Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование можжевельника сибирского (Juniperus sibirica B.) в условиях in vitro и получение биологически активных веществ на его основе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование можжевельника сибирского (Juniperus sibirica B.) в условиях in vitro и получение биологически активных веществ на его основе"

На оравах рукописи

Аёшина Екатерина Николаевна

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА СИБИРСКОГО (JUNIPERUS S1BIRICA В.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO И ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ЕГО ОСНОВЕ

03,00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

f

Красноярск - 2006

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии.

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Величко Надежда Александровна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Воинов Николай Александрович кандидат биологических наук, доцент Хижняк Сергей Витальевич

Ведущая организация: Красноярский научно-исследовательский институт сельского хозяйства

Защита диссертации состоится «29» июня 2006 г. в 13 00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.253.01 при ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет», по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 82.

Отзыв (в двух экземплярах с заверенными подписями) просим направить ученому секретарю диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет»

Автореферат разослан «26 » мая 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат химических наук, доцент Исаева Е. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы *

С каждым годом возрастает потребность в лекарственных препаратах. Несмотря на успехи химии, давшей медицине много новых эффективных синтетических препаратов, использование лекарственных растений приобретает все большие масштабы. Становится очевидным необходимость поиска альтернативных источников биологически активных веществ. На современном этапе развития биотехнология может предложить новые решения этой проблемы, благодаря появлению культуры тканей и клеюк высших растений.

Куль гура клеток растений, как один из разделов биотехнологии, является не только одним из альтернативных источников необходимых биологически активных веществ, но и нетрадиционным методом охраны и восстановления генофонда лекарственных растений Длительное микрочеренкование in vitro является одним из путей упрощения и повытпетя эффективности микроклонального размножения ценных пород Можжевельник сибирский является уникальным видом, представляющим интерес для озеленения и получения ценных биологически активных веществ, в том числе фармакологически значимого соединения подофиллотоксина. Традиционные способы восстановления и переработки можжевельника не обеспечивают высокие потребительские свойства производимой продукции.

Таким образом, создание ресурсосберегающей технологии микроклонального размножения Jumperus sibirica В. в условиях т vitro и получения практически значимых биологически активных веществ является актуальной задачей.

* Выражаю благодарность доктору биологических наук, профессору Третьяковой Ираиде Николаевне за оказанную помощь при выполнении диссертационной работы

fift., НА It'- ' " • Н

: бив- ■ сл.

оэ . SBZ'

Цель работы. Разработка технологии микроклонального размножения Juniperus sibirica В. в условиях т vitro и получение подофиллотоксина на его основе Основные задачи работы:

1 Введение в культуру in vitro интактного растения Juniperus sibmca В.

2 Микроклональное размножение Juniperus sibirica В. в условиях in vitro

3 Изучение влияния экзогенных регуляторов рос га на процесс каллусогенеза у различных видов эксплантов Juniperus sibirica В

4 Получение стабильно растущих каллусных тканей Juniperus sibirica В.

5 Исследование влияния индуцирующих факторов на выход подофиллотоксина в каллусной ткани Juniperus sibirica В.

6 Изучение химического состава хвои и каллусной ткани Juniperus sibirica В.

7 Разработка принципиальной схемы выделения подофиллотоксина из хвои и каллусной ткани Juniperus sibirica В,

Научная новизна. В работе впервые разработана 1ехнология микроклонального размножения Juniperus sibirica В. в условиях in vitro. Подобраны физико-химические условия, обеспечивающие высокие темпы роста и накопления продуктов вторичного метаболизма в каллусной ткани Juniperus sibirica В В качестве альтернативного источника для получения подофиллотоксина была использована каллусная ткань Juniperus sibirica В., полученная в условиях in vitro

Практическая значимость работы. На основе результатов экспериментальных исследований разработана технология микроклонального размножения можжевельника сибирского в условиях in vitro, которая позволяет быстро и эффективно получать элитный посадочный материал Проведен технико-экономический расчет стоимости элитного посадочного материала.

Предложена принципиальная схема получения подофиллотоксина из хвои и каллусной ткани Juniperus sibirica В

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийской научно-практической конференции "Химико-лесной комплекс - проблемы и решения" (Красноярск, 2002), XI съезде Русского ботанического общества "Ботанические исследования в азиатской России" (Новосибирск - Барнаул, 2003), Всероссийской научно-практической конференции "Лесной и химический комплексы: проблемы и решения" (Красноярск, 2003, 2004), VIII International Conference " The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology" (Saratov, 2003), Международной конференции "Физиология растений - основа фитобиотехнологии" (Пенза, 2003), Межрегиональной научно-практической конференции "Здоровое питание - основа жизнедеятельности человека" (Красноярск, 2006).

На защиту автором выносятся: ресурсосберегающая технология микроклонального размножения, позволяющая восстанавливать естественный ареал Jumperus sibirica В., и условия культивирования, обеспечивающие накопление подофиллотоксина в клеточной биомассе в условиях in vitro. Принципиальная схема получения подофиллотоксина из клеточной биомассы и хвои.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в которых изложено основное содержание проведенных исследований

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на J 51 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка, 15 таблиц. Работа содержит введение, пять глав, общие выводы, библиографический список, состоящий из 143 наименований и 6 приложений.

Основное содержание работы.

Введение. Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, ее вклад в решение задачи поиска альтернативных технологий, позволяющих получать биологически активные вещества растительного происхождения.

Аналитический обзор. В аналитическом обзоре проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по изучению химического состава растений рода Jumperus Рассмотрены методы культивирования изолированных органов и тканей хвойных растений в условиях in vitro и влияние различных групп фитогормонов на физические и морфогенетические программы растений. Особое внимание уделено использованию метода культуры клеток и тканей для селекции хвойных при размножении и выращивании элитного посадочного материала различных видов Большое развитие получил метод культуры клеток для синтеза продуктов вторичного метаболизма, производство которых в химических условиях либо экономически невыгодно, либо вообще невозможно Одним из таких веществ является подофиллотоксин, химический синтез которого трудно выполним и экономически невыгоден. Поэтому имеет большое практическое значение разработка способа культивирования Jimiperus sibirica В, позволяющего с большей эффективностью накапливать биомассу, содержащую подофиллотоксин.

Методы проведения эксперимента. В этом разделе дана характеристика объекта исследования Приведены описания методик, используемых для изучения химического состава хвои и каллусной ткани Jumperus sibirica В. Описаны условия введения в культуру эксплантов и получения каллусной культуры Jumperus sibirica В. Приведены методики для опенки физиологического состояния культуры

Экспериментальная часть.

Введение в культуру Jumperus sibirica В Обязательным условием для микроклонального размножения является использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность. Этому условию удовлетворяют пазушные почки органов стеблевого происхождения, Поэтому в качестве исходного материала для получения изолированных культур были выбраны вершины побегов размером 15-20 мм.

На начальном этапе исследования важно было подобрать оптимальные условия для стерилизации эксплантов Juniperus Sibmca В. В результате эксперимента было установлено, что наиболее эффективным стерилизующим раствором оказался 0,1 %-й раствор диацида с добавлением твина-80 (1-2 капли на 1 л) при продолжительности экспозиции эксплантов можжевельника сибирского в течение 25 мин. Эффективность стерилизации при этих условиях составила 97,50 %. При проведении дальнейших экспериментов использовали эти условия стерилизации.

Стерильные однолетние побеги Jumperus sibmca В. вводили на агаризованные питательные среды с минеральным составом по Murashige and Skoog (1962), Schenk and Hildebrandt (1972), Uata (1939), Knop (1865) и Sierlis (1964) без добавления гормонов. Полученные результаты эксперимента показали, что наиболее благоприятной для культивирования эксплантов оказалась питательная среда, содержащая соли по Murashige and Skoog (MS) с добавлением 30 г/л сахарозы и витаминов: пиридоксина (Вб), тиамина хлорида, ниацина в количестве по 1 мг/л.

Микроклоналъиое размножение. Стерильные побеги Jumperus sibirica В. вводили на стандартную среду MS с 0,2 мг/л " Вирозола "(рисунок 1а).

Рисунок 1- Этапы микроклонального размножения Jumperus sibirica В.

Следующим важным моментом в процессе микроклональпого размножения было подавление апикального доминирования у эксплантов Juniperus sibirica В и стимуляция роста пазушных почек. Для достижения этой цели вводили в питательную среду гормоны ауксинового и цитокининово! о типа.

На всех средах с содержанием 6-БАП в концентрации от 0,1-1,0 мг/л происходила стимуляция роста пазушных почек. В зависимости от концентрации гормона 6-БАП в среде развитее пазушных почек происходило либо у основания экспланта, либо по всему эксплангу. Наибольшее количество побегов было получено на среде с макро- и микроэлементами по MS с добавлением 0,1 мг/л 6-БАП (рисунок J б)

На следующем этапе полученные микропобеги в стерильном боксе отделяли скальпелем от экспланта и помещали на свежую питательную среду. Для вырашивания побегов в среду MS были добавлены регуляторы pocia в различных концентрациях и сочетаниях. Наибольший прирост побегов (1,8 см) в высоту наблюдался на питательной среде с содержанием а-НУК (0,1 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л) (рисунок 1в).

В работе по стимуляции ризогенеза у побегов ./ sibirica В варьировали концентрацией гормонов и составом питательных сред. Ризогенсз наблюдали на побегах J sibirica В, культивируемых сначала на среде Uata с добавлением ИУК (0,05 мг/л) в течение месяца, за г ем на среде MS/2 в течение трех месяцев. Появление первых корней на эксплантах J sibirica В охмечали к концу 15-й недели (рисунок 1д). Образование корней происходило на безэпитальной части побега. Максимально достигнутый процент укоренения no6ei ов J. sibirica составил 17,50 %.

Процесс адашации пробирочных растений к почвенным условиям являе1ся сложной операцией. Поэтому при пересадке растений-регенерантов были созданы условия, идентичные с их развитием в условиях in vitro. На основании полученных результатов разработана блок-схема

микроклонального размножения, которая представлена на рисунке 2.

В качестве эксплантов для получения изолированных культур были взяты вершины побегов Мтрегия вМпса В Стерилизацию побегов проводили в стерильном ламинар-боксе В качестве стерилизующего агента использовали 0,1 % - й раствор диацида с добавлением твина-80 (I -2 капли на 1 л), продолжительность экспозиции 25 мин. Далее побеги отмывали в дистиллированной воде трижды по 15 мин.

Стерильные экспланты помещали в пробирки со стерильной питательной средой, содержащей макро- и микроэлементы по МБ с добавлением 0,2 мг/л " Вирозола 30 г/л сахарозы, витаминов -пиридоксина (В6) в количестве - 1 \л /л. тиамина хлорида (В]) 1 мг/л и ниацина - 1 мг/л. Содержание агара в средс составляло 7 г/л. Экспланты культивировались при фотопериоде- 16 ч день и 8 ч ночь, при температуре 20 -25 °С

Рисунок 2 - Блок-схема микроклонального размножения Зитрегив яЛтса В.

На следующем этапе микроклонального размножения у эксплантов .Juniperus sibirtca В необходимо было подавить апикальное доминирование и стимулировать развитие пазушных почек, что было достигнуто на среде с макро- и микроэлементами по MS с добавлением 0,1 мг/л 6-БАП, 30 г/л сахарозы, витаминов - пиридоксина (Be) в количестве - 1 мг/л, тиамина хлорида (Bi) - 1 мг/л и ниацина - 1 мг/л Культивирование проводили в течение двух месяцев

Развившиеся из почек побеги в стерильном боксе отделяли скальпелем oi экспланта и помещали на агаризованную среду в пробирки для выращивания Питательная среда содержала макро- и микроэлементы по MS с добавлением витаминов, сахарозы, агара и регуляторов роста 6-БАЛ (0,5мг/л) и а-НУК (0.1 мг/л). Побеги культивировали на данной питательной среде в течение двух месяцев. Для индукции ризогенеза использовали двухстадийную систему культивирования. На первой стадии культивировали на стандартной среде Uata с добавлением ИУК (0,05 мг/л) в течение месяца, затем MS/2 в течение трех месяцев. Процент укоренившихся в условиях in vitro побегов составил 17,50 %

Полученные растения осторожно вынимали из пробирок, корневую систему побегов отмывали от агара дистиллированной водой, помещали в горшочки для рассады, на 1/3 заполненные горфо-перлитной смесью в соотношении 1 ■ 2, и накрывали полиэтиленовыми изоляторами. Горшочки с растениями помещали в теплицу с температурным режимом (22 ± 1) °С и относительной влажностью 60 % Количес1во адаптированных растений на данном этапе составило 91,60 %.

Проведенные технико-экономические расчеты показали экономическую целесообразность микроклонального размножения в условиях т vitro. Рентабельность предприятия составила 25,7 %

Инициаиш каллусогенеза. Известно, что наиболее важными компонентами питательной среды, определяющими каллусогенез, являются регуляторы роста Модификации подвергается в первую очередь

гормональная составляющая питательной среды, в связи с этим основной целью этого этапа было изучение влияния экзогенных регуляторов роста на каллусогенез и рост культуры клеток можжевельника сибирского.

При исследовании роли гормонов в индукции каллусогенеза было исследовано 25 модификаций питательной среды МБ, которые охличались качественным составом и количественным содержанием регуляторов роста (таблица 1).

Таблица 1 - Влияние гормонов на каллусогенез Зитрегш ягЬМса В.

Среда Концентрация гормона, мг/л Общее число эксплантов, шт. Частота каллусогенеза, % 1 Начало каллусогенеза, сут.

1 2 3 4 5

А-0 Без гормонов 20 - -

А-1 2,4-Д, 0,1 20 70 18-30

А-2 2,4-Д, 0,2 20 100 8-35

А-3 2,4-Д, 0,4 20 95 8-35

А-4 2,4-Д, 0,6 20 90 10-35

А-5 2,4-Д, 0,8 20 80 16-35

А-6 2,4-Д, 1,0 20 70 16-35

Б-1 а-НУК, 0,1 20 60 21-35

Б-2 а-НУК, 0,2 20 75 22-35

Б-3 а-НУК, 0,4 20 45 22-35

Б-4 а-НУК, 0,6 20 15 25-35

Б-5 а-НУК, 0,8 20 10 24-35

Б-6 а-НУК, 1,0 20 10 24-35

В-1 КИН, 0,1 20 30 27-35

В-2 КИН, 0,2 20 35 27-35

В-3 КИН, 0,4 20 20 23-35

В-4 КИН, 0,6 20 0 -

В-5 КИН, 0,8 20 0 -

В-6 КИН, 1,0 20 30 24-35

Г-1 6-БАП, 0,1 20 20 27-35

Г-2 6-БАП, 0,2 20 20 27-35

г-з 6-БАГ1, 0,4 20 25 15-35

Г-4 6-БАП, 0,6 20 0 -

Г-5 6-БАП, 0,8 20 15 27-35

Г-6 6-БАП, 1,0 20 15 27-35

Начало каллусообразовапия на различных средах варьировало от 8 до 27 су1. На среде, не содержащей регуляторов роста, инициации каллусной ткани не наблюдалось Присутствие в питательной среде экзогенного регулятора 2,4-Д оказало наибольшее влияние на процесс инициации каллусогенеза.

Для получения каллусной кулыуры были использованы экспланты разных органов растения Каллусогенез инициировали из эксплатов хвои, почек, сегментов стебля и побегов на средах с различными концентрациями 2,4-Д (рисунок 3).

Результаты эксперимента показали, что первичный каллус удалось получить из всех типов эксплантов, но не на всех средах Инициирование каллусной ткани из хвои .¡ишрегш .ч/Ьтса В наблюдали только на среде с добавлением 2,4-Д в количестве 0,6 мг/л (рисунок За). Каллусогенез из эксплантов почек и побегов можжевельника сибирского наблюдался на многих средах (рисунок 36, Зв).

Рисунок 3 - Каллусогенез из различных эксплантов Jumperus sibmca В.

Таким образом, в результате проведенного эксперимента установлено, что эффективность каллусообразования зависит не только от вида эндогенного регулятора роста и его концентрации, но и от типа экспланта Лучшими эксплантами для индукции каллуса оказались побеги и почки J sibmca В., менее эффективными - сегменты стебля

а

б

в

г

Получете каллусных культур. Для получения каллусных культур первичные каллусы переносили на свежие агаризованные питательные среды. Культивирование проводили на трех питательных средах: ОД мг/л 2,4-Д; 0,2 мг/л 2,4-Д; 0,2 мг/л 2,4-Д + 0,2 мг/л кинетина. Продолжительность культивирования составляла 45 сут.

Динамика роста каллусной ткани в зависимости от продолжительности культивирования приведена на рисунке 4 В качестве контроля была использована безгормональная среда. В процессе культивирования в течение 44 сут среднее увеличение массы произошло в 2,7 раза. В результате проведенного эксперимента установлено, что отсутствие в питательной среде цитокининов, в данном случае кинетина, не приводило к остановке роста ткани

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Продолжительность культивирования», сут

Рисунок 4 - Динамика роста каллусной ткани Мтрегих ыЫпса В на

Полученные результаты свидетельствуют о том, что данную культуру, как и большинство других культур клеток, можно отнести к ауксинозависимой. Однако наличие в среде кинетина имело важное

250 т

А - среда с 2,4-Д

(0,1 мг/л), ■ -среда с 2,4-Д

(0,2 мг/л), • - среда с 2,4-Д (0,2 мг/л) +

0

средах с различным содержанием гормонов

значение, так как взаимодействие ауксина (2,4-Д) с цитокинином (кинетином) обеспечивало более интенсивный рост культуры, чем присутствие в среде только 2,4-Д Максимальное накопление сырой биомассы за ростовой цикл наблюдалось на среде, содержащей 0,2 мг/л 2,4-Д -1- 0,2 мг/л кинетина, и составило 228,5 мг на пробирку

Влияние способа культивирования па рост каллусной ткани Juniperus sibirica В. Известно, что большое влияние на накопление продуктов вторичного метаболизма в условиях in vitro оказывают способы культивирования растительной ткани. Была исследована динамика роста каллусной ткани при поверхностном культивировании на агаре и инертном носителе - пенополиуретане (рисунок 5) с периодическим омыванием ткани питательной средой.

Рост культивируемых на пенополиуретановых подложках растительных клеток отличался по сравнению с культурой на агаре. Наблюдалась более короткая лаг-фаза и более раннее вступление в фазу экспоненциального роста (16-18 сут) и её большая продолжительность. Увеличение клеточной биомассы в 10 раз происходило примерно на 32-е

530

А

I

3 0 0 -*■

200 150

250

350

400 --

100

4 5 0

500

50

а - подложки

• - шаризованная

среда

пенополиуретана

о

О 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 4 8

ГГродотжитсльность культивирования, сут

Рисунок 5 - Динамика роста каллусной ткани .¡итрегих мЬтса В. в зависимости от способа культивирования

сутки, затем рост замедлялся, и к 40-м суткам культивирования культура выходила на стационарную фазу Количество биомассы, полугенной на пенополиуретане, в 2,2 раза больше, чем на агаре. Очевидно, что при культивировании на пенополиуретановых подложках улучшаются условия кислородного обмена и обмена элементами питательной среды.

Было определено содержание подофиллотоксина в каллусной ткани, культивируемой на агаре и пенополиуретановых подложках. Содержание подофиллотоксина в каллусной ткани, выращиваемой на пенополиуретановых подложках, составило 0,0038 % к а.с.м., а на агаре обнаружено лишь следовое количество Полученные результаты свидетельствуют о значительном влиянии способа культивирования на накопление биомассы и продуктов вторичного метаболизма.

С практической точки зрения наибольший интерес для применения в медицинской и пищевой промышленности представляет каллусная ткань, выращенная па пенополиуретановых подложках

Сравнение химического состава каллусной ткани и хвои (таблица 2) показало, что по основным компонентам состав каллусной ткани незначительно отличается от состава хвои

Таблица 2 - Химический состав каллусной ткани и хвои Лтрегш ыЬтса В.

Компонент Содержание, % от а с м

хвоя каллусная ткань

Подофиллотоксин 0,0018+0,00005 0,0038± 0,00005

Экстрактивные вещества 37,46 ± 0,07 36,52 ± 0,35

Легкогидролизуемые полисахариды 13,90 ±0,08 12,46 ±0,10

Трудногидролизуемые полисахариды 24,27 ± 0,01 23,82 ± 0,14

Лигноподобные вещества 19,13 ±0,08 22,41 ±0,34

Протеин 6,77 ± 0,01 7,50 ± 0,32

Зольность 4,77 ±0,06 1 4,50 ±0,12

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что хвоя и каллусная ткань .Титре тя мЬтса В. содержат значительное количество экстрактивных веществ В составе экстрактивных веществ содержится ряд ценных биологически активных веществ, таких как алкалоиды (0,29 % а.с.м.), флавоноиды (0,09 % а.с м.); сапонины (0,31 % а.с.м.); эфирные масла (],92 % а.с.м.); витамины- С, Р, В! (21,78 М1 %, 4,68 мг %, 1,43 мг %); хлорофилл А и В (95,42 мг % и 126,04 мг %); каротин (85,42 мг %).

Разработана принципиальная схема получения подофиллотоксина из хвои и каллусной ткани Литрегия яй/пса В (рисунок 6).

Согласно разработанной технологии хвою и каллусную ткань измельчают до размера частиц 1-5 мм, экстрагируют раствором вода: этанол в соотношении 11 (по объему) Экстракт отфильтровывают для отделения твердой фазы от жидкой Полученный водно-этонольный экстракг концентрируют под вакуумом. В полученный концентрат добавляют смесь дихлорметана с водой (соотношение 1:1) и проводят разделение на фракции. Дихлорметановую фракцию упаривают под вакуумом и обезвоживают. Дихлорметановую фракцию разделяли методом колоночной жидкостной хроматографии В качестве адсорбента предлагается силикагель, элюента - дихлорметан. Полученный экстракт дихлорметана упаривают под вакуумом до уменьшения объема в 100 раз. Далее проводят очистку подофиллотоксина.

Приведены технико-экономические расчеты, которые показали эффективность биотехнологической переработки Литре гш згЫпса В.

В работе предусмотрена утилизация послеэкстракционного остатка хвои и каллусной ткани Литретч эФтса В. методом биоконверсии с использованием дереворазрушающего гриба ПеитШ (Шгеа1и?, Рг.

Химический состав остатка после экстракции и после ферментации представлен в таблице 3.

Дихлорметановый концентрат

Экстракция

Этанояьный эк -

Экстракция _

Хлороформный экстракт

-Ч--

Упаривание под вакуумом

Рисунок 6 - Принципиальная схема выделения подофиллотоксина из Литрегив йЫпса В. В результате ферментативной обработки произошло изменение в

содержании компонентов, но степень изменения их неодинакова

Содержание углеводов, лигниновых веществ уменьшилось, а содержание

протеина увеличилось в хвое в 4,7 раза, в каллусе в 5,6 раза.

Перевариваемость послеэкстракционного остатка хвои и каллуса /итрегих

тЬтса В. после ферментации повысилась на 6,67 % и 7,18 %

соответственно

Этанол

сстракт

Хлороформ

Кристаллы подофиллотоксина

Таблица 3 - Химический состав послеэкстракционного остатка хвои и каллусной ткани Jumperus sibirica В.

Наименование компонента Содержание, % а.с.м.

послеэкстракционный остаток

исходный после ферментации

хвоя каллусная ткань хвоя каллусная ткань

Экстрактивные вещества 9,32 ±0,07 8,15 ±0,03 19,32 ±0,05 19,07 ±0,03

Легкогидролизуемые полисахариды 17,81 ±0,05 14,03 ±0,09 15,13 ±0,01 11,37 ±0,07

Трудногидролизуемые полисахориды 38,34 ± 0,03 40.72 ±0,12 33,27 ± ОД 1 37,93 ± 0,01

Лигниноподобные вещества 27,94 ± 0,08 31,18 ±0,14 21,56 ±0,17 24.86 ±0.21

Протеин 1,08 ± 0,03 1,28 ±0,05 5,04 ±0,07 7,20 ±0,05

Зольные вещее гва 3,61 ±0,01 4,01 ±0,01 4,41 ±0,03 4,93 ±0,01

Обогащенный протеином нослсэкстракционный остаток хвои и каллусной ткани можно рекомендовать в качестве кормовой добавки.

Основные результаты работы

1 Впервые подобраны условия для введения в культуру in vitro Jumperus sibirica В. Установлено, что наилучшей средой, обеспечивающей процессы жизнедеятельности эксплантов Jumperus sibirica В., является стандартная среда с минеральной основой по Murashige and Skoog.

2 Разработана технология мшфоклонального размножения Jumperus sibirica В в условиях in vitro Дано технико-экономическое обоснование ее целесообразности

3 Выявлены существенные отличия в активности каллусогенеза у различных видов эксплантов Jumperus sibirica В Наиболее высокий процент калусогенеза (до 100%) наблюдался при использовании в качестве эксплантов почек и побегов.

4 Получены штаммы каллусной ткани Juniperus sibirica В., характеризующиеся стабильностью роста. Установлена зависимость

накопления клеточной биомассы Jumperus sibirica В. от качественного и количественного гормонального состава среды.

5 Установлено влияние способа культивирования на накопление подофиллотоксина в каллусной ткани Jumperus sibirica В. Наибольшее содержание подофиллотоксина обнаружено в каллусной ткани, выращенной на пенополиуретановых подложках.

6 Определено содержание наиболее ценных биологически активных соединений и обнаружено фармакологически значимое соединение лигнановой природы - подофиллотоксин.

7 Предложена принципиальная схема выделения подофиллотоксина из хвои и каллусной ткани Jumperus sibirica В. Приведены технико-экономические расчеты, которые показали эффективность биотехнологической переработки Jumperus sibirica В.

8 Впервые показана возможность получения кормового продукта из послеэкстракционного остатка хвои и каллусной ткани Juniperus sibirica В. методом биоконверсии с использованием дереворазрушающего гриба Pleurotus ostreatus

Список публикаций: 1 Аёшина, Е Н Введение в культуру можжевельника сибирского [.Juniperus sibirica (Burgsd)] / Е. Н. Абшина, Я. А. Болдырева, Н А. Величко // Химико-лесной комплекс - проблемы и решения . сб. ст. по материалам Всерос. науч -практ конф - Красноярск : СибГТУ, 2002 -Т. Ш.-С. 155-156. 2. Аёшина, Е Н. Влияние уровня сахарозы на рост и развитие эксплантов [Juniperus sibirica (Burgsd)] в условиях in vitro / Е. II. Аёшина, II. А. Величко // Лесной и химический комплексы : проблемы и решения : сб. ст. по материалам Всерос. науч.-практ. конф. - Красноярск : СибГТУ, 2003. - ТЛ. - С. 398-403.

3 Аёшина, Е Н Можжевельник в культуре in vitro - источник для получения биологически активных веществ растительного происхождения / Е. Н. Аёшина // Ботанические исследования в азиатской России ■ материалы XI съезда Рус. Ботан. о-ва, 18-22 августа 2003 г., Новосибирск-Барнаул. - Барнаул : АзБука, 2003. - Т. 3. - С. 2-3.

4 Aeshina, Е N Introduction peculiarities of two Jumperus species into

culture in vitro / E. N. Aeshina, Ya A Boldyreva // The Biology of plant *

cells in vitro and biotechnology ■ abstracts Vin Intern, conf., 9-13 September. - Saratov, 2003. - P. 32-33.

5 Аёшина, E. H. Влияние генотипа растения на интенсивность каллуссообразования у эксплантов Jumperus sibirica В. в условиях in vitro / Е. Н. Аёшина // Физиология растений - основа фитобиотехнологии : тез. докл. Междунар. конф., 15-21септ. - Пенза, 2003. - С. 502-503.

6 Абшина, Е Н Экстрактивные вещества Jumperus sibirica В / Е Н Аёшина, Н. А Величко // Лесной и химический комплексы -проблемы и решения (экологические аспекты) : сб. ст по материалам Всерос. науч.-практ. конф. - Красноярск : СибГТУ, 2004 - Т. Ш. С. 37-39.

4

7. Аёшина, Е. Н. Исследование особенностей химического состава эфирных масел двух видов рода Jumperus / Е. Н. Аёшина, Н. А Величко // Химия растительного сырья. - 2004. - № 4. - С. 35-37.

8 Аёшина, Е. Н. Можжевельник сибирский (Juniperus sibirica В.) как ингредиент крепко-алкогольных напитков / НА. Величко, Е. Н. Аёшина, Е. А. Речкина // Здоровое питание - основа жизнедеятельности человека : сб. материалов межрегион, науч -практ. конф. - Красноярск, 2006. - С. 164-169.

Сдано в производство24.05.2006.

Формат 60x84 1/16

Уч.-изд.л -/,(? Тираж 100 экз,

Изд №39 Заказ № УШ Лицензия ИД № 06543 16.01 02.

Редакционно-издательский центр СибГТУ 660049, Красноярск, пр. Мира, 82

*

t

г

14 7 8 1 í V / В \

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Аёшина, Екатерина Николаевна

Введение.

• 1 Аналитический обзор.

1.1 Народнохозяйственное значение можжевеловых лесов.

1.2 Химический состав хвои Juniperus.

1.3 Культура клеток и тканей растений в решении задач биотехнологии.

1.3.1 Вторичный метаболизм в условиях in vitro.

1.3.1 Культивирование хвойных пород в условиях in vitro. г 2 Методическая часть. ф 2.1 Объект исследования.

2.2 Исследование химического состава хвои Juniperus sibirica В.

2.3 Определение влажности.

2.4 Определение суммарного содержания алкалоидов.

2.5 Определение содержания подофиллотоксина в хвое.

2.6 Определение флавоноидов.

2.7 Определение сапонинов.

2.8 Количественное определение витаминов.

2.9 Определение содержания хлорофилла А, Б и каротина.

• 2.10 Разделение липидов на силикагеле.

2.11 Спектрометрическое определение содержания белка.

2.12 Определение минеральных компонентов.

2.13 Определение концентрации редуцирующих веществ.

2.14 Определение легкогидролизуемых полисахаридов.

2.15 Определение трудногидролизуемых полисахаридов.

2.16 Определение содержания лигнина.

2.17 Определение содержания эфирного масла.

2.18 Определение экстрактивных веществ.

• 2.19 Введение в культуру Juniperus sibirica В.

2.20 Получение каллусной ткани Juniperus sibirica В.

2.21 Иммобилизация растительных тканей на инертные носители.

2.22 Методы оценки физиологического состояния культуры.

2.23 Определение содержание подофиллотоксина в клеточной биомассе методом ВЭЖХ.

2.24 Определение подофиллотоксина в клеточной биомассе методом ИК спектров.

3 Экспериментальная часть.

3.1 Химический состав хвои Juniperus sibirica В.

3.2 Культивирование Juniperus sibirica В. в условиях in vitro.

3.2.1 Получение интактных стерильных растений и введение в культуру in vitro.

3.2.2 Влияние фитогормонов на каллусогенез Juniperus sibirica В.

3.2.3 Влияние типа эксплантов Juniperus sibirica В. на каллусогенез.

3.2.4 Получение каллусных культур.

3.2.5 Влияние способа культивирования на рост каллусной ткани Juniperus sibirica В.

3.2.6 Микроклональное размножение Juniperus sibirica В.

3.2.6.1 Стимулирование развития пазушных (спящих) почек.

3.2.6.2 Культивирование побегов Juniperus sibirica В.

3.2.6.3 Укоренение размноженных побегов Juniperus sibirica В. и адаптация к условиям in vivo.

4 Выделение подофиллотоксина из хвои и каллусной ткани

Juniperus sibirica В.

5 Микроклональное размножение Juniperus sibirica В. в условиях in vitro.

Выводы.

Список используемых источников.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Культивирование можжевельника сибирского (Juniperus sibirica B.) в условиях in vitro и получение биологически активных веществ на его основе"

В настоящее время существуют традиционные биотехнологии для получения пищевых продуктов, фармацевтических средств с использованием животных, растении, микроорганизмов.

Современный этап биотехнологии связан не только с интенсификацией и улучшением имеющихся биологических технологий, но и с появлением принципиально новых объектов, которыми являются культивируемые ткани и клетки высших растений.

Культивируемые клетки высших растений способны синтезировать традиционно используемые продукты растительного происхождения, создавать принципиально новые вещества, трансформировать дешевые предшественники • в ценный продукт. Преимуществом данного метода является возможность получения продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий, круглогодично и сохраняя при этом естественные ареалы ценных лекарственных растений

Культура клеток и тканей растений, как один из разделов биотехнологии, является не только одним из альтернативных источников необходимых биологически активных веществ, но и нетрадиционным методом охраны и восстановления генофонда лекарственных растений. Длительное микрочеренкование in vitro является одним из путей упрощения и повышения ® эффективности клонального микроразмножения ценных лесных пород.

Применение метода культуры изолированных меристем in vitro открывает большие перспективы для оздоровления генофонда древесных и травянистых растительных форм от грибных и бактериальных патогенов, вирусов, микоплазменных, вироидных и нематодных инфекций. Этот метод широко используется для получения и оздоровления посадочного материала многих экономически важных видов.

Одним из таких видов, нуждающимся в изучении и защите, является можжевельник. Несмотря на многовековую историю применения ® можжевельника, как лекарственного средства, данный вид - Juniperus sibirica В является малоизученным. Можжевельник широко применяется в народной медицине различных стран из-за значительного содержания в хвое и ягодах биологически активных веществ. В последнее время, благодаря своим антисептическим и декоративным свойствам, можжевельник используется в озеленении парков и садов.

Традиционные способы восстановления и переработки можжевельника не обеспечивают высокие потребительские свойства производимой продукции.

В целях совершенствования использования данного уникального вида необходимо применять меры к внедрению современных биотехнологий переработки сырья, ориентированных на выпуск экологически чистой продукции с высокими потребительскими качествами.

Одной из таких технологий является культура клеток и тканей растений in vitro, которая является альтернативным источником для получения биологически активных веществ и, кроме того, рассматривается как нетрадиционный метод охраны лекарственных растений.

1 Аналитический обзор

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Аёшина, Екатерина Николаевна

Выводы

1 Впервые подобраны условия для введения в культуру in vitro Juniperus sibirica В. Установлено, что наилучшей средой, обеспечивающей процессы жизнедеятельности эксплантов Juniperus sibirica В., является стандартная среда с минеральной основой по Murashige and Skoog.

2 Разработана технология микроклонального размножения Juniperus sibirica В. в условиях in vitro. Дано технико-экономическое обоснование ее целесообразности.

3 Выявлены существенные отличия в активности каллусогенеза у различных видов эксплантов Juniperus sibirica В. Наиболее высокий процент калусогенеза (до 100%) наблюдался при использовании в качестве эксплантов почек и побегов.

4 Получены штаммы каллусной ткани Juniperus sibirica В., характеризующиеся стабильностью роста. Установлена зависимость накопления клеточной биомассы Juniperus sibirica В. от качественного и количественного гормонального состава среды.

5 Установлено влияние способа культивирования на накопление подофиллотоксина в каллусной ткани Juniperus sibirica В. Наибольшее содержание подофиллотоксина обнаружено в каллусной ткани, выращенной на пенополиуретановых подложках.

6 Определено содержание наиболее ценных биологически активных соединений и обнаружено фармакологически значимое соединение лигнановой природы - подофиллотоксин.

7 Предложена принципиальная схема выделения подофиллотоксина из хвои и каллусной ткани Juniperus sibirica В. Приведены технико-экономические расчеты, которые показали эффективность биотехнологической переработки Juniperus sibirica В.

8 Впервые показана возможность получения кормового продукта из послеэкстракционного остатка хвои и каллусной ткани Juniperus sibirica В. методом биоконверсии с использованием дереворазрушающего гриба Pleurotus ostreatus.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Аёшина, Екатерина Николаевна, Красноярск

1. Шретер, А. И. Методика определения запасов лекарственных растений / А. И. Шретер, JL Е. Курлович, И. В. Богаров. М.: Наука, 1986. - 42 с.

2. Государственный доклад о состоянии окружающей природной среды

3. Красноярского края в 1996 году : гос. доклад / ред. Г. В. Кельберг, Ю. М. Мальцев ; Гос. комитет Краснояр. края по охране окружающей среды. -Красноярск, 1998. 514 с.

4. Гаммерман, А. Ф. Лекарственные растения / А. Ф. Гаммерман, Г. Н. Кадаев,

5. А. А. Яценко-Хмелевский. 4-е изд., испр. и доп. - М. : Высш. шк., 1990. -542 с.

6. Мухамедшин, К. Д. Можжевеловые леса / К. Д. Мухамедшин, Н. К.

7. Таланцев. -М.: Лесн. пром-сть, 1982. 184 с.

8. Воробьев, Д. П. Декоративные деревья и кустарники Дальнего Востока / Д.

9. П. Воробьев. Л.: Наука, 1987.-277 с.

10. Токин, Б. П. Вероятная роль фитонцидов в природе / Б. П. Токин // Природа.-1946.-№4.-С. 29-38.

11. Мухамедшин, К. Д. Чемпионы долголетия / К. Д. Мухамедшин, С. К.

12. Сартбаев. 2-е изд., изм. и доп. - Алма-Ата : Кайнар, 1988. -168 с.

13. Peter, F. Rediscover junipers. Source / F. Peter // Horticulture. 1995. - Vol. 73.1. P. 50-55.

14. Шиманюк, А. П. Эколого-лесоводственная характеристика и физикомеханические свойства древесины можжевельника обыкновенного / А. П. Шиманюк, Л. М. Перелыгин // Труды института леса. 1950. - Т. 3. - С. 319-323.

15. Кьосев, П. А. Полный справочник лекарственных растений / П. А. Кьосев. -М.: ЭКСМО-Пресс, 2001. 992 с.

16. Клышев, Л. К. Флавоноиды растений / Л. К. Клышев, В. А. Бандюкова, Л. С. Алюкина. Алма-Ата: Наука, 1978. - 78 с.

17. Пашинина, JI. Т. Димерные процианидины Juniperus sabina / Л. Т. Пашинина, С. А. Абилькаева // Химия природ, соединений. 1980. - № 3. -С. 420.

18. Абилькаева, С. А. Флавоноиды хвои Juniperus sabina / С. А. Абилькаева, Л. Т. Пашинина // Химия природ, соединений. 1981. — № 6. - С. 798 - 799.

19. Пашинина, Л. Т. Димерные флаванолы Juniperus Sabina / Л. Т. Пашинина, С. А. Абилькаева, В. И. Шейченко // Химия природ, соединений. 1982. - № 3. -С. 307-312.

20. Григорьев, В. П. Запас фитомассы Juniperus communis L. и содержание в хвое хлорофиллов, каротиноидов и аскорбиновой кислоты / В. П. Григорьев, Л. Ф. Поплавская // Раст. ресурсы. 1985. -№ 2 - С. 164-169.

21. Азаров, В. И. Химия древесины и синтетических полимеров / В. И. Азаров, А. В. Буров, А. В. Оболенская. СПб.: СПбЛТА, 1999. - 628 с.

22. Накопление лигнинов в каллусных культурах Lignum austriacum L. под действием элиситоров / Г. Р. Вардапетян и др. // Биотехнология. 2002. -№ 3. - С. 37-41.

23. Экстрактивные вещества древесины и значение их в целлюлозно-бумажном производстве / под ред. В. Э. Хиллиса. М.: Лесн. пром-сть, 1965.-504 с.

24. Семенов, А. А. Очерк химии природных соединений / А. А. Семенов. -Новосибирск : Наука, 2000. 664 с.

25. Duke, J. A. Medicinal plants of China / J. A. Duke, E. S. Ayensu // Algonac (Mich.): reference publ. 1985. - Vol. 1-2. - P. 705.

26. Муравьева, Д. А. Тропические и субтропические лекарственные растения / Д. А. Муравьева. М.: Наука, 1971. - 414 с.

27. Duke, J. A. CRC handbook of medical herbs / J. A. Duke // Boca Raton (Fla.): CRC press.- 1986.-P. 677.

28. Машковский, M. Д. Лекарственные средства: пособие по фармакопии для врачей / М. Д. Машковский. М. : Медицина, 1984. - Т. 1. - 624 с.; Т. 2. -576 с.

29. Hegnauer, R. Chemotaxonomie der Pflanzer / R. Hegnauer // Birkhauser. 1986. -Bd. 1-7.

30. Носов, A. M. Лекарственные растения / A. M. Носов. M.: ЭКСМО-Пресс, 2001.-350 с.

31. Горяев, M. И. Растения, обладающие противоопухолевой активностью / М. И. Горяев, Ф. С. Шарипова. Алма-Ата: Наука, 1983. - 174 с.

32. Production of podophyllotoxin in juniperus chinensis callus cultures treated with oligosaccharides and a diogenetic precursor / Toshio Muranaka et al. // Phytochemistry. 1998. - Vol. 49, № 2. - P. 491-496.

33. Растительные ресурсы СССР. JI.; СПб.: Наука, 1985-1993. - Вып. 1.

34. Hong-Yen, Hsu. The chemical constituents of oriental herbs / Hong-Yen Hsu, Yuh-Pan Chen, Mina Hong // Oriental Healing Arts Inst. Los Angeles : OUP, 1982.-P. 15-46.

35. Кустова, С. Д. Справочник по эфирным маслам / С. Д. Кустова. М.: Пищ. пром-сть, 1978.-175 с.

36. Горяев, М. И. Эфирные масла флоры СССР / М. И. Горяев. Алма-Ата : Акад. наук КССР, 1952. - 380 с.

37. Гаммерман, А. Ф. Дикорастущие лекарственные растения СССР / А. Ф. Гаммерман, И. И. Гром. М.: Медицина, 1976. - 288 с.

38. Садыков, Ж. С. Идентификация некоторых компонентов воска / Ж. С. Садыков // Химическая фармация. 1978. - № 4. - С. 24-28.

39. Кузнецова, М. А. Лекарственное растительное сырье и препараты / М. А. Кузнецова. М.: Высш. шк., 1987. - 191 с.

40. Носов, А. М. Культура клеток высших растений уникальная система, модель, инструмент / А. М. Носов // Физиология растений. - 1999. - Т. 46, №6.-С. 837-844.

41. Культура клеток растений / под ред. Р. Г. Бутенко. М. : Наука, 1981. -167 с.

42. Биотехнология получения берберина из клеточной культуры Tralictrum minis L. / А. В. Смирнов и др. // Биотехнология. 2000. - № 1. - С. 14-22.

43. Особенности регуляции каллусогенеза и биосинтез таксола in vitro у тисса ягодного / JI. Г. Филонова и др. // Биотехнология. 1996. - № 8. - С. 3844.

44. Генетическая коллекция как способ сохранения биоресурсов планеты / А. Т. Мокроносовов и др. //Вестн. РАН. 1994.-№ 11.-С. 991-1001.

45. Гамбург, К. 3. Ауксины в культурах тканей и клеток растений / К. 3. Гамбург, Н. И. Рекославская, С. Г. Швецов. Новосибирск : Наука, 1990. -243 с.

46. Гамбург, К. 3. Фитогормоны и клетки / К. 3. Гамбург. М. : Наука, 1970. -102 с.

47. Биотехнология растений : культура клеток / Г. П. Болвелл и др.. М. : Агропромиздат, 1989. - 280 с.

48. Бутенко, Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе / Р. Г. Бутенко. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. -160 с.

49. Kirby, Е. G. Colony formation from protoplasts derived from Douglas fir cotyledons / E. G. Kirby, P. Y. Chang // Plant Sci. Letter. - 1979. - V. 14. - P. 145-154.

50. David, A. Evaluation of parameters affecting the yield, variability and cell division of Pinus pinaster protoplasts / A. David, H. David, T. Mateille // Physol. Plantarum. 1982. - V. 56. - P. 108-113.

51. Isolation and culture of protoplasts from cotyledons of Pinus coulteri D. Don. / K. R. Patel et al. // Piant Cell, Tissue and Organ Culture. 1984. - V. 3. - P. 85-90.

52. Lane, E. Somatic embryogenesis in immature embryos and protoplasts of Pinus caribaea / E. Lane, H. David // Plant Science. 1990. - Vol. 69. - P. 215-224.

53. Скрипаченко, В. В. Культивирование in vitro тканей хвойных Сибири: автореф. дис. канд. биол. наук / В. В. Скрипаченко. Красноярск, 1992.— 30с.

54. Новый подход к изучению зависимости между структурой и функцией цитокининов / Я. В. Земляченко и др. // Докл. РАН. 1997. - Т. 353, № 2. -С. 261-263.

55. Полевой, В. В. Физиология растений / В. В. Полевой. М. : Высш. шк., 1989.-464 с.

56. Картель, Н. А. Фитогормоны и фитопатогенность бактерий / Н. А. Картель, В. В. Лобанок. Минск : Наука и техника, 1994. - 182 с.

57. Дерфлинг, К. Гормоны растений. Системный подход / К. Дерфлинг. М. : Мир, 1985.-304 с.

58. Круглова, Н. Н. Морфогенез в культуре изолированных пыльников: роль фитогормонов Электронный ресурс. / Н. Н. Круглова, В. Ю. Горбунова, П. А. Куксо. Режим доступа: http://www.anrb.ru /inbiocyto/2.htm

59. Skoog, F. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro / F. Skoog, С. O. Miller // Sympos. Soc. Exp. Biol. 1957. - V. 11, № 2. — P. 118.

60. Skoog, F. Aspects of growth factor interaction in morhogenesis of tobacco tissue cultures / F. Skoog // Les cultures de tissus de plantrs. Paris, 1971. - P. 115.

61. Тивари, Ш. Действие 2,4-Д на морфогенез в культуре пыльников и микроспор ячменя / Ш. Тивари, И. Р. Рахимбаев // Регуляторы роста и развития растений : тез. докл. II Всесоюз. конф. Киев, 1989. - С. 295.

62. Карабаев, М. К. Каллусогенез и морфогенез в культуре генеративных органов весенне-цветущих видов Crocus L. / М. К. Карабаев, Ж. К. Джардемалиев // Физиология растений. 1994. - Т. 41, № 6. - С. 807-814.

63. Чайлахян, М. X. Гормональная регуляция роста и развития высших растений / М. X. Чайлахян // Успехи современной биологии. 1982. - Т. 95, вып. 1.-С. 23-34.

64. Вильданова, Г. В. Индуцированный органогенез у некоторых видов среднеазиатских можжевельников в культуре тканей / Г. В. Вильданова // Изв. вузов. Лесн. журн. 2002. -№ 5. - С. 22-28.

65. Разработка методов культивирования тканей копеечника in vitro / Н. С. Ляпкова и др. // Биотехнология. 1999. - № 1. - С. 55-61.

66. Calixto, F. Adventitious shoot formation and plant regeneration from Pinus pinaster Sol. / F. Calixto, S. M. Pais // Development Biology-Plant. 1997. - № 3.-P. 119-124.

67. Бутенко, P. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р. Г. Бутенко. М.: Наука, 1964. - 272 с.

68. Запрометов, М. И. Влияние кинетина на образование фенольных соединений и ультраструктурную организацию каллусных тканей чайного растения / М. И. Запрометов, Г. А. Субботина, Т. Н. Николаева // Физиология растений. 1994. - Т. 41, № 3. - С. 354-358.

69. Payne, G. N. Bioreactor considerations for secondary metabolite production from plant cell tissue culture: indol alkaloids from Catharanthus roseus / G. N.

70. Payne, N. N. Payne, M. L. Shuler // Biotechnology and bioeng. 1988. - Vol. 31, №9.-P. 905-912.

71. Бутенко, P. Г. Культура клеток растений / P. Г. Бутенко. М.: Наука, 1971. -46 с.

72. Фаулер, М. В. Экономические аспекты промышленного культивирования клеток растений / М. В. Фаулер // Биотехнология сельскохозяйственных растений. — М.: Агропромиздат, 1987. С. 19-32.

73. Бутенко, Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р. Г. Бутенко. М.: Наука, 1964. - 272 с.

74. Бутенко, Р. Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений / Р. Г. Бутенко // Рост растений и природные регуляторы. М.: Наука, 1977. С. 621.

75. Sare von Arnold. Effect of Sucrose on Initiation of Embryogenic Callus Cultures from Mature Zygotic Embryos of Picea abies (L.) Karst / Sare von Arnold, Inger Hakman // Plant Physiology. 1986. - Vol. 122, № 3. - P. 261-265.

76. Калашникова, E. А. Оптимизация условий культивирования сосны и ели в культуре ткани / Е. А. Калашникова // Лесн. хоз-во. 1992. - № 8. - С. 4143.

77. Козубов, Г. М. Современные голосеменные / Г. М. Козубов, Е. Н. Муратова. Л.: Наука, 1986. - 115 с.

78. Егорова, Т. А. Основы биотехнологии / Т. А. Егорова. М. : Академия, 2003.-208 с.

79. Sakuta, М. Cell growth and accumulation of secondary methabolites / M. Sakuta, A. Kommane // Cell culture and somatic cell genetics of plants. 1987. -P. 97-114.

80. Биотехнология сельскохозяйственных растений / пер. с англ. В. И. Негрука ; предисл. Р. Г. Бутенко. -М.: Агропромиздат, 1987. 301 е.: ил.

81. Величко, Н. А. Научные основы индуцированного синтеза алкалоидов в клеточной культуре Cathrantyus roseus L.: автореф. дис. д-ра техн. наук / Н. А. Величко. Красноярск : СибГТУ, 2004. - 45 с.

82. Запрометов, М. Н. Вторичный метаболизм в культуре клеток и тканей растений: Культура клеток растений / М. Н. Запрометов. М. : Наука, 1981.-С. 37-51.

83. Загоскина, Н. В. Особенности метаболизма фенольных соединений гетеротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур чайного растения (Camellina sinensis L.) : автореф. дис. докт. биол. наук / Н. В. Загоскина. -М., 1997.-49 с.

84. Носов, А. М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений / А. М. Носов // Биотехнология культивируемых клеток и биотехнология растений. -М.: Агропромиздат, 1987. С. 5-20.

85. Влияние фитогормонов на процессы роста и синтеза вторичных веществ в культуре in vitro василисника малого / Е. В. Скуратова и др. // Биотехнология. 1999. - № 2. - С. 46-52.

86. Уразбахтина, Н. А. Получение каллусной ткани из листьев Taxus baccata L. / Н. А. Уразбахтина, Мардамшин // Биотехнология. 1999. - № 4. - С. 5556.

87. Некора, С. В. Способность к каллусогенезу у эксплантов хвои пяти видов рода Taxus L. / С. В. Некора, В. П. Комов // Раст. ресурсы. 2001. - Т. 37, вып. 4.-С. 100-107.

88. Ball, Е. Studies on the nutrition of the callus culture of Sequoia sempervirens / E. Ball // Annee biol. 1955. -№ 1. - P. 4.

89. Straus, J. Response of Cupressus funebris tissue cultures to gibberellins / J. Straus, R. Epp // Science. 1960. -№ 3. - P. 4-16.

90. Torok, D. The auxin requirement and the effect of an auxin-antagonist on tumorous and normal tissues of Picea glauca / D. Torok, K. Thimann // Physiol, plant. 1961.-№3.-P. 18-24.

91. Reinert, J. The cultivation in vitro of tumor tissues and normal tissues of Picea glauca / J. Reinert, P. R. White // Physiol, plant. 1956. -№ 2. - P. 41-53.

92. White, P. R. Some aspects of differentiation in cell of Picea glauca cultivated in vitro / P. R. White // Am. J. Bot. 1967. - № 3. - P. 11-21.

93. White, P. R. Some basic parameters in the cultivation of spruce tissues / P. R. White, P. G. Risser // Physiol, plant. 1964. - № 3. - P. 41-48.

94. Aulikki Salmia, M. Cytological stadies on tissue culture of Pinus sembra / M. Aulikki Salmia //Physiol, plant. 1975. -№ 1. -P. 16-24.

95. Brown, C. L. Culture of pine callus on a defined medium / C. L. Brown, R. H. Lawrence // Forest Sci. 1968. - № 1. - P. 32-48.

96. David A. Obtention d'une souche tissulaire de Pinus pinaster Sol. A partir de tissus du tronc de l'arbre / A. David //Acad. Sci. -1971. -№ 23. P. 13-27.

97. Jorgensen, E. Formation of heartwood phenoles in callus tissbe of red pine (Pine resinosa) / E. Jorgensen, D. Balsillie // Can. J. Bot. 1969. - № 17. - P. 32-1.

98. Lavaud, J. Action conjuguee de quelques auxines et de la kinetine on du meso-inositol, sur les tissus de Pin maritime cultives in vitro / J. Lavaud // Acad. Sci. -1969.-№ 8.-P. 38-47.

99. Lavaud, J. Phenomenes d'histogenese se produisant au cours du development des cultures initiales de tissus de pin maritime; influence de certains modificateurs de croissance / J. Lavaud // Acad. Sci. 1970. - № 8 - P. 18-24.

100. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol, plant. 1962. - № 15 - P. 31-42.

101. Harvey, A. Procedures and media for obtaining tissue cultures of 12 conifer species / A. Harvey, J. Grasham // Can. J. Bot. 1969. - № 4 - P. 18-24.

102. Быченкова, Э. А. Подбор оптимальной питательной среды для выращивания первичных культур тканей ряда представителей сосновых и изучение их роста / Э. А. Быченкова // Изв. вузов. Лесн. журн. 1977. - № 1.-С. 22-28.

103. Gjuleva, V. Maturation capacity of somatic embryos of Picea abies after prolonged proliferation culture / V. Gjuleva, S. Arnold // Biologia plantarum. -1999.-Vol. 42, №2.-P. 161-168.

104. Ingram, B. Effect of bioreactor configuration on the growth and maturation of Picea sitchensis somatic embryo cultures / B. Ingram, F. Mavituna // Plant. Cell. -2000.-Vol. 61.-P. 87-96.

105. Wang, К. X. Adventitious bus production from mature Picea abies: rejuvenation associated with female strobili formation / К. X. Wang, D. F. Karnosky, R.Timmis // Woody Plant Biotechnology. 1991. - P. 83-90.

106. Байбурина, P. К. Микроклональное размножение взрослых гибридных деревьев BETULA PENDULA ROTH VAR. CARELICA MERCKL. / P. K. Байбурина // Раст. ресурсы. 1998. - Т. 34, № 2. - С. 9-22.

107. Negussie, F. In vitro induction of multiple bads in tissue culture of Juniperus excelsa / F. Negussie // Forest Ecology and Management. 1997. - Vol. 98. - P. 115-123.

108. Berha, D. Asexual propagation of Juniperus procera from Ethiopia: a contribution to the conservation of African pencil cedar / D. Berha, L. Negash // Forest Ecology and Management. 1998. - Vol. 112. - P. 179-190.

109. Leopold, A. C. Plant Growth and Development / A. C. Leopold, P. E. Kriedemann. 2 ed. - McGraw-Hill, 1975. - 545 p.

110. White, J. Factor influencing adventitious root production in cuttings of Griselinia littoralis and Griselinia lucida / J. White, P. H. Lovell // Ann. Bot. -1984.-Vol. 53.-P. 443-446.

111. White, J. The anatomy of root initiation in cuttings of Griselinia littoralis and Griselinia lucida / J. White, P. H. Lovell // Ann. Bot. 1984. - Vol. 54. - P. 720.

112. Zajczkowski, S. Auxin stimulation of cambial activity in Pinus silvestris. I. The differential cambial response / S. Zajczkowski // Physio. Plant. 1973. - Vol. 29.-P. 281-287.

113. Hortmann, H. T. Plant cell / H. T. Hortmann, D. E. Kester, F. T. Davies // Plant Propagation: Principles and Practices : 5th ed. Prentice-Hall, Englewood Cliffs. -New Jersey, 1990.-P. 16-27.

114. Mesen, J. F. The effects of propagation environment and foliar area on the rooting physiology of Cordia alliodora (Ruiz and Pavon) Oken cuttings / J. F. Mesen, A. C. Newton, R. R. B. Leakey // Trees. 1997. - № 11. - P. 404-411.

115. Катаева, H. В. Клональное микроразмножение растений / H. В. Катаева, Р. Г. Бутенко. -М.: Наука, 1983. -168 с.

116. Декоративное садоводство / Н. В. Агафонов и др.. М. : Колос, 2000. -320 с.

117. Мухамедшин, К. Д. Арча / К. Д. Мухамедшин. М. : Лесн. пром-сть, 1980. -96 с.

118. Лагони, Н. О можжевеловых ягодах / Н. Лагони // Аптечное дело. 2002. -№5.-С. 8-9.

119. Псурцева, Н. В. Биотехнология / Н. В. Псурцева, Н. В. Белова, И. А. Алехина. М.: Наука, 1978. - 14 с.

120. Химический анализ лекарственных растений / под ред. Н. И. Гринкевич, Л. Н. Сафронич. -М.: Высш. шк., 1983. 175 с.

121. Ловкова, М. Я. Почему растения лечат / М. Я. Ловкова, А. М. Рабинович, С. Н. Пономарева. -М.: Наука, 1989.-256 с.

122. Противораковый экстракт. Anti-cancer extract // Chem. Eng. (USA). 2000. -Vol. 107, № 8.-C. 17.

123. Адихотдаев, К. Б. Определение флавонойдов в растительном сырье / К. Б. Адихотдаев, А. И. Баньковский, В. И. Глызин // Фармация. 1977. - № 3. -С. 3-27.

124. Мальчуковский, JI. Б. Определение тритерпеновых сапонинов в порошке и таблетках "сапарал " / JI. Б. Мальчуковский, Н. И. Либизов // Фармация. -1971.-№ 2.-С. 68-71.

125. Девяткина, В. А. Методы определения витаминов / В. А. Девяткина. М. : Пшцепромиздат, 1954. - 135 с.

126. Кейтс, М. Техника липидологии / М. Кейтс. М.: Наука, 1975. - 322 с.

127. Нижний, С. А. Скрининг физиологически активных веществ / С. А. Нижний, Н. В. Дмитриева. М.: Медицина, 1985. - С. 158.

128. Левин, Э. Д. Современные физиолого-химические методы исследования : метод, указ. к проведению лаб. работ для студентов спец. 2603 всех форм обучения / Э. Д. Левин, П. В. Миронов. Красноярск : СТИ, 1988. - 28 с.

129. Рязанова, Т. В. Химия древесины / Т. В. Рязанова, Н. А. Чупрова, Е. В. Исаева. Красноярск : КГТА, 1996. - 358 с.

130. Практические работы по химии древесины и целлюлозы / Л. В. Оболенская и др.. М.: Наука, 1965. - 411 с.

131. Кузнецова, М. А. Лекарственное растительное сырье и препараты / М. А. Кузнецова. М.: Высш. шк., 1987. - 191 с.

132. Баренбойм, Г. М. Биологически активные вещества. Новые принципы поиска / Г. М. Баренбойм, А. Г. Маленков. М.: Наука, 1985.

133. Бутенко, Р. Г. Культура тканей и физиология морфогенеза растений / Р. Г. Бутенко. М.: Наука, 1964. - 272с.

134. Gamborg, О. L. Plant cell, tissue, and organ culture: fundamental methods / O. L. Gamborg, G. C. Phillips. Berlin : Springer-Verlag, 1995. - 557 p.

135. Бутенко, P. Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений / Р. Г. Бутенко // Рост растений и природные регуляторы. М. : Наука, 1977. - С. 697-710.

136. Момот, Т. С. Технология изолированных культур для микроразмножения лесных древесных растений / Т. С. Момот // Биология клеток растений invitro, биотехнология и сохранение генофонда : тез. докл. 7-ой Междунар. конф.-М., 1997.-С. 441-442

137. Высоцкий, В. А. Регенерационная способность изолированных меристе-матических верхушек черной смородины и вишни и методы получения из них целых растений / В. А. Высоцкий. JI.: ВИР, 1978. - С. 28-34.

138. Биотехнология. Принципы и применение : пер. с англ. / Г. Бич и др.; под ред. И. Хиггинса. М.: Мир, 1988. - 480 с.

139. Кретович, В. JI. Биохимия растений / В. JI. Кретович. М. : Высш. шк., 1986.-С. 356-357.

140. Гродзинский, А. М. Краткий справочник по физиологии растений / А. М. Гродзинский, Д. М. Гродзинский. Киев : Наук, думка, 1973. - 380 с.

141. Гоберман, В. А. Технология научных исследований методы, модели, оценки : учеб. пособие / В. А. Гоберман, JI. А. Гоберман. - 2-е изд. стереотип. - М.: МГУЛ, 2002. - 390 с.