Сравнительный анализ органоспецифичных профилей генной экспрессии у свиней

Хлопова, Наталия Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Сравнительный анализ органоспецифичных профилей генной экспрессии у свиней
ВАК РФ 06.02.10, Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ органоспецифичных профилей генной экспрессии у свиней"

На правах рукописи №

ХЛОПОВА НАТАЛИЯ СЕРГЕЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОРГАНОСПЕЦИФИЧНЫХ ПРОФИЛЕЙ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ У СВИНЕЙ

Специальность 06.02.10 — Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 НОЯ 2012

Москва 2012

005055794

Работа выполнена на кафедре разведения и племенного дела ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А.Тимирязева»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Глазко Татьяна Теодоровна, доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич, доктор биологических наук, профессор, ОАО «Московское» по племенной работе, начальник лаборатории иммуногенетической экспертизы;

Киселев Андреи Леонидович,

доктор биологических наук, профессор Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина

ФГБОУ Российская академия менеджмента в животноводстве

¿о

часов на

Защита диссертации состоится «*?•/» декабря 2012 года, заседании диссертационного совета Д 220.056.02 при ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный заочный университет» по адресу: 143900, Московская область, г. Балашиха, ул. Ю. Фучика, д.1, ауд. 114.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный заочный университет»

Автореферат разослан «^С » ноября 2012

года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

Т.В. Кракосевич

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Развитие животноводства требует ускорения селекционного процесса, что невозможно без увеличения надежности оценки генетического потенциала племенного поголовья. В этих целях разрабатываются методы применения молекулярно-генетических маркеров развития желательного фенотипа (количества и качества конечной продукции, устойчивости к условиям содержания, контроля наличия наследственных заболеваний и инфицированности патогенами) (Зиновьева Н.А. и др., 2010). ДНК микроматрицы (матрицы ДНК проб) позволяют осуществлять одновременное генотипирование многих геномных участков по мононуклеотидным полиморфизмам (Single Nucleotide Polymorphisms - SNP), оценивать активность транскрипции различных генов (профили генной экспрессии - 1113). Включение генетических маркеров в селекционные программы увеличивает надежность селекционной работы при сохранении оптимального уровня генетического разнообразия, обеспечивает проведение отбора и подбора животных с учетом генотипической оценки (Дунин И.М. и др., 1994; Калашникова J1.A. и др., 2001; Харченко П.Н., Глазко В.И., 2006; Эрнст JI.K., 2008). В свиноводстве с использованием ДНК микроматриц получено огромное количество данных о ткане- и органоспецифической экспрессии генов как у здоровых свиней (Lin C.S., Hsu C.W., 2005; Li M.Z. et al., 2008; Damon M. et al., 2012), так и при различных патологических состояниях (Chomwisarutkun К. et al., 2011; Maak S. et al., 2009). Выявлены определенные ассоциации между SNP в структурных и регуляторных областях генов и желательным развитием хозяйственно-полезных признаков (Wyszynska-Koko J. et al., 2006; Guiatti В. et al., 2011). Однако низкая воспроизводимость таких данных ограничивает внедрение маркерной селекции в животноводство. Это может быть связано с рядом причин: сложностью систем регуляции генной экспрессии (Шихов И.Я., 2007; Cheon Y. et al., 2005), возможностью перекрестной гибридизации ДНК проб (Okoniewski M. J., Miller С. J., 2006), техническими и статистическими погрешностями обработки данных (Nguyen Т.Т. et al., 2010), изменчивостью вкладов генотипической и паратипической компонент в проявление признака в разных условиях окружающей среды. В этой связи особую актуальность приобретают исследования возможных причин неоднозначности выявленных ассоциаций между ПГЭ, SNP регуляторных

областей предполагаемых «критических» генов и желательным проявлением хозяйственно-полезныхпризнаков.

Целью работы являлось повышение надежности прогнозирования развития основных хозяйственно-полезных признаков у свиней на основе использования современных методов молекулярно-генетического анализа.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Оценить и проанализировать профили генной экспрессии почек, печени, сердца и тимуса у свиней породы ландрас на основе использования метода гибридизации флуоресцентно-меченных ДНК;

2. Сопоставить результаты полученных оценок экспрессии структурных генов с пробами ДНК микроматриц, гомологичных к разным участкам кДНК;

3. Провести анализ индивидуальной изменчивости оценок экспрессии структурных генов и выявить факторы, её определяющие в группе свиней породы ландрас;

4. Оценить степени взаимосвязи показателей мясной продуктивности у свиней двух- и трехпородных помесей в различных половозрастных группах на основе ассоциаций мононуклеотидного полиморфизма регуляторных областей (промоторов) ключевых генов контроля липидного метаболизма (Lep, Sed) и миогенеза (Myf-6, Myod);

5. Оценить уровень изменчивости показателей мясной продуктивности и скорости роста помесных животных в зависимости от структуры комплексных генотипов по мононуклеотидным полиморфизмам в промоторах генов Lep, Sed, Myf-6, Myod, Opn.

ими белков и количеством метаболических путей, в регуляции которых они участвуют. Впервые выявлены и описаны две, хорошо идентифицируемые, составляющие органоспецифичного ПГЭ, одна включает гены, экспрессия которых отличается у разных животных, обозначенная нами как «вариабельная» часть ПГЭ, и другая объединяет гены, оценки экспрессии которых не имели индивидуальной изменчивости, составляющие, по нашему определению, «конститутивную» часть ПГЭ. Впервые получены данные о том, что продукты генов «вариабельной» части профиля участвуют в контроле в два раза большего количества метаболических путей и находятся в более сложных межгенных сетевых взаимоотношениях по сравнению с генами «конститутивной» части, что позволяет выделить в качестве ведущего фактора индивидуальной изменчивости их экспрессии средовую компоненту. На основании генотипирования ЯЫР в регуляторных последовательностях (промоторах) ключевых генов липидного обмена и миогенеза обнаружено, что ассоциации между моногенными и комплексными генотипами с характеристиками сальности свиней и динамикой миогенеза зависят от пола, возраста исследуемых животных, а также от особенностей типа скрещивания (двух- и трехпородные помеси).

Практическая значимость работы. Обнаруженная в работе подразделенность ПГЭ на конститутивную и вариабельную части, обусловленная вовлеченностью генов в разное количество метаболических путей, позволяет планировать подбор генов для получения органоспецифичных ПГЭ в целях повышения надежности выявления генов, экспрессия которых вносит определяющий вклад в проявление хозяйственно-полезных характеристик свиней.

Впервые получены и проанализированы данные об ассоциациях между мононуклеотидными полиморфизмами промоторов генов кандидатов контроля липидного обмена и миогенеза, как отдельных, так и комплексных генотипов, и проявлением характеристик сальности и динамики миогенеза. Показано, что выявленные моногенные и комплексные генотипы могут быть непосредственно использованы для прогноза проявления хозяйственно-полезных характеристик с учетом ограничений надежности таких связей возрастом, полом и типом скрещивания свиней (двух- и трехпородные помеси).

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Воспроизводимость оценок ПГЭ зависит от наличия/отсутствия перекрестной гибридизации между пробами ДНК микроматриц и участками

гомологии внутри- и между кДНК мРНК разных генов.

2) Подразделенность ПГЭ на конститутивную и вариабельную части обусловлена функциональными особенностями кодируемых белков и их участием в контроле разного количества метаболических путей.

3) Ассоциации между молекулярно-генетическими маркерами -мононуклеотидными полиморфизмами промоторов генов кандидатов контроля проявления мясной продуктивности у свиней приемлемы для прогноза развития признаков продуктивности с учетом ограничений надежности такого прогноза возрастом, полом и типом скрещивания животных (двух- и трехпородные помеси).

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертации были представлены в виде докладов на VI Международном научном симпозиуме «Прикладные исследования для улучшения производства свинины и их влияние на развитие сельских территорий» (Быдгощ-Торунь, Польша, 2012); Ш Международном симпозиуме для аспирантов и студентов аграрный вузов (Быдгощ-Торунь, Польша, 2012), 25й Международной конференции «Генетические Дни» (Вроцлав, Польша, 2012); Международной конференции «Достижения в микрочиповых технологиях» \ АМТ (Гамбург, Германия, 2011); 7й и 8й международных конференциях по биоинформатике регуляции генома и структурной/системной биологии / ВОК5\8В (Новосибирск, 2010; 2012); Международной московской конференции по вычислительной молекулярной биологии / МССМВ (Москва, 2009; 2011); XVI, XVII и XIX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2009; 2010; 2012); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию академии имени К.А. Тимирязева (Москва, 2010); Международной конференции по бионаукам и биотехнологии / 1СВВ (Осло, Норвегия, 2009), 49й встрече американского общества по клеточной биологии / АвСВ (Сан-Диего, США, 2009); Международной научно-технической конференции: нанотехнологии и наноматериалы (Москва, 2009); 62-й Международной студенческой научной конференции (Москва, 2009) Международной научно-практической конференции Нанотехнологии в сельском хозяйстве (Москва, 2008).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 24 научных работы общим объемом 6,3 пл. с личным вкладом

автора (75%), включая 4 статьи в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Минобрнауки РФ и 1 статью в иностранном англоязычном издании.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах компьютерного текста, включает введение, три главы (обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные результаты и их обсуждение), заключение, выводы и предложения производству. Основной текст диссертации включает 18 таблиц и 20 рисунков. Библиографический список включает 192 литературных источника, в том числе 178 - на английском языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В анализ были включены 6 свиней женского пола в возрасте шести месяцев породы ландрас. У каждого животного не менее, чем в двух повторностях анализировали экспрессию более 15 тысяч структурных генов из 22 — 26 тысяч имеющихся у высших млекопитающих в 5-ти различных органах (печень, почки, тимус, сердечная мышца, скелетная мышца). Анализ ПГЭ проводился отдельно по каждой ткани и каждому животному. Все животные содержались в сходных условиях, образцы тканей были получены в день убоя животных на экспериментальной базе Университета штата Миннесота, США.

Исследование однонуклеотидных полиморфизмов в генах-кандидатах липидного метаболизма и миогенеза проводилось в группе двухпородных (крупная белая х дюрок; п=356 голов, 163 самца и 193 самки), и трехпородных (крупная белая х дюрок х ландрас; п=256 голов, 131 самец и 125 самок) помесей. Схема исследований представлена на рисунке 1.

Характеристики продуктивности исследованных животных (табл. 1) получены на 3 племенных хозяйствах расположенных в провинции Порденоне и Верона, Италия. Сбор образцов мышц для дальнейшего анализа ДНК проводился в момент забоя животных на скотобойне или на перерабатывающем предприятии.

Выделение РНК, получение кДНК, гибридизация с микроматрицами, сканирование микроматриц

Рис. 1 Схема исследований

Таблица 1

Уровень развития основных хозяйственно-полезных признаков свиней двух- и трехпородных помесей

Показатель продуктивности Двухпородные помеси Трехпородные помеси

пол N М±т пол п М±т

Толщина шпика над 6-7 грудными позвонками, мм ? 162 29.11±0.415 О 95 28.67±0.521

с? 131 30.68±0.563 с? 107 29.44i0.555

Глубина длиннейшей мышцы спины, мм М. 1оп£1<а1тш (1ог$1 о 131 66.99±0.554 О 95 67.49±0.659

с? 162 65.25±0.662 с?' 107 66.09±0.666

15 3 '5 ? 1 от рождения до отъема (АОС1-Ауе^еВаЦуСат 1), кг 2 152 0.28±0.005 95 0.27±0.005

<? 127 0.28І0.005 с? 91 0.27±0.007

н а § 8 І от отъема до 10 недель (А002-Ауе^е0аиу0ат 2), кг 9. 192 О.ЗЗіО.ООЗ ? 124 0.33±0.004

а 155 0.33±0.004 с? 113 0.33±0.004

зі: от рождения до убоя (АООЗ-АуегадеОаПуОат 3), кг о 161 0.61 ±0.004 9 95 0.61±0.007

с? 131 0.60±0.005 с? 107 0.59±0.007

Масса туши, кг ? 161 132.64±0.936 О 95 133.75±1288

с? 131 132.10tl.098 с? 107 132.1ІІІ302

Предубойная живя масса, кг 161 164.48il.2U О 95 166.67±1.593

с? 131 163.86tl.362 г 107 164.53il.607

Структура микроматриц. Для выявления ПГЭ использовались микроматрицы, разработанные и напечатанные в рамках проекта SPAM (Garbeetal., 2010). На каждой микроматрице были представлены зонды к 15204 генам, из которых 12271 ген был представлен 1 пробой и 2933 гена от 1-14 пробами. Для создания проб использовались 70-нуклеотидные синтетически синтезированные последовательности, комплементарные к белок-кодирующим участкам геномной ДНК свиней.

Метод генотипирования. Генотипирование по полиморфным локусам в области промотора генов стеарил-КоА-десатуразы (Sed) [-233 Т/С], лептина (Lep) [-11606 С/Т; -12109 Т/А], белка детерминации миобластов (Myod) [-38 G/A], миогенетического фактора 6 (Myfó) [-375 Т/С], остеопонтина (Орп) [-24 G/A] выявляли методом конкурентной аллель-специфической полимеразной цепной реакции, основанной на принципе резонансного переноса энергии флуоресценции - «KASParGenotypingSystems» (Kbioscience).

Выделение нуклеиновых кислот. Выделение РНК проводилось с использованием набора реагентов «RNeasyMiniKit» (QIAGEN), затем были получены кДНК с применением набора реагентов «Аггау350 Expression Array Detection Kit for Microarrays» (Genisphere). Выделение ДНК для генотипирования промоторных областей генов-кандидатов липидного метаболизма и миогенеза выполняли методом фенол-хлороформной экстракции с предварительной обработкой каждого образца протеиназой К.

Анализ первичных данных ПГЭ. Сканирование микроматриц проводилось на ScanArray 5000 (GSI Lumonics) с использованием компьютерной программы Scan Array Express. Данные сканирования были распакованы и обработаны при помощи процедуры Blue Fuse for microarrays. В результате были получены числовые данные, характеризующие интенсивность сигнала гибридизации (с.и.) генов в каждом споте микроматрицы для каждого из образцов в отдельности. Деление генов на функциональные группы проводилось в соответствии с базой данных Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnological Information, NCBI). Поиск гомологичных последовательностей в GenBank осуществлялся с помощью алгоритмов семейства BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Корреляционный анализ проведен с расчетом коэффициентов корреляции Пирсона (пакет Statistica 7.0). Принадлежность генов к различным метаболическим путям определялась в соответствии с базой данных KEGG pathway

(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html), и софтом GNCPro

(http://gncpro.sabiosciences.com/gncpro/gncpro.php).

Анализ первичных данных генотипирования. Математическую обработку результатов генотипирования по каждому гену в отдельности проводили с использованием прикладных статистических программ SPSS 17.0 (SPSS statistics), Statistica 7.0 (Stat Soft Inc.). Достоверность различий в распределении частот аллелей и генотипов оценивали с использованием критерия %2 с поправкой Иэйтса (Med Calc Software 12.0.3). Для поиска зависимостей в экспериментальных данных путём исследования значимости различий в средних значениях выполнялся дисперсионный анализ (ANOVA) и метод оценки эмпирического попарного значения Тьюки [Li М. et al., 2008; Li Y. et al., 2011]. Определение сайтов посадки факторов транскрипции и их изменение в соответствии с полиморфизмами в промоторах генов липидного метаболизма и миогенеза проводилось при помощи софта Matlnspector (GenomatixSoftware). Все использованные процедуры анализа первичных данных лицензированы и широко используются в международной практике [Cartharius К., 2003; Cartharius K.et al., 2005; Guiatti D. et al., 2011; Garbe J.R. et al., 2010]

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Влияине перекрестной гибридизации проб микроматриц с транскриптами разных генов на результаты оценок органосиецнфнчных профилей генной экспрессии.

Для оценки влияния одного из источников ошибок — перекрестной гибридизации - был выполнен сравнительный анализ ПГЭ печени и почек у свиней. Среди 600 наиболее интенсивных сигналов гибридизации кДНК зрелых мРНК выделены транскрипты, к которым на ДНК микроматрицах присутствовало более, чем одна проба. Суммарно в печени выделено 12 таких транскриптов, в почках - 9. Сравнение с.и. разных участков одного и того же гена с пробами ДНК-микроматриц позволило выделить две основные группы генов: одна - с различиями до 4500 условных единиц свечения между с.и. различных участков кДНК одной и той же мРНК с пробами ДНК микроматриц, другая - с различиями более 10000 условных единиц свечения. Все рассмотренные случаи воспроизводимых отличий между с.и. разных проб ДНК

микроматриц к кДНК мРНК генов печени (8ЕИРШАЗ-2, БОА) и почек (ATP6,CgA, ЦЬ) типичны для генов, принадлежащих к супергенным семействам (табл.2).

Таблица 2

Множественные участки гомологии в кДНК мРНК одного или разных генов

Ген Гомология участков внутри транскрипта, между кДНК разных генов

альфа-1-атихе-мтрппсин2 (SERPINA3-2) 1 SERPINA3-2 84% (1027 - 1096); SERPINA3-1 86%; S ERPIN A3-3 81% (1045 - 1114); SERPINA3-6 81% (772-841); ШС100153899 100% (1096 - 1165); LOC100156752 100% (753 - 822); LOC100156325 80% (1096-1165)

2 SERPINАЗ-289% (1082 до 1150); SERPINA3-6 89% (809 - 877)

3 SERPINA3-2 100% (1194-1263); SERPINA3-2 89% (1295 - 1328)

фибринопетвд А (FGA) 1 gb:FD606208.1 100% (535 до 604), 80% (509 и 563)

2 100% (209 - 278)

АТФ синтаза А цепь (АТР6) 1 + цепь 100% (191 - 260) (377 - 446); - цепь 100% (124 до 55)

2 100% + цепь в прямой последовательности и в комплементарном варианте, - цепь

3 100% +цепь

хромогранин А (CgA) 1 100%+1№ь(120-18^3Ш-369;592-661Х-иж1ртш1кхше11Ова1ельнос1ь(193- 124)

2 100% + цепь (31-100; 85-154; 120-189; 195-264);

убиквитин (Üb) 1 100% + цепь (149-218); - цепь (399-330)

2 100% + цепь (177-246; 405-474; 630-699)

3 100% +цепь (83-152)

4 100% + цепь (138-207; 367-435; 593-661)

Для всех исследованных случаев наблюдались выраженные отличия по интенсивности гибридизации между разными пробами к последовательностям кДНК синтезированных по мРНК одного и того же гена, в связи с количеством в нем участков гомологии в кДНК мРНК других генов, а также с присутствием/отсутствием гомологичных последовательностей в кДНК мРНК плюс и минус цепей. Полученные данные свидетельствуют о том, что такая «перекрестная» гибридизация разных участков кДНК с одной и несколькими пробами ДНК микроматриц может являться источником ошибок при сравнительной оценке интенсивности экспрессии различных генов, что особенно существенно для генов, принадлежащих к супергенным семействам.

3.2. Органоспецифические особенности профилей генной экспрессии в печени и почках свиней.

Суммарный сравнительный анализ различий в интенсивности экспрессии генов в печени и почках, отличавшихся по уровню экспрессии более, чем на 20000 условных единиц свечения, позволил выявить 40 генов, экспрессия которых была существенно выше в клетках почек, по сравнению с клетками печени. Больше половины из них (26) являлись генами, продукты которых относятся к белкам, представляющим сигнальную и транспортную системы клетки и непосредственно участвующим в ионном обмене между внеклеточным пространством и цитоплазмой, а также между цитоплазмой и внутренним матриксом митохондрий. Продукты 10 генов относятся к факторам регуляции транскрипции и убиквитин-зависимого каскада, 3 гена кодируют белки рибосом и 1 ген - субъединицу динактинового комплекса, непосредственно участвующего в контроле цитокинеза. В целом, основные отличия в профилях генной экспрессии между клетками почек и печени оказались связанными с генами, контролирующими меж- и внутриклеточный ионный обмен, а также механизмы клеточного деления. Это объясняется доминирующим участием почек в поддержании ионного баланса в крови млекопитающих (по сравнению с печенью), а также сниженной активностью цитокинеза в печени (полиплоидизацией гепатоцитов). Таким образом, выявленные отличия в профилях генной экспрессии клеток почек и печени соответствуют функциональным и гистологическим особенностям этих органов.

3.3. Сложность спектра профиля генной экспрессии печени свиней.

Сравнительный анализ ПГЭ печени и почек по генам, интенсивность гибридизации которых отличалась более чем на 20000 условных единиц свечения между органами, позволил выделить группу генов, с конститутивной экспрессей и группу из 24 генов, уровень экспрессии которых варьировал от одного животного к другому. Среди них были определены 11 генов, по которым уровень экспрессии у исследованных животных высокодостоверно коррелировал в печени и почках (г=0,96-1,00; Р<0,05; Р<0,01). Это свидетельствует, что их экспрессия находится под влиянием общих для обоих органов регуляторных факторов. Оказалось также, что при рассмотрении отдельно ПГЭ печени 24 гена вариабельной части профиля разбиваются на функциональные группы, между которыми были определены статистически

достоверные коэффициенты корреляции в уровнях экспрессии генов у разных животных (1=0,95-1,00; Р<0,05; Р<0,01, Р<0,001). В итоге, были выделены 8 таких групп - 6 генов, продукты которых участвуют в формировании кровяного сгустка (FGB, FGG, VTN, F2, PAI2,PLG); 6 генов - в транспорте и метаболизме липидов (АроСЗ, Аро-Е, ApoA-I, AGP2, PRBP, FHR2); 5 генов представляют маркеры клеток крови и лизосом (ТМЕМ8, PAI2, ST7, AGAP1, NAGA); продукты 3 генов участвуют в апоптозе клеток (CLU, TNFRSF19, PLG), экспрессия 3 генов регулируется гормонами (FGB,ALR,VTN).TpH группы, включающие в себя по 2 гена, относились к транспортной системе Са2+ (Grin2b, KLHL1), кодировали белки межклеточного матрикса (HAPLN2, AHSG) и отражали функциональную активность митохондрий (ALR, TrpRS).

Сравнительный анализ данных ПГЭ печени, полученных в наших исследованиях и представленных в работе проф. Зао С. и др. (Zhao et al., 2005), выполнивших анализ ПГЭ в ряде органов свиней аналогичных по происхождению и физиологическому состоянию с животными, исследованными нами, позволил получить полные совпадения по органоспецифичному ПГЭ печени свиней только по 27 из 102 генов (-27%). Эти 27 генов имели конститутивную экспрессию в печени, превосходящую порог в 400 с.и. у всех исследованных животных. Основные отличия были обусловлены вариабельной частью ПГЭ, гены которой так же подразделяются на функциональные группы, внутри которых получены статистически достоверные коэффициенты корреляции (г=0,96-1,00; Р<0,05, Р<0,01) при сравнении уровней экспрессии генов у разных животных, что по нашему мнению, отражают отличия в действии экзо- и эндогенных факторов, регулирующих их транскрипцию.

Обращает на себя внимание функциональная близость групп генов, внутри которых получены высокодостоверные коэффициенты корреляции в уровнях экспрессии генов у разных животных при сравнении ПГЭ печени и почек в наших исследованиях, а также при сравнении ПГЭ печени полученных нами и проф. Зао С. и др.

3.4. Функциональные особенности генов с вариабельной и конститутивной экспрессией.

В базе данных KEGG Metabolie pathway из 27 генов с конститутивной экспрессией и 25 - с выраженными индивидуальными отличиями по уровню экспрессии между животными (вариабельная часть ПГЭ), были представлены 17

и 18 генами, соответственно. Продукты генов первой группы участвовали в 25 метаболических путях, что соответствует, в среднем, по 1,5 пути на один ген, а на каждый ген второй группы приходилось по 3 метаболических пути (рис. 2).

Группа генов с вариабельной экспрессиеи_ I "руппа генов с конститутивной экспрессией

метаболические нуги

Рис. 2 Количество метаболических путей, в регуляции которых участвуют гены вариабельной

и конститутивной части ПГЭ

Таким образом, гены вариабельной части ПГЭ участвуют в большем количестве метаболических путей, чем гены конститутивной части ПГЭ. В этой связи можно ожидать, что гены вариабельной части ПГЭ имеют более сложную сеть генных взаимодействий, чем гены конститутивной части. Для выяснения этого, с использованием софта GNC Pro (SABiosciences, USA) построены графы, характеризующие сетевые функциональные взаимодействия между генами в обеих группах. Полученные данные наглядно демонстрируют большую сложность сетевых взаимоотношений между генами вариабельной части ПГЭ по сравнению с конститутивной (рис 3).

soc: (SYMDn) PLG

gERPlNCT (ATIII)

Рис. 3. Функциональное взаимодействие генов в группе с вариабельной (А) и конститутивной (Б) экспрессией

3.5. Влияние генетической компоненты изменчивости на толщину шпика и скорость прироста живой массы.

В одну из групп вариабельной части ПГЭ печени входили гены, продукты которых непосредственно участвуют в контроле липидного метаболизма. Очевидно, что генетически детерминированный полиморфизм регуляторных геномных элементов, в частности, промоторов структурных генов, может вносить существенный вклад в изменчивость экспрессии генов, критических для проявления желательных фенотипических признаков. В литературе накоплено много данных о связи SNP полиморфизма в промоторах ключевых генов липидного метаболизма с толщиной пшика у свиней (Chen С.С. et al., 2004; Liu D. et al., 2011; Oliveira Peixoto J. et al., 2006).

В наших исследованиях, в целях оценки вклада генетически детерминированного полиморфизма регуляторной области (промоторов) ключевых генов липидного метаболизма и миогенеза в изменчивость показателей толщины шпика и скорости прироста живой массы было выполнено генотипирование SNP в промоторах генов Lep, Sed, Myod, Myf6 и Opn, а также оценено их влияние на сайты посадки факторов регуляции транскрипции (ТФ) и рассчитаны ассоциации выявленных генотипов с проявлением сальных и мясных показателей у двух и трехпородных помесей свиней.

3.5.1. Влияние SNP на чувствительность к сайтам посадок ТФ.

Выявлен ряд предполагаемых сайтов распознавания факторов регуляции транскрипции, некоторые из которых отсутствовали на альтернативном варианте аллеля. Следовательно, можно заключить, что эффекты SNP обуславливают вариабельность экспрессии генов в связи с изменением последовательности ДНК критичной для посадки ТФ (табл. 3).

Таблица 3

Факторы регуляции транскрипции, потенциальные сайты связывания с которыми могут

быть изменены в результате SNP в промоторах генов Myf-6, Myod, Lep, Opn, Sed

Гены аллельный вариант Сайты посадок «новых» факторов транскрипции, вызванных мутациями в промоторных областях Цепь Точка мутации (выделено жирным) и последовательность, критичная для посадки ТФ (выделено подчеркиванием)

Myf-6 -375 С ТФ семейства ргатуЬеаё + айсссОСГТеИ

ТФ с парным доменом Рах-4/Рах-6 + ааЮСССйгйеШеаа

Т/С Т Печеночный ядерный фактор 1 + tGTTAatccçtggttgt

Myod -38 G/A G ТФ семействаКгирре1 + cttgccgcteGGGTteg

Lep А Окгамерсвязывающие белки ettTTGCaaatgtcatt

-12109 Т Гомеодоменные ТФтипа bicoid + tttgCTAAacctaaatt

Т/А мяРНКактивирующийбелковыйкомплекс + ctaaaCCTAaatttgçaat

Lep -11606 С/Т Т ТФс мотивом GATA - agcgGATAaeeaa

цАМФ-зависимые ТФ - aaaatattttGTAAgaaatat

ТФ предпочтительно связывающиеся с АТ-богатыми участками - ccaaaATATtttctaaeaaat

Opn -24 G/A ТФсемействаРАК/Ь71Р - aaatattttGTAAeaaa

А ТФ семейства ССААТ/энхансер-связываюшихся белков - aatattttGTAAgaa

ТФ с доменом forkhead + tcttacAAAAtatttte

ТФ предпочтительно связывающиеся с АТ-богатыми участками + acaaaATATtttgcaggaaaa

Sed ядерныйрецептор ROR-alpha и Rev-erb alpha + ggaaatacaaGACAcggtcgccc

-233 С T®basonucleinrDNA (Poll) - tgggcgaccgTGTCctgta

Т/С ТФ PAX-5 + acaggACAQgtcgcxxactgpçagctct

3.5.2. Анализ ассоциаций отдельных мононуклеотидных полиморфизмов (SNP) в промоторных областях генов кандидатов контроля признаков продуктивности.

Генотипирование полиморфных локусов генов Lep, Sed, Myod, Myfó, Opn выявило существенные отличия по распределению аллелей и генотипов по SNP промоторов изучаемых генов (табл.4). По генотипам SNP промотора гена Lep двух- и трехпородные помеси оказались более генетически гомогенными, чем по SNP промоторов других генов, включенных в анализ. По SNP генотипам промоторов генов Myf-6, Opn, Sed, Myod гетерозиготность, в среднем, была выше на 15% у свиней, полученных от двухпородного скрещивания, по сравнению с трехпородными помесями.

Анализ ассоциаций выявленных генотипов по SNP, с толщиной шпика над 6-7 грудным позвонком (BF) в группах животных, попадающих в экстремальные 5%-ные интервалы распределения значений этого признака, выявил, что двухпородные помеси с генотипом AG по гену Opn отличаются, в среднем, большей толщиной шпика по сравнению с животными с генотипом АА (Р<0,01). Следует подчеркнуть, что такая ассоциация выявлена только по SNP гена Opn и не имеет универсального характера, поскольку обнаруживается только у двухпородных помесей.

Таблица 4

Частоты встречаемости аллелей и генотипов (%) по полиморфным сайтам промоторных районов ключевых генов линидного метаболизма и регуляции мпогенеза в изученных

группах помесных животных

Полиморфный вариант Генотипы, аллели Частоты встречаемости аллелей и генотипов 7.2 Р

двухпородные помеси трехпородные помеси

Myf-6 -375 Т/С N=355 N=252

СС 4.5 20.2 35.470 Р< 0.001

ТС 30.7 60.3 51.487 Р <0.001

ТТ 64.8 19.5 119.940 Р <0.001

С 19.85 50.4 61.284 Р < 0.001

Т 80.15 49.6 61.284 Р < 0.001

Орп -24 G/A N=354 N=253

АА 46.9 97.6 172.067 Р < 0.001

ОА 53.1 2.4 172.067 Р <0.001

А 73.45 98.8 68.731 Р <0.001

О 26.55 1.2 68.731 Р< 0.001

Lep -12109 Т/А N=350 N=246

АА 2.0 6.9 7.760 -

ТА 29.4 25.6 0.858 -

ТТ 68.6 67.5 0.0378 -

А 16.7 19.7 0.691 -

Т 83.3 80.3 0.691 _

Lep -11606 С/Т N=352 N=255

СС 67.0 60.8 2.216

ТС 31.0 31.0 0.00790 -

ТТ 2.0 8.2 11.568 Р <0.001

с 82.5 76.3 3.163

Т 17.5 23.7 3.163 _

Sed -233 Т/С N=346 N=254

СС 24.3 0.8 63.909 Р <0.001

ТС 67.9 30.7 79.745 Р< 0.001

ТТ 7.8 68.5 239.549 Р <0.001

с 58.3 16.2 106.012 Р < 0.001

т 41.7 83.8 106.012 Р < 0.001

Myod -38 G/A N=339 N=243

АА 16.2 40.3 41.216 Р< 0.001

Ав 53.4 54.3 0.0170 .

ЄЄ 30.4 5.4 53.815 Р< 0.001

А 42.9 67.5 33.420 Р <0.001

й 57.1 32.5 33.420 Р <0.001

При анализе всей выборки животных наибольшее количество ассоциаций выявлено у двухпородных помесей между генотипами БИР промотора гена Орп с толщиной шпика, а также с характеристиками мясной продуктивности

(Р<0,05). Однако выявленные ассоциации оказались зависимыми от принадлежности животных к определенному типу скрещивания и полу (табл.5). У трехпородных помесей, независимо от их половой принадлежности, наблюдались статистически достоверные ассоциации между БЫР генотипами всех изучаемых генов и среднесуточными приростами живой массы в разные периоды онтогенеза (Р<0,05,Р<0,01,Р<0,001) (табл.5).

Таблица 5

Показатель уровня статистической достоверности ассоциации характеристик продуктивности с полиморфизмами в промоторной области генов с учетом половой

принадлежности

Показатель Уровень статистической достоверности

Двухпородые помеси с учетом половой принадлежности Трехпородные помеси без учета половой принадлежности

Ори Му 16 аг Муй Орт Ьер Т/А С/Г МуосІ

Толщина шпика над 6-7 грудными позвонками * *

Глубина длиннейшей мышцы спины М. йогй *

Среднесуточный прирост от рождения до отъема (А1Ю1) * *** * * ** ***

Среднесуточный прирост от отъема до 10 недель (АГЮ2) * *** *** ** ***

Среднесуточный прирост от рождения до дня забоя (АОвЗ) *

Масса туши *

Предубойная живя масса *

* Р<0,05; ** Р<0,01; ***Р<0,001

3.5.3. Анализ влияния межгенных взаимодействий на уровень развития хозяйственно-полезных признаков.

При анализе БОТ гена лептин [Т/А] обнаружено, что генотип ТТ ассоциирован с низкими среднесуточными приростами. Однако при рассмотрении одновременного влияния аллелей 6 полиморфных генов в группе животных с высокими приростами по этому БЫР неоднократно встречался генотип ТТ. По второму БОТ гена лептин [Т/С] без учета генотипов по

остальным генам генотип СС оказался ассоциированным с низкими среднесуточными приростами животных. В то же время у животных с высоким среднесуточным приростом с определенным сочетанием аллелей по другим генам по SNP гена лептин [Т/С] так же обнаруживается генотип СС. Аналогичная ситуация наблюдалась и по SNP промоторов генов Орп и Sed. То есть, при анализе отдельных генов обнаруживается влияние некоторых SNP генотипов на различия животных по характеристикам прироста живой массы. Однако, сцепление такого влияния разных генов в наших исследованиях не обнаружено.

Заключение

Выполненный нами анализ свидетельствует о том, что противоречия в оценках органоспецифичных ПГЭ обусловлены протяженными участками гомологии нуклеотидов в разных генах, приводящих к перекрестной гибридизации одной пробы с кДНК мРНК разных генов (или с разными участками внутри одного гена), влиянием экзогенных факторов, а так же генетической гетерогенностью животных, обусловленной наличием SNP в промоторных участках генов, влияющих на экспрессию генов-кандидатов контроля проявления хозяйственно-полезных признаков.

Выводы

1. Выявлены различия в оценках экспрессии отдельных генов, представленных на ДНК микроматрицах более чем одной пробой. Эти различия обусловлены протяженными участками гомологии нуклеотидов в разных генах. Как правило, такие гены принадлежат к супергенным семействам, имеющим общее происхождение, обусловливающее наличие общих функциональных участков (доменов).

2. Различия в оценках экспрессии структурных генов печени и почек свиней породы ландрас определены по генам ионного баланса крови, метаболизма ксенобиотиков, полиплоидизации клеток (в частности, динактин 3 -р22), что обусловлено функциональными и гистологическими отличиями между органами животного.

постоянен у исследованных животных, и вариабельную часть, объединяющую гены, уровень экспрессии которых различается у разных животных.

4. Гены вариабельной части находятся под влиянием общих для печени и почек регуляторных факторов, о чем свидетельствует статистически достоверная (Р<0,05; Р<0,01) корреляция (г=0,96-1,00) между оценками уровня экспрессии в разных органах у разных животных. Гены, отнесенные к вариабельной часта профиля, участвуют в два раза большем количестве метаболических путей, образуют более многообразные и сложные межгенные взаимодействия по сравнению с генами, отнесенными к конститутивной части профиля.

5. Выявлены статистически достоверные взаимосвязи показателей развития мясной продуктивности и скорости роста у свиней двух- и трехпородных помесей с мононуклеотидным полиморфизмом регуляторных областей (промоторов) ключевых генов контроля липидного метаболизма (Lep, Sed) и миогенеза (Myf-6, Myod), а так же определены факторы, лимитирующие достоверность прогноза исследуемых селекционных показателей у свиней: пол, возраст, тип скрещивания.

6. Уровень изменчивости показателей мясной продуктивности и скорости роста помесных животных зависит от структуры комплексных генотипов по мононуклеотидным полиморфизмам в промоторах генов Lep, Sed, Myf-6, Myod, Opn.

Предложения производству

1. При включении в селекционную работу с применением мировых генетических ресурсов импорт генетического материала для увеличения точности и надежности прогноза мясной продуктивности свиней следует учитывать характеристики экспрессии генов, входящих в конститутивную часть ПГЭ.

2. Для повышения уровня достоверности прогноза мясной продуктивности у двухпородных помесей свиней (крупная белая х дюрок) следует использовать оценку генотипов: по промоторам стеарил-КоА-десатуразы, остеопонтина и лептина у самцов, и по миогенному фактору 6 - у самок для прогноза скорости роста их живой массы.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Минобрнауки РФ

1. Glazko Т.Т., Khlopova N.S., Fahrenkrug S., Glazko V.I. Gene expression profiles in liver and kidney of pig // IZVESTIA Timiryazev Agricultural Academy. Scientific-theoretical Journal of the Russian State Agrarian University - Moscow Agricultural Academy named after K.A. Timiryazev. - 2009. - Special Issue March-May. -P. 55-60.

2. Глазко В.И., Хлопова H.C., Глазко T.T., Фаренкруг С. Сравнение профилей генной экспрессии в печени и почках свиней (Susscrofa) // Доклады Российской Академии сельскохозяйственных наук: Научно-теоретический журнал. - 2010. -№ 1. - С. 34-39.

3. Хлопова Н.С. Глазко Т.Т., Глазко В.И. Конститутивная и вариабельная компоненты профилей генной экспрессии печени свиней // Вавиловский журнал генетики и селекции.-2011.-Т. 15,-№16.-С. 130-138.

4. Хлопова Н.С. Стефанон Б., Гуатга Д., Глазко Т.Т., Глазко В.И. Мононуклеотидные полиморфизмы (SNP) промоторов генов кандидатов контроля характеристик продуктивности свиней // Доклады Российсой Академии сельскохозяйственных наук,- 2012.-№4.- С. 39-45.

Статьи в других изданиях:

1. Glazko Т., Khlopova N., Fahrenkrug S., John G., Glazko V. Gene Expression Profiles in Porcine Tissues of Liver and Kidney // Journal of Life Sciences. - 2011. - V. 5. -№3.-P. 192-200.

2. Хлопоза H.C., Глазко T.T. Оценки транскрипции с использованием ДНК микроматриц // Нанобиотехнологии в сельском хозяйстве: Доклады международной научно-практической конференции. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2008. - С. 66.

3. Хлопова Н.С. ДНК-микроматрицы (ДНК-биочипы) для сравнения профилей генной экспрессии в печени и почках свиней // Сборник студенческих научных работ. Вып. 15. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2009. - С. 170173.

4. Хлопова Н.С. Анализ профилей генной экспрессии и возможные источники ошибок // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов,

аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». [Электронный ресурс] - М.:: Изд-воМГУ,2009.-С. 31.

5. Глазко В.И., Хлопова Н.С., Глазко Т.Т. Нанобиотехнологии в исследованиях молекулярных основ хромосомного и клеточного фенотипов Нанотехнологии и наноматериалы // Нанотехнологии и наноматериалы: материалы международной научно-технической конференции (МГОУ). М.: Изд-во МГОУ, 2009. - С. 299 -304.

6. Khlopova N.S., Glazko V.I., Glazko Т.Т. Comparative analysis of gene expression profiles in liver and kidney of pigs // Proceedings of the international Moscow Conference on Computational Molecular Biology. Moscow, 2009. - P. 159-160.

7. Khlopova N.S., Glazko V.I., Glazko T.T. Differentiation of gene expression profiles data for liver and kidney of pigs // World Academy of Science Engeneering and Technology. Oslo, Norway, July 2009. Vol 55. - P. 267-270.

8. Khlopova N., Glazko Т., Glazko V. Genomics Methods in Investigation of Chromosome and Cell Phenotypes // ASCB Regular Abstracts. San-Diego, USA,

2009. - P. 628-629.

9. Хлопова H.C. Reproducing and variable part of organ-specific gene expression profiles in liver and kidney of pigs // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2010». Отв. Ред. И.А. Алекшовский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев, А.В. Андриянов. [Электронный ресурс] - М.: МАКСПресс, 2010.

10. Хлопова Н.С. Анализ Вариабельной части профилей генной экспрессии у свиней и возможные источники ошибок, связанных с перекрестной гибрилизациецией // Международная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 145-летию РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева: Сборник статей. В 2-х т. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2010. -Т. 1.-С. 333-336.

11. Khlopova N.S., Glazko Т.Т. Variable part of gene expression profiles in Liver and kidney of pigs // Proceedings of the Seventh International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology. Novosibirsk,

2010.-P. 132.

12. Khlopova N.S., Glazko T.T., Glazko V.I. DNA microarrays in revealing organspesific gene expression profiles in pigs // Proceedings of the VI Moscow International congress Biotechnology: state of the art & prospect of development, part 1. Moscow,

2011. -P. 426-427.

13.Khlopova N.S., Glazko T.T. DNA-microarrays and complexity of gene expression variability in porcine tissues // Proceedings of the conference Advances in Microarray

Technology. Hamburg, Germany, 2011. - P.67.

14. Khlopova N., Glazko T. Individual differences in gene expression in liver and kidney (Susscrofa) // Proceedings of the international Moscow conference on Computational molecular biology. Moscow, 2011. - P. 163-165.

15.Хлопова H.C. Вариабельная часть профилей генной экспрессии (ПГЭ) и факторы, влияющие на нее: материалы Международного молодежного научного форума «JIOMOHOCOB-2012». Отв. ред. А.И. Андреев, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, К.К. Андреев, М.В. Чистякова. [Электронный ресурс]. - М.: МАКС Пресс, 2012.

16.Khlopova N.S., Glazko Т.Т., Guiatti D., Stefanon В. Associations between promoter polymorphisms in key genes of lipid metabolism and miogenesis and economically valuable traits in pigs // The 8th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology: Abstracts. Novosibirsk, 2012.-P.144.

17.Poscic F., Khlopova N. New algorithm for identification of individual differences in gene expression. The 8th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology: Abstracts. Novosibirsk, 2012.- P.248.

18.Khlopova N.S., Glazko T.T., Guiatti D. Stefanon B. Association of SNPs in the promoter region of candidate genes for growth and carcass traits andtheir manifestation in pigs // Book of Abstracts of the 25th International Conference "Genetic Days", Wroclaw, Poland, 2012.-P.13-14.

19.Khlopova N.S., Glazko T.T., Guiatti D., Stefanon B. Effect of promoter polymorphisms in key genes of lipid metabolism and myogenesis and its associations with production traits of pigs // VIth International Scientific Symposium"Application of scientific researchers in pig production improvement and their influence on rural areas development", University of Technology and Life Sciences in Bydgoszcz, 2012. -P. 79.

20. Khlopova N.S., Glazko T.T. Key genes of economically valuable traits in pigs and complex character of its expression variability // IIIrd International Scientific Symposium for PhD Students and Students of Agricultural Colleges "Innovative researches in the field of animal breeding and production". University of Technology and Life Sciences in Bydgoszcz, 2012. - P. 177.

Подписано в печать 14.11.2012 г. Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Объем 1,0 п.л. Заказ 691 Тираж 100 экз.

Издательство ФГБОУ ВПО РГАЗУ 143900, Балашиха 8 Московской области

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хлопова, Наталия Сергеевна

Введение.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Современное состояние изученности генома свиньи.

1.2 Методы молекулярного анализа экспрессии генов, обоснование необходимости внедрения технологии ДНК-чипов в практику широкомасштабного транскриптомного анализа.

1.3 Перспективы использования ДНК микроматриц в фундаментальных и прикладных исследованиях.

1.3.1 Поиск различий в профилях генной экспрессии мышечной и жировой ткани в разные периоды онтогенеза у разных пород свиней.

1.3.2 Исследование динамики тканеспецифичных ПГЭ при применении различных рационов кормления и кормовых добавок, влияющих на проявление качественных и количественных характеристик мясосальной продуктивности свиней разных пород.

1.3.3 Применение ДНК матричных технологий для глубокого и детального изучения молекулярных основ системы репродукции свиней.

1.3.4 Широкомасштабный анализ изменений ПГЭ в ответ на патологические состояния, возникающие в организме в ответ на повреждающее действие болезнетворных агентов, с целью диагностики и контроля развития заболеваний животных на молекулярном уровне.

1.3.5 Создание баз данных о межорганных особенностях ПГЭ у животных, состояние здоровья которых находится в пределах клинической нормы.

1.3.6 Разработка тест систем для эндокринного контроля развития хозяйственно-полезных признаков у свиней.

1.3.7 Другие направления использования ДНК матриц.

1.3.8 Интеграция анализа ПГЭ с 8МР анализом.

1.4 Геномное сканирование методом 8№> анализа.

1.5 Поиск полиморфизмов в генах-кандидатах контроля липидного метаболизма и миогенеза у свиней.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объект исследования.

2.2 Материал исследований.

2.2.1 Дизайн и печать микроматриц для анализа ПГЭ.

2.2.2 Сбор образцов и процедура выделения нуклеиновых кислот (РНК, ДНК).-.

2.2.3 Получение первичных экспериментальных данных ПГЭ.

2.2.4 Получение первичных данных по 8ЫР в промоторах генов-кандидатов липидного обмена и маркеров развития мышечной ткани.

2.3 Методы исследований.

2.3.1 Анализ первичных данных ПГЭ.

2.3.2 Анализ первичных данных генотипирования.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Источники ошибок при анализе профилей генной экспрессии в печени, почках, сердце и тимусе свиней.

3.2 Органоспецифические особенности профилей генной экспрессии в печени и почках свиней.

3.3 Анализ воспроизводимости результатов оценок ПГЭ печени свиней.

3.4 Возможные молекулярные механизмы влияния мононуклеотидных замен в промоторах генов Lep, Sed, Myf-6, Myod и Opn на прочность связывания с факторами регуляции транскрипции.

3.5 Анализ ассоциаций SNP в промоторной области генов-кандидатов контроля липидного обмена и миогенеза с хозяйственно-полезными признаками.

3.6 Анализ влияния мононуклеотидных полиморфизмов в промоторных областях ключевых генов-кандидатов метаболизма липидов и миогенеза на сальные характеристики свиней.

3.6.1 Статистический анализ ассоциаций генотипов по SNP с показателем толщины шпика у животных, попадающие в экстремальные 5%-ные интервалы распределения значений этого признака.

3.6.2 Статистический анализ ассоциаций генотипов по SNP с хозяйственно-полезными характеристиками у всей выборки животных двух- и трехпородных помесей.

3.6.3 Статистический анализ ассоциаций межгенных взаимодействий на проявление хозяйственно-полезных признаков.

Обсуждение результатов исследований.

Выводы.

Предложения производству.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Сравнительный анализ органоспецифичных профилей генной экспрессии у свиней"

Актуальность темы исследования. Развитие животноводства требует ускорения селекционного процесса, что невозможно без увеличения надежности оценки генетического потенциала племенного поголовья. В этих целях разрабатываются методы применения молекулярно-генетических маркеров развития желательного фенотипа (количества и качества конечной продукции, устойчивости к условиям содержания, контроля наличия наследственных заболеваний и инфицированности патогенами) (Зиновьева Н.А. и др., 2010). ДНК микроматрицы (матрицы ДНК проб) позволяют осуществлять одновременное генотипирование многих геномных участков по мононуклеотидным полиморфизмам (Single Nucleotide Polymorphisms -SNP), оценивать активность транскрипции различных генов (профили генной экспрессии - ПГЭ). Включение генетических маркеров в селекционные программы увеличивает надежность селекционной работы при сохранении оптимального уровня генетического разнообразия, обеспечивает проведение отбора и подбора животных с учетом генотипической оценки (Дунин И.М. и др., 1994; Калашникова JI.A. и др., 2001; Харченко П.Н., Глазко В.И., 2006; Эрнст JI.K., 2008). В свиноводстве с использованием ДНК микроматриц получено огромное количество данных о ткане- и органоспецифической экспрессии генов как у здоровых свиней (Lin C.S., Hsu C.W., 2005; Li M.Z. et al., 2008; Damon M. et al., 2012), так и при различных патологических состояниях (Chomwisarutkun К. et al., 2011; Maak S. et al., 2009). Выявлены определенные ассоциации между SNP в структурных и регуляторных областях генов и желательным развитием хозяйственно-полезных признаков (Wyszynska-Koko J. et al., 2006; Guiatti В. et al., 2011). Однако низкая воспроизводимость таких данных ограничивает внедрение маркерной селекции в животноводство. Это может быть связано с рядом причин: сложностью систем регуляции генной экспрессии (Шихов И.Я., 2007; Cheon

Y. et al., 2005), возможностью перекрестной гибридизации ДНК проб (Okoniewski М. J., Miller С. J., 2006), техническими и статистическими погрешностями обработки данных (Nguyen Т.Т. et al., 2010), изменчивостью вкладов генотипической и паратипической компонент в проявление признака в разных условиях окружающей среды. В этой связи особую актуальность приобретают исследования возможных причин неоднозначности выявленных ассоциаций между ПГЭ, SNP регуляторных областей предполагаемых «критических» генов и желательным проявлением хозяйственно-полезныхпризнаков.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

Научная новизна исследований. Впервые выявлены факторы, влияющие на изменчивость оценок экспрессии генов в разных органах и тканях отдельных особей, и между разными животными. Выявлен фактор (перекрестная гибридизация), связанный с наличием гомологичных последовательностей как внутри отдельных структурных генов, так и между разными генами, что приводит к перекрестной гибридизации проб ДНК микроматриц с кДНК более чем одной мРНК. Показано, что индивидуальная изменчивость экспрессии разных генов тесно связана с функциональными особенностями кодируемых ими белков и количеством метаболических путей, в регуляции которых они участвуют. Впервые выявлены и описаны две, хорошо идентифицируемые, составляющие органоспецифичного ПГЭ, одна включает гены, экспрессия которых отличается у разных животных, обозначенная нами как «вариабельная» часть ПГЭ, и другая объединяет гены, оценки экспрессии которых не имели индивидуальной изменчивости, составляющие, по нашему определению, «конститутивную» часть ПГЭ. Впервые получены данные о том, что продукты генов «вариабельной» части профиля участвуют в контроле в два раза большего количества метаболических путей и находятся в более сложных межгенных сетевых взаимоотношениях по сравнению с генами «конститутивной» части, что позволяет выделить в качестве ведущего фактора индивидуальной изменчивости их экспрессии средовую компоненту. На основании генотипирования SNP в регуляторных последовательностях (промоторах) ключевых генов липидного обмена и миогенеза обнаружено, что ассоциации между моногенными и комплексными генотипами с характеристиками сальности свиней и динамикой миогенеза зависят от пола, возраста исследуемых животных, а также от особенностей типа скрещивания (двух- и трехпородные помеси).

Впервые получены и проанализированы данные об ассоциациях между мононуклеотидными полиморфизмами промоторов генов-кандидатов контроля липидного обмена и миогенеза, как отдельных, так и комплексных генотипов, и проявлением характеристик сальности и динамики миогенеза. Показано, что выявленные моногенные и комплексные генотипы могут быть непосредственно использованы для прогноза проявления хозяйственно-полезных характеристик с учетом ограничений надежности таких связей возрастом, полом и типом скрещивания свиней (двух- и трехпородные помеси).

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Воспроизводимость оценок ПГЭ зависит от наличия/отсутствия перекрестной гибридизации между пробами ДНК микроматриц и участками гомологии внутри- и между кДНК мРНК разных генов.

3) Ассоциации между молекулярно-генетическими маркерами -мононуклеотидными полиморфизмами промоторов генов-кандидатов контроля проявления мясной продуктивности у свиней приемлемы для прогноза развития признаков продуктивности с учетом ограничений надежности такого прогноза возрастом, полом и типом скрещивания животных (двух- и трехпородные помеси).

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертации были представлены в виде докладов на VI Международном научном симпозиуме «Прикладные исследования для улучшения производства свинины и их влияние на развитие сельских территорий» (Быдгощ-Торунь, Польша, 2012); III Международном симпозиуме для аспирантов и студентов аграрный вузов (Быдгощ-Торунь, Польша, 2012), 25й Международной конференции «Генетические Дни» (Вроцлав, Польша, 2012); Международной конференции «Достижения в микрочиповых технологиях» \ АМТ (Гамбург, Германия, 2011); 7й и 8й международных конференциях по биоинформатике регуляции генома и структурной/системной биологии / ВОЯ8\8В (Новосибирск, 2010; 2012); Международной московской конференции по вычислительной молекулярной биологии / МССМВ (Москва, 2009; 2011); XVI, XVII и XIX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2009; 2010; 2012); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию академии имени К. А. Тимирязева (Москва, 2010); Международной конференции по бионаукам и биотехнологии / 1СВВ (Осло, Норвегия, 2009), 49й встрече американского общества по клеточной биологии / АБСВ (Сан-Диего, США, 2009); Международной научно-технической конференции: нанотехнологии и наноматериалы (Москва, 2009); 62-й Международной студенческой научной конференции (Москва, 2009) Международной научно-практической конференции Нанотехнологии в сельском хозяйстве (Москва, 2008).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 24 научных работы общим объемом 6,3 п.л. с личным вкладом автора (75%), включая 4 статьи в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Минобрнауки РФ и 1 статью в иностранном англоязычном издании.

Заключение Диссертация по теме "Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства", Хлопова, Наталия Сергеевна

Выводы

2. Различия в оценках экспрессии структурных генов печени и почек свиней породы ландрас определены по генам ионного баланса крови, метаболизма ксенобиотиков, полиплоидизации клеток (в частности, динактин 3 - р22), что обусловлено функциональными и гистологическими отличиями между органами животного.

3. Данные полученных профилей генной экспрессии по образцам печени и почек свиней породы ландрас можно условно подразделить на конститутивную часть, включающую гены, уровень экспрессии которых постоянен у исследованных животных, и вариабельную часть, объединяющую гены, уровень экспрессии которых различается у разных животных.

4. Гены вариабельной части находятся под влиянием общих для печени и почек регуляторных факторов, о чем свидетельствует статистически достоверная (Р<0,05; Р<0,01) корреляция (г=0,96-1,00) между оценками уровня экспрессии в разных органах у разных животных. Гены, отнесенные к вариабельной части профиля, участвуют в два раза большем количестве метаболических путей, образуют более многообразные и сложные межгенные взаимодействия по сравнению с генами, отнесенными к конститутивной части профиля.

Предложения производству

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Хлопова, Наталия Сергеевна, Москва

1.H. Молекулярные и физиологические механизмы старения. -Спб.: Изд-во "Наука", 2003. -468 с.

2. Глазко В.И. Геномная селекция крупного рогатого скота: исследовательские и прикладные задачи // Известия ТСХА.-2011.-№ 5.-С. 126-135.

3. Дружевская A.M. Полиморфизмы генов миогенного фактора 6 и альфа-актина-3 и их ассоциация со структурой и функцией склетных мышц человека: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.01.04-Спб. 2010. -20 с.

4. Дунин И.М., Лебенгарц Я.З., Аджубеков К.К. Генотипическая и возрастная изменчивость ферментов сыворотки крови молочного скота различных экологических зон // Молекулярно генетические маркеры животных.- 1994.-С. 16-17.

5. Зиновьева H.A., Костюнина О.В., Гладырь Е.А., Банникова А.Д., Харзинова В.Р., Ларионова П.В., Шавырина K.M., Эрнст Л.К. Роль ДНК-маркеров признаков продуктивности сельскохозяйственных животных // Зоотехния. -2010. -№ 1. -С. 8-10.

6. Калашникова Л.А., Дунин И.М., Глазко В.И. Селекция XXI века: использование ДНК-технологий / Минсельхоз РФ. ВНИИПлем.-Моск. обл.: Лесные Поляны, 2001. 50 с.

7. Козликин A.B. Мясная продуктивность и биологические особенности чистопородных и помесных свиней: Дис. . канд. с.-х. наук: 06.02.01, 06.02.04- п. Персиановский, 2006.-169 с.

8. Орешин A.M. Оценка генотипа и фенотипа свиней (Sus scrofa) по гену лептина: Автореф. дис. канд. биол. наук: 06.02.01,06.02.07-Саранск, 2010. -19 с.

9. Харченко П.Н., Глазко В.И. ДНК-технологии в развитии агробиологии.-М.: Воскресенье, 2006. -480 с.

10. Ширинский В.П., Степанова О.В., Куликова Т.Г., Хапчаев А.Ю. Молекулярно-генетические механизмы развития сердца и перспективы восстановления миокарда при сердечной недостаточности // Кардиологический вестник.-2009.-№ 2.-С. 70-77.

11. Шихов И.Я. Интерференционная РНК как защита клетка от трансгенеза // Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология животных. 2009. -№ 4. -С. 3-13.

12. Шихов И.Я. Нанотехнологии в изучении работы генов // Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология животных. 2007. - № 6. -С. 3-8.

13. Эрнст JI.K. Роль биологии в развитии животноводства в XXI веке // Достижения науки и техники АПК. -2008. -№ 10. -С. 7-8.

14. Agsteribbe E., Faassen H., Hartog M.V., Reversma Т., Taanman J.W., Pannekoek H., Evers R.F., Welling G.M., Berger R. Nucleotide sequence of cDNA encoding human fumarylacetoacetase // Nucleic Acids Research.-1990 .-Vol. 18.-P. 1887.

15. Andersen B., Rosenfeld M.G. POU domain factors in the neuroendocrine system: lessons from developmental biology provide insights into human disease. Endocrine Reviews.-2001.-Vol. 22.-P. 2-35.

16. Aromolaran K.A., Benzow K.A., Koob M.D., Piedras-Rentería E.S.The Kelch-like protein 1 modulates P/Q-type calcium current density // Neuroscience.-2007.-Vol. 145.-P. 841-850.

17. Bajic V.B., Tan S.L., Christoffels A., Schonbach C., Lipovich L., Yang L., Hofmann O., Kruger A., Hide W., Kai C., Kawai J., Hume D.A., Carninci P., Hayashizaki Y. Mice and men: their promoter properties // PLoS Genetics.-2006.-Vol. 2.-P.54.

18. Biswas M.G., Russell D.W., Expression cloning and characterization of oxidative 17beta- and 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenases from rat and human prostate // Journal of Biological Chemistry.-1997.-Vol. 272.-P. 15959-15966.

19. Blair A. , Ngo L. , Park J ., Paulsen I.T. , Saier M.H.Jr. Phylogenetic analyses of the homologous transmembrane channel-forming proteins of the F0F1-ATPases of bacteria, chloroplasts and mitochondria // Microbiology.-1996.-Vol. 142.-P. 17-32.

20. Caetano A.R., Johnson R.K., Ford J.J., Pomp D. Microarray profiling for differential gene expression in ovaries and ovarian follicles of pigs selected for increased ovulation rate//Genetics.-2004.Vol. 168.-P. 1529-1537.

21. Cagnazzo M., Pas M.F., Priem J., Wit A.A., Pool M., Davoli R., Russo V.V. Comparison of prenatal muscle tissue expression profiles of two pig breeds differing in muscle characteristics // Journal of animal science.-2006.-Vol. 84.-P. 1-10.

22. Canovas A., Quintanilla R., Amills M., Pena R. N. Muscle transcriptomic profiles in pigs with divergent phenotypes for fatness traits // BMC Genomics.-2010,-Vol. 11.-P. 372.

23. Carmeliet P., Collen D. Genetic Analysis Of The Plasminogen And Coagulation System In Mice // Haemostasis.-1996.-Vol. 26.-P. 132-153.

24. Cartharius K. Matlnspector and beyond: promoter analysis based on transcription factor binding sites // FASEB Journal.-2003.-Vol. 17.-P. 1228-1237.

25. Cartharius K., Freeh K., Grote K., Klocke B., Haltmeier M., Klingenhoff A., Frisch M., Bayerlein M., Werner T. Matlnspector and beyond: promoter analysis based on transcription factor binding sites Bioinformatics.-2005.-Vol. 21.-P. 29332942.

26. Chen C.C., Chang T., Su H.Y. Genetic polymorphisms in porcine leptin gene and their association with reproduction and production traits // Australian Journal of Agricultural Research.-2004.-Vol. 55.-P. 699-704.

27. Chen J., Song C., Redinger R.N. Effects of dietary cholesterol on hepatic production of lipids and lipoproteins in isolated hamster liver // Hepatology.-1996.-Vol. 24.-P. 424-434.

28. Chomwisarutkun K., Murani E., Ponsuksili S., Wimmers K. Microarray analysis reveals genes and functional networks relevant to the predisposition to inverted teats in pigs // Journal of Animal Science.-2012.-Vol. 90.-P. 1-15

29. Costa N., McGillivray C., Bai Q., Wood J.D., Evans G., Chang K.C. Restriction of dietary energy and protein induces molecular changes in young porcine skeletal muscles // The Journal of nutrition.-2004.-Vol. 134.-P. 2191-2199.

30. Courtois G., Morgan J.G., Campbell L.A., Fourel G., Crabtree G.R. Interaction of a liver-specific nuclear factor with the fibrinogen and alpha 1-antitrypsin promoters // Science.-1987.-Vol. 238.-P. 688-692.

31. Damon M., Wyszynska-Koko J., Vincent A., Hérault F., Lebret B. Comparison of muscle transcriptome between pigs with divergent meat quality phenotypes identifies genes related to muscle metabolism and structure // PLoS One.-2012.-Vol. 7.-P. 33763.

32. D'Andrea M., Dal Monego S., Pallavicini A., Modonut M., Dreos R., Stefanon B., Pilla F. Muscle transcriptome profiling in divergent phenotype swine breeds during growth using microarray and RT-PCR tools // Animal Genetics.-2011.-Vol. 42.-P. 501-509.

33. Dang D.T., Pevsner J., Yang V.W. The biology of the mammalian Kruppel-like family of transcription factors // The International Journal of Biochemistry and Cell Biology.-2000.-Vol. 32.-P.1103-1121.

34. David H. Quantitative and qualitative changes in the mitochondria in hepatocytes during postnatal development of male rats // Experimental Pathology.-1979.-Vol. 17.-P. 359-373.

35. Dvorak C.M., Hyland K.A., Machado J.G., Zhang Y., Fahrenkrug S.C., Murtaugh M.P. Gene discovery and expression profiling in porcine Peyer's patch // Veterinary immunology and immunopathology.-2005.-Vol. 105.-P. 301-315.

36. Dworkin S., Malaterre J., Hollande F., Darcy P.K., Ramsay R.G., Mantamadiotis T. cAMP response element binding protein is required for mouseneural progenitor cell survival and expansion // Stem Cells.-2009.-Vol. 27.-P. 1347-1357.

37. Ekmekci O.B., Ekmekci H. // Vitronectin in atherosclerotic disease. International Journal of Clinical Chemistry and Diagnostic Laboratory Medicine.-2006,-Vol. 368.-P. 77-83.

38. Ezashi T., Telugu B.P., Alexenko A.P., Sachdev S., Sinha S., Roberts R.M. Derivation of induced pluripotent stem cells from pig somatic cells // Proceedings of the National Academy of Sciences.-2009.-Vol. 106.-P. 10993-10998.

39. Flori L., Fritz S., Jaffrezic F., Boussaha M. Gut I., Heath S., Foulley J.-L., Gautier M. The Genome Response to Artificial Selection: A Case Study in Dairy Cattle // PLoS ONE.-2009.-Vol. 4.-P. 6595.

40. Flowers M.T., Ntambi J.M. Role of stearoyl-coenzyme A desaturase in regulating lipid metabolism // Current Opinion in Lipidology.-2008.-Vol.19.-P. 248-256.

41. Forman B.M., Chen J., Blumberg B., Kliewer S.A., Henshaw R., Ong E.S., Evans R.M. Cross-talk among ROR alpha 1 and the Rev-erb family of orphan nuclear receptors // Molecular Endocrinology.-1994.-Vol. 8.-P. 1253-1261.

42. Foster S.L., Hargreaves D.C., Medzhitov R. Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin modifications // Nature.-2007,-Vol. 447.-P. 972-978.

43. Foster T.E., Puskas B.L., Mandelbaum B.R., Gerhardt M.B., Rodeo S.A. Platelet-Rich Plasma: From Basic Science to Clinical Applications // The American Journal of Sports Medicine.-2009.-Vol. 37.-P. 2259-2272.

44. Gachon F., Olela F.F., Schaad O., Descombes P., Schibler U. The circadian PAR-domain basic leucine zipper transcription factors DBP, TEF, and HLF modulate basal and inducible xenobiotic detoxification // Cell Metabolism.-2006.-Vol. 4.-P. 25-36.

45. Gladney C.D., Bertani G.R., Johnson R.K., Pomp D. Evaluation of gene expression in pigs selected for enhanced reproduction using differential display PCR and human microarrays: I. Ovarian follicles // Journal of animal science.-2004.-Vol. 82.-P. 17-31.

46. Glenn K.C., Frost G.H., Bergmann J.S., Carney D.H. Synthetic peptides bind to high-affinity thrombin receptors and modulate thrombin mitogenesis // Peptide Research.-1988.-Vol. l.-P. 65-73.

47. Granadino B.; Perez-Sanchez C.; Rey-Campos J. Fork Head Transcription Factors // Current Genomics.-2000.-Vol. l.-P. 353-382.

48. Green J.A., Kim J.G., Whitworth K.M., Agca C., Prather RS. The use of microarrays to define functionally-related genes that are differentially expressed in the cycling pig uterus // Reproduction (Cambridge, England).-2006.-Vol. 62.-P. 163-176.

49. Guiatti D., Sgorlon S., Chessa S., Raschetti M., Stefanon B. Targeting DNA variability in the promoter region of candidate genes to carcass traits of heavy pigs // Italian Journal of Animal Science.-201 l.-Vol. 10.-P. 14.

50. Guyonnet B., Marot G, Dacheux J.L., Mercat M.J., Schwob S., Jaffrezic F., Gatti J.L. The adult boar testicular and epididymal transcriptomes // BMC Genomics.-2009.-Vol. 10.-P. 369.

51. Hammamieh R., Bi S., Das R., Neill R., Jett M. Modeling of SEB-induced host gene expression to correlate in vitro to in vivo responses // Biosensors and Bioelectronics.-2004.-Vol. 20.-P. 719-727.

52. Haumaitre C., Barbacci E., Jenny M., Ott M.O., Gradwohl G., Cereghini S. Lack of TCF2/vHNFl in mice leads to pancreas agenesis // Proceedings of the National Academy of Sciences USA.-2005.-Vol. 102.-P. 1490-1495.

53. Hausman G.J., Poulos S.P., Richardson R.L., Barb C.R., Andacht T., Kirk H.C., Mynatt R.L. Secreted proteins and genes in fetal and neonatal pig adipose tissue and stromal-vascular cells // Journal of animal science.-2006.-Vol. 84. -P. 1666-1681.

54. Hazard D., Liaubet L., SanCristobal M., Mormede P. Gene array and real time PCR analysis of the adrenal sensitivity to adrenocorticotropic hormone in pig // BMC Genomics.-2008.-Vol. 9.-P. 101.

55. He C., Cheng H., Zhou R. GATA family of transcription factors of vertebrates: phylogenetics and chromosomal synteny // Journal of Biosciences.-2007.-Vol. 32.-P. 1273-1280.

56. Helle K.B., Corti A., Metz-Boutigue M.H., Tota B. The endocrine role for chromogranin A: a prohormone for peptides with regulatory properties // Cellular and Molecular Life Sciences.-2007.-Vol. 64.-P. 2863-2886.

57. Horcher M., Souabni A., Busslinger M.Pax 5/BSAP maintains the identity of B cells in late B lymphopoiesis // Immunity.-2001.-Vol. 14.-P. 779-790.

58. Hornshoj H. Application of bioinformatics for microarray platform development and analysis of global gene expression in porcine tissues: Dissertation for the PhD Degree: -University of Aarhus, 2008.-171 p.

59. Hornshoj H., Conley L.N., Hedegaard J., Sorensen P., Panitz F., Bendixen C. Microarray expression profiles of 20.000 genes across 23 healthy porcine tissues // PLoS One.-2007.-Vol. 2.-P. 1203.

60. Huang L, Yoneda M, Kimata K, A serum-derived hyaluronan-associated protein (SHAP) is the heavy chain of the inter alpha-trypsin inhibitor // Journal of Biological Chemistry.-1993.-Vol. 268.-P. 26725-2630.

61. Humm A, Fritsche E, Steinbacher S, Huber R. Crystal structure and mechanism of human L-arginine:glycine amidinotransferase: a mitochondrial enzyme involved in creatine biosynthesis // EMBO Journal.-1997.-Vol. 16.-P. 3373-3385.

62. Huttner W.B, Gerdes H.H, Rosa P. The granin (chromogranin/secretogranin) family // Trends in Biochemical Sciences.-1991.-Vol. 16.-P. 27-30.

63. Jay L, Zweier J.L, Wooten J.B, Cohen J.S. Studies of anion binding by transferrin using carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy // Biochemistry.-1981.-Vol. 20.-P. 3505-3510.

64. Jenner R.G, Young R.A. Insights into host responses against pathogens from transcriptional profiling // Nature Reviews Microbiology.-2005.-Vol.3.-P. 281-294.

65. Jetten A.M. Retinoid-related orphan receptors (RORs): critical roles in development, immunity, circadian rhythm, and cellular metabolism // Nuclear Receptor Signaling.-2009.-Vol.7.-P. 3.

66. Jitrapakdee S., St Maurice M., Rayment I., Cleland W.W., Wallace J.C., Attwood P.V. Structure, mechanism and regulation of pyruvate carboxylase // Biochemical Journal.-2008.-Vol. 413.-P. 369-387.

67. Jones S.E., Jomary C. Clusterin // The international journal of biochemistry and cell biology.-2002.-Vol. 34.-P. 427-431.

68. Jorgensen R., Sogaard T. M., Rössing A.B., Martensen P.M., Justesen J. Identification and Characterization of Human Mitochondrial Tryptophanyl-tRNA Synthetase // The Journal of biological chemistry.-2000.-Vol. 275.-P. 1682016826.

69. Jouffe V., Rowe S., Liaubet L., Buitenhuis B., Hornshoj H., SanCristobal M., Mormede P., Koning DJ. Using microarrays to identify positional candidate genes for QTL: the case study of ACTH response in pigs // BMC Proceedings.-2009.-Vol. 3.-P. 14.

70. Kanzaki T., Wang A. M., and Desnick R. J. Lysosomal alpha-N-acetylgalactosaminidase deficiency, the enzymatic defect in angiokeratoma corporis diffusum with glycopeptiduria // The Journal of Clinical Investigation.-1991.-Vol 88.-P. 701-711.

71. Kim M., Mc Ginnis W. Phosphorylation of Grainy head by ERK is essential for wound-dependent regeneration but not for development of an epidermal barrier

72. Proceedings of the National Academy of Sciences USA.-201 l.-Vol. 108.-P. 650655.

73. Klingenhoff A., Freeh K., Werner T. Regulatory modules shared within gene classes as well as across gene classes can be detected by the same in silico approach // In Silico Biology.-2002.-Vol. 2.-P. 17-26.

74. Kostecka Z., Blahovec J., Animal insulin-like growth factor binding proteins and their biological functions // Veterinary medicine.-2002.-Vol. 47.-P. 75-84.

75. Lahmers S., Wu Y., Call D.R., Labeit S., Granzier H. Developmental control of titin isoform expression and passive stiffness in fetal and neonatal myocardium // Circulation research.-2004.-Vol. 94.-P. 505-513.

76. Larsson L.I., St-Onge L., Hougaard D.M., Sosa-Pineda B., Gruss P. Pax 4 and 6 regulate gastrointestinal endocrine cell development // Mechanisms of Development.-1998.-Vol. 79.-P. 153-159.

77. Ledger T.N., Pinton P., Bourges D., Roumi P., Salmon H., Oswald I.P. Development of a macroarray to specifically analyze immunological gene expression in swine // Clinical and diagnostic laboratory immunology.-2004.-Vol. 11.-P. 691-698.

78. Li S., Zhang H., Gao P., Chen Z., Wang C., Li J. A functional mutation at position -155 in porcine APOE promoter affects gene expression // BMC Genetics.-2011.-Vol. 12.-P. 40.

79. Li Y., Zhou H., Wen Z., Wu S., Huang C., Jia G., Chen H., Jin M. Transcription analysis on response of swine lung to H1N1 swine influenza virus // BMC Genomics.-2011.-Vol. 12.-P. 398.

80. Lin C.S., Hsu C.W. Differentially transcribed genes in skeletal muscle of Duroc and Taoyuan pigs // Journal of animal science.-2005. -Vol. 84.-P. 20752086.

81. Liu D., Hu Y., Yang X., Liu Y., Wei S., Jiang Y. Identification and genetic effects of a novel polymorphism in the distal promoter region of porcine leptin gene // Molecular Biology Reports.-201 l.-Vol. 38.-P. 2051-2057.

82. Liu Y., Zhang J.Recent development in NMDA receptors // Chinese medical journal.-2000.-Vol. 113.-P. 948-956.

83. Machado J.G., Hyland K.A., Dvorak C.M., Murtaugh M.P. Gene expression profiling of jejunal Peyer's patches in juvenile and adult pigs // Mammalian Genome.-2005.-Vol. 16.-P. 599-612.

84. Merritt C.M., Board P.G., Structure and characterisation of a duplicated human alpha 1 acid glycoprotein gene // Gene.-1988.-Vol. 66.-P. 97-106.

85. Mindnich R., Moller G., Adamski J. The role of 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenases // Molecular and Cellular Endocrinology 2004.-Vol. 218.-P. 7-20.

86. Mitchell J.W., Baik N., Castellino F.J., Miles L.A. Plasminogen inhibits TNFa-induced apoptosis in monocytes // Blood.-2006.-Vol. 107.-P. 4383-4390.

87. Mittal V., Ma B., Hernandez N. SNAP(c): a core promoter factor with a built-in DNA-binding damper that is deactivated by the Oct-1 POU domain // Genes.-1999,-Vol. 13.-P. 1807-1821.

88. Moe M., Lien S., Bendixen C., Hedegaard J., Hornshoj H., Berget I., Meuwissen T.H., Grindflek E. Gene expression profiles in liver of pigs with extreme high and low levels of androstenone // BMC Veterinary Research.-2008.-Vol. 4.-P. 29.

89. Moe M., Meuwissen T., Lien S., Bendixen C., Wang X., Conley L.N., Berget I., Tajet H., Grindflek E. Gene expression profiles in testis of pigs with extreme high and low levels of androstenone // BMC Genomies.-2007.-Vol. 8.-P. 405.

90. Montminy M.R., Bilezikjian L.M. Binding of a nuclear protein to the cyclic-AMP response element of the somatostatin gene // Nature.-1987.-Vol. 328.-P. 175 178.

91. Moody D.E., Zou Z., Mclntyre L. Cross-species hybridisation of pig RNA to human nylon microarrays // BMC Genomics.-2002.-Vol. 3.-P. 27.

92. Moon J.K., Kim K.S., Kim J.J., Choi B.H., Cho B.W., Kim T.H., Lee C.K.Differentially expressed transcripts in adipose tissue between Korean native pig and Yorkshire breeds // Animal Genetics.-2009.-Vol. 40.-P. 115-118.

93. Mosesson M.W. Fibrinogen and fibrin structure and functions // Journal of Thrombosis and Haemostasis.-2005.-Vol. 3.-P. 1894-1904.

94. Mosesson M.W. Fibrinogen gamma chain functions. Journal of Thrombosis andHaemostasis.-2003.-Vol. l.-P. 231-238.

95. Nei M., Rogozin I.B., Piontkivska H. Purifying selection and birth-and-death evolution in the ubiquitin gene family // Proceedings of the National Academy of Sciences USA.-2000.-Vol. 97.-P. 10866-10871.

96. Nguyen T.T., Almon R.R., DuBois D.C., Jusko W.J., Androulakis I.P. Importance of replication in analyzing time-series gene expression data:

97. Corticosteroid dynamics and circadian patterns in rat liver, available at http://www.biomedcentral.com/1471 -2105/11 /279.

98. Nobis W, Ren X, Suchyta S.P, Suchyta T.R, Zanella A.J, Coussens P.M. Development of a porcine brain cDNA library, EST database, and microarray resource//Physiological genomics.-2003.-Vol. 16.-P. 153-159.

99. Novak S, Ruiz-Sanchez A, Dixon W.T, Foxcroft G.R, Dyck M.K. Seminal plasma proteins as potential markers of relative fertility in boars // Journal of Andrology.-2010.-Vol. 31.-P. 188-200.

100. Okomo-Adhiambo M, Beattie C, Rink A. cDNA microarray analysis of host-pathogen interactions in a porcine in vitro model for Toxoplasma gondii infection // Infection and immunity.-2006,-Vol. 74.-P. 4254-4265.

101. Okoniewski M. J, Miller C. J. Hybridisation interactions between probesets in short oligo microarrays lead to spurious correlations // BMC Bioinformatics.-2006.-Vol. 7.-P. 276.

102. Oliveira Peixoto J, Facioni Guimaraes S.E, Savio Lopes P, Menck Soares M.A, Vieira Pires A, Gualberto Barbosa M.V, de Almeida Torres R, de Almeida

103. E. S.M. Associations of leptin gene polymorphisms with production traits in pigs // Journal of Animal Breeding and Genetics.-2006.-Vol. 123.-P. 378-383.

104. Pas M.F., Wit A.A., Priem J., Cagnazzo M., Davoli R., Russo V., Pool M. Transcriptome expression profiles in prenatal pigs in relation to myogenesis. // Journal of muscle research and cell motility.-2005.-Vol. 26.-P. 157-165.

105. Prochownik E.V., Markham A.F., Orkin S.H. Isolation of a cDNA clone for human antithrombin III // Journal of Biological Chemistry.-1983.-Vol. 258.-P. 8389-8394.

106. Qiao M., Wu H.Y., Li F.E., Jiang S.W., Xiong Y.Z., Deng C.Y. Molecular characterization, expression profile and association analysis with carcass traits of porcine LCAT gene // Molecular Biology Reports.-2010.-Vol. 37.-P. 2227-2234.

107. Qu A., Rothschild M.F., Stahl C.H. Effect of dietary phosphorus and its interaction with genetic background on global gene expression in porcine muscle // Journal of Animal Breeding and Genetics.-2007.-V. 124.-P. 214-224.

108. Ramji D.P. and Foka P. CCAAT/enhancer-binding proteins: structure, function and regulation // Biochemical Journal.-2002.-Vol. 365.-P. 561-575.

109. Redondo C., Vouropoulou M., Evans J., Findlay John. // Identification of the retinol-binding protein (RBP) interaction site and functional state of RBPs for the membrane receptor // The FASEB Journal.-2008.-Vol. 22.-P. 1043-1054.

110. Reiner G., Hepp S., Hertrampf B., Kliemt D., Mackenstedt U., Daugschies A., Zahner H. Genetic resistance to Sarcocystis miescheriana in pigs following experimental infection // Veterinary Parasitology.-2007.-Vol. 145.-P. 2-10.

111. Reiner G., Willems H., Pesch S., Ohlinger V.F. Variation in resistance to the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in Pietrain and Miniature pigs // Journal of Animal Breeding and Genetics.-2010.-Vol. 127.-P. 100-106.

112. Ren J., Knorr C., Guo Y.-M., Ding N.-S., Ai H.-S., Brenig B., Huang L.-S. Characterization of five single nucleotide polymorphisms in the porcine stearoyl-CoA desaturase (SCD) gene // Animal Genetics.-2004.-Vol. 35.-P. 255-257.

113. Sancho P., Troyano A., Fernández C., Blas E., Aller P. Differential Effects of Catalase on Apoptosis Induction in Human Promonocytic Cells. Relationshipswith Heat-Shock Protein Expression // Molecular Pharmacology.- 2003.-Vol. 63.-P. 581-589.

114. Seale P., Rudnicki M.A. Looking back to the embryo: defining transcriptional networks in adult myogenesis // Nature Reviews Genetics.-2003.-Vol. 7.-P. 497 -507.

115. Setty R.S. Biotechnology, Cell Biology and Genetics Part-1. New Age International, 2006.-190 p.

116. Shih H.H., Xiu M., Berasi S.P., Sampson E.M., Leiter A., Paulson K. E., Yee A.S. HMG box transcriptional repressor HBP1 maintains a proliferation barrier in differentiated liver tissue // Molecular and Cellular Biology.-2001.-Vol. 21.-P. 5723-5732.

117. Smith T.P., Fahrenkrug S.C., Rohrer G.A., Simmen F.A., Rexroad C.E., Keele J.W. Mapping of expressed sequence tags from a porcine early embryonic cDNA library // Animal genetics.-2001.-Vol. 32.-P. 66-72.

118. Sole R.V., Valverde S. Are network motifs the spandrels of cellular complexity? // Trends in Ecology and Evolution.-2006.-Vol. 21.-P. 419-422.

119. Stachowiak M., Flisikowski K., Szydlowski M., Fries R., Switonski M. Postnatal transcription profile and polymorphism of the ADIPOR1 gene in five pig breeds // Animal Genetics.-2010.-Vol. 41.-P. 97-100.

120. Stewart J.D., Lou Y., Squires E.J., Coussens P.M. Using human microarrays to identify differentially expressed genes associated with increased steroidogenesis in boars//Animal biotechnology.-2005.-Vol. 16.-P. 139-151.

121. Stratil A., Peelman L.J., Mattheeuws M., Van Poucke M., Reiner G., Geldermann H. A novel porcine gene, alpha-1-antichymotrypsin 2 (SERPINA3-2): sequence, genomic organization, polymorphism and mapping // Gene.-2002.-Vol. 292.-P. 113-119.

122. Sugimoto H., Yang C., LeBleu V.S.,. Soubasakos M.A , Giraldo M., Zeisberg M., Kalluri R. BMP-7 functions as a novel hormone to facilitate liver regeneration // The FASEB Journal.-2007.-Vol. 21.-P. 256-264.

123. SwitonskiM., Stachowiak M., Cieslak J., Bartz M., Grzes M. Genetics of fat tissue accumulation in pigs: a comparative approach // Journal of Applied Genetics. -2010.-V.51 .-P. 153-168.

124. Tanaka T., Yoshida N., Kishimoto T., Akira S. Defective adipocyte differentiation in mice lacking the C/EBPbeta and/or C/EBPdelta gene // EMBO Journal.-1997.-Vol. 16.-P. 7432-7443.

125. Urbanski P., Kury J. New SNPs in the coding and 5' flanking regions of porcine MYOD1 (MYF3) and MYF5 genes // Journal of Applied Genetics.-2004.-Vol. 45.-P. 325-329.

126. Weiler J., Ron M. Invited review: quantitative trait nucleotide determination in the era of genomic selection // Journal of Dairy Science.-201 l.-Vol. 94.-P. 1082-1090.

127. Wexler I.D., Du Y., Lisgaris M.V., Mandal S.K., Freytag S.O., Yang B.-S., Liu T.-C., Kwon M., Patel M.S., Kerr D.S., Primary amino acid sequence and structure of human pyruvate carboxylase // Biochimica et Biophysica Acta.-1994.-Vol. 1227.-P. 46-52.

128. Wimmers K., Murani E., Schellander K. , Ponsuksili S. Combining QTL-and expression-analysis: identification of functional positional candidate genes for meat quality and carcass traits // Archives of Animal Breeding.-2005.-Vol. 48.-P. 23-31.

129. Wimmers K., Murani E., Te Pas M.F., Chang K.C., Davoli R., Merks J.W., Henne H., Muraniova M., da Costa N., Harlizius B., Schellander K., Boll I., Braglia S., de Wit A.A., Cagnazzo M., Fontanesi L., Prins D., Ponsuksili S.

130. Associations of functional candidate genes derived from gene-expression profiles of prenatal porcine muscle tissue with meat quality and muscle deposition // Animal Genetics.-2007.-Vol. 38.-P. 474-484.

131. Wimmers K., Trong Ngu N., Murani E., Schellander K. & PonsuksiliS. () Linkage and expression analysis to elucidate the genetic background of muscle structure and meat quality in the pig // Archives of Animal Breeding.- 2006.-Vol. 49.-P. 116-125.

132. Wohlwend A., Belin D., Vassalli J-D. Plasminogen activator-specific inhibitors prodused by human monocytes/macrophages // Journal of Experimental Medicine.-1987.-Vol 165.-P. 320-339.

133. Wyszynska-Koko J., Kuryl J. Porcine MYF6 gene: sequence, homology analysis, and variation in the promoter region // Animal Biotechnology.-2004.-Vol. 15.-P. 159-173.

134. Xu J., Zhang J., Wang L., Zhou J., Huang H, Wu J., Zhong Y., Shi Y. Solution structure of Urml and its implications for the origin of protein modifiers // Proceedings of the National Academy of Sciences USA.-2006.-Vol. 103.-P. 11625-11630.

135. Yuan D., Ma X., Ma J. Sequences outside the homeodomain of bicoid are required for protein-protein interaction // Journal of Biological Chemistry.-1996.-Vol. 271.-P. 21660-21665.

136. Zhang X., Tseng H. Basonuclin-null mutation impairs homeostasis and wound repair in mouse corneal epithelium // PLoS One.-2007.-Vol. 2.-P. 1087.

137. Zhao S.H., Kuhar D., Lunney J.K., Dawson H., Guidry C., Uthe J.J., Bearson S.M., Recknor J., Nettleton D., Tuggle C.K. Gene expression profiling in

138. Salmonella Choleraesuis-infected porcine lung using a long oligonucleotide microarray//Mammalian Genome.-2006.-Vol. 17.-P. 777-789.

139. Zhao S.H, Nettleton D, Liu W, Fitzsimmons C., Ernst C.W, Raney N.E, Tuggle C.K. Complementary DNA macroarray analyses of differential gene expression in porcine fetal and postnatal muscle // Journal of animal science.-2003.-Vol. 81.-P. 2179-2188.

140. Zhao S.H, Recknor J, Lunney J.K, Nettleton D, Kuhar D, Orley S, Tuggle C.K. Validation of a first-generation long-oligonucleotide microarray for transcriptional profiling in the pig // Genomics.-2005.-Vol. 86.-P. 618-625.

141. Zhou Q.Y, Fang M.D, Huang Т.Н., Li C.C, Yu M, Zhao S.H. Detection of differentially expressed genes between Erhualian and Large White placentas on day 75 and 90 of gestation // BMC Genomics.-2009.-Vol. 10.-P. 337.

142. NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov

143. Nextbio database: http://www.nextbio.com

144. SPAM project: http://www.pigoligoarray.org

145. Uniprot database: http://www.uniprot.orgсоюз

146. СПРАВКА О ВНЕДРЕНИИ результатов исследований Н.С. Хлоповой в практику российскогосвиноводства

147. Считаем также обоснованным продолжение исследований в данном направлении с целью расширения объемов и конкретизации полученных результатов в

Информация о работе

Хлопова, Наталия Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 06.02.10

Диссертация

Сравнительный анализ органоспецифичных профилей генной экспрессии у свиней - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы