Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование in vitro тканей хвойных Сибири

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Культивирование in vitro тканей хвойных Сибири"

L' 1

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЛЕСА И ДРЕВЕСИНЫ им. В. Н. СУКАЧЕВА

Па ираиах рукописи

СКРИПАЧЕНКО Валентина Васильевна

УДК 582.475:578.085.23

Культивирование in vitro тканей хвойных

Сибири

0Л.00.05— Ботаника

А В Т OPE Ф Е 1' А Т диссертации па соискание учепон степени кандидата биологических наук

Красноярск 1992

Работа выполнена в Институте леса и древесины имени В. Н. Сукачева СО РЛН.

Научные руководители:

доктор Апологических наук К. Г. Минина

доктор биологических наук, профессор I?. 3. Гамбург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор 13. М. Гольд кандидат биологических наук Г. 11. Путова

Ведущая организации:

Московская сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева

Защита диссертации состоится << » 1992 юду

К 002.70.01 по присуждению ученой степени кандидата наук прп Институте леса и древесины нм. В. II. Сукачева СО РЛН.

Ваши отзывы (в двух экземплярах) просим направлять но адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, Институт леса и древесины нм. В. Н. Сукачева СО РАН; ученому секретарю специализированного Совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института леса и древесины нм. В. Н. Сукачева СО РАН.

Автореферат разослан « / 1992 году

Ученый секретарь специализированного Совета доктор сельскохозяйственных

наук Р. М. Бабинцева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Потребности народного хозяйства в лесопользовании постоянно возрастает. Удовлетворение их требует увеличения объемов л сокращения сроков лесовосстановления, повышения продуктивности и устойчивости, улучшения качественного состава лесов.

При разработке конкретных целевых селекционных программ улучшения лесных пород больиое внимание уделяется, в частности, возможности и необходимости использования клонозых насаждений, отбору и разпногению гетерозисных особей.

Вегетативное размнонение могло бы обеспечить массовое воспроизведение особо ценных генотипов в наиболее короткие сроки, ускорить лесное семеноводство. Однако высокая трудоемкость и низкая продуктивность основного в настоящее время способа вегетативного размножения хвойных - прививок - нз ыолет удовлетворить нузды лесной селекции. Необходим поиск более эффективных способов клонального разынсгения.

В настоящее время достаточно ширско разрабатываются методы, обещающие значительный прогресс в генетике и селекции растений, один из них - культура клеток и тканей in vitro . Необходимо такзе иметь в виду,что, наряду с банками зародышевой пдазны, изолированные культуры клеток и тканей могут стать способом сохранения и использования мирового генофонда высших растений.

Особенно перспективным метод культивирования изолированных тканей и клеток монет оказаться дая лесных древесных растений, так как для их исследования большинство классических генетических подходов невозможно или ограничено ввиду длительного периода смены поколений.

Хотя, согласно концепции тотипотентности растительной клетки, мохно было ожидать, что культивируемая in vitro каллусная клетка любого вида растений будет способна дать начало организованны.! структурам, на практике это удается далеко не всегда. Наибольшую трудность в 3To;j! отношении представляют культуры ткачей голосе:,юнных, в частности, хвойных - основных лесообразукшх пород большей части территории России.

Древесные растения оказались трудным объектом как для культивирования их тканей in vitro вообще, так и при разработке способов ыикроклональяого разлшо-ения. Несомненно, эти трудно-

ста з первую очередь связанн с недостаточными методическими разработками.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение общих закономерностей и особенностей механизмов, контролирующих пролиферацию и морфогенез в изолированных; культурах хвойных различного уровня организации, и разработка на основе этих исследовании способов клонального размножения основных ле-сообразуыднх пород Сибири.

Исходя из этого, перед нами стояли следущие задачи:

- Получить каллусные культуры кедра сибирского. Изучить особенности длительно пассируемых культур, получить по возможности наиболее полные характеристики их потребности в питании и реакции на экзогевные регуляторы роста. '

- Получить культуры ыикростробилов сосны обыкновенной и исследовать влияете среди культивирования и стадии развития микроспор на ход ростовых процессов,

- Исследовать влияние экзогенных регуляторов роста на индукцию морфогенеза в культурах тканей хвойных.

Научная новизна. Результаты, представленные в работе, получены Епервые для изучаемых объектов - хвойных Сибири: кедра сибирского, ели сибирской, лиственницы, кедрового стланика.

Впервые гормональные и трофические потребности изучались параллельно на штаммах резного генетического и онтогенетического происхождения. Получены фактические подтверждения существования значительных штаммовых различий в пределах одного вида по гормональный и трофическим потребностям культивируемых ткачей.

Оригинальными являются такие данные по культивированию "опухолевых" тканей сосны обыкновенной из Забайкалья.

Впервые детально изучено происхождение каллусных тканей в культуре ыикростробилов сосны обыкновенной и кадра сибирского.

Получены результаты, показывающие возможность клонального микроразмнокения основных лесообразующих пород Сибири.

Проведенные исследования создают предпосылки для построения целостной картины, характеризующей особенности и закономерности выращивания изолированных культур хвойных.

Практическая значимость габоты. Изучение морфогенеза в изолированных культурах может иметь значение для понимания, а главное, для регулирования под действием экзогенных стимуляторов Ростоеых процессов у интактных растений.

2

- Полученные в работе экспериментальные данные открывают возможности для введегшя в практику лесного хозяйства нового способа разыноаения ценных генотипов.

- Изучение культур гаплоидных клеток, генезиса тканей в этих культурах, а в перспективе достиненае регенерация является определенным вкладом в практику лесной генетики и селекции.

Апробация работы п публикации. Материалы настоящей работы были представлены на I Всесоюзной конференции по проблемам физиологии и биохимия древесных растений (Красноярск, 1974); !Д Есесо-юзпсй конференции по культуре клеток растений (Абовян, 1979); Краевой научно-технической конференции молодых ученых и специалистов (Красноярск, 1980); Региональной сибирской конференция "Актуальные вопросы генетики и селекции растений" (Барнаул, 1980); I Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений (Москва, 1581)¡Проблемном совете по лесной генетике и селекции (Гомель, 1986); У съезде ВОГХ (Г.'осква, 1987); Пеядународной конференции "Вюлогля культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988); Ш Всесоюзной конференции по проблема!.! физиологии л биохш.шл древесных растений (Петрозаводск, 1989), а также на молодежных конференциях ИПяД (1977, 1979 гг.), заседании Красноярского филиала Сибирского отделения БОГИС.

По результата!.! исследований опубликовано 18 работ.

Структура и объем диссетоацид. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, главы, посвященной описании объектов и методов исследования, 4-х глаз с излонением результатов экспериментов и их обсуждением, заключения п выводов. Приложение вклшает список латинских названий растений, упоминаемых в тексте, и описание состава минеральных сред, используемых для культивирования тканей хвойных. Текст излокен на 135 страницах машинописи, не считая таблиц, рисунков п списка литературы. 1Шаэ-стрзтивная часть диссертации содержит 42 таблицы и 37 рисунков, 24 из которых вклвчавт 77 фотографий. Прилагаемый список использованной литературы состоит из 407 источников, из них отечественных 102.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Обоснование возможности и перспективности использования изолированных культур тканей для генетико-селекнионнкх исследований хвойных.

2. Методические основы получения изолированных культур хвой-

3

ных Сибири. Гормональные, трофические факторы срсды п физиологическое состояние первичного экспланта определяют ход ростовых процессов з изолированных культурах.

3. Шкроразыноиение - новый возыоаный способ вегетативного разшокения хзошых Сибири. В изолированных культурах хвойных реализуется тотипотентность растительно;; клетка.

Глава I. СОСТОЯНИЕ BGíIPOCA

В главе приводится обзор мировой литературы по культивированию in vitro тканей дрезесных, в ток числз хвошых. Рассыатрп-ваются работы Готра (Gautheret, 1934, 1948, 1955, 1956, 1959), Уайта (White, 1949, 1958, 1967), являющихся основоположниками данного метода для лесных древесных. Анализируется состояние исследований по регенерации in vitro. Прослеживается связь менду регенерацией in vivo и in vitro. Отмечается необходимость и перспективность применения метода для генетико-селекциошых исследований хвойных. Подчеркивается сложность изучаемых объектов, недостаточность методических разработок и ограниченность еидового состава культур для сравнительного анализа. Отсутствие работ по культивированию хвойных Сибири стимулировало проведение настоящей работы.

Глава П. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИСОЩОВЛНИЯ

Объекты исследования: кедр сибирский ( Pinus sibirica Du Tour ), сосна обыкновенная (Р. sylvestris L. ), кедровый стланик (P. puaila (Pall.) Rgl.); лиственница сибирская (Larix aibirica Ledeb.), лиственница Сукачева (L. eukaczewii Dylie), листвешшца Д.! ели на (L.gmolinii(Rupr.)Rupr.); ель сибирская (Picea obovata Ledeb. ), ель аянская (Р. ajanensis (Lindl, et Gord.) Fisch, ez Carr.).

Основной использованный в работе ыетод - стерильное культивирование тканей растений- Приготовление сред и материалов проводилось по общепринятой методике (Бутенко, 1964; Смирнов, 1970).

Каллусрые культуры. Исходным материалом для каллусных культур служили семена, полученные из лесхозов, а такне паши собственные сборы и сборы сотрудников лаборатории.

В некоторых экспериментах изучались конкретные генотипы, как то - кедр сибирский, дерево 808, припоселковыи кедровник, с.Лист-вянка Ермахоьского района, возраст 65 лет. Это дерево характери-

4

зуэтся прохождением болышнства этапов формирования семян в год цветения, неустойчивостью в многолетнем цикле сроков созревания шшек (Ирошников, 1963; Минина, Ларионова, 1976).

- сосна обыкновенная, дерево K32-I, Ниянечикойская популяция (пробная площадь заложена А.Л.Ирошниковим), г.Новоселенгинск, Бурятия. Дерево K32-I характеризуется большими опухолям на стволе и побегах, возраст 50 лет, высота 6 м, ширина кроны 3 п.

Для культивирования каллусных тканей использовались среды на основе минеральных растворов по Мурасиге и Скугу (Í.ÍC) (Murashige, Skoog, 1962) и Уайта (White, 1944). В состав основной среды МС входили макро- и микроэлементы, хелат яелеза по Мурасиге и Скугу, сахароза 2%, тиамин (0,4), пирздоксин (0,1), никотиновая кислота (0,5), миоиноздт (100), гидролззат казеина (200), агар 0,6-0,7Й. Основная среда Уайта содержала макроэлементы по Уайту, остальные компоненты аналогично среде МС.

Первичные каллусы кедра сибирского получены на среде МС с добавлением 2,4Д (2 мг/л) л кинетика (0,2 мг/л). КаздыЗ штамм каллуса имеет буквенное обозначение, соответствуют,ее происхождению тканей. Каллус из эксплантоз семядолей - С, глпскотллей - Г, побегов взрослых особей - П. Цифровое обозначение соответствует определенному генотипу.

Запасные культуры каллусов на протяжении всего периода исследований поддерживали на осноеяой среде МС с добавлением НУЦ/К (0,2 /0,2). Эта se среда служила контролем во всех экспериментах по оптимизации среды.

Каллусы инкубировались в темноте при 26°С с регулярным ежемесячным субкультивированием (вес инокулята 100 мг).

Рост культур оценивали по весу сырой и сухой ткани в конце месячного пассгша. Содержание сухого вещества определяли после высушивания навески ткани при Ю5°С до постоянного веса. Опыты по изучению дитмпкл роста проводили на двух штаммах семядольного происхождения - С-35 и 0-45, з 12-13 пассаяах. На каждый с'рок фиксации брали от 10 до 15 каллусов.

Для цитологического анализа каллусы фиксировали в растворе Kapuya л окрашивали реактивом Шпффа по Зельгену (Пирс, 1962) с пос-ледукщеЗ окраской светлым зеленым. Для подсчета клеток ткани мацэ-рировалл смесью 5% хромового ангидрида с 555 соляной кислотой в течение I часа. Количество клеток подсчитывали в гемоцитометре Оукса-Розенталя.

Культура мпктосттюбилов. Для вырадаваняя иикростробилов кедра сибирского и сосны обыкновенной использовались основные среда Г,!С и Уайта. На каздай вариант среды высалазалось от 30 до 50 микростробилов.

Для цитологического анализа фиксировали микростроба лы, культивировавшиеся 1-8 месяцев. Для приготовления препаратов брали "наросты1' тканей шесте с содержимым спорангиев. Учитывалась: шо-роспая пыльца, форма и длина пыльцевых трубок, наличие каллусных клет ок.

Стадия разьнтия микроспор, а такге число ядер и их расположение в проросших микроспорах определялись на материале, скрашенном гематоксилином (Смирнов, 1968; Шоферлстова, 1973).

г'дкротазмножение. В опытах по индукции морфогенеза, наряду с изолированными зародышами, изучали 3 типа эксплантов из проростков. А - апикальные отрезки, включающие основание семядолен, почечку и небольшую зону гипокотиля. Общая дайна экспланта 5 мм. С - отрезки сзыядолсй, Г - отрезки гипокотилей, взятые из зон, прилеягщих к экспланту А. Биологическая повторность 30-50 эксплантов на как-дцй вариант среды.

В экспериментах по клонированию взрослых особей ели сибирской в качестве первичного экспланта использовались верхушки пооегов текущего года, находящиеся в фенофазах: - набухание почек, распусканае почек, У^ - рост побегов (Елагин, Лобанов, 1979).

В другой серии опытов по ыикроразкно^ению взрослых особей ели сибирской эмбрональные побеги выделены из апикальных почек побегов, собранных в декабре-феврале 1389-1990 гг.

За основу взята среда МС, концентрации регуляторов роста варьировали от 3 до 2 мг/л.

Полученные экспериментальные данные обработаны статистически. Достоверность различий меэду вариантами всех опытов проверяли по критерию Стыодента для порогов вероятности доверительного сузденпя, равных 0,95, 0,99 и 0.999 (Плоханский, 1970).

Глава Ш. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР. НЕКОТОШЕ ЩГШОРЗО-ЛОПНЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ КВДРА СИБИРСКОГО

Начиная эксперименты по получения культур, анализируя литературу по культуре тканей голосеменных растений, мы отмечали, что получены культуры ограниченного числа видов, более того добиться

б

успеха в длительном культизлрованли удавалось далеко не всегда ( Konar, Guha, 1968; ïïiaton, 1972).

В напих экспериментах показано, что практически пе существует ограничений в выборе оксаланта для получения каллусов, однако легче и быстрее первичная пролиферация осуществляется из тканей ювенильных растений. Первичный каллус на изолированных зародышах, эксплантах проростков образуется через 2-4 недели. Полярность з образовании каллуса не обнаруживается.

Строго лоллряыи (на базальном конце) было образование каллуса в культуре макро-,млкростробилов кедра сибирского.

Известно, что в процессе субкультивирования формируются птам-тканей, харектерпзущяеся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями (.Куяах, 1978; Фролова, 1981).

Полученные птсммы тканей кедра сибирского различались ыегду собой по окраске, структуре, морфологии поверхности, скорости роста.

Часть пгтаммоз характеризовалась неустойчивостью скорости роста, и по мерз пассирования они "затухали". Срэд:; этих штаммов ткани, полученные из экспгантов 8С8 дерева. Попытки полупить каллус-ные культуры svoro генотипа предпринимались неоднократно, но более 5-ь пассакел культивировать их не удавалось. Эндоспермы беззаредн-шевых семян 808 дерева не была способны к образованию и первичного каллуса, в отлзчпе от эндосперма нормальных семян других генотипов.

Цитологическое изучение показало, что каллусные ткани кедра сибирского не являются однородными клеточными системами, для hex характерен ядерный п клеточный полиморфизм.

Два штамма семядольного происхождения, значительно различагь щиеся по морфология, были изучены в дшзмяке роста в течение 13-14 пассаяей.

Штамм С-35 - каллус однородный, рыхлый, распадающийся на отдельные комочка. Окраска ткачей белая, к концу пассаяа темнеет,появляются отдельные некротические зоны.Сырой вес ткани нарастает непрерывно в течение всего (30-дневного) пассата.Отсутствие четко выраженной лагфазы подтверждается данными по митотпческому индексу. Максимум митотической активности приходится на 4-10 сутки пассат. На графике митотической активности в течение пассака отмечается I пик.

Существует мнение,что одновершинная кривая митотической актпв-

7

ыостл характерна для каллусоз, не способных ко вторичной морфологической дифференциации (Ковалева, 1870; Писецкая, 1971).

Высокое содержание сухого вещества характерно для ткани штампа 0-35 (до 9%). В последние 1С дней пассата содержание сухсго вещества в ткани снипается, клетки переходят к растяжению. Об этом татке свидетельствуют данные о числе клеток на единицу сырого веса.

3 изучаемом кглдусе проходят процессы вторичной гистологической дифференциации. Отмечены клетки с различными типами вторичных утолщении клеточных стенок, однако содернание их не более - 0,12.

Штамм С-45 - каллус однородный, плотный, не распадающийся. Цвет каллуса белосяенный на протяненпи всего пассала. Первые 4 суток после пэр садки видимых изменений в каллусе не происходит. Число клеток и масса сырой ткани практически не меняются. Это ^е подтверждается и отсутствием делений. Затем показатели мптотичес-еои активности, массы ткани, числа клеток и содержания сухого вещества щчинают увеличиваться, что соответствует экспоненциальной фазе роста - интенсивной меристематизацзи каллуса. Максимум ыито-тической активности клеток каллуса приходится на 7-10 день пасса-га. Содержание сухого вещества в тканях штамма 0-45 не превышает 6%. Способность клеток данного штамма ко вторичной дифференциации значительно ниге - 0,0025».

Таким образом выявлены различия в динамике роста двух птаммов по показателям роста, содержанию сухого вещества, уровню ыитоти-ческой активности, способности к клеточной дифференциации.

Получая каллусные культуры кандого нового вида.. необходимо учитывать характеристики, свойственные конкретному виду растений п отдельным штампам тканей, формирующимся в процессе длительного культивирования.

Глава Г/. ТР05ПЧЕСКПЕ И ГОЕИОНМКШЕ ПОТРЕШОСТИ ДЛИТЕШО ПАССИКГСШХ КАЛЛУСНШ: КУЛЬТУР

Неудачи многих исследователей в длительном культивировании тканей хвойных вероятнее всего имели место из-за несоответствия используемых сред и потребностей отдельных культур. Кроме того, для реализации тотнпотентностд растительной клетки требуются специфические для ка;здой культуры условия. К числу факторов, определяющих эти условия,относятся в первую очередь регуляторы роста и

в

элементы питания (Skoog, Uiiier, 1957; Jaquiot, 1966;Бутенко,1975).

Новизна настоящей работы заключается в том, что влияние компонентов питательной среды на рост я дифференциацию изучалось параллельно н?. нескольких штаммах тканей одного вида. Изменения, происходящие под влиянием обеднения или обогащения сред, ттросле-кивались не менее чем в трех последовательных пассатах.

Регуляторы -роста. Пассирование запасных культур на протяжении всего периода исследований (около 8 лет) проводили на контрольной среде, содержащей НУК - 0,2 мг/л, кинетин - 0,2 мг/л.

Потребности з экзогенных ауксинах проверялись на всех без исключения штаммах тканей. Не обнаружено нл одного штамма тканей кедра сибирского (равно как и других изучаемых нами видов), не нуждающихся в экзогенных ауксинах. На протяжении длительного пеш-ода культивирования не отмечалось "привыкания" каллуспых тканей.

В течение одного пассажа на средах без ауксинов обеспечивается примерно 5CvS прироста биомассы,но во втором, третьем субкудьти-влрОБЗния культуры погибают.

Значительное повысение гормонального фона среды также неблагоприятно. Угнетение роста наблюдалось уже при концентрации НУК -3 мг/л.

Зависимость роста кадлусных культур кедра сибирского от экзогенных цитокинлнов менее выражена. Каллусы нескольких штаммов выдерживают до 6 субкультизирований нз средах без цптокининов. При этом рост однако ухудшается от пассажа к пассажу. 15 лаге если показатели веса сырой ткани снижаются незначительно, "качество" культур резко падает: каллусы темнеют,появляется множество некрозов. Реакция тканей разных штаммов на отсутствие кннетина схожа -постепенное снижение прироста биомассы,появление отмирающих клеток.

Ухудшение роста наблюдается на только в случае удаления кине-тнна, но при повышении его концентрации. 5-ти кратное увеличение концентрации,как правило,переносятся без изменения характера роста, но при увеличении до 2 мг/л - нарастание биомассы некоторых штаммов снижается вдвое.

Попытки снизить потребность каллусных тканей в кинетине повышением концентрации ауксина не привели к успеху. Данные по сырому весу каллусов на среде с НУК/К (2/0) в течение 2-х пассажей соответствовали росту в контроле - НУК/К (0,2/0,2). Однако в последующих пассажах нарастание биомассы снижалось. Еще активнее ухудшалось "качество" культуры - каллусы имели много некрозов.

9

Забранный нами уровень кинетпна в среде (0,2-1 мг/л) обеспечивает максимальное накопление биомассы за пассая. Изменением концентрации кинетина не удаюсь ни стимулировать прирост биомассы у низкопродуктявных штаммов, ни вызвать дифференциацию.

По потребностям в регуляторах роста каллусние ткачч кедра сибирского не отличаются от культур других видов хвойных (Brown, Lawrence, 1968; Bonga, 1977).

Углеводы. Каллусные ткани, выращиваемые in vitro и в темноте, и на свету практически все гетеротрофны. При достаточном разнообразии используемых сред почти единодушно рекомендуется применение 2-33 сахарозы (Бутенко, 196Холодова, 1981;Диксон, 1989 и др.).

На примере таша Г-39 показано, что 2-4% сахарозы обеспечивают примерно равный рост. Дальнейшее увеличение концентрации сахарозы приводит к снвнешю прфоста биомассы, причем при 5% сни-кеяие отмечается только по весу сырой ткани, а при сахарозы -и сырой,и сухой биомассы. Среда с L% сахарозы обеспечивает лишь половину прироста биомассы по отношению к контролю.

В экспериментах показано, что применение фруктозы (0,12!Л) обеспечивает рост, равный росту на сахарозе. 'Мнималышп рост способны поддергивать галактоза и мальтоза. На средах с ссрбозои и ксилозой каллусы погибали.

Вптагпчя. Штаммы каллуешх ткач ел кедра сибирского по-разному реагируют на исключение из питательной среда шштшой, добавки, Ткани штамма Г-39 в 6-ти последовательных пассатах на среде без витаминов росли так :.;е, как и в контроле. Л для каллусов штамма Г-31 прирост биомассы снижался в 3 раза уке з первом субкуль-тивированли на дефицитной среде. Для самого продуктивного в нашей коллекции итагма С-45 снижение накопления биомассы отмечалось лишь в 3-м пассаке на среде без витаминной добавки, но далее вплоть до 6-го последовательного пасса:.а поддерживалось на одном уровне, который составил примерно 257 от контроля. Проверка необходимости отдельных компонентов витаминной добавки выявила такпе широкий спектр реакции различных штаммов.

Мюпнозпт. Каллусные ткани кедра сибирского проявляют ебти-ге.тгшй характер потрзбности з миоинозите, Па средах бег миоияозита ткани чернеют на 7-10 день. Пересадка каллусов на контрольную среду после 2-х недельного инкубирования на среде без инозита не вызывала возобновление роста. Отсутствие инозита з питательной среде приводило к гибели клеток.

Увеличение концентрации мподнозита в среде до 1С г/л существенных изменений в росте культур не вызывало: на примере штамма С-45 показано сниг.енке роста биомассы яа ¡¡¡055. Оптимальной является концентрация инозита - 100 мг/л.

Потребность в мяолнозите специфична. Сорбит (100 мг/л) нэ сказывал злляшя яа рост каллусов ш на фоне шюинозита, ни в эго отсутствии.

Нцинственный итамм (С-45), из всех имеющихся в коллекция, был способен к минимальному росту на средах без инозита - 2-х кратное увеличение сырого веса за пасса?.. Более того,длительное зыдерзизаняе на среде без инозита (без пересадок до 4 месяцев) не приводило к гибели всех клеток. Пересадка, на контрольную среду, или только внесение ииоинозита, вызывало возобновление роста кал-лусоз.

Учитывая облигатную потребность в миоинозите всех шташоз ткачей кедра сибирского (как з тешовой, так и з световой культуре) проверена зависимость роста от этого фактора тканей других видов. Показано, что ткани сосны обыкновенной (нормальные я опухолевые), лиственницы сибирской., Емелина, Сукачева - строго инозлт-зависямы.

Каллусы елл сибирской автономии по отношению к инозиту в световой и в темповой культуре. Б экспериментах на 10 штаммах з тече-нгс 3-х пессакой на установлено снижения продуктивности я изнене-няя характера роста.

Слоглив органические добавки. Широкий спектр реакций разных гяеммов выявлен при исключении пз стада гыдролнзата казеина. Ткан:, птамма Г-39 не показали сня:ззния роста дазе з 6 пассате. Другие г.9 штаммы снягаит накопление биомассы вдвое (птамм 0-45), однако это происходят лишь в 3-м последовательном пассаке на ооедненной среде, в изучаемых тканях не отмечено изменения уровня дпффэрея-циащ'п ткаыл з заздсимости от наличия гядролизата казеина.

Единственным дополнительным компонентом сред, стикулиругхшм прирост каллусов (в среднем на 25%), оказалось кокосовое молоко. Сглако дифференциации культур я в этом случае не отмечена.

Культура опухолевых тканей сосны обыкновенной из ю.здого За-ба-.'.калы1. 3 изолированных популяциях сосны обыкновенной в влккх района:;: Бурятии описаны особи с аномалией роста в виде наростов на стволе п побегах (Сосна..., 1983).

Н

Опухоли сосны обыкновенной характеризуются ограниченны;.! и организованным типом роста. На поперечных срезах опухоли просматривается упорядоченная структура побега, с четкими годичными кольцами.

Вырахивалсе эксплантов из опухолей сосны в культуре in vitro показало, что образование первичного каллуса имело место только па средах с ауксинами. Штаммы опухолевых тканей и в пассируемой культуре строго ауксин- и инозитзависимы, как и нормальные каллусы сосны обыкновенной. Каллусгае ткани, полученные из опухолей сосны обыкновенной, характеризовались низкой интенсивностью роста (5-7-кратное увеличение массы сырой ткани за пассак).

По результатам выращлвашш в изолированной культуре, морфологическим и анатомическим характеристикам предполагается, что опухоли сосны обыкновенной из Южного Забайкалья идентичны широко известным "опухолям Уайта на ели" (t?Mte, Uillington, 1954; Reinert, Yfiiite, 1956; Risser, White, 19o4).

Главное, что отличает опухоли сосны и ели от всех известны:: опухолей растении - это зависимость их'роста в изолированной культуре от экзогенных ауксинов.

Глава Г. ШЬЯШРОВАНКЕ IH VI2RO МИКРОСТРОБМОВ ХВОЙНЫХ

Наиболее эффективны!.! методом получения гэшюидоз в настоящее время является культура пыльников (Ницше, Венцель, 1980). Разработка этого метода для хвойных, характеризующихся высокой гетерогенностью, длительным циклом смены поколений, крайне перспективна для повыкения эффективности генетико-селекционных исследований.

Tai-; как опыты по культивированию ыикростробилов сосны обыкновенной и кедра сибирского проводились впервые, в качестве основной ставилась задача методического характера - создание культур, определение стадии развития микроспор и фактороз среды, обеспечивающих образование каллусов и эмбриоидоз.

Кэдр сибирский. Проведенные эксперименты позволяли получить каллусные культуры при выращивании ыикростробилов и отдельных микроспорофиллов на средах MC и Уайта, дополненных 2.4Д/К (2/0,2 ыг/л).

Микростробилы вводились в культуру ка стадии тетрад микроспор. Визуальные наблюдения и данные цитологического анализа по-

12

казати, что в образованна каллуса принимают участке соматические ■ткани микростробила и тетрады микроспор. В каллусах отпечено наличие клеток разного урозш плоядяостл. Ткани характеризовались недифференцированным типом роста.

Сосна обыкновенная. В экспериментах в течение 3-х вегетационных периодов в культуру зводпллсь микростробила, содержало одноядерные микроспоры.

Цитологический анализ мнкростробилоз сосны обыкновенной пчеле 1-2 месяцев культивирования in vitro показал, что "наросты" на поверхности микростробнлов не являются калдусной тканью, а образованы проросшими микроспорами.

Прорастание микроспор, длина пыльцевых трубок, их ветвление и образование вздутий не зависят от присутствия регуляторов роста в питательной среде. К концу месячного пассаяа большинство проросших микроспор имело I ядро. Деление ядер в пыльцевых трубках, а такие многоядерные пыльцевые трубки отмечены в стробилах, выращенных на средах с регуляторами роста - 2,4Д/К (до 7 ядер).

В процессе дальнейшего культивирования изменения, происходящие в микроотробилах, связаны с увеличением длины пыльцевых трубок (примерно на 25%), усилением зетвления (прямых остается около 20«) и образованием вздутий.

В массе проросших микроспор, узка в течение 2-го месяца культивирования отмечалось присутствие ценоцятов. В последующих пас-санах число ценоцитоз возрастало, присутствовал!': многоклеточные пыльцевые трубил и отдельные клетки паренхимного типа.

Каллусная ткань была образована через 8-10 месяцев выраиива-ш:я микростробилов на средах с регуляторами роста.

Таким образом, показана возмоаность получения каллуспых тканей в культуре ыикростробилоз кедра сибирского и сосны обыкновенной, изучено происхождение каллуса.

Глава П. МОРЗОГЗПВ 3 ИЗ(Ж?(ШПЩХ КУЛЬТУРАХ ХВО&ШХ

Согласно концепции Скуга и Миллера (Skoog, Miller, 1957) соотношение ауксинов а цитокпнинов является тем репапизм фактором, который определяет ход ростовых процессоз а морфогенез. Контроль морфогенеза имеет генетическую и эпигенетическую природу, степень тотипотентности различна даже у клеток одного организма.

Кедр сибирский. Изолированные зародыши способны прорастать на питательных средах. Присутствие ауксинов (НТК - 0,1-1, ИУК/К -

13

0,2/0,1) вызывало пролиферацию тканей зародышей. Показано отсутствие влияния стратификации и непрерывгого освещения на прорастание изолированных зародышей и каллусогенез.

Образование адвентивных почек на изолированных зародышах имело место на средах с ИУК/К (0,2/0,1) (единичные, главны:» образом на концах семядолей), содержащих только Е£П (1-5) пли НУК/БАП (0,1/5). При более высоких концентрациях НТК в средах процесс кал-лусообразования становился доминирующим.

Почке, индуцированные на средах с РУК/ЕАП, более .низнеспоссб-ны. Побеги, развивающиеся из адвентивных меристем, характеризовались крайне слабым удлинением, укоренить их не удалось.

Три типа эксплантов проростков выращивались в условиях освещения р в темноте на средах с различными сочетаниями содерлзния НУК/Е'Л в концентрации от 0 до 5 иг/л. Ткани проростков кедра сибирского в темновой культуре, в отличие ст изолированных зародышей, оказались некомпетентными к индукции морфогензза. Отмечались увеличение линейных размеров С и Г эксплантов па средах с ауксинами и активная пролиферация.

В световой культуре апикальные экспланты на средах ЮЧС^БАП развивались в побеги. Имело место прорастание пазушных почек в основании первичной хвои, развитие дополнительных побегоз.

Сосна обыкновенная. Из трех типов эксплантов проростков компетентными к индукции оказались только атнсальные отрезки. Могло наметить 2 основные схемы размножения ювенильнкх растений сосны обыкновенной:

1. Эксплант - развитие побега - укоренение - прорастание насущных почэк - укоренение пазушных побегов.

2. оксплант - образование пазушных и адвентивных побегов -укоренение.

Второй путь обеспечивает получение большего числа растений.

Рост и развитие пазушных побегов проходили на средах без регуляторов роста. Укоренение имело место на средах без гормонов с 1/2 минеральной основы ЫС н 0,5-12 сахарозы.

Укоренение да^е пазушных побегов сосны обыкновенной нельзя считать решенной задачей, несмотря на то, что в отдельных спытах ми отмечали ЮСй укоренение. Стабильного укоренения во всех опытах (разные партии семян) не достигалось. Пазушные побеги, получеяяце в опытах, проводимых весной, укоренялась более успешно.

Наблюдались факты спонтанного рлзогенеза на семядолях, гипо-

I*.

котилях изолированных зародышей и эксплантах проростков сосны обыкновенной. В культурах других видов хвойных (разных уровней сложности) ни одного случая образования корневых меристем не обнаружено.

Лиственница Рлелпна. Развитие апикальных отрезков проростков аналогично описанному для с ост обыкновенной. На средах, содержащих 2.4Д/БЛ1 (0,02-0,1/0.1-0,5), происходило прорастание пазушных почек. Слабое удллнепие пазушых побегов имело место на срэдах без гордонов. ПУК, ИЖ, ПУК - (0,1-5) вызывали образованна каллуса. -Укоренения не происходило. В дальнейшей побзги прекращали рост, несмотря на регулярные пересадки на свете среды, а теряли по.~елтевпуга хвою.

Кздг)0Б1тГт стланик. А, С, Т экспланты проросткоз на средах с 2,4Д/К, 2,4-Д/ЕШ, были способны к пролиферации. Получены активно растущие каллусные культуры. А-эксплантн некоторых генотипов образовывал:! "глобулярный каллус", в котором дифференцировались почта. На средах без гормонов они развивались з побеги до 7 ми длиной.

Поддерпивать способность каллуса к образованию стеблевых меристем длительно не удавалось. Все испытанные среда с ауксина;.« стимулировали пролиферацию, вызывали изменение структуры тканей, приводили к их разрыхлению. На средах без регуляторов роста в течение одного пассата "глобулярная" структура тканей сохранялась. 3 этих каллусах отмечено высокое содержание клеток со вторичными утолщениями (7,2£). При последующих субкудьтивированиях на среды без ауксинов каллусы погибали.

Ель аянска^. Испытаны различные сочетания НУК, 2,ЧЦ, БАЛ з качестве индукторов гемогенеза на А эксплантах 1-2-несячных сеянцев.

Максимальное число эксплантоз (75%), способных к геиогенезу, отмечено при внесении в среды 2,4Д/БАП (0,02/0,5). Для успешного развития индуцированных структур концентрация горюнов сказалась вдвое, далее развивающиеся побеги культивировались на средах без стимуляторов роста. Рост побегов крайне медленный. Через 6 месяцев выращивания побеги достигали 4 мм длины, отдельные до 10 им. На некоторых эксплантах насчитывали до 50 почек.

Эти жэ индукторы обеспечивали образование глобулярного каллуса и развитие почек л при культивировании изолированных зародышем, ели аянской. Необходимо отметить, что образование мерфогеиного

15

каллуса отмечалось в на средах с 2,*й/К (2Л). Этот уровень регуляторов роста в культурах описаяых ранее водов вызывал образование рыхлого недифференцированного каллуса.

Побеги, индуцированные на зародышах ели аянской, развивались активнее. Через 8 месяцев они достигали в длину 10-20 мм. Сохранность побегов низкая. Количество размногенных генотипов (от исходных) примерно 70$. Количество Ее побегов, сохранившихся на этот срок, не более 20% от общего числа индуцированных почек.

Различия меаду отдельными генотипами как по числу индуцированных структур, так и по выживанию побегов очень большие.

Побеги, индуцированные на средах с 2, ЧЩ/К. погибали полностью.

Низкая скорость роста и сохранность, по-видимому, определялась как недостаточно соответствующими физическими условиями культивирования (нестабильность температуры и влааности), так и особенностями культивируемых тканей.

Часть микропобегов помещалась в условия пониженных температур на 40-50 дней. Отмечено активное возобновление роста после периода покоя.

Едь сибирская. Размножение хаеяашгсго материала ели сибирской проходило, как и для ели аякской, через образование морфо-гонного каллуса (адвентивный морфогенез).

Отмечены случаи прямого гемогеыеза на изолированных зародышах.

Изучалась возможность микроразмнокения плодоносящих особей. Б культуру вводились верхушки побегов разных генотяпоз, взятые з разных фенофазах.

'5изиологичбсгл более молодые экспланты (фенофаза Шд) слабо цролкфэрировадя дане на средах без регуляторов роста. В более поздние сроки (шеяофазк все испытанные среды с регулято-

рами роста - 2.4Д (0,2-2), Ш (0,5), К (0,5), НУК (2) обеспечивали образование рыхлого каллуса.

Культивируя экспланты взрослых особей эли сибирской, мы показали, что почки в фазе набухания, распускания и роста неспособны к развитию в изолированной культуре. Сиу. ае являются компетентными у к индукции - под действием регуляторов роста не происходило ни прорастания пазушных, ни образования адвентивных меристем.

В опытах, где в качестве первичных эксплантов были иснользо-

16

ванн эмбриональные побеги, выделенные из покоящихся почек, было достигнуто, как и в культуре юзеяяльнпх тканей, образование мор-фогенного кащгса. Развитие морфогенного каллуса я образование побегов (длиной до 20 мм) занимало 8-10 месяцев.

Таким образом, в культурах разных видов хвойных Си бара экспериментально подтверждена тотипотеп-тность пх моток, л показаны путп ее реализации. Компетентными к индукция морфогенеза могло считать клетки зародышей, молодых- сеянцев, эмбриональных побегов (елл сибирской). Отмечена высокая генетическая вариабельность по способности к морфогенезу.

Индукция прорастания и образования почек осуществлялась под дейстзпем ЕШ (реяе кинетина) в сочетании с 2,НТК, ИУК. Наиболее эффективными для индукция гемогенеза оказались сроди с Б.АП/2, 4Д - 20:1. Количество и сохранность почек, индуцируемых при таком соотношении регуляторов роста, всегда была выше.

Адвентивные побеги характеризовались низкой скоростью роста п плохой сохранностью.

Для большинства изучаемых видов хвойных Сибири реализованы первые этапы мпкроразннолюния (индукция почек, их развитие). Разработка последующих этапов - укоренение, акклиматизация - требует дополнительных исследований.

ВЫВОДЫ

1. Подтверждена возможность получения и длительного выращивания в стерильной культуре изолированных тканей кедра сибирского. Установлено, что з процессе субкультивироваяия формируются штаммы, характеризующиеся стабильностью темпов и типов роста. Штаммы каллускых ткачей данного вида различаются мезду собой по ростовым и цнтоморфологячесютм характеристикам.

2. Выявлены значительные разлячпя з гормональных и трофических потребностях мезду штаммами одного вида. На основе изучения большого числа птаммов тканей дается характеристика среды для каллусных культур кедра сибирского: Среда Нурасиге и Скуга, дополненная витаминами (пзридокскп - 0,1; тиамин - 0,4; никотиновая кислота - 0,5; миоянозит - 100 мг/л), гидролшатом казеина - 200, сахарозой - 20000, ч-НУК - 0,2; кинегпном - 0,2 мг/л,

— является необходимой и достаточной для обеспечения длительного пассирования каллусных тканей кедра сибирского.

Получение я длительное выращивание на указанной среде кал-

17

лусных тканей кедрового стланика, лиственницы сибирской, Сукачева, В<елина, ели сибирской л аянской, сосны обыкновенной дают основание считать, что эта среда монет использоваться в качестве основы для получения каллусов и других видов хвойных.

3. Установлено, что экспланты аномального дерева кедра сибирского (с однолетним циклом развития женской шишки) способны к пролиферации в изолированной культуре на среде указанного состава. Однако калщусные ткани этого генотипа не растут in vitro более 5-6 пассажей.

4. Впервые проведено культивирование in vitro опухолей сосны обыкновенной. Первичные культуры опухолей и полученные каллус-ные ткани нуждаются в экзогенных ауксинах и миоинозите.

По результатам выращивания in vitro , изучения .морфологии и анатомии предполагается, что опухоли сосны обыкновенной из Шно-го Забайкалья идентичны "опухолям Уайта на ели".

5. Показано, что микростробнлы кедра сибирского (на стадии тетрад микроспор) способны к образованию каллуса на среде с 2,4Д (2 мг/л) и кпнетином (I ur/л). Образование каллуса строго полярно. Полученный каллус ыо^сет расти в пассируемой культуре и характеризуется отсутствием дифференциации.

6. Изучен каллусогонез в культуре мнкрострооилов сосны обыкновенной, содержащих одноядерные микроспоры. Процесс образования каллуса характеризуется длительностью и имеет место только на средах с регуляторами роста. Образованию тканей цредшествуюг прорастание микроспор, рост и ветвление пыльцевых трубок, развитие ценоцитол и многоклеточных пыльцевых трубок.

7. Впервые для кедра сибирского, кедрового стланика, ели аянской и сибирской в культуре тканей показана возможность индукции морфогенеза.

Для изучаемых видов хвойных Сибири реализованы первые этапы микрорезынокения ювенильных растений (индукция прорастания пазуи-ных, образования адвентивных почек и их развитие).

Показана компетентность к индукции морфогенеза клеток зрелы:-' особей хвойных (на примере эмбриональных побегов ели сибирской).

2. Совокупность экспериментальных данных, полученных на разных видах хвойных, позволяет сделать вывод, что, как и в культурах растений других систематических групп, ведущую роль в регуляции каллусогеаеза хвойных играют ауксины, тогда как в индукции гемогенеэа преобладает влияние цитокининоз.

Список основных работ, опубликованных по материалам дис-сертаияи:

1. Толочко В.В. Изолированная культура каллусной ткани кедра сибирского //Информ.матер.: Коорд.регион.совет по визпол. и биохим.раст. - ¡'¡ркутск: СИФИЕР, 1974. -л12. - С. 10-12.

2. Толочко В.В., Гамбург Х.З. Влияние ыиоинозита на культуру ткани кедра сибирского //'Там не. -1975. -Й13. - С.5-6.

3. Толочко В.В., Гамбург К.З. Выращивание каллусных ткаяеП кедра сибирского в условиях освещения //Опер.информ.матер.: Коорд. регион.совет по физиол. и биохим.раст. -Иркутск: СИФИЕР, 1976. -С.8-9.

4. Толочко В.В., Гамбург К.З. Возможные функции шаоянозита в растениях //Успехи совр.биол. -1978. -Т.85, Я1. -С.50-62.

5. Толочко В.В. Культура микростробилов кедра сибирского и сосны обыкновенной //Опер.инфор,».матер.: Коорд.регион.совет по физиол. и биохим.раст. -Иркутск: СИЖЕР, 1979. - С.49-51.

6. Толочко В.В. культура тканей хвойных Сибири. Проспект ВДНХ. -Красноярск: ИПиД, СО АН СССР, 1979. - 4 с.

7. Толочко В.В. Особенности роста микростробилов некоторых, хвойных in vitro //Актуальные вопросы генетики и селекции растений: Тез. докл. Сяб.регион.конф. -Барнаул, 1980. - С.293.

8. Толочко В.В. Получение растений из апикальных меристем хвойных //Опер, информ. матер.: Коорд. регион, совет по физиол. и биохим. раст. - Иркутск: СИФИБР, 1980. -С. 14-16.

S. Скрипаченко В.В. Получение растений в культуре изолированных зародышей и апикальных отрезков проростков некоторых хвойных //Селекция, генетика и семеноводство древесных пород как основа создания высокопродуктивных лесов: Тез. докл. и сообщ. Всесоюз. н.-т.совещ. -М.: 1980. - C.3II-3I5.

10. Скрипаченко В.В. Влияние фитогорлонов на инициацию каллуса и рост каллусных тканей хвойных //Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. 1-й Всесоюз. конф. по регул, роста. -М., 1981. - С.175.

11. Скрипаченко В.В. Выращивание in vitro тканей проростков трех еидоз сосны //Физиол.раст. -1982. -Т.2Э, Вып.1. -

С. 205-211.

12. Скрзпачеяхо B.B. Каллусные и клеточные культура видов сем. Pinaceae //Проблемы физиологии и биохимии древесных растении: Tes. докл. Ш Всесоюз.конф. - Петрозаводск, 1989. - C.I92-194.

13. Скрипаченко Е.В. Культура in vitro опухолевых тканей сосны обыкновенной из Еняого Забайкалья //Там se. -1989. - C.IIS.

•Чшсгра'рия Красноярского Научного Центра СО РАН Заказ* H? 37.Тирая 100 экз. Объем 1,2 п.л.