная обработка в растворе 148,0 мкМ ИМК с последующим переносом на AMO.

В ходе анализа полученных данных установлено, что для всех исследуемых видов и сортов рододендронов наиболее эффективным способом укоренения оказалась импульсная обработка побегов в водном растворе 148,0 мкМ ИМК. Известно, что корневая система, развившаяся в условиях in vitro, имеет ряд аномалий (Pospisilova, 1999; Hazarika, 2006). В связи с этим, дальнейшие наши эксперименты были направлены на оптимизацию укоренения после импульсной обработки в условиях ex vitro: в гидропонной установке или смеси торфа и песка.

В гидропонной установке укореняли микропобеги R sichotense, R «Helsinki University» и R «Haaga». Анализ полученных результатов показал различия исследуемых генотипов: повышение частоты укоренения в гидропонной установке отмечено у сортов, относящихся к группе вечнозеленых {R «Helsinki University» и R «Haaga»), до 90 и 78 % соответственно, в то время как микропобеги R sichotense, напротив, укоренялись с меньшей частотой в гидропонике, чем на AMO.

Использование смеси торфа и песка, как субстрата для укоренения после импульсной обработки ИМК регенерантов R sichotense, R dauricum, R schlippenbachii, R catawbiense «Grandiflorum» и ^.«Helsinki University», позволило существенно увеличить выход укорененных и адаптированных растений. При этом корневая система растений при адаптации в смеси торфа и песка получила лучшее развитие по сравнению с растениями, укорененными в условиях in vitro (табл. 4).

Таблица 4

Влияние условий укоренения на степень развития корневой системы регенерантов представителей рода Rhododendron после импульсной обработки ИМК

% Количество Длина Растения с Высота

Вид или сорт Способ укоренения укоре- корней, корней, корнями 2-го побегов,

нения шт. см порядка, % см

R. dauricum in vitro на AM0 30 2,00 ±0,63 а 0,72 ±0,23 а 40 1,32 ±0,11а

ex vitro (торф : песок) 89 6,41 ± 0,61 b 1,60 ± 0,09 b 88 2,90 ± 0,22 b

R. sichotense in vitro на АМ0 40 2,32 ±1,01 а 1,02 ±0,61 а 70 2,17 ±0,52 а

ex vitro (торф : песок) 84 6,33 ± 1,73 b 1,71 ±0,44 а 100 2,64 ±0,63 а

R. schlippen- in vitro на АМ0 30 0.75 ±0.11 а 1.25 ±0.25 а 0 1,01 ±0,09 а

bachii ex vitro (торф : песок) 60 1.08 ± 0.14 b 3.78 ± 0.86 b 77 1,61 ±0,31 b

R cat. in vitro на АМ0 37,5 1,33 ±0,21 а 0,48 ±0,03 а 0 1,37 ±0,10 а

'Grandiflorum' ex vitro (торф : песок) 77 4,00 ± 0,34 b 0,59 ±0,04 а 85 1,73 ± 0,13 b

R 'Helsin. in vitro на АМ0 75 1,95 ±0,34 а 0,37± 0,02 а 0 1,26 ±0,35 а

University ' ex vitro (торф : песок) 100 5,48 ± 0,25 b 1,03 ± 0,13 b 100 1,70 ± 0,11 b

Примечание: см. пояснения к табл. 1.

выводы

1. Семена, листовые и флоральные экспланты исследуемых представителей рода Rhododendron перспективны для введения в культуру и инициации прямого морфогенеза побегов. Доказана высокая активность ТДЗ как индуктора морфогенеза вне зависимости от типа экспланта.

2. Показана эффективность использования семян R dauricum и R schlippen-bachii, имеющих неглубокий тип покоя и высокую всхожесть, в качестве источников эксплантов для введения в культуру in vitro. Для массового получения микроклонов R dauricum и R schlippenbachii рекомендуется использовать среду AM, дополненную 1,0 мкМ ТДЗ или 2,5 мкМ зеатина. Установлено, что ТДЗ (1,0 мкМ) и зеатин (1,0-5,0 мкМ) стимулируют как активацию пазушных меристем, так и закладку адвентивных почек, которые образуются на гипокотиле проростков.

3. Разработана система регенерации R sichotense и R catawbiense «Grandiflorum» из листовых эксплантов, основанная на высокой эффективности ТДЗ в низких концентрациях (0,1-1,0 мкМ) как триггера процессов дедифферен-циации клеток, с последующей регенерацией побегов de novo. Показана перспективность импульсной обработки ТДЗ для оптимизации стадий инициации и собственно размножения.

4. Установлено, что начальные этапы морфогенеза в культуре листовых эксплантов R catawbiense «Grandiflorum» и R sichotense происходят в эпидермаль-ном слое адаксиальной стороны основания листовой пластины. Выявлены видовые различия дальнейших этапов морфогенеза: появлению почек у R sichotense предшествует образование протуберанцев на поверхности эксплантов, а органогенез из листовых эксплантов R catawbiense «Grandiflorum» проходит через формирование эмбриоидоподобных структур.

5. Разработан оригинальный метод введения в культуру флоральных эксплантов R dauricum и R sichotense с использованием предкультивирования на безгормональной AM в течение 4 дней. Дальнейшая индукция адвентивного побегообразования на цветоножках получена на средах с использованием 1,0 мкМ ТДЗ в сочетании с 2,5 мкМ зеатина для R dauricum и 1,0 мкМ ТДЗ для R sichotense. Показано, что предкультивирование на AMO позволяет ускорить получение морфогенного ответа и увеличить частоту регенерации.

6. Культивирование полученных регенерантов на AMO способствует элонгации побегов и преодолению аномалий, возникших под действием ТДЗ вне зависимости от типа экспланта.

7. Оптимизирована система укоренения исследуемых рододендронов, включающая импульсную обработку регенерантов с использованием 148,0 мкМ ИМК в течение 4 часов и перенос микропобегов в условия ex vitro на смесь торфа и песка (1:1). В результате удалось увеличить выход адаптированных растений с хорошо развитой корневой системой и сократить сроки получения качественного посадочного материала.

8. На основании выявленных закономерностей разработаны и оптимизированы протоколы клонального микроразмножения морозоустойчивых видов (R dauricum, R. sichoptense, R schlippenbachii) и сортов (R. catawbiense «Grandiflorum» и R. «Pohjola's Daughter») рода Rhododendron.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых изданиях из списка ВАК

1. Эрст, А.А. Адаптация регенерантов Rhododendron hybridum к условиям ex vitro / А.А. Эрст, Т.И. Новикова, А.В. Каракулов, Ю.Г. Зайцева // Научные ведомости БелГУ: естественные науки. - 2012. - Вып. 19, № 9. - С. 44-49.

2. Зайцева, Ю.Г. Клональное микроразмножение Rhododendron dauricum / Ю.Г. Зайцева, Т. И. Новикова//Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: биология, клиническая медицина. - 2014. - Вып. 1. - Т. 12. - С. 26-31.

Статьи в прочих изданиях

1. Зайцева, Ю.Г. Использование гидропонной системы для акклиматизации микроклонов представителей рода Rhododendron в условиях ex vitro / Ю.Г. Зайцева, А.А. Эрст, Т.И. Новикова // Ботаническое образование в России: прошлое, настоящее, будущее: материалы I Всероссийской научно-практической конференции. - Новосибирск, 2013. - С. 37-38.

2. Зайцева, Ю.Г. Регенерация побегов Rhododendron sichotense из листовых эксплантов в культуре in vitro / Ю.Г. Зайцева, Т.И. Новикова // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: сборник тезисов X Международной конференции. — Казань, 2013. - С. 115-116.

3. Зайцева, Ю.Г. Использование методов биотехнологии для сохранения и размножения Rhododendron schlippenbachii / Ю.Г. Зайцева, Т.И. Новикова // Растительный мир Северной Азии: проблемы изучения и сохранения биоразнообразия: материалы Всероссийской конференции. - Новосибирск, 2013. - С. 39-40.

4. Зайцева, Ю.Г. Технология клонального микроразмножения Rhododendron dauricum и Rhododendron schlippenbachii / Ю.Г. Зайцева, Т.И. Новикова // Международная научная конференция по биологии и биотехнологии растений: материалы конференции. — Алматы, 2014. - С. 256.

5. Зайцева, Ю.Г. Оптимизация протокола микроразмножения Rhododendron dauricum с использованием зеатина / Ю.Г. Зайцева, Т.И. Новикова // Перспективы развития и проблемы современной ботаники: материалы III (V) Всероссийской молодежной научно-практической конференции. - Новосибирск, 2014. - С. 142-143.

Подписано в печать 16.06.15. Формат 60x84'/,6. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 25.

Центральный сибирский ботанический сад СО РАН. 630090 Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101