Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности аттенуированного штамма ВТМ V-69 и его патогенных ревертантов
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности аттенуированного штамма ВТМ V-69 и его патогенных ревертантов"
На правах рукописи
ИСТОМИНА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АТТЕНУИРОВАННОГО ТОМАТНОГО ШТАММА ВТМ V-69 И ЕГО ПАТОГЕННЫХ РЕВЕРТАНТОВ.
03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА - 2004
Работа выполнена в лаборатории генетики растений Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ
кандидат биологических наук Александр Николаевич Шиян
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ
доктор биологических наук Дмитрий Владимирович Муха
кандидат сельскохозяйственных наук Карина Алексеевна Можаева
ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
Институт Биологии Гена РАН
Защита диссертации состоится "_"_2004 г. в_часов
на заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, г. Москва, ул. Губкина 3. Факс: (095)132-8962
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
Автореферат разослан"_"_2004 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук
Галина Николаевна Полухина
Актуальность проблемы. Вирусы растений являются фитопатогенами, поражающими многие сельскохозяйственные культуры. Для борьбы с вирусными инфекциями используют сорта с генами устойчивости, устойчивые трансгенные растения и вакцинацию растений ослабленными штаммами вирусов. Создание вакцин основывается на том, что среди природных популяций патогенных вирусов спонтанно возникают аттенуированные мутанты со сниженной патогенностью, в том числе не вызывающие на растениях видимых симптомов. Ослабленные штаммы используются для перекрестной защиты от близкородственных патогенов. Сравнение структуры геномов авирулентных и патогенных штаммов способствует пониманию тонких механизмов, регулирующих размножение вируса и его взаимодействие с хозяином.
В последнее время все большее распространение получают работы по созданию трансгенных растений, устойчивых к патогенам. Следует иметь в виду, что до сих пор нет однозначного мнения о безвредности использования трансгенных растений. Во многих странах мира существует запрет на выращивание подобных растений и использование их в сельскохозяйственной практике.
На основе геномов растительных вирусов создаются векторы для экспрессии в растениях гетерологических генов. При использовании вирусных векторов не происходит интеграции чужеродной вставки в геном растения, как в случае агробактериальной трансформации, поэтому не нарушается хромосомная организация хозяйского генома, и не происходит часто наблюдаемой инактивации трансгена (Mason and Arntzen, 1995). Использование вирусных векторов позволяет получать значительные количества чужеродного белка в растении-хозяине. Кроме того, создание химерных вирусов с помощью генно-инженерных методов является перспективным направлением для получения вакцин против широкого круга патогенов.
Объектами данной диссертационной работы являлись природный аттенуированный штамм V-69 вируса табачной мозаики и его четыре спонтанных патогенных ревертанта R1,
Цель и задачи работы. Целью данной диссертационной работы было определение и сравнение нуклеотидных последовательностей патогенных ревертантов (R1, R2, R2-76 и R3) с исходным аттенуированным штаммом ВТМ V-69 и выявление нуклеотидных замен, ответственных за патогенность, путем введения обнаруженных в ревертантах замен в полноразмерную кДНК ВТМ V-69. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Создать плазмидные конструкции, содержащие полноразмерные кДНК-копии аттенуированного штамма ВТМ V-69 под контролем Т7-промотора, и получить in vitro инфекционные транскрипты.
2. Определить нуклеотидные последовательности геномов патогенных ревертантов и провести их сравнение с исходным аттенуированным штаммом V-69.
3. Ввести обнаруженные мутации в структуру кДНК бессимптомного штамма ВТМ V-69, получить инфекционные транскрипты и проверить их патогенность.
Научная новизна работы. Были получены плазмидные конструкции, содержащие полноразмерные кДНК генома уникального вакцинного штамма ВТМ V-69 под контролем Т7-промотора, позволяющие получать in vitro инфекционные транскрипты. Впервые была определена первичная структура четырех патогенных ревертантов исходного бессимптомного штамма V-69. Была обнаружена высокая консервативность первичной структуры ВТМ V-69 и его ревертантов. Показано, что единственная общая, обнаруженная в ревертантах нуклеотидная замена в положении 1654 (G-+A), вызывающая аминокислотную замену на ответственна за проявление
патогенных свойств.
Практическая значимость. Полученные конструкции, несущие полноразмерные кДНК копии генома ВТМ V-69 являются базовыми как для направленного введения мутаций с целью получения вируса с измененными свойствами, так и для экспрессии гетерологических генов в растении. Показано, что спейсерная неконсервативная область между метилтрансферазным и геликазным доменами в белках репликазы тобамовирусов является определяющей в аттенуации вируса.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на конференциях: "Селекция и семеноводство овощных культур в 21 веке", (Москва, 2000); "Памяти Грегора Менделя", (Москва, 2001); 'Трансгенные растения и проблемы биобезопасности" (Москва, 2004) и докладывались на научных семинарах лаборатории генетики растений ИОГен РАН и межлабораторном научном семинаре ИОГен РАН (14 октября 2004 года).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 127 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 236 источников. Работа содержит 2 таблицы и 30 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Создание плазмидных конструкций. В работе использовали стандартные методики: выделение плазмид щелочным лизисом (Маниатис и др., 1984) с доочисткой ДНК на стекло-волокнистых фильтрах GF/F (Whatman) с использованием 4М гуанидинтиоционата (ГТЦ) (Грибанов и др., 1996), выделение фрагментов из геля (Carter et al., 1993), расщепление рестрикционными эндонуклеазами, лигирование, трансформацию плазмидными конструкциями клеток Е. coli штамма DH5a (None et a!., 1990), полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Для клонирования использовали плазмидный вектор pBluescript (+) (pBS+). Ферментные реакции проводили в соответствии с методическими рекомендациями фирм производителей.
Транскрипция in vitro и заражение растений. Для получения инфекционных транскриптов плазмиды, содержащие полноразмерные кДНК-копии геномов ВТМ, линеаризовали по Smal-сайту, отделяли от примесей электрофорезом и чистили на GF/F. РНК синтезировали с помощью РНК полимеразы фага Т7 (Т7 Transcription Kit фирмы Fermentas (Литва)) с использованием кэп-аналога - m?GpppG (Promega, США). В работе использовали растения: восприимчивый табак - Nicotiana tabacum cv. Samsun (генотип nri), сверчувствительный гибрид Терновского - Nicotiana tabacum x
Nicotiana glutinosa (генотип NN) и томаты - Lycopersicum esculentum cv. "Москвичка" и "Белый налив". Растения выращивали в климакамере "Fisons Fitotron 600H" с фотопериодом 16 ч день: 8 ч ночь при температуре 24°С. Растения инфицировали на стадии 3-4 настоящих листьев. Два нижних листа натирали карборундом с 50 мкл препарата РНК (0,3-0,5 мкг). Развитие некрозов происходило на листьях сверхчувствительного сорта табака через 72 часа после заражения, а развитие системной инфекции - через 12-15 дней.
Выделение РНК и синтез кДНК. Вирусные частицы выделяли из системно зараженных растений через 13-15 дней после инфицирования по методике, сочетающей высаливание вирусного нуклеопротеида сернокислым аммонием (25-30%-ов от насыщения) с последующим двухкратным переосаждением 3%-ным ПЭГ-6000 в среде 0,2М NaCI (Атабеков, 1981). Для выделения РНК вирусные частицы солюбилизировали в двух с половиной объемах 5М ГГЦ и после добавления одного объема этанола сорбировали на колонках с GF/F (Гусев, 1997). Синтез стокового набора фрагментов кДНК на матрице РНК ВТМ велся с помощью набора RiboClone cDNA Synthesis System AMV RT (Promega, США) и смеси специфических праймеров (для первой цепи - Ш1 (6383-6368), L2 (4177-4161) и L4 (2355-2337), а для второй - Ш2 (1-20), L3 (1948-1964) и L1 (4157-4173)). ОТ-ПЦР проводили с помощью набора First Strand cDNA Synthesis Kit и Гад-ДНК-полимеразы (Fermentas, Литва).
Определение нуклеотидной последовательности. Секвенирование по Сенгеру осуществляли с помощью набора Cycle Rea_er™ DNA Sequencing Kit (Fermentas, Литва) с радиоктивной меткой [у-32Р]АТФ (Изотоп, Обнинск). Концевые участки вставок клонов секвенировали с универсальных (прямого M13/pUC dir (17н) и обратного M13/pUC rev (17н)) праймеров, а для определения внутренних последовательностей использовали вирус-специфические праймеры. Разделение продуктов секвенирующих реакций проводили по стандартной методике в 6.5% ПААГ. Радиоавтографы получали после фиксации и сушки на рентгеновской пленке Сгопех 4 (Sterling Diagnostic Imaging, США).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1. Получение полноразмерной кДНК-копии генома ВТМ V-69.
Для получения полноразмерной копии использовали клонотеку просеквенированных ранее перекрывающихся фрагментов вирусного генома ВТМ V-69 (Снегирева, 1999). Были отобраны четыре плазмиды: С41 - (122348); С23 - (974-4173); С12 - (2404-6379); С13 - (3644-6383) (Рис. 1), содержащие фрагменты кДНК вирусной РНК, встроенные в вектор pBS(+) по Smal-сайту, которые по соответствующим рестрикционным сайтам были объединены в полноразмерную кДНК ВТМ V-69.
Рис. 1. Схема получения полноразмерной кДНК ВТМ ^69. А.) Показана последовательность рестрикционных сайтов в полилинкере плазмиды pBS(+). Б.) Структура плазмиды pSKVl, содержащей полноразмерную кДНК ВТМ ^69. Прямоугольниками показаны фрагменты кДНК различных плазмид, объединенные по соответствующим рестрикционным сайтам в полноразмерную кДНК. Цифры соответствуют положениям нуклеотидов в геноме вируса. В.) Схема положения перекрывающихся клонов. Стрелками показано ориентация фрагментов относительно Т7-промотора.
1.1. Получение слитой с Т7-промотором кДНК первых 4173
нуклеотидов вирусной последовательности.
Плазмида С41, содержащая кДНК 5'-концевой части генома, имела делецию первых 11 п.о. Для синтеза и ПЦР-амплификации кДНК интактного 5'-концевого фрагмента использовали Р/и-ДНК-полимеразу, стоковый набор фрагментов кДНК и праймеры, содержащие EcoRI-сайты. Прямой праймер ШЗ содержал на своем 5'-конце помимо первых 20 н. вирусной последовательности линкер, соответствующий EcoRI-сайту. Обратный праймер К1 был комплементарен внутреннему участку генома (280-258), где в положении 273-278 также находился EcoRI-сайт. Полученный ПЦР-фрагмент обрабатывали рестриктазой EcoRI и встраивали по тому же сайту в вектор pBS(+). Была отобрана плазмида pSK13, содержащая вставку в прямой ориентации относительно Т7-промотора. С помощью секвенирования было подтверждено наличие интактного 5'-концевого участка (Рис. 2А).
Для синтеза инфекционных транскриптов in vitro необходимо, чтобы геном вируса был слит с Т7-промотором, т.е. первый нуклеотид кДНК генома должен находиться +1 положении относительно промотора.
т
Рис. 2. Фрагмент радиоавтографа секвенирующего геля плазмид А.) pSKl3 и Б.) pSK14, секвенирование проводили с праймера M13/pUC Dir. G+i - первый нуклеотид вирусной последовательности.
Для удаления 10 нуклеотидов, разделяющих Т7-промотор и последовательность ВТМ, проводили амплификацию плазмиды рSК13 с помощью Р/и-ДНК-полимеразы и пары фосфорилированных праймеров. Прямой праймер Ш2 (1-20) соответствовал 5'-концевому фрагменту ВТМ, а обратный T7R был комплементарен последовательности Т7-промотора (51-TATAGTGAGTCGTATTAC-3'). Полученную в результате амплификации линейную форму плазмиды лигировали саму на себя и использовали для трансформации клеток E.coli. Для отбора клонов использовали рестрикционный анализ плазмид рестриктазой EcoRI и сравнение электрофоретической подвижности в 5% ПААГ ПЦР-фрагментов, синтезированных с меченых радиоактивным фосфором праймеров (M13/pUC Dlr. и Р28 (Rev, 117-97)). Наличие интактного 5'-концевого участка слитого с Т7-промотором в структуре плазмидной конструкции pSK14 было подтверждено секвенированием (Рис. 25).
В плазмидную конструкцию pSK14 пo EcoRI и ßamHI-сайтам был встроен участок «ДНК вирусного генома (273-2348 п.о.) из С41 и получена плазмида pSK21. В эту плазм иду по Pstl-сайту был встроен фрагмент (18444173 п.о.), вырезанный из С23 плазмиды. Для отбора клонов, содержащих вставку в нужной ориентации проводили ПЦР с праймеров Р1 (Dir, 1242-1262) и Р12 (Rev, 2774-2754). В результате была получена конструкция pSK31 содержащая слитую с Т7-промотором кДНК первых 4173 н. ВТМ V-69.
1.2. Получение интактного З'-концевого участка генома ВТМ V-69,
слитого со Smal-сайтом.
Следующим этапом было получение кДНК интактного З'-концевого участка в прямой ориентации относительно Т7-промотора. Для этого использовали две плазмиды из клонотеки, которые содержали З'-концевые фрагменты (Рис. 1). Плазмида С13 содержала интактный З'-концевой участок кДНК вирусной РНК, но в обратной ориентации относительно Т7-промотора, что не позволяло напрямую встраивать кДНК фрагмент из С13 в плазмиду pSK31. Плазмида С12 - содержала вставку в прямой ориентации, но в ней отсутствовали 4 концевых нуклеотида.
Для реконструкции интактного З'-концевого участка в прямой ориентации была получена промежуточная конструкция (рис.ЗБ). В плазмиду С12, обработанную рестриктазами Крп21 (3759) и Stul (5604), встраивали кДНК фрагмент, вырезанный из плазмиды С13 рестриктазами Крп21 и Sacl В результате лигирования этих фрагментов по липким Крп21 -концам и тупым Sacl- и Stul-концам была получена плазмида pSK41, содержащая дуплицированные кДНК З'-концевых участков ВТМ V-69 из плазмид С13 и С12, разделенных коротким участком плазмидного полилинкера.
Рис. 3. Схема получения интактного 3'-конца ВТМ ^69, содержащего Smal-сайт. А.) Исходные плазмиды С12 и С13. Б.) Промежуточная конструкция р5К41. С.) Конструкция р5К51. Прямоугольниками показаны фрагменты кДНК ВТМ. Цифры соответствуют
положению нуклеотидов в геноме ВТМ. показан Т7-промотор. В конструкции р5К51 зачеркнут нефункциональный -сайт.
Для точной терминации транскрипции вирусной РНК in vito необходимо наличие рестрикционного сайта, расщепляющего плазмиду точно по концу вирусной «ДНК. Для этой цели нами был выбран Smal-сайт, т.к. он не представлен в геноме. Рестриктаза Sfflal узнает последовательность 5'-CCCGGG-3', поэтому последние три цитозиновых остатка генома ВТМ можно использовать в качестве первых трех цитозиновых остатков в S/nal-сайте. Для введения Smal-сайта, удаления дефектного З'-концевого участка, и делегирования из полилинкера сайтов SamHI, Xíbal, Sa/I и Psñ, плазмиду pSK41 обрабатывали рестриктазами ApaI (6381) и Psñ, и лигировали её с двунитевым адаптером, состоящим из олигонуклеотидов К2 (5'-CGGCCGCCCGGGCC-31) и К3 (5'-CGGGCGGCCGTGCA-3'). Адаптер содержал в двунитевой части и -сайты, а на концах - липкие концы для
рестриктазДра! и Psñ. Полученная плазмидная конструкция р5К51 (Рис. ЗС), содержала интактный З'-концевой участок генома со Smal-сайтом. Следует отметить, что З'-концевой аденозин (6383), отсутствующий в этой конструкции, при репликации вируса in vivo включается хозяйской аденилазой.
1.3. Получение полноразмерной кДНК генома ВТМ V-69 и
удаление дуплицированных Hlrtdttl -сайтов.
При введении в плазмиду pSK31, обработанную рестриктазами Крп21 (3759) и Spfll, кДНК фрагмента (3759-6382 п.о.) вырезанного из плазмиды по тем же сайтам, была получена конструкция содержащая
полноразмерную «ДНК-копию ВТМ V-69 с Т7-промотором на 5'-конце и с сайтом на З'-конце.
Для удобства манипуляций с «ДНК генома ВТМ V-69 в его структуре желательно иметь как можно больше уникальных сайтов рестрикции. На предыдущих этапах из полилинкера были удалены все рестрикционные сайты, представленные в геноме, кроме Н/ПсЯН-сайта. Для инактивации этого сайта плазмидуpSKV1 обрабатывали рестриктазойпри этом вырезался внутренний участок кДНК вирусного генома (206-5604 п.о.), содержащий два Hind\II-•сайта. После рестрикции образуются два фрагмента - легкий (4,2 п.о.) и тяжелый (5,4 п.о.), которые разделялись электрофорезом. Выделенный
легкий фрагмент лигировали и клонировали. Полученную, таким образом плазмиду расщепляли по сайту, находящемуся в полилинкере, липкие
концы "затупляли" с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и лигировали. В отобранную плазмиду с инактивированным Н/Л(Я11--сайтом по Sft/l-сайту был возвращен тяжелый фрагмент. Новая конструкция pSKV2 содержала полноразмерную кДНК генома ВТМ V-69 и нефункциональный из-за его неполной дупликации H/ndlll-сайт в полилинкере.
Для инактивации одного из двух сохранившихся H/ndlll-сайтов и введения молекулярного маркера в наши конструкции использовали сайт-направленный мутагенез. Для этого была проведена двухступенчатая ПЦР с комплементарными праймерами HD и HR (1438-1470), перекрывающими H/ndlll-сайт в положении 1449. Праймеры HD-прямой и HR-обратный содержали три точечные мутации в позициях 1445, 1551 и 1554, нарушающие Mrtdlll-сайт, но не изменяющие значения аминокислотных кодонов. На первом этапе были проведены две независимые ПЦР со смесью и полимераз и парами праймеров: HD, P2 (Rev, 2074-2054) и HR, P13 (Dir, 789809). Полученные фрагменты содержали взаимокомплементарные участки, соответствующие праймерам HD и HR, по которым они могут гибридизоваться, и, в условиях второго ПЦР с праймерами Р2 и Р13, направлять синтез большого объединенного фрагмента. Этот фрагмент содержал в середине измененный -сайт, а вблизи своих концов - сайты для рестриктаз SsiXI (831) и Pst\ (1844). По этим сайтам синтезированный фрагмент встраивали в плазмиду из которой предварительно был
удален аналогичный фрагмент. Из трансформантов был отобран клон с плазм идой содержащей единственный -сайт в положении 565. Наличие запланированных нуклеотидных замен в полученных конструкциях было подтверждено секвенированием (Рис. 4А).
1.4. Получение инфекционных транскриптов и подтверждение их
соответствия исходным кДНК конструкциям.
В результате первого этапа работы были получены три конструкции, содержащие полноразмерные кДНК-копии генома аттенуированного
томатного штамма ВТМ V-69 под контролем Т7-промотора, отличающиеся количеством НтсПII-сайтов. С полученных конструкций in vitro были синтезированы транскрипты, которыми заражали восприимчивые растения табака. На 12 день на контрольных растениях, зараженных вирусными частицами патогенного штамма, появлялись первые мозаичные симптомы. На растениях табака, инокулированных транскриптами плазмид pSKVI, pSKV2 и pSKV3, а так же вирусными частицами V-69 симптомов вирусного заболевания не наблюдали Наличие системной инфекции в бессимптомных растениях подтверждалось тем, что сок из них, вызывал на сверхчувствительном гибриде Терновского локальные некрозы.
Рис. 4. Фрагмент радиоавтографов секвенирующих ПААГ плазмид pSKV\, pSKV3, содержащих полноразмерные кДНК ВТМ V-69 и плазмид pSKR\, pSKS2, содержащих полноразмерные кДНК аналогов ревертантов Для секвенирования использовали ПЦР-фрагменты, синтезированные с праймеров Р13 и Р2. А. Секвенирование проводили с праймера P1 (Dir, 1242-1262). Стрелками и звездочками показаны три точечные замены Б. Секвенирование проводили с праймера Р10 (Rev, 1714-1694). Считываемая с радиоавтографа последовательность комплементарна последовательности ВТМ V-69 Нуклеотид в положении 1654 отмечен стрелкой Рядом показан аминокислотный кодон и соответствующий ему 528-ой аминокислотный остаток.
Для проверки соответствия вирусной РНК исходным кДНК конструкциям, из верхних системно зараженных листьев табака через 16 дней после заражения выделяли вирусную РНК. Фрагмент кДНК, содержащий область мутаций и соответствующий РНК вирусного потомства, амплифицировали в ОТ-ПЦР с праймеров Р13 (Dir, 789-809) и Р2 (Rev, 20742054), и секвенировали на автоматическом секвенаторе. В потомстве транскриптов плазмиды pSKV3 подтверждено наличие 3-х введенных точечных мутаций, изменяющих H/ndlll-сайт, и отсутствие этих мутаций в потомстве транскриптов плазмиды pSKY\.
2. Определение нуклеотидной последовательности ревертантов ВТМ V-69.
Для каждого препарата РНК ревертантов R1, R2, R2-76, R3 была синтезирована кДНК, которая использовалась в дальнейшем для получения коротких ПЦР-фрагментов, удобных для секвенирования по методу Сэнгера. Полное секвенирование геномов ревертантов, за исключением первых и последних 25 н., выявило значительную консервативность первичной структуры генома ВТМ V-69. Оказалось, что все нуклеотидные замены, характерные для штамма ВТМ V-69 (отличающие его от патогенного штамма L), за исключением мутации в позиции 1654, присутствуют во всех четырех ревертантах (Рис. 5).
R1 R2 R3 R2-76 V-69
G АТС G G A TCG GATCGG ATCGGATCG
Рис. 5. Фрагмент радиоавтографа секвенирующего ПААГ, иллюстрирующий различия между ВТМ V-69 и его ревертантами в позиции 1654 (отмечен стрелкой). Для секвенирования использовали фрагменты синтезированные в ОТ-ПЦР с праймеров P1 (Dir, 1242-1262) и Р2 (Rev, 2074-2054). Секвенирование проводили с праймера Р10 (Rev, 1714-1694). Считываемая с радиоавтографа последовательность комплементарна последовательности ВТМ V-69.
Единственная общая нуклеотидная замена в позиции 1654 приводит к замене 528-ого аминокислотного остатка с аргенина (Arg), характерного в этом положении для ВТМ V-69, на гистидин (His), характерный в этом положении для дикого патогенного штамма ВТМ L. Ревертанты R1 и R3 не содержали дополнительных мутаций по сравнению с V-69. Ревертант R2 содержал две (Т1223-+А и A4187->G), a R2-76 - одну (А3983-^) молчащие мутации (Рис. 6).
А.
126/183К
зок
оме?:-: 1 '/////////У/////////// '//////jpVM/////// '///r/zhMth/////// иол
БО
J'
528 672 Arg А*Р
979 984 Glu Туг
1546 Glu
86 Ser
Б. В.
r1 R2
r2-76 R3
111 J Hill L1L :! j 1 Лчч lül IUI L
1—Д.1_II mi 1654 2087 3006 3021 4710 596I Н1«га 1 А A4 ▲ А
1ШМШШ» «Ш® S ШШМШ ЯНШ Ш«|
Т->А His0*
1 I ▲
•t
.-И»
1ШЖ» !ü«m Жй; Н8Ж., чЯЯШ ШЖ»
1223
4187
Hta™ 1 А
A-+G 1
жш» .шшш.ж!
Нй™,
3983
1шшшшт ж «я» s шшвмш шаш ssssi
г
4000
6383
Рис 6. А. Структура генома ВТМ Б. Карта расположения в геноме ВТМ V-© нуклеотидных замен относительно штамма L В. Карта отличий геномов ревертантов от ВТМ ^69 126/183К - белки репликазы, ЗОК - транспортный белок, БО - белок оболочки Белки репликазы содержат функциональные домены МЕТ - метилтрансферазный, ГЕЛ - геликазный и ПОЛ -полимеразный, зачерненная область соответствует консервативному участку, характерному для многих фитовирусов Б) | • молчащие мутации, цифры над толстыми линиями показывают количество находящихся рядом замен, - аминокислотные замены, над стрелкой указаны название АК и их положение В)
реверсия к дикому типу,
- молчащие мутации, относительно штамма V-69
3. Получение кДНК аналогов ревертантов.
3.1. Введение реверсии в кДНК ВТМ V-69.
Обнаруженная нами единственная реверсия в позиции 1654 была внесена в полученную ранее плазмидную конструкцию pSKV2, содержащую полноразмерную кДНК-копию генома аттенуированного штамма ВТМ V-69. Реверсия вводилась двумя способами: с сохранением двух H/ndlll-сайтов в структуре генома и с одновременным изменением Н/лсЛН-сайта в позиции 1449 вирусного генома.
В первом случае на стоковом препарате кДНК ревертанта R1 в ПЦР с праймеров Р13 (Dir, 789-809) и Р2 (Rev, 2074-2054) с помощью Р/и-ДНК-полимеразы синтезировали соответствующий фрагмент «ДНК, который встраивали по сайтам SsOG (831) и Psti (1844) в плазмиду pSKV2. Полученная конструкция pSKR1 содержала два внутренних -сайта. Во втором
случае для получения конструкции pSKR2, содержащей маркерный видоизмененный -сайт, использовали сайт-направленный мутагенез на матрице кДНК ревертанта R1 по описанной ранее схеме инактивации сайта в конструкции pSKV2.
Таким образом, были получены еще две конструкции, содержащие реверсию в позиции 1654 и отличающиеся наличием или отсутствием маркера. Наличие введенных точечных мутаций (Рис. 4А) и реверсии в этих конструкциях (Рис. 4Б) было подтверждено секвенированием.
3.2. Проверка инфекционности транскриптов с кДНК аналогов
ревертантов и анализ их потомства.
Для того, чтобы проверить инфекционность конструкций pSKR1 и pSKR2, проводили транскрипцию in vitro с помощью РНК-полимеразы фага Т7 в присутствии кэп-аналога. РНК, синтезированной с этих конструкций, заражали восприимчивые растения табака и томатов. На растениях табака и томата, зараженных транскриптами плазмид pSKR1 и pSKR2, а также вирусными частицами патогенного ревертанта, через две недели после заражения наблюдали развитие мозаики и деформацию листьев, тогда как на растениях табака и томата, зараженных транскриптами плазмиды pSKV3,
содержащей кДНК ВТМ V-69, видимых симптомов вирусного заболевания не наблюдали (Рис 7)
Таким образом, нами показано, что транскрипты, синтезированные in vitro с полученных конструкций, индуцируют развитие на растениях симптомов, аналогичных симптомам заражения соответствующим вирусом То есть, транскрипты конструкций, содержащих кДНК ВТМ V-69, дают бессимптомную инфекцию, а транскрипты конструкций кДНК аналогов ревертантов с аминокислотной заменой - индуцируют резкую
зеленую мозаику.
Для проверки соответствия вирусной РНК, исходным кДНК конструкциям, из верхних системно зараженных листьев табака через 16 дней после заражения выделяли вирусную РНК На матрице полученных препаратов РНК проводили обратно-транскриптазную ПЦР с праймерами Р13 и Р2 для получения фрагментов кДНК, содержащих области мутаций
А. В,
Рис 7. Тестирование синтезируемых in vitro инфекционных транскриптов на растениях табака Nicotiana tabacum cv Samsun (генотип nn) A - контрольное здоровое растение, Б - растение, инфицированное транскриптами, синтезируемыми с плазмиды pSKV3, В - растение, инфицированное транскриптами, синтезируемыми с плазмидыpSKR2
ПЦР-фрагмент, содержащий область введенных мутаций, секвенировали на автоматическом секвенаторе. В потомстве транскриптов плазмид pSKRI и pSKR2 обнаружено наличие реверсии в позиции 1654, т.е. в этом положении находится аденозин. В потомстве транскриптов плазмиды pSKR2, дополнительно, подтверждено наличие 3-х введенных точечных мутаций в положениях 1445, 1451 и 1454, приводящих к изменению HindlW-сайта.
Таким образом, показано, что замена в структуре РНК ВТМ V-69 одного единственного нуклеотида (G на А в позиции 1654), приводящая к замене 528-ой аминокислоты, вызывает резкое усиление патогенности вируса. Также показано, что введенные молчащие мутации сохраняются в вирусном потомстве и могут играть роль молекулярного маркера.
ОБСУЖДЕНИЕ.
Объектом данной работы является природный аттенуированный томатный штамм V-69 вируса табачной мозаики, полученный ранее в нашей лаборатории и внедренный в агрономическую практику для перекрестной защиты томатов от патогенных штаммов. ВТМ V-69 не вызывает видимых симптомов вирусного заболевания на восприимчивых к ВТМ растениях томата и табака. На листьях сверхчувствительных сортов табака с генотипом NN он индуцирует некрозы (Сухов и др., 1982).
Ранее было показано, что геном ВТМ V-69 содержит относительно патогенного томатного штамма L 38 нуклеотидных замен (Рис. 6). Шесть нуклеотидных замен вызывают изменения аминокислот в кодируемых вирусом белках (Шиян и др., 1994; Снегирева и др., 1999). Две аминокислотные замены в геликазном домене репликазы (Gin—»Glu879 и отвечают за способность вирусов размножаться в томатах с геном устойчивости Тт-1 (Meshi et al., 1988). Другие три аминокислотные замены, находящиеся также в белках репликазы, характерны только для штамма ВТМ V-69 и локализованы вне функциональных доменов и не связаны с нарушением каталитических функций. Две консервативные замены и находятся в вариабельном участке, разделяющем
МЕТ- и ГЕЛ-домены 126/183К-белков, и одна замена Lys-» Glu1546, влияющая на зарядовые характеристики, - в ПОЛ-домене 183К-белка. Нуклеотидная замена в гене БО вызывает изменение аминокислоты Ala-^Ser*6. Эта АК замена не является, строго говоря, мутацией, так как в данном положении обе эти аминокислоты являются типичными для разных видов тобамовирусов.
На первый взгляд, как нам казалось, именно неконсервативная замена в полимеразном домене является основной причиной снижения патогенности. Однако, это требовало проверки. Для решения этой задачи можно было проверить влияние всех шести аминокислотных замен и их комбинаций на патогенность вируса. Однако, в нашем распоряжении имелась серия спонтанных патогенных ревертантов V-69, которые вызывают на восприимчивых растениях (как на табаках, так и на томатах) зеленую мозаику и деформацию листьев. Ревертанты, как ближайшие потомки аттенуированного штамма, должны иметь с ним минимальные различия, локализованные в области мутаций, определяющих аттенуацию. Поэтому, нам представлялось более простым просеквенировать ревертанты и сравнить их с родительским штаммом ВТМ V-69.
В результате полного секвенирования 4-х геномов патогенных ревертантов аттенуированного штамма V-69 было подтверждено наличие всего набора мутаций, характерных для штамма V-69, кроме единственной нуклеотидной замены в позиции 1654, где произошла замена G на А. Эта замена приводит к реверсии на характерный для патогенного штамма ВТМ L. В двух ревертантах не было обнаружено никаких дополнительных мутаций, а в двух других были обнаружены три молчащие мутации, которые не затрагивают известных регуляторных участков генома вируса.
Введенная в полноразмерную кДНК-копию аттенуированного штамма ВТМ V-69 единственная обнаруженная реверсия, как и следовало ожидать, приводит к усилению патогенности транскриптов, получаемых с кДНК аналогов ревертантов. Таким образом, можно утверждать, что основной вклад в механизм аттенуации ВТМ V-69 вносит соответствующая мутация в позиции 1654 вирусного генома.
Обнаруженная во всех ревертантах высокая воспроизводимость структуры генома ВТМ V-69 является неожиданной, так как, считается, что репликазы, не имеющие корректирующих систем ДНК-полимераз, не точны (Malpica et al., 2002), а также, принимая во внимание значительные различия нуклеотидных последовательностей между штаммами V-69 и L и наблюдавшийся полиморфизм в нуклеотидной последовательности самого штамма ВТМ V-69 (Снегирева и др., 1999). По-видимому, существуют дополнительные механизмы (хозяйские или вирусные), поддерживающие точное воспроизведение исходной РНК и сильно ограниченное количество допускаемых конфигураций вирусных белков.
В настоящее время, кроме вакцинного штамма ВТМ V-69, изучены еще пять аттенуированных штаммов тобамовирусов: два томатных штамма L11A (Nishiguchi et al., 1985) и ВМТо-К (Yang et al., 2002), два табачных - М (Holt et al., 1990) и V-36 (Lewandowski and Dawson, 1993) и штамм вируса слабой крапчатости перца (Hagiwara et al., 2002).
Аттенуированный штамм М был выделен из популяции патогенного табачного штамма U1. В геноме штамма М было обнаружено 55 нуклеотидных и 11 аминокислотных замен относительно патогенного штамма. Установлено, что аттенуация ВТМ М определяется двумя аминокислотными заменами в белках репликазы (в положениях 360 и 601), находящимися в неконсервативной области, разделяющей МЕТ- и ГЕЛ-домены (Holt et al., 1990; Shintaku et al.,1996). Каждая из них при реверсии к штамму U1, независимо друг от друга, вызывает мозаичную симптоматику дикого типа (Bao et al., 1996). Было показано, что аттенуация этого штамма связана с нарушением сосудистого транспорта (Ding et al., 1995). Однако, согласно последним данным, ослабление патогенности этого штамма может быть связано с подавлением супрессорной активности белков репликазы в отношении постранскрипционного молчания генов (ПТМГ) (Ding et al., 2004).
Другой аттенуированный штамм - V-36 также происходит от штамма U1. Анализ его нуклеотидной последовательности выявил одну аминокислотную замену ответственную за снижение патогенных свойств этого
аттенуированного штамма (Lewandowski and Dawson, 1993).
BTM L11A - японский томатный штамм используется, как и наш штамм V-69, для вакцинации томатов (Nishiguchi and Oshima, 1977). При сравнении его нуклеотидной последовательности с вирулентным томатным штаммом L было выявлено 10 нуклеотидных замен (Nishiguchi et al., 1985), три из которых приводят к изменению аминокислот (Cys-^Tyr348, Asn-» Asp759 и Gly-> Arg884) в белках репликазы. Было показано, что ослабление патогенности сопряжено со снижением эффективности ближнего транспорта (Watanabe et al., 1987). Позже было установлено, что мутация Cys^Tyr348, являющаяся лимитирующей в ослаблении симптомов, также снижает супрессорную эффективность 130К белка в отношении ПТМГ (Kubota et al., 2003).
Томатный вакцинный штамм К, полученный в Китае, также используется для вакцинации тепличных и грунтовых посадок томатов. Особенностью нуклеотидной последовательности этого штамма является наличие двух дополнительных терминирующих кодонов: опал-кодона в 126К белке в положении 2670-2672, приводящего к синтезу укороченной формы белка репликазы (98К), и охра-кодона в пол. 5632-5634, приводящего к синтезу укороченной формы транспортного белка (27К). Было показано, что основной вклад в аттенуацию вируса вносит мутация в белке репликазы, а мутация в ТБ дополнительно усиливает ее эффект. Связана ли аттенуация этого штамма с синтезом дефектного белка репликазы или со снижением синтеза нормальных белков 123К/186К, не ясно. Однако, аттенуация может быть связана и с тем, что сквозное считывание опал-кодона приводит к замене аминокислоты Arg867 в N-концевой части ГЕЛ-домена, скорее всего на триптофан или цистеин (Yang et al., 2002).
Для BTM V-69 показано снижение, приблизительно в 3 раза, уровня накопления вирусных частиц в растениях относительно его патогенных ревертантов, что, возможно, свидетельствует о некотором дефекте репликации вируса.
Изолят PMMoV С-1421 вируса слабой крапчатости перца в отличие от своего патогенного предшественника PMMoV-J имеет две нуклеотидные замены, одна из которых приводит к изменению Для данного
аттенуированного штамма показано снижение накопления 126К белка
репликазы и белка оболочки, что, по-видимому, свидетельствует о нарушении репликации (Hagiwara et al., 2002).
Следует заметить, что ослабление симптомов не обязательно связано со снижением уровня накопления вируса. Так, один из изолятов Казахского томатного штамма - ВТМ К1 имеет дефект дальнего транспорта и накапливается в растении в малых количествах, тем не менее, при нормальной температуре, хотя и с запаздыванием, он все же индуцирует желтую мозаику. Для этого штамма характерно накопление высокого уровня свободного белка оболочки. Анализ нуклеотидной последовательности этого штамма показал наличие двух гомологичных аминокислотных замен в белках репликазы и четырех замен в БО по сравнению со штаммом L. Авторы предполагают, что замена положительно заряженного лизина на отрицательно заряженную глютаминовую кислоту в белке
оболочки нарушает субъединичное взаимодействие и является причиной ослабления вируса (Беленович и др., 2000).
Все бессимптомные штаммы по сравнению с патогенными имеют замены в белках репликазы, хотя снижение патогенности у разных аттенуированных штаммов связано с различными фенотипическими проявлениями (ближний транспорт, дальний транспорт, накопление вируса).
Стратегия репликации ВТМ включает асимметричный синтез минус- и плюс- цепей РНК, продукцию субгеномных мРНК и копирование вирусных РНК. Установлено, что 183К белок в отсутствие 126К способен выполнять все репликативные функции, но с эффективностью в 10 меньшей, чем с активным 126К белком (Lewandowski and Dawson, 2000). Показано, что вирусный репликативный комплекс содержит эквимолярные количества 126К и 183К белков (Watanabe et al., 1999). Полагают, что эти белки в составе репликативного комплекса формируют гетерогексамер, межсубъединичные взаимодействия в котором осуществляются посредством геликазных доменов (Goregaoker and Culver, 2003). Известно, что 126К белок синтезируется в значительном избытке по отношению к 183К. Возможно, что синтезируемый в избытке 126К необходим для сборки репликативного комплекса на эндоплазматическом ретикулуме. В составе репликативного комплекса ВТМ
также выявлены различные хозяйские белки, взаимодействующие с белками репликазы (Ahlquist et al., 2003).
Многофункциональность белков репликазы служит основой для многообразия возможных механизмов ослабления вируса, связанных с изменением структуры белков репликазы. Однако, для всех изученных аттенуированных штаммов характерно, что мутации, отвечающие за ослабление вирулентности (смягчение симптомов), расположены в неконсервативной спейсерной области между метилтрансферазным и геликазным доменами или примыкают к последнему, как в случае китайского штамма. Известно, что неконсервативная область состоит из двух субдоменов, разделенных консервативной областью с неизвестной функцией, но гомологичной у многих фитовирусов (у штамма U1 ее положение 418-454 ак). Аттенуирующие мутации могут находиться в обоих субдоменах.
Эта спейсерная область между МЕТ- и ГЕЛ-доменами вместе с геликазным доменом играет важную регуляторную роль. Показано, что участок белков репликазы ВТМ, включающий аминокислотные остатки 388781, ответственен за локализацию вирусных белков на мембранах эндоплазматического ретикулума - сайта, где осуществляется репликация вируса (dos Reis Figueira et al., 2002). Также было показано, что часть неконсервативной области (314-423 ак) ответственна за прикрепление вирусной репликазы к З'-концевой нетранслируемой области вирусной РНК (Osman and Buck, 2003). В этой же неконсервативной области находятся структуры, которые вместе с ТБ ответственны за ближний транспорт, хотя точная локализация аминокислот, отвечающих за эту функцию, не установлена (Hiroshima and Watanabe, 2003).
По-видимому, и ТБ, участвуя в организации репликативного комплекса, может влиять на уровень репликации, накопление вируса и жесткость симптомов, как в случае китайского штамма К. Известно, что и мутации в БО могут влиять на синтез ТБ и накопление вирусных частиц (Asurmendi et al., 2004). Однако, значимых мутаций в этих белках у аттенуированых штаммов не обнаружено.
Из наших и литературных данных следует, что феномен аттенуации тобамовирусов, как правило, связан с белками репликазы, а именно с неконсервативной областью между МЕТ- и ГЕЛ- доменами. Очевидно, что неконсервативная область, хотя и не содержит каталитических функций, но участвует в регуляции активности репликации, возможно за счет организации репликативного аппарата, или за счет регуляции супрессорной активности к ПТМГ, вызывающей усиленную деградацию вирусной РНК. Конечно, возможны и другие варианты. На наш взгляд, остается открытым вопрос, насколько уровень накопления вирусных частиц связан с появлением мозаичных и других симптомов. Не исключено, что белки репликазы, взаимодействуя через неконсервативный домен с хозяйскими белками, индуцируют нарушение метаболизма и развитие болезненных симптомов. В этом случае уровень синтеза репликазы и, как следствие, уровень накопления вируса, могут лишь косвенно влиять на проявление симптомов. Как влияют различные механизмы аттеннуации на защитные свойства вакцинных штаммов в настоящее время не изучено.
выводы.
1. Получены плазмидные конструкции, содержащие полноразмерные «ДНК-копии аттенуированного штамма вируса табачной мозаики V-69 под контролем Т7-промотора, позволяющие получать in vitro инфекционные транскрипты, соответствующие исходной кДНК.
2. Введены нуклеотидные замены в кДНК-копию генома вируса, инактивирующие Hmcflll-сайт в положении 1449, и служащие маркером для вирусного потомства РНК.
3. Определены нуклеотидные последовательности геномов четырех патогенных ревертантов аттенуированного штамма V-69 и обнаружена высокая консервативность первичной структуры РНК ВТМ V-69 и его ревертантов.
4. Установлено, что все ревертанты характеризуются общей нуклеотидной заменой в положении 1654, восстанавливающей в структуре белков репликазы 528-ой аминокислотный остаток гистидина (Arg —>His528) характерный для дикого штамма L.
5. Показано, что введение единственной общей для ревертантов мутации в полноразмерную «ДНК копию генома ВТМ V-69 приводит к усилению его патогенности.
6. Подтверждено, что ответственные за патогенность аминокислотные замены у всех известных аттенуированных штаммов ВТМ, находятся в неконсервативной области белков репликазы между метилтрансферазным и геликазным доменами.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Снегирева П.Б., Шиян А.Н., Истомина Е.А. Полная нуклеотидная последовательность вакцинного штамма вируса табачной мозаики V-69. // Генетика, 1999. Т. 35, №7. С. 878-885.
2. Шиян А.Н., Снегирева П.Б., Истомина ЕА Вакцинный штамм V-69 вируса табачной мозаики. // Тезисы докладов международной научно-прикладной конференции "Селекция и семеноводство овощных культур в 21 веке". Москва, 2000, С.344-345.
3. Снегирева П.Б., Истомина ЕА Отличия первичной структуры генома вакцинного томатного штамма ВТМ V-69 и его патогенных ревертантов. // Тезисы докладов научной конференции "Памяти Грегора Менделя'. Москва, 2001,С.167-168.
4. Снегирева П.Б., Шиян А.Н., Истомина ЕА Получение полноразмерной кДНК вакцинного томатного штамма вируса табачной мозаики V-69. // Материалы научной генетической конференции. Москва, 2002. С. 365-366.
5. Истомина ЕА, Моисеева Е.Д., Снегирева П.Б., Шиян А.Н. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности аттенуированного штамма ВТМ V-69 и его патогенных ревертантов. // Тезисы докладов научной конференции "Вавиловские чтения - 2004". Саратов, 2004. С. 124-125.
6. Истомина Е.А., Моисеева Е.Д., Снегирева П.Б. Получение полноразмерной кДНК копии генома ВТМ V-69. // Тезисы докладов "Трансгенные растения и проблемы биобезопасности". Москва, 2004. С. 99.
7. Истомина Е.А., Снегирева П.Б., Шиян А.Н. Получение полноразмерной кДНК копии генома штамма вируса табачной мозаики штамма V-69. // Генетика, 2004. Т. 40, №12. С. 1637-1645.
8. Снегирева П.Б., Истомина Е.А., Шиян А.Н. Единственная реверсия в 126/183К гене белков репликазы аттенуированного томатного штамма V-69 вируса табачной мозаики вызывает усиление патогенности вируса. // Генетика, 2005. Т. 41, №1. С. 41-49.
№2572 5
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г Подписано к печати 17.11 2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ 511 Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Истомина, Екатерина Александровна
Список сокращений.
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность проблемы.• • •.-
Цель работы, задачи.
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Характеристика и организация вируса табачной мозаики.
1.1.1. История открытия ВТМ.
1.1.2. Организация генома вируса табачной мозаики.
1.1.3. Регуляторные области.
1.1.4. Субгеномные мРНК.
1.1.5. Репликация и трансляция.
1.1.6. Сборка вирионов.
1.1.7. Транспорт вируса в растении.
1.2. Векторы на основе вируса табачной мозаики.
1.2.1. Дефектные РНК ВТМ.
1.2.2. Основные подходы к получению вектора на основе генома ВТМ.
1.2.3. Применение ВТМ-векторов.
1.3. Замолкание генов, индуцируемое РНК.
1.3.1. Отличия TGS от PTGS.
1.3.2. Постранскрипционное замолкание генов.
1.3.3. Вирус-индуцируемое замолкание генов.
1.3.4. Замолкание генов, обусловленное ВТМ-вектором.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности аттенуированного штамма ВТМ V-69 и его патогенных ревертантов"
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Большинство вирусов растений относятся к фитопатогенам, поражающим многие сельскохозяйственные культуры. Для борьбы с вирусными инфекциями используют сорта с генами устойчивости, устойчивые трансгенные растения и вакцинацию растений ослабленными штаммами вирусов. Создание вакцин основывается на том, что среди природных популяций патогенных вирусов спонтанно возникают мутанты со сниженной патогенностью, в том числе, не вызывающие на растениях видимых симптомов. Ослабленные штаммы используются для перекрестной защиты от близкородственых патогенов. Сравнение структуры геномов авирулентных и патогенных штаммов способствует пониманию тонких механизмов, регулирующих размножение вируса и его взаимодействие с хозяином.
В последнее время все большее распространение получают работы по созданию трансгенных растений, устойчивых к патогенам. Следует иметь в виду, что до сих пор нет однозначного мнения о безвредности использования трансгенных растений. Во многих странах мира существует запрет на выращивание подобных растений.
На основе геномов растительных вирусов создаются векторы для экспрессии в растениях гетерологических генов. Применение подобных векторов, в отличие от использования трансгеных растений, получаемых в результате агробактериальной трансформации, позволяет избежать интеграции трансгена в геном растения, вследствие чего чужеродная вставка не нарушает хромосомной организации растительного генома, и не происходит инактивации экспрессии данного трансгена, часто наблюдаемой в трансгенных растениях (Mason and Arntzen, 1995). Использование вирусных векторов позволяет получать значительные количества чужеродного белка. Кроме того, химерные вирусы, полученные с помощью генно-инженерных методов, можно использовать для защиты растений от более широкого круга патогенов.
Данная работа является продолжением работ по изучению особенностей первичной структуры атгенуированного штамма ВТМ V-69 и посвящена сравнению его первичной структуры со спонтанными патогенными ревертантами и выяснению значения обнаруженных в ревертантах аминокислотных замен.
Цель работы: Определить и сравнить нуклеотидные последовательности патогенных ревертантов (Rl, R2, R2-76 и R3) с исходным атгенуированным штаммом ВТМ V-69, и выявить нуклеотидные замены ответственные за патогенность путем введения обнаруженных в ревертантах замен' в полноразмерную кДНК-копию ВТМ V-69.
При этом были поставлены следующие задачи:
1. Создать плазмидные конструкции, содержащие полноразмерные кДНК-копии аттенуированного штамма ВТМ V-69 под контролем Т7-промотора и получить in vitro инфекционные транскрипты.
2. Определить нуклеотидные последовательности геномов патогенных ревертантов провести их сравнение с исходным атгенуированным штаммом V-69.
3. Ввести обнаруженные мутации в структуру кДНК бессимптомного штамма ВТМ V-69, получить инфекционные транскрипты и проверить их патогенность.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Истомина, Екатерина Александровна
выводы.
1. Получены плазмидные конструкции, содержащие полноразмерные кДНК-копии аттенуированного штамма вируса табачной мозаики V-69 под контролем Т7-промотора, позволяющие получать in vitro инфекционные транскрипты, соответствующие исходной кДНК.
2. Введены нуклеотидные замены в кДНК-копию генома вируса, инактивирующие #ш<ЛП-сайт' в положении 1449 и служащие маркером для вирусного потомства РНК
3. Определены нуклеотидные последовательности геномов четырех патогенных ревертантов аттенуированного штамма V-69, и обнаружена высокая консервативность первичной структуры РНК ВТМ V-69 и его ревертантов.
4. Установлено, что все ревертанты характеризуются общей нуклеотидной заменой в положении 1654, восстанавливающей в структуре белков репликазы 528-ой аминокислотный остаток гистидина (Arg—»His528), характерный для дикого штамма L.
5. Показано, что введение единственной общей для ревертантов мутации в полноразмерную кДНК копию генома ВМТ V-69 приводит к усилению его патогенности.
6. Подтверждено, что ответственные за патогенность аминокислотные замены у всех известных аттенуированных штаммов тобамовирусов, находятся в неконсервативной области белков репликазы между метилтрансферазным и геликазным доменами.
7. Показана возможность введения мутаций в кДНК конструкции для изучения влияния введенных мутаций на функции вирусных белков.
1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Геномная РНК ВТМ, содержит единственную плюс цепь, кодирующую информацию о четырех белках, которые осуществляют все основные функции вируса в растении: репликацию геномной РНК, синтез субгеномных мРНК, транспорт вирусной РНК от клетки к клетке нераспространение системной инфекции. Установлено, что для выполнения этих основных функций и достижения максимального уровня размножения вируса в растении необходимо взаимодействие вирусных белков, как между собой, так и взаимодействие их со многими факторами хозяина. Многие факты тонкой регуляции функций вирусных белков стали известны в результате молекулярного клонирования кДНК как отдельных генов, так и полноразмерных кДНК, соответствующих вирусным геномам. В клонированные вирусные гены вводили мутации, сплавляли вирусные гены с репортерными генами, и получали с химерных конструкций трансгенные растения или инфекционные РНК и выясняли, как мутантные и химерные белки ведут себя в растении-хозяине.
Кроме того, на основе генома ВТМ можно создавать вектора для экспрессии гетерологических генов, как для синтеза различных белков, так и для получения вакцин против различных патогенов. В первом случае для экспрессии генов используют субгеномный промотор белка оболочки тобамовирусов. Во втором случаи - для получения вакцин экспрессируют антигенные детерминанты (короткие пептиды - эпитопы) слитые с С-концевым участком БО, который находится на поверхности вирусных частиц. Вектора на основе РНК ВТМ не нарушают хромосомную организацию растения-хозяина и позволяют получать значительные количества чужеродного белка (до 10% от общего количества белка).
Вирусные вектора открывают дополнительные возможности для создания клонетек кДНК растительных генов для изучения их функций. Кроме того, на основе вирусных векторов получают вирусные вакцины нового поколения для защиты растений от патогенов, используя механизм вирус-индуцируемого замолкания генов.
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. МАТЕРИАЛЫ.
Растительный материал. Препарат вирусных частиц получали из листьев зараженных вирусом растений Nicotiana tabacum cv. Samsun (генотип nri). Инфекционность очищенных препаратов геномной РНК проверяли на листьях сверхчувствительного хозяина - гибрида Терновского (Nicotiana tabacum х Nicotiana glutinosa, генотип NN). Системную инфекцию наблюдали на табаках Nicotiana tabacum cv. Samsun и на томатах сорта "Белый налив". Рассаду выращивали в климокамере 'Fisons Fitotron' при фотопериоде 16 ч день и 8 ч ночь при температуре 24°С.
Бактериальный штамм. Для трансформации плазмидными конструкциями использовали клетки Е. coli штамм DH 5а [ F", gyr А96 (Nal1), rec Al, rel Al, end Al, thi-1, hsdRll (rk-, mk+), glnV44, deo R, D (lac ZYA-arg F)U169|^80dA(focZ)M15]].
Плазмидный вектор. Для создания конструкций использовали плазмидный вектор pBluescript (+) (pBS+).
Олигонуклеотидньге праймеры. Специфические праймеры синтезировались фирмой Синтол (Москва) (Табл. 1), а также использовались коммерческие препараты праймеров: Dir. (17mer) pUC/M13 и Rev. (17mer) pUC/M13 фирмы Fermentas (Литва).
Ферментативные препараты. В работе использовались следующие наборы: набор для синтеза кДНК - RiboClone cDNA Synthesis System AMV RT фирмы Promega (США); набор для определения нуклеотидной последовательности - Cycle Reager™ DNA Sequencing Kit, набор для обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) - Fipst Strand cDNA Synthesis Kit, набор для проведения транскрипции in vitro - Т7 Transcription Kit фирмы Fermentas (Литва) в присутствии т7СрррО-кеп-аналога фирмы Promega (США).
Ферменты: фрагмент Кленова ДНК-полимеразы IЕ. coli, щелочная фосфотаза, ДНК-лигаза фага Т4, эндонуклеазы рестрикции, полинуклеотидкиназа фага Т4, Taq-ДНК-полимераза, Р/м-ДНК-полимераза, фирмы Fermentas (Литва). 7>/ьДНК-полимераза фирмы Силекс (Москва). Ферментные реакции проводили в буферах и при условиях, соответствующих рекомендациям фирм.
Для мечения ДНК использовали [у-32Р]АТР (Изотоп, Обнинск).
Химические реактивы. Акриламид (Sigma, Serva), Метилен-бис-акриламид (Serva), персульфат аммония (BioRad), додецилсульфат натрия (Sigma), трис-НС1 (Sigma), гуанидинтиоционат (ГТЦ) (Merck), ЭДTA(Sigma), трипгон (Difco), пептон (Difco), бакто-агар (Difco), агар Триптоза (Difco), хлорид кальция (Sigma), хлорид магния (Sigma), гидроксид натрия (Chemapol), полиэтилен гликоль (ПЭГ-6000) (Serva), сульфат аммония- (Serva),-fi-меркаптоэтанол^ (Reanal), бромистый этидий (Sigma), ИПТГ (Sigma), X-gal (Sigma), ТЕМЕД (Ы,К,К',К'-тетраметилэтилендиамин) (Reanal), у-метакрилоксипропилтриметоксилан (LKB), диметилдихлорсилан (LKB), диметилсульфоксид (ДМСО) (Merck), ионообменная смола Serdolit MB (Serva), формамид (Fluka), тритон Х-100 (Sigma), пиперазин-1,4-бис-2-этансульфоновая кислота (PIPES) (Fluka), диетилпирокарбонат (DEPC).(Serva).
Среды. Клетки E.coli, содержащие нужные плазмиды, выращивали на агаризованных средах LB: Дрожжевой экстракт 5г
Бактотриптон Юг
NaCl Юг
Бакто-агар 15г ,
Вода дистилированная до 1л. ■
Фотоматериалы. Для получения авторадиограмм использовали рентгеновскую пленку РМ-В (ПО 'Тасма', Казань) и Сгопех 4 (Sterling Diagnostic Imaging, США). Пленки после экспозиции с. радиоактивным материалом обрабатывали: в проявителе:
Метол 2.2г
Сульфит натрия безводный 72. Ог
Гидрохинон 8.8г
Сода безводная 48.0г
Калий бромистый 4.0г
Вода дистилированная до 1л.
Гипосульфит натрия 250г
Сульфит натрия безводный 25г
Кислота уксусная (ледяная) 5мл
Вода дистилированная до 1л.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Истомина, Екатерина Александровна, Москва
1. Атабеков И.Т. (1981). Практикум по общей вирусологии. Изд. Московского университета. С. 60-73.
2. Беленович Е.В., Новиков В.К., Завриев С.К. (2000). Биологические свойства и структура генома Казахского изолята К1 вируса табачной мозаики. Мол. Биол. Т.34, №1. С. 172-176.
3. Вартепитян А.Б. (1991). Полимеразная цепная реакция. Молекулярная биология, Т. 25 № 4. С. 926-936.
4. Гусев А.А. (1997). Простой метод выделения и очистки РНК. Биорганическая химия, Т. 23. № 9. С. 763-765.
5. Грибанов О.Г., Щербаков А.В., Перевозчикова Н.А., Гусев А.А. (1996). Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК плазмид и РНК. Биохимия, Т. 61. № 6. С. 1064-1070.
6. Дьяков Ю.Т. (1996). Пятьдесят лет теории ген-на-ген. Усп. Совр. Биол. Т. 116. С. 293-305.
7. Маниатис Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Дж. (1984). Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 480 с.
8. Мэтьюз Р. (1973). Вирусы растений: М: Мир. 600 с.
9. Стент Г. и Келиндар Р. (1981). Молекулярная генетика. М.: Мир. С. 474-479.
10. Снегирева П.Б. (1999). Изучение особенностей первичной структуры генома вакцинного штамма вируса табачной мозаики V-69. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. 134 с.
11. Снегирева П.Б., Шиян А.Н., Истомина Е.А. (1999). Полная нуклеотидная последовательность вакцинного штамма вируса табачной мозаики V-69. Генетика, Т.35, №7, С. 878-885.
12. Сухов К.С., Подъяпольская, Т.С., Извекова, Л.И., Андреева Э.Н., Вострова, Н.Г., Иванова, Е.С. (1982). Вакцинный штамм вируса табачной мозаики V-69: получение, свойства и практическое применение. Известия АН СССР. Серия биол. 1. С. 113-125.
13. Реунов А.В. (1999). Вирусный патогенез и защитные механизмы растений. Владивосток: Дальнаука. 215 с.
14. Шиян А.Н., Мильшина Н.В., Снегирева П.Б., Пухальский В.А. (1994). Изучение первичной структуры вакцинного штамма вируса табачной мозаики V-69. Генетика 30:1626-1629.
15. Anandalakshmi R, Pruss G.J., Ge X., Marathe R., Mallory A.C., Smith Т.Н., Vance V.B. (1998). A viral suppressor of gene silencing in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, V. 95(22). P.13079-13084.
16. Agrawal N., Dasaradhi P.V., Mohmmed A.,- Malhotra P., Bhatnagar R.K., Mukheijee S.K. (2003). RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol. Biol. Rev., V. 67(4). P.657-685.
17. Ahlquist P., Noueiry A.O., Lee W.M., Kushner D.B., Dye B.T. (2003). Host factors in positive-strand RNA virus genome replication. J. Virol., V .77(15). P.8181-8186.
18. Assaad F.F., Tucker K.L., Signer E.R (1993). Epigenetic repeat-induced gene silencing (RIGS) in Arabidopsis. Plant Mol. Biol., V22. P.1067-1085.
19. Asurmendi S., Berg RH., Koo J.C., Beachy R.N. (2004). Coat protein regulates formation of replication complexes during tobacco mosaic virus infection. PNAS, V. 101(5). P.1415-1420.
20. Atkins D., Hull R, Wells В., Roberts K., Moore P., Beachy RN. (1991). The tobacco mosaic virus 30K movement protein in transgenic tobacco plants is localized to plasmodesmata. J. Gen. Virol., V.72 (1). P. 209-211.
21. Beck D.L. and Dawson, W.O (1990). Deletion of repeated sequences from tobacco mosaic virus mutants with two coat protein genes. Virology, V. 177, P. 462-469.
22. Berna A., Gafny R., Wolf S., Lucas W.J., Holt C.A., Beachy R.N. (1991). The TMV movement protein: role of the C-terminal 73 amino acids in subcellular localization and function. Virology, V. 182(2). P.682-689.
23. Bao Y., Carter S.A., Nelson R.S. (1996). The 126- and 183-kilodalton proteins of tobacco mosaic virus, and not their common nucleotide sequence, control mosaic symptom formation in tobacco. J. Virol., V.70(9). P.6378-6383. :
24. Batschelet E., Domingo E., Weissmann C. (1976).The proportion of revertant andmutant phage in a growing population, as a function of mutation and growth rate. Gene, V. 1(1). P.27-32.
25. Bendahmane M., Fitchen J.H., Zhang G., Beachy R.N. (1997). Studies of coat protein-mediated resistance to tobacco mosaic tobamovirus: correlation between assembly of mutant coat proteins and resistance. J. Virol., V.71 (10). P.7942-7950.
26. Bendahmane M., Koo M., Karrer E., Beachy R.N. (1999). Display of epitopes on the surface of tobacco mosaic virus: impact of charge and isoelectric point of the epitope on virus-host interactions. J. Mol. Biol., 290(1). P.9-20.
27. Bendahmane M, Szecsi J, Chen I, Berg RH, Beachy RN. (2002). Characterization of mutant tobacco mosaic vims coat protein that interferes with virus'cell-to-cell movement. PNAS, V. 99(6). P.3645-3650.
28. Воуко V., van der Laak J., Ferralli J., Suslova E., Kwbn M.O., Heinlein M.2000). Cellular targets of functional and dysfunctional mutants of tobacco mosaic virus movement protein fused to green fluorescent protein. J. Virol., V. 74(23). P.l 1339-11346.
29. Brigneti G., Voinnet O., Li W.X, Ji L.H., Shou-Wei Ding S.W. and Baulcombe D.C. (1998). Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. J. EMBO, V. 17. P.6739-6746.
30. Bucher G.L., Tarina C., Heinlein M., Di Serio F., Meins F.Jr., Iglesias V.A.2001). Local expression of enzymatically active class I beta-1, 3-glucanase enhances symptoms of TMV infection in tobacco. J. Plant, V. 28(3). P.361-369.
31. By Kary В., Mullis A. and Falloona F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalezed Chain Reaction. Methods in enzymology, V.155. P. 335-350.
32. Carr J.P., Marsh L.E., Lomonossoff G.P., Sekiya M.E., Zaitlin M. (1992). Resistance to tobacco mosaic vims induced by the 54-kDa gene sequence requires expression of the 54-kDa protein. Mol. Plant Microbe Interact., V. 5(5). P.397-404.
33. Chen M.H., Sheng J., Hind G., Handa A.K., Citovsky V. (2000). Interactionbetween the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. J. EMBO, V. 19(5). P. 913-920.
34. Chen M.H. and Citovsky V. (2003). Systemic movement of a tobamovirus requires host cell pectin methylesterase. J. Plant, V. 35 (3). P. 386-392.
35. Cheng N.H., Su C.L., Carter S.A., Nelson R.S. (2000). Vascular invasion routes and systemic accumulation patterns of tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. J. Plant, V. 23(3). P.349-362.
36. Citovsky V., Knorr D., Schuster G., and Zambryski P. (1990). The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell, V. 60. P.637-647.
37. Citovsky V., Wong M.L., Shaw A.L., Prasad B.V., Zambryski P. (1992). Visualization and characterization of tobacco mosaic virus movement protein binding to single-stranded nucleic acids. Plant Cell., V. 4(4). P. 397-411.
38. Citovsky V., McLean B.G., Zupan J.R., Zambryski P. (1993). Phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein by a developmentally regulated plant, cell wall-associated protein kinase. Genes Dev., V. 7(5). P.904-910.
39. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. (1994). Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, V.263. P.802-805.
40. Canto Т., Palukaitis P. (2002). Novel N gene-associated, temperature-independent resistance to the movement of tobacco mosaic virus vectors neutralized by a cucumber mosaic virus RNA1 transgene. J. Virol., V. 76(24). P.12908-12916.
41. Carter M.J. and Milton I.D. (1993). An inexpensive and simple method for DNA purification on silica particles. Nucleic Acids Res., V. 21. P. 1044.
42. Carrington J.C., Kasschau K.D., Mahajan S.K., Schaad M.C. (1996). Cell-to-Cell and Long-Distance Transport of Viruses in Plants. Plant Cell, V. 8(10). P.1669-1681.
43. Casper S.J., Holt C.A. (1996). Expression of the green fluorescent protein-encoding gene from a tobacco mosaic virus-based vector. Gene, V. 173. P. 69-73.
44. Cowan G.H., Lioliopoulou F., Ziegler A., Torrance L. (2002). Subcellular localisation, protein interactions, and RNA binding of Potato mop-top virus triple gene block proteins. Virology, V. 298(1). P.106-115.
45. Chiu Y.L., Rana T.M. (2002). RNAi in human cells: basic structural and functional features of small interfering RNA. Mol. Cell, V. 10(3). P.549-561.
46. Cline J., Braman J.C., Hogrefe H.H. (1996). PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res., V. 24(18). P.3546-3551.
47. Dawson W.O., Beck D.L., Knorr D.A. and Grantham, G.L. (1986). CDNA cloning of the complete genome of tobacco mosaic virus and prediction of infectious transcript. PNAS, V. 83. P. 1832-1836.
48. Dawson W.O., Bubrick C., and Grantham G.L. (1988). Modifications of the tobacco mosaic virus coat protein gene affecting replication, movement, and symptomatology. Phytopathology, V. 78. P. 783-789.
49. Dawson W. O. (1992). Tobamovirus-plant interactions. Virology, 186. P. 359-367.
50. Dawson W. O. (1999). Tobacco mosaic virus virulence and avirulence. Phil. Trans. R. Soc. Lond., V. 354. P. 645-651.
51. Dehio C., and Schell J. (1994). Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., V. 91. P.5538-5542.
52. Deom C.M., Oliver M.J., and Beachy R.N. (1987). The 30-kilodalton gene product of tobacco mosaic virus potentates virus movement. Science, V.237. P. 389-394.
53. Ding X.S., Shintaku M.H., Carter S.A. and Nelson R.S. (1995). Accumu-lation of mild and severe strains of tobacco mosaic virus in minor veins of tobacco. Mol. Plant Microbe. Interact., V.8. P. 32^40.
54. Donson J., Kearney C.M., Hilf M.E. and Dawson O.W.(1991) Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. PNAS, Vol. 88. P.7204-7208.
55. Dunigan D.D. and Zaitlin M. (1990). Capping of tobacco mosaic virus RNA. Analis of viral-encoded gyaniltransferase-like activity. J. Biol. Chem., V. 265. P. 7779-7786.
56. Dunoyer P., Pfeffer S., Fritsch C., Hemmer O., Voinnet O., Richards K.E. (2002). Identification, subcellular localization and some properties of a cysteine-rich suppressor of gene silencing encoded by peanut clump virus. J. Plant, V. 29(5). P.555-567.
57. Elmayan Т., and Vaucheret H. (1996). Expression of singl copies of a strohgly expressed 35S transgene can be silenced posttranscriptionally. J. Plant, V. 9. P.767-797.
58. Erickson F.L., Holzberg S., Calderon-Urrea A., Handley V., Axtell M., Corr C., Baker B. (1999). The helicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defence response in tobacco. J. Plant, V. 18(1). P.67-75.
59. Escobar N.M., Haupt S„ Thow G., Boevink P., Chapman S., Oparka K. (2003).
60. High-throughput viral expression of cDNA-green fluorescent protein fusions reveals novel subcellular addresses and identifies unique proteins that interact with plasmodesmata. Plant Cell., V.15(7). P.1507-1523.
61. Fitchen J., Beachy RN., Hein M.B. (1995). Plant virus expressing hybrid coat protein with added murine epitope elicits autoantibody response. Vaccine, V. 13(12). P.1051-1057.
62. Gafny R, Lapidot M., Berna A., Holt C.A., Deom C.M., Beachy R.N. (1992). Effects of terminal deletion mutations on function of the movement protein of tobacco mosaic virus. Virology, V. 187(2). P. 499-507.
63. Gallie D.R, Feder J.N., Schimke RT., Walbot V. (1991). Functional analysis of the tobacco mosaic virus tRNA-like structure in cytoplasmic gene regulation. Nucleic Acids Res., V. 19(18). P.5031-5036.
64. Gallie D.R., Walbot V. (1992). Identification of the motifs within the tobacco mosaic virus 5 '-leader responsible for enhancing translation. NAR, V.20. P.4631 -463 8.
65. Giesman-Coormeyer D., Silver S., Vaewhongs A.A., Lommel S.A., Deom C.M. (1995). Tobamovirus and diantovirus movement proteins are Functionally homologous. Virology, V. 213. P. 38-45.
66. Goelet P., Lomonossoff G.P., Butler P.J., Akam M.E., Gait M. J. and Karn J. (1982). Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA. PNAS, V.79. P.5818-5822.
67. Gorbalenya A.E., and Koonin E.V. (1989). Viral proteins containing the purine NTP-binding sequence pattern. Nucleic Acids Res., 17. P.8413-8440.
68. Goregaoker S.P., Eckhardt L.G., Culver J.N. (2000).Tobacco mosaic virusreplicase-mediated cross-protection: contributions of RNA and protein-derived mechanisms. Virology, V. 273(2). P.267-275.
69. Goregaoker S.P., Culver J.N. (2003). Oligomerization and activity of the helicase domain of the tobacco mosaic virus 126- and 183-kilodalton replicase proteins. J Virol., V.77(6). P.3549-3556.
70. Golemboski D.B., Lomonossoff G.P., Zaitlin M. (1990). Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus. PNAS, V. 87(16). P.6311-6315.
71. Grant S.R (1999). Dissecting the mechanisms of posttranscriptional gene silencing: divide and conquer. Cell, V. 96(3). P.303-306.
72. Grdzelishvili V.Z., Chapman S.N., Dawson W.O., Lewandowski D.J. (2000). Mapping of the Tobacco mosaic virus movement protein and coat protein subgenomic RNA promoters in vivo. Virology, V. 275(1). P.177-192.
73. Gossele V., Fache I., Meulewaeter F., Cornelissen M., Metzlaff M. (2002). SVISS a novel transient gene silencing system for gene function discovery and validation in tobacco plants. J. Plant, V. 32(5). P.859-866.
74. Guilley H., Jonard G., Kukla В., Richards K.E. (1979). Sequence of 1000 nucleotides at the 3' end of tobacco mosaic virus RNA. Nucleic Acids Res., V. 6(4). P. 12871308.
75. Hamacher J., Wettern M., Schulz M. (2003). Ubiquitination of TMV coat protein aggregates in infected tobacco leaves. J. Phytopathology, V. 151. P.652-659.
76. Hamilton A.J., Baulcombe D.C. (1999). A species of small antisense RNA inposttranscriptional gene silencing in plants. Science, V. 286.P. 950-952.
77. Hamilton A., Voinnet O., Chappell L., Baulcombe D. (2002). Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. J. EMBO, V. 21(17). P. 4671-4679.
78. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G. (2000). An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature, V.404 (6775). P.293-296.
79. Hagiwara Y., Komoda K., Yamanaka Т., Tamai A., Meshi Т., Funada R., Tsuchiya Т., Naito S. and Ishikawa M. (2003). Subcellular localization of host and viral proteins associated with tobamovirus RNA replication. J. EMBO, Vol. 22. P. 344-353.
80. Hills G.J., Plaskitt К.А., Young N.D., Dunigan D.D., Watts J.W., Wilson T.M., Zaitlin M. (1987). Immunogold localization of the intracellular sites of structural and nonstructural tobacco mosaic virus proteins. Virology, V. 161(2). P.488-496.
81. Hirashima K., Watanabe Y. (2001). Tobamovirus replicase coding region is involved in cell-to-cell movement. J. Virol., V. 75(18). P.8831-8836.
82. Hirashima K., Watanabe Y. (2003). RNA helicase domain of tobamovirus replicase executes cell-to-cell movement possibly through collaboration with its nonconserved region. J. Virol., V. 77(22). P.12357-12362.
83. Heinlein M., Epel B.L., Padgett H.S., Beachy RN. (1995). Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science, V. 270 (5244). P. 19831985.
84. Hilf M.E., and Dawson W.O. (1993). The tobamovirus capsid protein functions as a host-specific determinant of long-distance movement. Virology, V.l93. P. 106-114.
85. Himber C., Dunoyer P., Moissiard G., Ritzenthaler C., Voinnet O. (2003). Transitivity-dependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing. J. EMBO, V. 22(17). P.4523-4533.
86. Hiriart J.B., Lehto K., Tyystjarvi E., Junttila Т., Aro E.M. (2002). Suppressionof a key gene involved in chlorophyll biosynthesis by means of virus-inducing gene silencing. Plant Mol. Biol., V. 50(2). P.213-224.
87. Hobbs S.L., Warkentin T.D., DeLong C.M. (1993). Transgene copy number can be positively or negatively associated with transgene expression. Plant Mol. Biol., V. 21(1). P. 17-26.
88. Hu W.Y., Myers C.P., Kilzer J.M., Pfaff S.L., Bushman F.D. (2002). Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Curr Biol., V. 12(15). P.1301-1311.
89. Ingelbrecht I., Van Houdt H., Van : Montagu M., Depicker A. (1994). Posttranscriptional silencing of reporter transgenes in tobacco correlates with DNA methylation. PNAS, V. 91(22). P.10502-10506.
90. Ishikawa M., Meshi Т., Motoyoshi F., Takamatsu N. and Okada Y. (1986). In vitro mutagenesis of the putative replicase genes of tobacco mosaic virus. Nucleic Acids Res. V.14. P. 8291-8305. ;
91. Ishikawa M., Meshi Т., Ohno T. and Okada Y. (1991). Specific cessation of minus-strand RNA accumulation at an early stage of tobacco mosaic virus infection. J. Virol., V. 65. P.861-868.
92. Ishihama A. and Barbier P. (1994). Molecular anatomy of viral RNA-directed RNA polymerases. Arch. Virol., V.134. P.235-258.
93. Ivanov P.A., Karpova O.V., Skulachev M.V., Tomashevskaya O.L., Rodionova N.P., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. (1997). A tobamovirus genome that contains an internal ribosome entry site functional in vitro. Virology, V. 232(1). P.32-43.
94. Joshi RL., Chapeville F., Haenni A.L. (1985). Conformational requirements oftobacco mosaic virus RNA for aminoacylation and adenylation. Nucleic Acids Res., V. 13(2). P.347-354.
95. Hunter T.R., Hunt Т., Knowland J., Zimmern D. (1976). Messenger RNA for the coat protein of tobacco mosaic virus. Nature, V. 260(5554). P. 759-764.
96. Hunter T.R., Jackson R., Zimmern D. (1983). Multiple proteins and subgenomic mRNAs may be derived from a single open reading frame on tobacco mosaic virus RNA. Nucleic Acids Res., V. 11(3). P.801-821.
97. Kahn T.W., Lapidot M., Heinlein M., Reichel C., Cooper В., Gafny R., Beachy R.N. (1998). Domains of the TMV movement protein involved in subcellular localization. J. Plant, V. 15(1). P. 15-25.
98. Kapadia S.B., Brideau-Andersen A., Chisari F.V. (2003). Interference of hepatitis С virus RNA replication by short interfering RNAs. PNAS, V. 100(4). P.2014-2018.
99. Karrer E.E., Beachy R.N., Holt C.A. (1998). Cloning of tobacco genes that elicit the hypersensitive response. Plant Mol. Biol., V. 36(5). P.681-690.
100. Kearney C.M., Donson J., Jones G.E., Dawson W.O. (1993). Low level of genetic drift in foreign sequences replicating in an RNA virus in plants. Virology, V.192 (1). P.ll-17.
101. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karger E.M., Frolova O.Y., Dorokhov Y.L.,
102. Atabekov J.G. (2001). Visualization by atomic force microscopy of tobacco mosaic virus movement protein-RNA complexes formed in vitro. J. Gen. Virol., V.82(6). P.1503-1508.
103. Kubota K., Tsuda S., Tamai A., Meshi T. (2003). Tomato mosaic virus replication protein suppresses virus-targeted posttranscriptional gene silencing. J. Virol., V. 77(20). P. 11016-11026.i
104. Kumagai M.H., Donson J., Della-Cioppa G., Harvey D., Hanley K., Grill K.L. (1995). Cytoplasmic inhibition of caretenoid biosynthesis with virus-derived RNA. PNAS, V. 92. P. 1679-1683.
105. Lacomme C. and Cruz S. (1999). Bax-induced cell death in tobacco is similar to the hypersensitive response. Proc. Natl. Acad. Sci., V. 96(14). P.7956-7961.
106. Lacomme С., Hrubikova К., Hein I. (2003). Enhancement of virus-induced gene silencing through viral-based production of inverted-repeats. J. Plant, V. 34(4). P.543-553.
107. Leathers V., Tanguay R., Kobayashi M., Gallie D.R. (1993). A phylogenetically conserved sequence within viral 3' untranslated RNA pseudoknots regulates translation. Mol. Cell Biol., V. 13(9). P. 5331-5347.
108. Lehto K., Bubrick P., Dawson W.O. (1990a). Time course of TMV 30K protein accumulation in intact leaves. Virology, V. 174(1). P.290-293.
109. Lehto K. and Dawson W.O. (1990в). Replication, stability, and gene expression of tobacco mosaic virus mutants wits a second 30K ORF. Virology, V.175. P.30-40.
110. Lewandowski D.J., Dawson W.O. (1993). A single amino acid in tobacco mosaic vims replicase prevents symptom production. Mol. Plant Microbe. Interact., V. 6. P. 157-160.
111. Lewandowski D.J., Dawson W.O. (1998). Deletion of internal sequences results in tobacco mosaic vims defective RNAs that accumulate to high levels without interfering with replication of the helper vims. Virology, V.251. P.427-437.
112. Lewandowski D.J., Dawson W.O. (2000). Functions of the 126- and 183-kDa proteins of tobacco mosaic vims. Virology, V. 271(1). P. 90-98.
113. Li H.W., Lucy A.P., Guo H.S., Li W.X., Ji L.H., Wong S.M., Ding S.W. (1999). Strong host resistance targeted against a viral suppressor of the plant gene silencing defence mechanism. J. EMBO, V. 18(10). P.2683-2691.
114. Lu В., Stubbs G., Culver J.N. (1998a). Coat protein interactions involved in tobacco mosaic tobamovirus cross-protection. Virology, V. 248(2). P.188-198.
115. Lu В., Taraporewala F., Stubbs G., Culver J.N. (19986). Intersubunit interactions allowing a carboxylate mutant coat protein to inhibit tobamovims disassembly. Virology, V. 244(1). P.13-19.
116. Ogawa Т., Watanabe Y., Okada Y. (1991). cis-acting elements for in trans complementation of replication-defective mutant of tobacco mosaic virus. Virology, V. 191(1). P.454-458.
117. Ogawa Т., Watanabe Y., Meshi Т., Okada Y. (1992). Trans complementation ofvirus-encoded replicase components of tobacco mosaic virus. Virology, V. 185(2). P.580-584.
118. Osman T.A.M., and Buck K.W. (1996). Complete replication in vitro of tobacco mosaic virus RNA by a template-dependent, membrane-bound RNA polymerase. J. Virol., V. 70. P. 6227-6234.
119. Osman T.A. and Buck K.W. (1997). The tobacco mosaic virus RNA polymerase complex contains a plant protein related to the RNA-binding subunit of yeast elF-3. J. Virol., V. 71(8). P.6075-6082.
120. Osman T.A.M. and Buck K.W. (2003). Identification of a Region of the Tobacco Mosaic Virus 126- and 183-Kilodalton Replication Proteins Which Binds Specifically to the Viral З'-Terminal tRNA-Like Structure. J. Virology, V. 77 (16). P. 8669-8675.
121. Osman T.A., Hemenway C.L., Buck K.W. (2000). Role of the 3' tRNA-like structure in tobacco mosaic virus minus-strand RNA synthesis by the viral RNA-dependent RNA polymerase In vitro. J. Virol., V. 74(24). P. 11671-11680.
122. Ohno Т., Aoyagi M., Yamanashi Y., Saito H., Ikawa I., Meshi Т., and Okada Y. (1984). Nucleotide sequence of the TMV (tomato strain) genome and comparison with the common strain genome. J. Biochem., V.96. P.1915-1923.
123. Namba K., Pattanayek R, Stubbs G. (1989). Visualization of protein-nucleic acid interactions in a virus. Refined structure of intact tobacco mosaic virus at 2.9 A resolution by X-ray fiber diffraction. J. Mol. Biol., V. 208(2). P.307-325.
124. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell., V.2(4). P.279-289.
125. Nemchinov L.G., Liang T.J., Rifaat M.M., Mazyad H.M., Hadidi A., Keith J.M. (2000). Development of a plant-derived subunit vaccine candidate against hepatitis С virus. Arch. Virol., V. 145(12). P.2557-2573.
126. None H. J., Nojima H., Okayma H. (1990). High efficiency transformation of E.coli withplasmids. Gene, V. 96. P. 23-28.
127. Nishiguchi M., Kikuchi S., Kiho Y., Ohno Т., Meshi Т., Okada Y. (1985). Molecular basis of plant viral virulence; the complete nucleotide sequence of an attenuated strain of tobacco mosaic virus. Nucleic Acids Res., V. 13(15). P.5585-5590.
128. Nykanen A., Haley В., Zamore P.D. (2001). ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell, V. 107(3).P.309-321.
129. Malpica J.M., Fraile A., Moreno I., Obies C.I., Drake J.W., Garcia-Arenal F. (2002). The rate and character of spontaneous mutation in an RNA virus. Genetics, V.162 (4). P.1505-1511.
130. Marathe R., Smith Т.Н., Anandalakshmi R., Bowman L.H., Fagard M., Mourrain P., Vaucheret H., Vance V.B. (2000). Plant viral suppressors of post-transcriptional silencing do not suppress transcriptional silencing. J. Plant, V. 22(1). P.51-59.
131. Mas P., Beachy R.N. (1999). Replication of tobacco mosaic virus on endoplasmic reticulum and role of the cytoskeleton and virus movement protein in intracellular distribution of viral RNA. J. Cell Biol., V. 147(5). P.945-958.
132. Mas P., Beachy R.N. (2000). Role of microtubules in the intracellular distribution of tobacco mosaic virus movement protein. PNAS, V. 97(22). P. 12345-12349.
133. Mason H.S. and Arntzen CJ. (1995). Transgenic plants as vaccine production systems. Trends. Biotechnol., V.13(9). P.388-392.
134. McCaffrey A.P., Meuse L., Pham T.T., Conklin D.S., Hannon G.J., Kay M.A. (2002). RNA interference in adult mice. Nature, V. 418(6893). P.38-39.
135. McLean B.G., Zupan J., Zambryski P.C. (1995). Tobacco mosaic virus movement protein associates with the cytoskeleton in tobacco cell. Plant Cell, V. 7(12). P .2101-2114.
136. McKinney H.H. (1929). Mosaic disease in the Canary Islands, West Africa, and Gibraltar. J. Agricultural Research, V.39. P. 557-578.
137. Merits A., Kettunen R., Makinen K., Lampio A., Auvinen P., Kaariainen L., Ahola T. (1999). Virus-specific capping of tobacco mosaic virus RNA: methylation of GTP prior to formation of covalent complex pi26-m7GMP. FEBS Lett., V. 455. P. 45-48.
138. Meshi Т., Isnikawa M., Semba K., Okada Y. (1986). In vitro transcription of infectious RNAs from full-length cDNAs of tobacco mosaic virus. PNAS, V. 83. P. 5043-5047.
139. Meshi Т., Watanabe Y., Saito Т., Sugimoto A., Maeda T. and Okada Y. (1987). Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensibility for replication. J. EMBO, V. 6. P.2557-2563.
140. Meyer P., Heidmann I., Neiedenho F.I. (1993). Differences in DNA-methylation are associated with a paramutation phenomenon in transgenic petunia. J. Plant, V. 4. P.89-100.
141. Pelham H.R.B. (1978). Leaky UAG termination codon in tobacco mosaic virus
142. RNA. Nature, V. 272. P.469-471.
143. Powell-Abel P., Nelson R.S., De В., Hoffmann N., Rogers S.G., Fraley R.T., and Beachy R.N. (1986). Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science, V. 232. P. 738-743.
144. Raffo A.J., Dawson W.O. (1991). Construction of tobacco mosaic virus subgenomic replicons that are replicated and spread systemically in tobacco plants. Virology, V. 184(1). P.277-289.
145. Rabindran S., Dawson W.O. (2001). Assessment of recombinants that arise from the use of a TMV-based transient expression vector. Virology, V. 284(2). P. 182-189.
146. Ratcliff F.G., MacFarlane S.A., and Baulcombe D.C. (1999). Gene silencing without DNA rna-mediated cross-protection between viruses. Plant Cell, V. 11 (7). P. 12071216.
147. Reed J.C, Kasschau K.D., Prokhnevsky A.I., Gopinath K., Pogue G.P., Carrington J.C., Dolja V.V. (2003). Suppressor of RNA silencing encoded by Beet yellows virus. Virology, V. 306(2). P.203-209.
148. Reichel C., Mas P., Beachy RN. (1999).The role of the ER and cytoskeleton in plant viral trafficking. Trends Plant Sci., V. 4(11). P.458-462.
149. Rozanov M.N., Koonin E.V., Gorbalenya A.E.(1992). Conservation of the putative methyltransferase domain: a hallmark of the 'Sindbis-like' supergroup of positive-strand RNA viruses. J. Gen. Virol., V.73 (8). P. 2129-2134.
150. Ruiz M.T., Voinnet O., Baulcombe D.C. (1998). Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell, V. 10(6). P.937-946.
151. Ryabov E.V., Oparka K.J., Santa Cruz S., Robinson D.J., Taliansky M.E. (1998). Intracellular location of two groundnut rosette umbravirus proteins delivered by PVX and TMV vectors. Virology, V. 242(2). P.303-313.
152. Ryabov E.V., Robinson D.J., Taliansky M.E. (1999). A plant virus-encodedprotein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA. PNAS, V. 96(4). P. 1212-1217.
153. Saito Т., Yamanaka K., Okada Y. (1990). Long-distance movement and viral assembly of tobacco mosaic virus mutants. Virology, V. 176(2). P.329-336.
154. Sameer P., Goregaoker S.P., Culver J.N. (2003). Oligomerization and Activity of the Helicase Domain of the Tobacco Mosaic Virus 126- and 183-Kilodalton Replicase Proteins .Virol о gy, V. 77 (6). P.3549-3556.
155. Skuzeski J.M., Nichols L.M., Gesteland R.F., Atkins J.F. (1991). The signal for a leaky UAG stop codon in several plant viruses includes the two downstream codons. J. Mol. Biol., V. 218(2). P.365-373.
156. Sulzinski M.A., Gabaro K.A., Palukaitis P. and Zaitlin M. (1985). Replication of tobacco mosaic virus. VII. Characterization of a third subgenomic TMV RNA. Virology, V. 145. P.132-140.
157. Siegel А., Нал V. and Kolacz K. (1978). The effects of tobacco mosaic virus infection on host and virus-specific protein synthesis in protoplasts. Virology, V. 85. P.494-503.
158. Sijen Т., Fleenor J., Simmer F., Thijssen K.L., Parrish S., Timmons L., Plasterk R.H., Fire A. (2001). On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing. Cell, V. 107(4);Т.465-476.
159. Sherwood J.L. (1987). Demonstration of the specific involvement of coat protein in tobacco mosaic virus (TMV) crosses protection using a TMV coat protein mutant. J. Phytopathology, V. 118. P. 358-362.
160. Shivprasad S., Pogue G.P., Lewandowski D.J., Hidalgo J., Donson J., Grill L.
161. KL, Dawson W. О. (1999). Heterologous sequences greatly affect foreign gene expression in tobacco mosaic virus-based vectors. Virology, V. 255. P. 312-323.
162. Sugiyama Y., Hamamoto H., Takemoto S., Watanabe Y., Okada Y. (1995). Systemic production of foreign peptides on the particle surface of tobacco mosaic virus. FEBS Lett., V. 359. P. 247-250.
163. Shaw J.G., Plaskitt K.A., Wilson T.M.A. (1986). Evidence that tobacco mosaic virus particles disassemble contranslationally in vivo. Virology, 148. P. 326-336.
164. Shintaku M.N., Carter S.A., Bao Y., Nelson R.N. (1996). Mapping nucleotides in the 126-kDa protein gene that control the differential symptoms induced by two strains of tobacco mosaic virus. Virology, V. 221. P.218-225.
165. Szittya G., Silhavy D., Molnar A., Havelda Z., Lovas A., Lakatos L., Banfalvi Z., Burgyan J. (2003). Low temperature inhibits RNA silencing-mediated defence by the control of siRNA generation. J. EMBO, V. 22(3). P.633-640.
166. Taliansky M.E., Malyshenko S.I., Pshennikova E.S., Kaplan I.B., Ulanova E.F., Atabekov J.G. (1982). Plant virus-specific transport function. Virus genomic control required for sistemic spread. Virology, V.122. P. 318-326.
167. Takebe I., Otsuki Y. (1969). Infection of tobacco mesophyll protoplasts by tobacco mosaic virus. Proc Natl Acad Sci U S A, V. 64(3). P. 843-848.
168. Takamatsu N., Watanabe Y., Iwasaki Т., Shiba Т., Meshi, T. and Okada Y. (1991). Deletion analysis of the 5' untranslated leader sequence of tobacco mosaic virus RNA. J. Virol., V.65. P.1619-1622.
169. Takamatsu N., Watanabe Y., Meshi T. and Okada Y. (1990). Mutational analysis of the pseudoknot region in the 3' noncoding region of tobacco mosaic virus RNA. J. Virol., V.64. P.3686-3693.
170. Takamatsu N., Watanabe Y., Yanagi H., Meshi Т., Shiba Т., Okada Y. (19906). Production of enkephalin in tobacco protoplasts using tobacco mosaic virus RNA vector. FEBS Lett., V. 269:73-76.
171. Taylor D.N., Carr J.P. (2000). The GCD10 subunit of yeast eIF-3 binds the methyltransferase-like domain of the 126 and 183 kDa replicase proteins of tobacco mosaic vims in the yeast two-hybrid system. J. Gen. Virol., V. 81. P. 1587-1591.
172. Toth R.L., Pogue G.P., Chapman S. (2002). Improvement of the movement and host range properties of a plant virus vector through DNA shuffling. J. Plant, V. 30(5). P.593-600.
173. Tomenius K., Clapham D., Meshi T. (1987). Localization by immunogold cytochemistry of the virus-coded 30R protein in plasmodesmata of leavel ihfected with tobacco mosaic virus. Virology, V. 160. P. 363-371.
174. Tuschl Т., Zamore P.D., Lehmann R, Bartel D.P., Sharp P.A. (1999). Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev., V. 13(24). P.3191-3197.
175. Turpen Т.Н., Reinl S.J., Charoenvit Y., Hoffman S.L., Fallarme V., Grill L.K. (1995). Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobacco mosaic virus. Biotechnology, 13(1). P.53-57.
176. Van Belkum A., Abrahams J. P., Pleij C. W. A. and Bosch L. (1985). Five pseudoknots at the 204 nucleotides long 3' noncoding region of tobacco mosaic virus RNA. Nucleic Acids Res., V. 13. P.7673-7686.
177. Vaucheret H., Beclin C., Elmayan Т., Feuerbach F., Godon C., Morel J.B., Mourrain P., Palauqui J.C., Vernhettes S. (1998). Transgene-induced gene silencing in plants. J. Plant, V. 16(6). P.651-659.
178. Voinnet 0., Lederer C., Baulcombe D.C. (2000). A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell, V. 103. P.157-167.
179. Waigmann E., Lucas W.J., Citovsky V., Zambryski P. (1994). Direct functional " assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domaininvolved in increasing plasmodesmal permeability. PNAS, V. 91(4). P.1433-1437.
180. Watanabe Y., Morita N., Nishiguchi M., Okada Y. (1987). Attenuated strains of tobacco mosaic vims. Reduced synthesis of a viral protein with a cell-to-cell movement1 function. J. Mol. Biol., V. 194(4). P. 699-704.
181. Wanatabe Y., Ohnishi J., Saitoh H., Hosokawa D., Okada Y. (1996). Addition of nucleotides similar to deleted CAA repeats in the 5' non-coding region of tomato mosaic virus RNA following propagation. J. Gen. Virol., V.77. P.2353-2357.
182. Waterhouse P.M., Graham M.W., Wang M.B. (1998). Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. PNAS, V. 95(23) P.13959-13964.
183. Weber H., Haeckel P., Pfitzner A.J. (1992). A cDNA clone of tomato mosaic virus is infectious in plants. J. Virol., 66(6). P.3909-3012.
184. Wilson T.M.A. (1993). Strategies to protect crop plant against virus: pathogen-derived resistance blossoms. PNAS, V. 90. P. 3134-3141. r
185. Wilson T.M.A. (1984). Cotranslational disassambly of tobacco mosaic virus in vitro. Virology, V.137. P.255-265.
186. Wolf S., Deom C., Beachy R.N., Lucus W. J. (1989). Movement protein of tobacco mosaic vims modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science, V. 246.P. 377379. :
187. Wu L., Fan J., Jiang L., Wang H., Song R., Zhang Q., Zhu H., Li N., Liu Z., Xu Z. (2003a). A specific cis-hairpin ribozyme facilitates infection of a TMV-based DNA vector in tobacco protoplasts. J. Virol. Methods., V. 111(2). P. 101-109.
188. Wu L., Jiang L., Zhou Z., Fan J., Zhang Q., Zhu H., Han Q., Xu Z. (20036). Expression of foot-and-mouth disease vims epitopes in tobacco by a tobacco mosaic vims-based vector. Vaccine, V. 21(27-30). P.4390-4398.
189. Wu X. and Shaw J.G. (1997). Evidence that a viral replicase protein is involved in the disassembly of tobacco mosaic vims particles in vivo. Virology, V. 239(2). P. 426-434.
190. YamanakaТ., Ohta Т., Takahashi M., Meshi N. Schmidt R., Dean C., Naito S. and Ishikawa M. (2000). TOM1, an Arabidopsis gene required for efficient multiplication of a tobamovims, encodes a putative transmembrane protein. PNAS, V. 97. P. 10107-10112.
191. Yang D., Lu H., Erickson J.W. (2000). Evidence that processed small dsRNAs may mediate sequence-specific mRNA degradation during RNAi in Drosophila embryos. Curr Biol., V. 10(19). P.l 191-1200.
192. Yang G„ Qiu B.S., Liu X.G., Li Y., Wang X.F. Nonsense mutations of replicase and movement protein genes contributes to the attenuation of an avirulent tomato mosaic vims. Vims Res., V. 87. P. 119-128.
193. Yusibov V., Loesch-Fries L.S. (1995). High-affinity RNA-binding domains ofalfalfa mosaic virus coat protein are not required for coat protein-mediated resistance. Proc. Natl. Acad. Sci., V. 92(19). P.8980-8984.
194. Yusibov V., Modelska A., Steplewski K., Agadjanyan M., Weiner D., Hooper D. C., Koprowski H. (1997). Antigens produced in plants by infection with chimeric plant viruses immunize against rabies virus and HIV-l. Proc Natl Acad Sci, V. 94. P.5784-5788.
195. Zamore P.D., Tuschl Т., Sharp P.A., Bartel D.P. (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell, V. 101(1). P.25-33.
196. Zeyenko V. V., Ryabova L. A., Gallie D. R., Spirin A. S. (1994). Enhancing effect of the 3'-untranslated region of tobacco mosaic virus RNA on protein synthesis in vitro. FEBS Lett., V. 354. P. 271-273.1. БЛАГОДАРНОСТИ.
197. Автор выражает благодарность за поддержку и помощь в осуществлении представленной диссертационной работы своему научному руководителю с.н.с., к.б.н. Шияну Александру Николаевичу.
198. Елизаровой Елене Васильевне и Коростылевой Татьяне Викторовне за помощь в культивировании растений Табаков и томатов.
199. Сотрудникам лаборатории генетики растений за очень доброе благожелательное отношение.
200. Сотрудникам ИОГен за интерес к работе и к диссертанту.
- Истомина, Екатерина Александровна
- кандидата биологических наук
- Москва, 2004
- ВАК 03.00.15
- Изучение особенностей первичной структуры генома вакцинного штамма вируса табачной мозаики V-69
- Изучение генетического полиморфизма аттенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов
- Тобамовирус крестоцветных: полная нуклеотидная последовательность и механизм экспрессии гена белка оболочки
- Структура гена РНК-полимеразы и разработка метода выявления вируса ящура
- Структурная и функциональная организация нетранслируемых областей генома пикорнавирусов