Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ каллусной ткани Aconitum septentrionale K.: физиологические и генетические аспекты

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Анализ каллусной ткани Aconitum septentrionale K.: физиологические и генетические аспекты"

На правах рукописи

РГБ ОД

1 2 Ш 7 "НИ

Мигранова Ирина Гайсаровна

„<лл

W

ШкУ и

АНАЛИЗ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ACONITUM SEPTENTRIONALE К.: ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

03.00.12. - Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2000

Работа выполнена в лаборатории математической и молекулярной генетики Института биологии Уфимского научного центра Российской академии наук.

Научные руководители: доктор биологических наук

Мардамшин Л.Г. доктор биологических наук Чураев Р.Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Першина Л.А (г. Новосибирск)

Доктор биологических наук, профессор Ахметов Р.Р (г. Уфа)

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский

институт растениеводства им. Н.И Вавилова (г. С анкт-Петербург)

Защита состоится "30" иНРНЯ_2000 г. в /4/ часов на заседания

специализированного Совета К0641309 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Башкирском государственном университете по адресе: 450025 г. Уфа, ул. Фрунзе, биологический факультет Башкирского государственного университета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирскогс государственного университета.

Автореферат разослан МО. Я 2000 г.

Ученый секретарь специализированного совета А

д.б.н., 7Ш Г.Г.Кузяхмстов

00 • III сМ ^

Актуальность исследования

Известно, что в результате все возрастающего антропогенного воздействия на окружающую среду происходит сокращение численности многих видов лекарственных растений. В качестве дополнительного источника сырья при получении продуктов вторичного метаболизма, имеющих широкое применение в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности, могут служить клетки, культивируемые in vitro. К сожалению, как правило, в каллусных и суспензионных культурах происходит снижение содержания искомых продуктов вторичного метаболизма как минимум на порядок, хотя имеются и некоторые исключения. Наблюдаемая в настоящее время низкая эффективность клеточных технологий объясняется, главным образом, недостатком знаний об особенностях биологии клеток, выращиваемых в асептических условиях. Известно, что при введении в культуру in vitro многих видов лекарственных растений возникают определенного рода трудности, в частности, связанные с обильным выделением полифенолов, приводящим к гибели клеток. Кроме того, каллусные и суспензионные культуры достаточно часто оказываются неспособными к длительному выращиванию в условиях in vitro. Для решения данных проблем необходимо расширение исследований с привлечением большего количества видов растений, вводимых в культуру in vitro, и оптимизация условий получения и культивирования свободноживущих клеток.

При лечении аритмии сердца используют препарат Аллапинин, действующим началом которого является дитерпеновый алкалоид лаппаконитин, который получают из корневищ борца белоустого (Aconitum leucostomum) [Маш-ковский, 1993]. С целью увеличения сырьевой базы для производства Аллапи-пина проводятся исследования другого вида - борца северного (Aconitum septentrionale). Установлено, что содержание лаппаконитина в его подземной части колеблется от 0,47% до 2.31% в зависимости как от места обитания, так и от возраста растения; содержание же данного дитерпенового алкалоида в надземной части находится в пределах 0,01% - 0,1% [Федоров и др., 1996]. Имеется одно сообщение об успешном введении в культуру in vitro этого лекарственно-

го растения [Иванцов и др., 1988]. Однако, полученные результаты практически невоспроизводимы.

Исходя из вышесказанного, цель настоящей работы заключалась в разработке подходов стабильного получения каллусной ткани борца северного (Aconitum septentrionale), способной к длительному культивированию in vitro.

Для достижения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи:

1) оптимизация условий получения каллусных тканей борца северного;

2) анализ межпопуляционного полиморфизма методом полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров;

3) изучение влияния генотипа борца северного на жизнеспособность каллусных тканей;

4) изучение степени стабильности генома клеток борца северного, культивируемых in vitro, методом полимеразной цепной реакции.

Научная новизна работы

1. Выявлено, что отбор эксплантов на ранней стадии вегетации растений по-■ зволяет избавиться от выделения полифенолов в питательную среду при индукции каллусообразования.

2. Методом полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров установлено наличие генетического полиморфизма трех популяций борца северного.

3. Показано, что каллусные ткани, полученные из растений борца северного различных популяций, отличаются по способности к длительному культиви-

- .рованию in vitro.

4. Методом полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров выявлена нестабильность генома клеток борца северного, культивируемых in vitro.

Научно-практическая значимость

Полученные результаты имеют прежде всего теоретическое значение, расширяющее наше представление об особенностях биологии свободноживущих клеток. Использованные подходы при изучении генетического полиморфизма

трех популяций борца северного могут применяться для дальнейшего исследования генетической неоднородности различных популяций лекарственных растений. Разработанный подход к индукции каллусообразования может использоваться при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за обильного выделения полифенолов.

Апробация работы

Полученные результаты докладывались и обсуждались на Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997), Международной конференции «Состояние и перспективы развития биотехнологии растений» (Алматы, 1997), Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» (Минск, 1998), конференции биохимиков Урала и Западной Сибири (Уфа, 1998), республиканской конференции «Современные проблемы естествознания на стыках наук» (Уфа, 1998), Международной конференции «Молекулярная и клеточная биология на рубеже веков» (Алматы, 1999). Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена па/02 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 18 рисунков. Список использованной литературы включаетМ2 наименования, из них - %2. на иностранном языке. Благодарность

Считаю своей приятной обязанностью выразить искреннюю признательность моим научным руководителям д.б.н. Мардамшину А.Г. и д.б.н. Чураеву Р.Н., сотрудникам лаборатории математической и молекулярной генетики к.б.н. Федорову Н.И., к.б.н. Ишбирдиной Л.М., м.н.с. Сидоровой Л.В., м.н.с. Лукиче-

вой И.А., сотрудникам Института цитологии и генетики (г. Новосибирск) к.б.н. Салиной Е.А. и к.б.н. Леоновой И.Н.

1. Объект и методы исследования

Объектом изучения являлась каллусная ткань, инициированная из различных частей борца северного (Aconitum septentrionale К.), отобранных из четырех географически разобщенных популяций Предуралья Башкирии.

Для получения каллусной ткани были использованы корни, листья и сердцевинная паренхима борца. Стерилизацию растительного материала проводили по следующей схеме: листья - 2,5 мин 70%-ным этанолом + 1 мин 0.1%-ным диацидом; паренхима - 2,5 мин 70%-ным этанолом + 15 мин 0.1%-ным диаци-дом; корни - 2,5 мин 70%-ным этанолом + 3 мин 3%-ной перекисью водорода + 20 мин 0.1%-ным диацидом. Инициацию каллусообразования и последующее субкультивирование (через каждые 3 недели) осуществляли на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга в световом и темновом режиме при температуре 25-26°С.

Определение содержания лаппаконитина проводили по ранее разработанной методике с помощью ВЭЖХ [Федоров и др., 1996]. Концентрацию исследуемого дитерпеноида в анализируемых образцах определяли по калибровочному графику.

Выделение ДНК для проведения полимеразной цепной реакции проводили по прописи, предложенной Дж. Дрейпером и П. Скоттом [1991]. Амплификацию ДНК проводили стандартным способом. В работе использованы 98 случайных праймеров с произвольной последовательностью (GC-состав 5070%>) длиной 10-11 нуклеотидов (синтезированы в ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск). Для .подсчета размера ДНК-ампликонов, образованных в результате полимеразной цепной реакции, использовали ДНК фага X, расщепленной рест-рикционной эндонуклеазой Pstl. Электрофоретическое разделение препаратов ДНК-ампликонов в 1.5%-ном агарозном геле проводили стандартным методом [Скотт, 1991].

2. Результаты исследований и их обсуждение 2.1. Получение каллусной ткани борца северного

Первый этап работы заключался в оптимизации процесса каллусообразова-ния путем подбора определенных условий, которые позволили бы избавиться от выделения полифенолов из эксплантов различных органов борца северного при культивировании in vitro. В качестве эксплантов нами были выбраны листья, сердцевинная паренхима и корни растений Уфимской популяции борца северного. На рис. 1. представлены результаты хроматографического исследования содержания лаппаконитина и его дезацитилированной формы в выбранных объектах исследования.

н

2,03 Л

н

/

I

II

/

2,03 3,30 т'мин Б

н

2,03 В

т, мин

Рис. 1. Хроматограммы дитерпеновых алкалоидов борца северного: А - корень; Б - стебель; В - лист.

Стрелками указано положение лаппаконитина (I) и дезацетиллаппаконитина (II). Проведенные расчеты показали, что содержание искомого продукта вторичного метаболизма в различных органах было следующим: в листьях - 0,03%, в корнях - 0,482%, в паренхиме- 0,063%. В последнем случае наблюдалось также

т. мин

наличие дезацетиллаппаконитина. Представляется маловероятным, что его появление является результатом деструкции лаппаконитина при сушке растительного материала и/или экстракции. Предположение о маловероятиости деструкции основано на том факте, что превращение чистых препаратов лаппаконитина в дезацетиллаппаконитин может быть осуществлено путем его гидролиза в течение 16 часов при 22°С 2н H2SO4. При экстракции же использовалась 0,2н H2S04. По-видимому, появление дезацетилированной формы лаппаконитина в паренхиме связано с особенностями физиологического состояния клеток в различных типах эксплантов. Из литературных данных известно, что в культивируемых in vitro клетках борца белоустого также наблюдалось присутствие дезацетилированной формы лаппаконитина, а в зародышах, из которых был получен каллус, - только лаппаконитип [Валиева и др., 1988]. Известно, что получение каллусных тканей у многих видов растений затруднено из-за обильного выделения полифенолов. Окисленные полифенолы подавляют окислительное фосфорилирование в митохондриях и тем самым убивают клетку. Для предотвращения этого в питательную среду добавляют аскорбиновую кислоту, поли-винилпирролидон, активированный уголь [Bonner and Vamer, 1965]. Не исключено, что выделение полифенолов и все попытки избавления от них при каллу-сообразовании путем добавления различных соединений в питательную среду сужают спектр проявления всех возможных типов каллусных тканей из конкретных эксплантов. Поэтому нами была предпринята попытка избавления от выделения полифенолов путем использования растений на начальных этапах их вегетации, не добавляя антиоксиданты. У всех типов эксплантов (корни, листья, стебель), полученных из растений на 10-е сутки от начала вегетации, не наблюдалось выделения полифенолов при каллусообразовании. Экспланты, изолированные из корней растений на 22-е сутки от начала вегетации, из-за обильного выделения полифенолов чернели через 2-3 часа после помещения на питательную среду, а листовые сегменты - через 3-4 суток. Каллусная ткань на этих экс-плантах не образовывалась. Выделение полифенолов из клеток сердцевинной паренхимы происходило в меньшей степени, однако каллусообразование также

не наблюдалось.

Частота каллусообразования из различных частей более молодых растений на трех вариантах питательной среды представлена в таблице 1. Как видно из полученных данных, каллусообразование происходило на всех типах эксплан-гов.

Необходимо отметить, что данные варианты питательных сред были оптимальны для получения каллусных тканей, поскольку каллус формировался на зсех типах эксплантов. На других средах частота каллусообразования не превышала 20%.

Таблица 1

Инициация каллусообразования в зависимости от типа экспланта борца северного и состава питательной среды.

Тип экспланта Доля эксплантов, образовавших каллус (%)

МБ + 2,4-0 + НУК МБ + 2,4-Э + 6БАП МБ + 2,443

Пистья 92.9 ± 0.85 93.1 ± 1.01 97 ± 1.05

Стебель (сердцевинная 1аренхима) 86.9 ± 0.73 85.610.77 92.2 ± 0.69

Сорни 81.4 ± 1.08 80 ±0.81 83.3+0.82

Примечание. МБ - питательная среда Мурасиге и Скуга, НУК - а-нафтилуксусная ки-лота, 6БАП - 6 бензиламинопурин, 2,4-0 - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.

Ранее отмечалось, что для получения каллусных тканей необходимо ис-юльзовать молодые растения, для которых характерна активная клеточная гролиферация [Бутенко, 1964]. Полученные нами результаты показали, что ис-юльзуя молодые растения на определенной стадии их развития, можно также [збавиться от выделения полифенолов, что существенно облегчает получение :аллуса.

Следует заметить, что экспланты для вышеупомянутых экспериментов были юлучены из растений Уфимской популяции борца северного. При этом, не-мотря на интенсивное каллусообразование на различных эксплантах, каллус ¡ыл нежизнеспособен при его пассировании.

Как видно из рис. 2, каллусные ткани, полученные из листьев, сердцевинной

паренхимы и корней, показали разную способность к пассированию in vitro. Каллусные ткани, полученных из корней и паренхимы, были жизнеспособны в течение 2-х пассажей, а листовые каллусы - 3-х пассажей.

Листья Корни Сердцевинная паренхима

источник экспланта

Рис. 2. Зависимость жизнеспособности каллусных тканей борца северного

Уфимской популяции от типа экспланта и условия культивирования.

Относительный прирост биомассы также зависел от источника экспланта и после первого пассажа у листового каллуса составил 70%, паренхимного - 75%, корневого - 60%. Попытки повышения жизнеспособности за счет изменения компонентов питательной среды не увенчались успехом.

Известно, что каллусные ткани представляют собой гетерогенную популяцию клеток, различающихся по уровню плоидности и другим характеристикам [Бутенко, 1999]. Изменение условий культивирования каллусов в ряде случаев может привести к изменению популяционного состава клеток, составляющих каллусную ткань.

С целью повышения жизнеспособности каллуса мы решили изменить условия культивирования, в частности, выращивать их на свету. Из рис. 2 видно, что жизнеспособность всех типов каллусов повышалась в среднем на один пассаж при культивировании на свету по сравнению с вариантами, культивируемыми в темноте.

Также необходимо отметить, что при культивировании на свету изменялась

и морфология каллусных тканей. Если в темноте каллусы, как правило, представляли собой однородную, слегка оводненную желтоватую массу, то при культивировании на свету консистенция каллуса уплотнялась и принимала вид крепкоспаянных между собой мелких гранул. При этом ни один тип каллуса не был способен к позеленению при культивировании на свету, несмотря на то, что возраст каллуса небольшой. По-видимому, это обусловлено тем, что про-пластиды каллусных тканей борца северного утратили способность к диффе-ренцировке в хлоропласты. В то же время, например, из восемнадцати линий каллусной ткани солодки голой, шесть лет пассировавшейся in vitro, семнадцать линий сохранили, хоть и в разной степени, способность зеленеть на свету [Валиева, 1999].

Из литературных данных известно, что инициация каллусообразования из растений рода Aconitum проводилась и в других лабораториях. Но, как отмечали японские исследователи [Hatano et al., 1987], полученный каллус отличался низкой жизнеспособностью и не был способен к длительному пассированию in vitro. Необходимо отметить, что А.И.Иванцовым и др. [1988] была инициирована каллусная ткань борца северного, которая оказалась жизнеспособной и поддерживается в культуре in virto уже в течение 12 лет. Однако этот успех оказался трудновоспроизводимым. Второй успешный опыт по длительному пассированию был проведен на борце белоустом [Мардамшин и др., 1997]. Каллус был получен из зрелых зародышей и успешно культивируется в течение 4-х лет.

Ранее было показано различие по ряду фенотипических признаков и изо-ферментному составу борца северного, произрастающего в географически удаленных популяциях на территории Башкортостана [Федоров и др., 1999].

Нельзя исключить возможность того, что причиной неудачного введения в культуру являлась генетическая гетерогенность популяций борца северного, произрастающего на территории Башкортостана. Основанием для такого предположения являлись результаты экспериментов, проведенных на некоторых видах культурных растений, таких как ячмень, люцерна и др., показавших влия-

Hile генотипа (различные сорта) на способность к длительному культивированию in vitro [Бородько и др., 1991; Чеченева, Труханов, 1994; Хотылева, 1996]. Исходя из вышесказанного, следующим этапом работы являлось изучению полиморфизма борца северного, произрастающего в разных популяциях башкирского Предуралья методом полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров (RAPD-PCR).

2.2. Анализ генетической гетерогенности популяций борца северного

Одной из характерных особенностей борца северного, произрастающего в башкирском Предуралье, является резко выраженное разнообразие по морфологическим признакам. Большое разнообразие отмечалось и для европейских популяции этого вида растений [Utelli et al., 1986].

Мы провели сравнительный анализ растений трех популяций борца северного методом полимеразной цепной реакции с использованием 98 случайных праймеров, имеющих произвольную последовательность (GC-состав 50-70%) длиной 10-11 нуклеотидов (табл. 2). В этой таблице также приведено описание Уфимской популяции, растения которой использовались в экспериментах, описанных в разделе 2.1. В результате проведенных исследований был обнаружен полиморфизм по 13-и праймерам. (табл. 3.). Количество образованных ДНК-ампликонов варьирует от 2 до 8, а их размеры от 0.8 до 2.8 тпн.

Таблица 2

Характеристика четырех популяций Aconitum septentrionale К. Предуралья Башкирии.

NN Географическое местоположение Расстояние от г.Уфы (км) Характеристика растительного сообщества Характеристик площадок

1 Ашинский район 120 (восток) Хвойно-широколиственный лес Слабый склон

2 Чишминский район 40 (запад) Широколиственный лес Лесной овраг

3 Благовещенский район 60 (север) Широколиственный лес, вырубка Выровненная местность

4 Уфа - Широколиственный лес Слабый склон

Полученные результаты демонстрируют межпопуляционные различия борца северного на генетическом уровне. При этом следует подчеркнуть высокую частоту изменений первичной структуры ДНК. К этому заключению можно прийти, учитывая тот факт, что из испытанных 98 случайных праймеров различия наблюдались по 13 из них. Данные изменения могли быть обусловлены как мутациями (точковые мутации, инсерции, делеции), так и рекомбинационными процессами.

Таблица 3

Характеристика ДНК-ампликонов

Праймер Размер ДНК- Популяция

ампликона, тпн Чишминская Благовещенская Ашинская

1 2 3 4 5

2.8 + - +

2.65 - + +

5 ТвСТС АС АО АЗ 2.6 2.2 + + +

2.15 + - -

1.85 + + +

1.65 - - +

2.1 + - +

1.85 + + +

1.5 + + +

ЗАТССССТАОАОЗ 1.3 1.2 + + -4-

1.1 + - -

0.95 - - +

0.8 + + +

1.45 - + +

5СССТСАААСАСЗ 1.35 1.05 + + + +

1 - + -

1.85 + - -

1.65 + - +

5ССАСТТССАТАЗ 1.45 - - +

1.15 + + +

1.05 + - -

2.0 + + +

1.7 + + +

5ССОААССССТЗ 1.6 1.35 + + +

1.25 + + +

1.05 + +

Продолжение таблицы!

1 2 3 4 5

1.4 + - +

1.2 + + +

5ССАСОАСОАТЗ 1.05 + + +

0.95 - + -

0.9 + - -

2.4 + + +

1.8 + - +

1.75 - + -

5СССАССТСТСЗ 1.65 1.6 + + -

1.5 + + -

1.4 + + -

1.15 - + -

1.8 + - -

1.65 + - +

5ААОАОСССТСЗ 1.3 + + +

1.2 - + -

1.05 + + +

2 + - -

1.85 + + +

50ТССАСАСС03 1.7 + + -

1.1 - + -

0.9 - - +

2.3 + + +

2.05 + + +

1.6 + + -

5АССССТТСАОЗ 1.5 - - +

1.25 - + -

1.1 + - -

1.05 - - +

1.45 - + -

5 ССААС СГС йТЗ 1.15 1.05 + + + +

1.0 + + -

2.35 + + +

2.0 + + +

5СОТСТААСОСТЗ 1.75 1.2 + + + + +

1.0 - - +

0.9 + + -

Эти результаты дают основание рекомендовать использование КАРБ-РСЯ при анализе популяций борца северного как более чувствительного метода по сравнению с оценкой полиморфизма по белковым маркерам.

2.3. Сравнительный анализ жизнеспособности каллусных тканей борца северного, полученных из различных популяций

Генетически различающиеся растения борца северного Чишминской, Благовещенской, Ашинской популяций (см. разд. 2.2) отличались между собой и по содержанию лаппаконитина как в надземной, так и в подземной частях (табл. 4). Наивысшее содержание лаппаконитина в листьях, сердцевинной паренхиме и корнях было характерно для растений Благовещенской популяции, а наименьшим для всех трех объектов исследования оно было для Чишминской выборки. Растения Ашинской популяции по содержанию данного алкалоида были более близки к растениям Благовещенской популяции. Следует отметить, что ни в листьях, ни в сердцевинной паренхиме, ни в корнях дезацетиллаппако-нитин не детектировался, что отличало растения этих популяций от растений Уфимской популяции (см. разд. 2.1).

Инициацию каллусообразования удалось осуществить из трех типов экс-плантоврастений A. septentrionale трех изучаемых популяций. Каллусная ткань, полученная из листьев и сердцевинной паренхимы, была рыхлой, слегка овод-ненной светло-серого цвета. Каллус, полученный из корневых эксплантов, был более плотной консистенции, светло-желтого цвета.

Таблица 4

Содержание лаппаконитина в растениях трех популяции Aconitum septentrionale К.

Популяция Содержание лаппаконитина (%)

Листья Сердцевинная паренхима Корни

Чишминская 0.25 0.17 1.27

Ашинская 0.31 0.33 1.84

Благовещенская 0.35 0.45 1.95

Примечание. В таблице представлены средние арифметические значения. Аналитическая погрешность измерения концентрации лаппаконитина методом ВЭЖХ составляла 3-5%.

Как видно из таблицы 5, исследуемые популяции отличались как по частоте каллусообразования на различных зксплантах, так и по жизнеспособности каллуса. Каллусные ткани, инициированные из листа, сердцевинной паренхимы и корней растений борца северного Чишминской популяции, были жизнеспособны в течение 5-и пассажей, а каллусная ткань листового происхождения успешно культивируется в течение 14-и пассажей. В то же время каллус, полученный из корней растений Ашинской популяции, погибал уже после 1-го пассажа, а каллусные ткани, инициированные из листа и сердцевинной паренхимы - после 3-го. Наименьшей жизнеспособностью характеризовался каллус из всех типов эксплантов растений Благовещенской популяции - он погибал в течение 2-х пассажей.

Таблица 5.

Частота каллусообразования и жизнеспособность каллусов, полученных из растений трех популяций борца северного.

Популяция Лист Сердцевинная паренхима Корень

Ч.К. Пассаж Ч.К. Пассаж Ч.К. Пассаж

% 1 2 3 4 5 % 1 2 3 4 5 % 1 2 3 4 5

1 85 + + + + + 83 + + + + + 37 + + + + +

2 31 + + + - - 81 + + + - - 5 + - - - -

3 95 + + - - - 10 + - - - - 69 + + - - -

Примечание: Ч.К. - частота каллусообразования - отношение количества эксплантов на которых произошло каллусообразование, к общему числу высаженных эксплантов.

1 - Чишминская популяция; 2 - Ашинская популяция; 3 - Благовещенская популяция.

Поскольку содержание лаппаконитина в трех типах эксплантов был наименьшим у растений Чишминской популяции (см. табл. 3.), можно предполо жить, что жизнеспособность каллусных тканей зависела от содержания данной алкалоида. Необходимо, однако, отметить, что хотя жизнеспособность каллус ных тканей листового происхождения (Чишминская популяция) выше, чем ;

[ем у каллусов, полученных из сердцевинной паренхимы, содержание лаппако-штина в листьях было выше, чем в паренхиме.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что :уществующий межпопуляционный полиморфизм (на генетическом уровне, а акже по уровню содержания лаппаконитина, который, возможно, генетически (етерминирован) оказывает влияние на способность клеток борца северного к (лительному пассированию in vitro. Кроме того, по-видимому, жизнеспособ-юсть каллусов также зависит от эпигенетической характеристики экспланта, госкольку наиболее жизнеспособной оказалась каллусная ткань, инициирован-[ая из листьев растений Чишминской популяции. Нельзя исключить юзможность того, что изменение условий культивирования, в частности, ком-юнентов питательной среды, позволит получить каллусную ткань, способную : длительному культивированию, из корней и паренхимы растений Чишмин-кой популяции.

2.4. Характеристика каллусной ткани борца северного

Дальнейшие исследования были проведены на каллусной ткани, получен-юй из листьев растений Чишминской популяции. Характерной особенностью :аллуса является его побурение через 3-4 часа после пересадки (впрочем это вносится к культивируемым клеткам, полученным и из корней, а также серд-(евинной паренхимы). Только через определенный промежуток времени (не-колько суток) начинается видимый рост светлого каллуса. При этом необхо-(имо отметить, что с увеличением количества пассажей продолжительность того периода сокращается: в первые 8 пассажей он составлял 12-14 суток, а [ачиная с 9го - 7-8 суток. Это привело к тому, что относительный прирост сы-юй биомассы каллуса в 14-ом пассаже стал составлять 192%. По всей видимо-;ти, по мере культивирования происходит отбор клеток у которых в меньшей :тепени происходит синтез и выделение фенольных соединений. Аналогичная :артина наблюдалась и у каллусной ткани борца белоустого. Только через 11

пассажей удалось получить светлый, относительно быстрорастущий каллу (относительный прирост 160-180%). Однако эта каллусная ткань, в отличие о каллусной ткани борца северного, не бурела после пересадки. Выделение по лифенолов у них начинало происходить лишь на 22-25 сутки от начала суб культивирования [Валиева и др., 1988].

Содержание лаппаконитина в каллусной ткан: борца северного определяли хроматографическ] (Рис. 3). Проведенные расчеты показали, что кон центрация данного алкалоида составила примерц 0,0002%. При этом дезацетиллаппаконитин не де тектировался. У каллусной ткани борца белоустогс наоборот, в 1-й год культивирования содержани дезацетиллаппаконитина и лаппаконитина бьиг примерно равным и составляло 0,0003% и 0,0004°/ а в 3-летнем каллусе содержание этих алкалоидо составляло 0.0005% и 0.0002% соответственнс Необходимо отметить, что в 6-летнем каллус борца белоустого произошло увеличение содержа ния лаппаконитина (0.0003%), а его дезацетилирс ванная форма практически не детектировалась [Валиева и др., 1998].

Уменьшение содержания искомого алкалоида в культуре тканей борц северного по сравнению с целыми растениями (см. табл. 4) не являете неожиданным. Известно, что в каллусных и суспензионных культура снижение концентрации продуктов вторичного метаболизма происходит ка минимум на порядок, хотя имеются и исключения. При этом достаточно част на первых этапах культивирования многие метаболиты хроматографически н детектируются [Бутенко, 1996; Носов, 1991].

Не исключено, что в определенной степени уменьшение концентраци: вторичных метаболитов связано с изменением генома свободноживущи клеток. Известно, что в каллусных и суспензионных культурах происходит из

Н

1

2,03 т

:ин

Рис. 3. Хроматограмма дитерпенового алкалоида лаппаконитин каллусной ткани борца северного.

менение уровня плоидности. При этом степень нестабильности кариотипа клеток зависит как от вида растения, так и от продолжительности их культивиро-зания in vitro. В целом для свободноживущих клеток растений характерно увеличение плоидности [Кунах, 1999].

Из литературных данных также известно об изменении уровня метилирова-гая ДНК в клетках, культивируемых in vitro, по сравнению с целыми шстениями. Так, метилирование 18S-25S рибосомальных генов в каллусной :кани петунии было ниже, чем у растений [Anderson et al., 1990]. В целом считается, что при культивировании in vitro наблюдается тенденция к уменьшению

метилированных остатков цитозина [Peschke and Phillips, 1992]. Кроме того, изменения происходят и в митохондриальном геноме. Эти изменения касаются как высокомолекулярной мт ДНК, так и плазмидо-подобных мт ДНК [Мардамшин, 1999].

Для исследования стабильности генома каллусной ткани борца северного был проведен RAPD-PCR анализ препаратов ДНК, выделенных из листьев и каллусной ткани с использованием случайных прай-меров, по которым не был обнаружен меж-популяционный полиморфизм. Наиболее яркие различия были получены при использовании случайного праймера 5AACAGCTATGACCAT3 (Рис. 5). Как

1 2 3 видно из этого рисунка, в каллусной ткани

Рис.5. Электрофорез в 1.5%-ном ага-

произошли существенные изменения в ге-розном геле ДНК-ампликонов, полу- р J

номе. Если в результате полимеразной цеп-

п.о

5.08 4.75 : 4.51 '

2.84 ■ 2.56 . 2.45 ' 2.14 : 1.99 1.70 '

1.16 1.09

0.81

-Л-

ченных в результате ПЦР с помощью праймера

1 -ДИКХ-фага + РвИ

2 - ДНК растения

3 - ДНК каллусной ткани

ной реакции препаратов ДНК растений образуется 4 ДНК-ампликона, имеющих

примерный размер 1.6, 1.2, 1.0, 0.81 тпн, то в случае каллусной ткани числ( ДНК-ампликонов составляет 2 размером 0.95, 0.81 тпн.

3. Заключение

Клетки растений, культивируемые in vitro, являются перспективным источ ником продуктов вторичного метаболизма, имеющих практическую значимость. Расширение количества видов растений, вводимых в культуру, изучение особенностей образования каллусов на эксплантах и факторов, повышающи> частоту каллусообразования, а также изучение условий, определяющих способность клеток и тканей к длительному выращиванию на искусственных питательных средах, позволят иметь более реальное представление о биологии клеток, культивируемых in vitro. Это в конечном итоге может привести к увеличению количества суперпродуцентов биологически активных соединений, имеющих практическую значимость.

В результате проведенной работы нам удалось оптимизировать процесс получения каллусной ткани из различных частей такого трудного объекта, как борец северный. Использование эксплантов на начальных этапах его развития позволило избавиться от выделения полифенолов при индукции каллусообразования. При получении каллусных тканей лекарственных растений, способных к длительному культивированию in vitro, успех. главным образом достигался за счет увеличения количества высаживаемых эксплантов. Использование современных методов физико-химической биологии, позволяющих на генном уровне отбирать различающиеся особи, дает основание для более целенаправленного отбора экземпляров растений для введения в культуру. Методом полимеразной цепной реакции был обнаружен полиморфизм по количеству и размеру ДНК-ампликонов трех популяций борца северного на территории башкирского Пре-дуралья. Это послужило основанием для сравнительного анализа жизнеспособности каллусных тканей, полученных из растений различных популяций. Данный подход позволил получить жизнеспособную каллусную ткань борца северного. Нельзя исключить возможность того, что при более детальном анализе с

¡спользованием данного подхода будет выявлен внутрипопуляционный поли-горфизм борца северного. Контрастные формы в будущем могут быть полезны ля дальнейших исследований генетики культивируемых клеток этого вида ле-арственного растения как потенциального продуцента дитерпеноида лаппако-итин.

Высокочувствительный метод RAPD-PCR оказался достаточно адекватным ри сравнительном анализе генома каллусной ткани и растений борца северно-о, что позволило выявить существенные его изменения уже через 14 пассажей, (озможно, это является одной из причин резкого снижения содержания лаппа-онитина в культивируемых клетках этого вида растений.

4. Выводы

. Установлено, что при индукции каллусообразования на эксплантах, полученных от растений борца северного, на начальных этапах его развития не происходит обильного выделения полифенолов. Это обуславливает образование жизнеспособного первичного каллуса на листовых, стеблевых и корневых эксплантах растений четырех исследованных популяций Aconitum septentrionale К.

. Методом RAPD-PCR продемонстрирован высокий уровень генетического полиморфизма трех популяций борца северного: различие по количеству и размеру ДНК-ампликонов наблюдалось по 13-ти праймерам из 98-ми, использовавшихся в исследовании. . Показано, что каллусные ткани борца северного, полученные от растений различных популяций, отличаются по способности к длительному культивированию in vitro. Можно полагать, это свойство зависит от генотипа растений.

. Показано, что сравнительный анализ межпопуляционных различий с использованием полимеразной цепной реакции может быть использован при

отборе эксплантов различных видов лекарственных растений для успешног введения их в культуру in vitro. 5. Методом полимеразной цепной реакции с использованием случайног праймера установлено, что при культивировании клеток борца северного i vitro происходят изменения на генетическом уровне.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мигранова И.Г., Лукичева И.А., Мардамшин А.Г. Каллусообразование и различных органов борца северного // Тезисы докладов Международной ков ференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение ге нофонда».Москва.-1997.-С.40-41.

2. Мигранова И.Г., Лукичева И.А., Мардамшин А.Г. Простой способ изба! ления от полифенолов при индукции каллусообразования борца северног (Aconitum septentrionale К.) // Тезисы докладов Международной конференци: «Состояние и перспективы развития биотехнологии растений». Алматы.-1997. ■ С.23-24.

3. Мигранова И.Г., Мардамшин А.Г., Старухин Ф.Н., Лукичева И.А. Опта мизация условий получения каллусной ткани борца северного // Биотехнолс гия.-1997.-М9-10.-С.24-26.

4. . Мигранова И.Г., Лукичева И.А., Мардамшин А.Г. Некоторые особенна сти каллусной ткани борца северного // Материалы конференции биохимико Урала и Западной Сибири. Уфа.-1998.-С.222-223.

5. Мигранова И.Г., Лукичева И.А., Мардамшин А.Г. Культура клеток ако нита как источник новых алкалоидов // Сборник докладов «Современные про блемы естествознания на стыках наук». Уфа.-1998.С.106-107.

6. Мигранова И.Г., Лукичева И.А., Мардамшин А.Г. Получение и характе ристика каллусной ткани борца северного // Материалы Международной кон ференции «Молекулярная генетика и биотехнология». Минск.-1998.-С.230-231.

7. Мигранова И.Г., Лукичева И.А., Мардамшин А.Г. Исследование способности каллусной ткани борца северного к длительному культивированию in vitro.// Материалы Международной конференции «Молекулярная и клеточная биология на рубеже веков». Алматы.-1999.-С.59.

8. Мигранова И.Г., Уразбахтина H.A., Сидорова Л.В., Лукичева И.А., Чура-св P.II., Мардамшин А.Г. Сравнительный анализ жизнеспособности каллусных тканей, полученных из растений борца северного различных популяций // Био-технология.-2000.-№2.-С.44-47.

Отпечатано в типографии издательства БИРО. 450005, Уфа, ул. Мингажева, 120. Лиц. № Б 848151 МПиМИРБ от 15.05.98.

Подписано в печать 25.05.2000. Бумага ксероксная. Формат 60x80 1/16. Отпечатано на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ 102.