Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ электрофоретических и иммунохимических свойств гликопротеиновых гормонов позвоночных

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ электрофоретических и иммунохимических свойств гликопротеиновых гормонов позвоночных"

российская академия 'сельскохозяйственных наук внии сельскохозяйственной биотехнологии

На правах рукописи ГОВОРУН Марям СтапзсяаЕоггз С?ЛТСС21ШТЕЛЫШЙ АНАЛИЗ ЭЛЕХСТРОООРЕТНЧЕСаК И

пиг.отохтппшаак свойств гликопротешговых гормонов позвоночных

сяс^зальпогть 03.СЭ.23. - Биотехнология

автореферат '

па сокагапла учепоЗ стексгш пяядядата баолопгеесшх парт

Моема 1534

Работа выполнена в лгзборатораа кюлекуляриой диагностики гоыноЯ шкэнеряа микроорганизмов ВШШ сельскохозяйственной бгатехнагогва РАСХН.

Научный руководитель: кандидат Отологических наук

лшзько СЛЗ

Официальные ошюпэнты: доктор биологических наук

Гпнодаан Л.1: кандидат биологических наук Иакгровская Е.Е

Ведущая организация - Институт БеоЦздпцпнской РАМН

Защдта диссертации состоится " "___1994 г.

в _час., па заседании Специализированного Совета Д.020.40.0) при

ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г.Москва, уд.Тгагаризевская д.42.

С _ диссертацией ?,:о2по ссшаксьглться в библиотеке ВНИ1 сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " "_1994 г.

Ученый секретарь

• специализированного совета, ■ ,

- • /

кандидат биологических цаук / Пэлзкова С.А.

■ '

(ЩЙЯ ХДОДОЖРПСТШСА РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность. Глгссопротеиновне гормоны продуцируются в гипофизе всех изученных позвоночных гзпзотных. Это семейство представлено четырьмя типами гормонов, которые регулируют важнейшие функции организма кпвотимх и человека. Два из них (лютегашзируксзй гормон (ЛГ) и фоллякулостпмулируксий гормон (ФСГ)) контролируют репродуктивные функции, а тирзотропнна гормон (ТТГ) - функции ситовидной г.злэзн. Четвертый тип - хоркопический гонедотропия (ХГ), обнаругзнпнй у человека и некоторых »шжооттащпх, синтезируется тканью хориона (\7aitt ег а1., 1591).

• В ветеринария п медицине шгрско используются очищенные препараты глякопротенновнх гормонов как для регуляции репродуктивного цикла у кивоткых ФспзМеоп, 1938, 1989; СаЬогеаи, 1587), тек и для конструирования ккмунохпгдгеескпх диэгностнкуиов (АМи1-Ай]га(1 ег а1.. 1937; Вэдс1тата ег а!., 1973; ПесИег ег а1. 1990; Оагигк et а1., 1987). ¡.йогостаднйные процедуры очистки-глзсопротепнавых горкопов из гппофизарннх экстрактов, применяющиеся а настоящее время, не являются гехнологнчшйи. В связи с этш актуальной является разработка простых и еффектшлшх способов очистки этих гормонов.

Биологическое тестирование, РИА п ИМ, обычно применякзкеся для-детекции глпсопротепноЕНх гормонов в бхгалогических кидкостях я для контроля обогащения фракций гормснокя в процессе их выделения, пэ всегда доступш, являются дорогостоящ,"! й требуют вясокоочицекных антигенов глишпротенноЕше горюнои. В . связи с этпи вакяой и актуальной является разработка простого и быстрого метода дз текши глихопротепповнз гормонов.

Все глпкопротешювие гор?,:ояц гмзю? сходное строение, для итогах кз них определена первичная структура (Г,'агй а!., 1991). Однако глногтге аспекта филогенетических взаимоотношений мезду гликопротеппоЕЮ-й гормонами разных классов позвоночных глхеотпнх остаются не;гзучетщ?.п. Полепи обцше аитпгепшх дзтеришант и . консервативных аташокпелотных последовательностей в глакопротеиношг горг.'снах представителей разных филогенетических' груш позвоночных гавотнюс помогут попять закономерности эволюС&ш внутри этого семейства гормонов. В сеязп с этим актуальной является

разработка нових шмуыохЕшчоских подходов к сравнительно: исследованию антигенных свойств щикопротеиновых горшнов. Так подходы являются такие необходимая для скрининга шноклональных поликлональных антител, что может иметь практическое значение д получения высоко-—специфичных антител с целью создан диагностикужш в ветеринарии и медицине.

Таким образом, гликопротеиновые гормоны как объект исследован представляют практический и теоретический интерес.

Цель работа. Целью работы явилось исследован

электрофоретнческих свойств различных глинопротеиновых гордонов сравнительный иммунохимический анализ гликопротеиновых горлон-представителей разных классов позвоночных швотных. В рабо' решались следующие конкретные задачи:

1. Получение препаратов гликопротеиновых гормонов,

2. Разработка простого метода дцэктзвдякации гликопротеинов! гормонов,

3. Сравнительный олектрбфэрегачэский анализ различных гликопротеиновых гормонов,

4. Сравнительное исследование антигенных свойств гликопротеинов! гормонов разных филогенеипеасих групп позвоночных кммунохимическая характеристика некоторых поликлональных антител.

Научная новизна рсбота.

Впервые предложен метод одновременного электрсфэретическо! анализа а,р-димеров п субъедишц гликопротеиновых горшнов денатурирующих условиях, позволяющий детектировать эти гормоны кг в Еысокоочтлденных препаратах, так и в слоеных белковых амзеях, ' таксе суммарные препарата этих гор,шов. Исследована устойчивее! гетеродимеров различных, гликопротеиновых гормонов зс действ; восстанавливающих агентов. Предающей простой и быстрый спосс > определения специфичности онтигашороток по отношению гетеродамерам и субъединицагл широкого спектра гликопротеинов! гормонов при гшоща сочетания одновременного алектро$оретнческо1 анализа а,р-димеров и субъедашщ с блопимунопероксидазж детекцией. Обнарукена п локализовано общие антигенные детерминант в гликопротеиновых гормонах цлекоплтанда и гонадотропш костно-хряцевых рыб.

Научная и практическая ценность работы.

Полученше в работе даншо об общие антигошшх детерминантах в ликопротешовнх гормонах разных классов позвоночных животных, ополненнне результата?«! частичного сиквенса аминокислотной эследовательности гонадотропинэ костно-хрящевой рибы севрюги омогут раскрыть закономерности эволюционных взаимоотношешШ в ряду ллкопротешошх гормонов. Часть результатов, полученных в работе, дает практическое значение. Прт'енешпгй в работе новый способ чистки глшопротэиновых гормонов и удобные метода их определения эгут сыть использованы при разработке технологи:! очистки пккопротеиновых. гормонов п в создании диагностикунов.

' Лпробоцпя работа. Результата работы был:! доложены на научной ЭЕфэренцЕЯ молодых учете: ВНЗШСБ п 1990 (первая премия), на 15-й вропвйской копференцш по сравнительной эндокринологии (Леувен, э;о).

По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работ».

Объаы я структура ре5отн. Диссертация изложена на 130 страницах ггннописного текста, включая 7 гобдащ и 16 рисунков, и состоит из зэдения, 4 глав н выводов. Библиография составляет 177 именований работ отечественных и зарубежных авторов.'

^ТЕКШЗ! и теки ксслк.г.ов.мптя

Лцэтоняровашше гипофизн человека, р:гб, амфабий, фракции знздотропного гормона* (ГГГ) севрюги послз анионообметшоЛ эоматогра|сш на ДЕАЕ-целлшозе п политональные ентнтола кратка ротяв ГТГ- севрюга, а такаэ против р-субьелэзщн ГТГ севрюги обезно предоставлены А.Вплгшсоч (НИИ кикрбиологии Латв.ССР) и .Ф.Гончарово-л (ЙИ биологизм развития). Очищекшй препарат лг кита обезно предоставлен В.С. • Карасевым (ВЗЩ АШ СССР). Очищенные зепаратн ЛГ, ИГ, ФСГ человека и антиигеорэтзи кролика против ЛГ и ЗГ человека лзайезно предоставлены Т.А. Осиновой (ВЗЩ АМН СССР), поденный препарат ХГЧ лвбеяио предоставлен Н.Д. Дурмановш (НГОД гасергис). • Антисгеоротка кролика против ФСГ сшшьи любезно зэдостазлзпа В.В.Турчинсгага (НЩ Бкосаршс). Коньогировашшо с »роксэдазоЯ антитела осла против ксдуяоглобулаЕов кролика лабозно »доставили С.Н. Хллько п Л.В. Верховская.

Для получения, суммарных препаратов глшеопротеинових гормонов из

гипофизов свиньи, крупного рогатого скота.- (КРС), человека использовали сходные процедуры очистки. Экстракцию гликопротеиноЕых гормонов из гипофизов млекопитающих и человека проводили при pH 4 (Reichert, 1975) с модификациями. Гликопротеиновые гормоны пз гипофизов костистых рыб и амфибий экстрагировали при pH 9,6. Суммарные препараты гликопротеиновых гормонов из экстракта гиюф:аа получали методом хроматографии па окрашенном сорбенте Blue-toypsarl (Тоуо Soda) (Thotataxra, 1991). Полученный суммарный препарат гликопрогеинових гормонов разделяли на индивидуальные гор;,¡они (ЛГ в ФСГ - в случае гликопротеиновых горюнов свиньи и ТТГ и ЛГ - в случае гликопротеиновых гормонов КРС) ыетодом шшонооОелэеной хроматографии (Donaldson L.E., 1988) на сорбенте QAE-toyopearl (Тоуо Soda). Содержание гор.юна в хроматографаческкх фракциях определяли спектрсфотоыетротеске, ö такае полуколичественно при помсии *плюс ** - "минус * модификации элекгрсфэретического иатода Lawnmil (1970). В случае очистка из гипофиза севрнл* для определения активного ГТГ во фракциях проводили биологическое тестирование нэ ооцитах лягуЕки совместно с Б.Ф. Гончаровы*! (НИИ Виологки развития).

Диск-электрофорез глнкопротекноЕнх горлонов проводила при ncMosaï разработанной нами "плхс™-"шнус*1 кодгфпсацпи метода Laenall (1970) (см. раздел "Основные результата исследований"). После электрофореза гели окраиивала серебром (В1ш et' al., 1987).

Изээлектрофохусирование проводила в вертикальном полиакрпламидноы геле (Robertson et al., 1987) с небольшая модификациями.

АнткснБоротки кролика п кггп против ГТГ севрюга а антисыворотку кролика против ЛГ КРС получали совместно с А Езлнисоы, В.В. Турчинсквм и B.C. Яхъяешгл, используя схеху гаялунизацап, описанную Johnstone et al. (1984).

Твердофазный ;п.муноф?рг:ентный анализ на поли стироловых панелях (MA) проводили по стандартном кэтодикал (Ocelerlch, 1934) с некоторыми модификациями:.

П^уноферментный анализ в точкех на пзтроцеллалозе осуществляла но методу, описанному ТарасЕВИШЕЛ (1Э86).

Ьлот-тамунопероксидйзную дэтекщпо гликопротеиновых_ горюнов после электрофореза в полнакравзмидаси геле проводили методом

олектропереноса бежав из пластан геля на нятроцеллюлозные фильтры в "полусухой" буферной системз (Kyhse-Andersen, 1984) с последующей обработкой фильтров как п в ИМ в точках на нитроцеллюлозе.

Все варианты PI4A проводили совместно с H.A. Кирасовой, G.D. Папоповнм п Г-К. Юровнм.

Прямой радиоиммуннш анализ с преципитацией скмунных комплексов суспензией гашстивированкшс клеток золотистого стафхпококко проводили по методу, описанному Тарасишным (1930). ЛГ НРС и ИТ севрюги металл С I] прп пог-ощл йодогена. За зону 50;? осаздепия антигена прэшзмзли разведение антител, при котором В- Р1 Вп-. где В100 - радиоактивность осадка при максимальном осаздешш аптагена, Вл - радиоактивность осадка при использовании нормальной сыворотки кролика в разведении 1:100, В - радиоактивность осадка прз давнем разведения сыворотка.

Конкурентней вариант РИА проводили но схеме, аналогичной прямому РИА, но с добавлении различных количеств колкурирукза вемочешк антигенов глнкспротегшошг гормонов в различиях сястемпг. - гомологичных л гетзрологлчшк, а именно: [1251]-ЛГ КРО -снтиснЕоротка против JIT КРС, С1251]-.5Г КРС-антпсшзоротка против ГТГ се прети, [1251]-ГГГ сезрюгл-антпеиворотка против ИТ севрюга, [l2üI]-riT севраги-автлсцгоротиа против ЛГ KFC. Процент прзцпдитащш метеного антигена определял! по формуле : 1СШ, где Ао- радиоактивность осадка в отсутствии немеченого шггигено, А- радиоактивность осадка при наллчял неученого сдтагенз, Вн- как я щн прямом' радаохзлунном сналнзе.

РадпохааотопрецгтйтшшонннЯ анализ (РИПА) (Kessler, 1975) проводили с- использованием разработанной пош кодп&асацга "n.Eoc"-"tsnyc" электрофореза. в буферной системе laeraili (baeraili. 1S70) с последующей радяоавтографзеЯ на пленке P'i-B.

основные ЯЕЗМОДШ гаагвдозАшя

1; Отнстяа глпйспрототао^пг гсрютсз.

В начале напей работы перед цвт стояла задача получения очпцешшх препаратов рада глшсспротешових гормонов. В настоящее время существуют различные подходы к фракционировании гликопротеиновых гормонов. Известные методу фракционирования позволяют получать високоочаденные препараты гжпсопротеиношх

горюнов (Closest et al., 1974, 1975, 1978; Reichert, 1975; Salrna, 1979; Burzawa-Gerard, 1971, Hiama, 1930). Однако, как правило, очистка гликопротешовых горюнов представляет соСоД многостадийный длительный процесс, занимавцзй в некоторых случаях до четырех недель. Способы экстракции отличаются в разных работах н тага» зависят от ввда, пз которого наделяют горюны. В данной работе использован известный способ экстракции щи рЯ 4, в результате которой, глнкопротешовые гормоны млекопптаицих оказываются в экстракте, а остальные гшюфазарные горюш остаются в осадке, получаемом после центрифугирования пжогената (ftalcliort, 1975). Однако было сокращено время экстракции до двух часов (два раза по 1 ч) п мы отказались от последукщах стадии фракцаонароаапия, применяющихся в различных сочетаниях в других работах..

Дальнейшая очистка представляет собой обычно ко:;бШ1ациз пз ряда хроматографических стадий, вклячаицах гельфлльтрацшо, хроматографа на нонообменниках (Bursawa-Gerad, 1971, 1975; Reichert, 1975; Condlilf 1973, Donaldson, 1S88), б иеко'торих случаях афишную хроматографию на con-А сэфарозе (Salraa, 1931; Salraa, 1978, Laag, 1985). В настоящей работе применен вошй способ получения суммарного препарата гдшсопротепновых гормонов путем хромагографш на Blue-toyopearl (габлацз 1), которая, позволяет освободиться от ссльшнства прикесяшс белков, содерващахся б скстракте гагофзза, практически без потерь глжопротешоЕнх горошш, что подтверздаэтся данвши "штос"-";.пшус" глактрофореза с ДСИ (р:с. S) п результатами биологического тестирования в случае гзделзшм ГГГ пз гипофиза севрюги (данные црздставлзвн в диссертации).

Дальнейшая хроматография на QiE-toyopsarl фракцпа, обогааенноЗ . гликопротеиновыми гормонам, полученной посла хроматографам скстракта гипофиза на Blus-toyopearl, приводит к разделении ЛГ с ©СГ (рис. 4, таблица 2) в случае- очистки пз гапсфлза свиньи п JJT п 1 ТТГ - в случае KFC (рис. 1). Одаако алэктрофоретпчесгаШ анализ (pro. 1 ) п блотиммунофергентный анализ (рис. 5) свидетельствуют о взаимной загрязненности препаратов ЛГ п ТТГ.

В результате очисткп получено обогащение ЛГ и ФСГ свЕньн пргдэр-но в 190 раз и концентрирование ЛГ из екстракта пшсфаза в 10 раз, а <ШГ - в 20 раз. Результаты биологического тестирования свидетельствует об обогащении ГТГ севраги в процессе очисткп в 119 раз.

ïi:ônz?/) 1

Фгхет» ггаЕстротезгосаг rcts<ouœ» сетшл Ri гляжаа (2.6x1 G csj) _" о Blm-toyopcnfl из 200 г rnicten._

Пй®э Фракции Элюзпт Скорость элвдди, «Л/Ч Объем, Ш1 Количество бежа. А280 Содержание горшна

CE-sitoTpacT ютоЬиза - - 1600 11200 +

СВ-0 20 1.;.' töoci-a-кадяя, pH 9 G00 1700 10000 -

OB-t 10 !.Й CoefrsT кал::-;, pH 11 1С0 170 765 ++

СВ-2 0,1 M IUCO3 с 3® nao-проясгюл 100 ЮТ СО —

Рвэдшнеэ cjiriaraoro гюзпсазуа rrsaorooieniiesas гощолсз (flpsiann СВ-1 ) гэ ЛГ С С? нп г.5лспяз (1.6x1 П. S с?.;) с QAE-toyopsrl

па.фр Qpaitunn Эдээнт Спорость олсцшг, мл/ч Объем, UIÎ Количество белка, "230 Содернашю ЛГ ССГ

СВ-1 — — 1G0 191 О. +

CBQ-0 20 м"Л фосфат паяй, pH 7 .500 165 1GÛ ++ -

CEQ-1 200 îc'î яцзтот air-гопЕЯ, pli 7 со 40 m _ ++

CBQ-2 500 кЦ яцэгат агегога, pH 7 со 40 3,2 - -

Тахта образом, прз помощи приманенной нагл новой схемы очистки гликопротепиовта гормонов получено пять чистых препаратов югакопротеиновых гормонов: ЛГ и ©СГ свляьи, ЛГ и ГТГ КРС, ГТГ севрпгп. Получены тахта суииаринв препараты гликопротеиновых гормонов свяньа, КРС, человека. Пр9Длог:ешшй з данной работе кез?од в 'сравнении с исгользуеияди в настояние время способам очистки глякопротешозых гормонов отличается значительно кеныяим

количеством стадий^ является сравнительно простым и бистрам в исполнениди.

2. Электрофорзтичаскка свойства глжопрэтапксг^г гор^осоэ.

Электрофоретический анализ в полиакрылавддном гелз (ПААГ) в денатурирующих и неденатурярущих условиях применялся и ранее для исследования гликопротеияовых горшнов. Обычно для анализа натившп' гетеродимеров гликопротешовшс гормонов используют электрофорез в педенатурирующих условиях (в системах без додэцплсульфага) (Burzawa-Gerard et al., 1975; 1976; Rooa et al., 1976; Salna, 1979). При этом на электрофореграммах после окраливвния нередко выявляется более одной электрофоретаческоЯ зона вследстшг микрогетерогенностп глякопротешгошх гормонов по заряду. Количество и расположение этих зон для различных глнкопротешошх гормонов неидентично. При электрофорезе в буферной системе Laeinnll, то есть после кипячения образцов в додецилсульфате, разделяются a-, я р-субъединицы, составляйте молекулу глЕкопротенновых гормонов (Lo et al., 1S81; Pask-Hughlea, 1937; Hartree et al., 1991; Stanton et al., 1987). Оба варианта электрофоретического анализа позволяют идентифицировать глякопротешювые горюш только в высоко очищенных препаратах.

В настоящей работе мы разработала . "Ш2гс''-Нкгнус" кодафакацз» алектрофоретического метода 1аели11, тазволяацуэ анализировать гетеродимеры и а-, р-субъедпницы гликолротеивоЕЦх горюнов в одаои полиакриламвдном гелэ.

Особенностью молекулярного строения всех изученных глскоцротеиновых гормонов является большое количество дясульфадапх связей внутри каздой субгедзшиш (Ward et al., 1977). Для некоторых белков такие структурные свойства приводят к покгаенноЗ стабильности наткаши молекул, что позволяет разделять цедпссоциированные или невосстановленные фор~1 таких белков путей электрофореза в денатурирувдзх условиях. Такое поведение характерно, например, для главного белка аденовирусов - гексона, трпмеры которого сгабильш в додзщисульфзте без дополнительной терлоденатурацпи. (Khlllto et al., 1990). Кро:;е того для гликопротеиноЕыз гормонов человека сзвество свойство стабильности их натшшых гетеродшэров в растворах с кнзккм содержанием ДСН (Shlail, 1977).

Учитывая вше изложенное, виесли две модификации в

олектрофоретпческпЯ метод laeraill. Первая модификация заключалась в том, что кацдий образец, содерпавтсй гормон, наносили на соседние дорозси полпакрдла/лдного геля в двух вариантах: без предварительного прогревания в диссошщрувдем буфере (и?.Енусн-доро"кэ) я с предварнтолыпд.1 кипячением в диссоциирующем буфере ("плюси-доро,лсз). Вторая кодификация квсплась восстанавливающих , свойств дассоцкЕруквдго буфера. дкссощгарущйЯ буфзр для "!':"!лус"-прой нз содержал SH-воостанавливайтего агента. Восстанавлпваяцсе условия диссоциирующего буфера для "плзс"-прсб подбирали ннднзидуальпэ для каадого глпкспротеипового гор?-она. Оказалось, что в указавши условиях электрофореза разлгпш'о глясопротегновне горшы обпоругязакт сходство злектро1орет1г-:еского поведения. Оно проявляется о тем, что после электрофоре "плоского разделения и окраска геля езргбром на элоктрэфорегриже в "гшоо"--дорожяах выявляется сона, обладаютш болкгоа электрофоретическоЛ подЕпгнсстыэ к соответствующие весу а- и б-субъедишщ , п в "кшус" дорогих - зона, облздакгш мевьсай электрофоратсчзской шдаяюстыэ и соответствупал нащьному гзтеродпмзру гормона. На р:с. 1 и 2 представлена херактерние электрофорегрпммы готемфотеягошпе горлопоз пекоторых видов млешшггэгллх и ГТГ сопряги« а гакгз глякопротекЕозых гормонов человека, получзнпме. после пшгос"-"вЕщусп электрофореза. После электрофоретаческого разделения глззеопротепповых горлопоз и oicjecteshim геля серебро:.; з К?гтзус"-тр2ках 1ШГ ьапшется еста в области 30 - 40 кда, соответствующая по молекулярной мессе а-.р-дзлеру, a в "ляое"-треках- - гота в облестл 15 - 18 КГ,а, соответствуете по молекулярной массе субъедпляцам (р::з, 1).

Такое характерное Еовэдепггэ и описанном варианте электрсфорэтаческого анализа пргсуще по только разным типе:,? гдхювротапповнх _ горюнов ■ (ЛГ, ТТГ КРО, ее: сук$аришл препаратам), по такш гликопротешгошм горздвсм от рззшх видов и классов позвогючнчх шзогпю: и человека.

"Шпос" - "кинус" ' электрофорез з ПМГ с ДСП на только оаяарушшае? ебщгз Зпзиго-хгкзтасш} свойства разлютих ппЕопротепновнх горгоноз, ко п позволяет выявить индивидуальна разлитая пх электрофоре тэте cicero поведения. Тек гетеродшер ЛГ

ВИД:

ПРЕПАРАТ:

!00?С

а,р-ДИ?,1ЕГ-

КРС

СЕВ-КИТ РОГА ——11—-

1-1!

{=-) п п г"

+ ~

S7ii

.в« СJ *— 68К - Р Ù.U q|«— год

î

а.

20К

СУБЪШНМШ]

43. , X ^

Fso. 1. Диск-электрофорез в 152 ПААГ С ДСН глшсоиротешовы: гормонов КРС, севрюги и кита. Обработка образцов: в "шлос-треках" -кипячение в диссоциирукщем буфере, в "мгшус-треках" - !ткубащн образцов при 20 С в том se буфере Цифрами обозначены енвдизируемы( препараты гликопротеиновых гормонов; 'к - экстракт гипофиза ; 2 ■ суммарный препарат гликошзотеиновыХ гормонов, очшцешшЯ и: гипофиза; 3 - ЛГ; 4 - ТГГ; 5 - ЛГ; 6 - ГТГ, 7 - маркер! молекулярного веса.

ПРЕПАРАТ: о

100 С:

а,р-ДИМЕР

стЕДИНИДО

ФСГ

¿¡3 |—^

ттг

_м +

ЛГ ХГ -II—

rS

I I '<~J

t '\ Cza

О

о fi

Рйс. 2. Диск-электрофорез гликопротеиновых горюнов человека в 175 ПААГ с ДСН. Обработка образцов: в "плюс-треках" - кипячение I диссоциирующем буфере с 10 мМ ДТГ, в "минус-треках"- инкубация пре 20° С в том ке буфере без ДТТ.

человека обладает большей электрсфоретнческой подашюстьв пс сравнению с гетеродимераыи ФСГ, ХГ и ТТГ человека, а р-субъединицЕ ХГ обнаруживает значительно меньшую электрофоре тическу к подвижность, чем р-суОъеддащщы других гликопротеиновых горлонов, что отражает известные структурные особенности р-субъедоницы ХГ пс

+■ -

+

равнении о ЛГ - bl>corail уровень глшсозилирования и присутствие ополнительного пептидного фрагмента па С-конце (Sugino, 1987).

Дэтогаргя глшсопрэгокиоЕЦХ гориопоп катодом иплтсн-'1шя17с" лэптрсфоропа.

Характерное поведение глккопротеинових гормонов в "шпоо" - • минус" электрофорэзз, т. е. разделение а-.р-субъецшшц в случае радвар'.тельного прогревания образца ("гагдс"-проСи) п разделение еторода>леров в непрогрэтцх образцах ("ьпшус"-проЗы), позноллэт эпсо идентифицировать эти гормоны по только в высокоочищешшз рэпаратах, по п в слоеных белковых смесях, например, гипофизарних кстр актах, где их содергшшю составляет менее 1S, а такяэ прэделять их сукмартп'е препарата. Электрофорегракма, редотевлэшая на (ркз» 3) иллюстрирует очистку глнкопротеиповнх ормонов из nniajraa свиньи. Глзкопротенковые горлонн, благодаря пецифпвскпзл электрофоре тичэслш свойствам, определяются в кстракто (СЕ?>, так как располо*:эт:э электрофореткчэских зон других элков экстракта та меняется в зависпдзстп от предварительной-емпературной обработки образцов, что хоросо видно на лектрофорэгрсммэ для фракция гипо^таарного экстракта, свободной от ликспротехшових горкошв (СВ-О). Тонкие различил в яектрофорэтичеокой кодвшяоста гэтероджлероз к р-субъедишц дают оздаеность в некоторых случаях вденти£яцйр0в8ть индивидуальные ■ ормош и определять эффективность ■ их хроматографического ззделения из сукмартшх препаратов, что продемонстрировано для (МГ ЛГ свиньи, ЛГ а ТТГ НГС (рко. 1,3).

Тагам образом, "шгвз"-"гагаус" »локтрофорэз является быстрым и добнша способом полукодичзстаенного контроля за содержанием ликопротеивових гормонов в хроматогрефичэскнх' фракциях, начиная с ;ервнх этапов их очпстгги.

"Плюс" - "минус" электрофорез з ПААГ с ДСН гипофизарных кстрактоз пяти.'видов костистых рыб :i одного вида амфибий бнаругшвает струнтурн, сходные по электрофоретическому поведению данных условиях с глнкопротеиковнни гормонам!, в частности, с спользовэнным для сравнения чистил препаратом ГТГ севрюги Эти труктуры могут представлять собой суютарные препараты ГТГ (или ТН 1 и GTH 2 /SuzuKi, 1988/) и ТТГ. Исследования 'в лотиммуноферментном анализе свидетельствуют о множественности

о

100 С

а,р-ДШЕР-

•и.

п

СУБЪЕДИНШШ у{;) Л- С,- Ы & \ ] ' О

г"*

и С^

Рис. 3. Электрофоретический анализ в 153 ПАЛГ с ДСН хроматографических фракций, получении при очистке глинопротеиновых гормонов из гипофиза свиньи. Обработка образцов: кипячение образцов в 1'шпсс"-треках п диссоциирующем буфере бва ДТТ, в "минус"-треках -инкубация при 20 С в том ш буфере. Цифрами обоаначош слэдуициэ фракции: 1 - экстракт гипофиза свиньи (СЕ);. 2 - фракция (СВ-0), нэ сорбировавшаяся на В1ие-гоуореаг1 при пакасепии экстракта гипофиза на колонку; 3 - элюат (СВ-1) о колонки с Ш.из-1;оуорааг1, обогащенный суммарным препаратом гликопротешгавых гормонов; 4- -Фракция (СВСЗ-О), но сорбировавшаяся на колонку с ОАЕ-гоуореаП н обогащенная ЛГ; Б - олюат (СВС)-1), с колонка о СШ2-гоуореаг1, обогащенный ФСГ.

полос, выявляемых антпоыворотной против ИГ севрюга на ¡штроцеллюлознах репликах алвктрофораграмм гипофяаоршас экстрактов костистых раб и амфибий, как в области миграции гетеродамеров в "минус"- треках, так и в области, соответствующей субъодшшцаа в "шпоо" треках (рас. 7.). Это указывает на присутствие Солею одного гликопротеинового гормона в исследованных икстрактах, • 4.Исследование устойчивости гатородазэргаз гдпищрохоншшх горисдао к поссташшливащиы агентам при поыоца электрофореза б 1ШГ о ДСП.

Сравнительный анализ в "плюс" - "минус" влектрофорэзо показал, что гетеродимйры гликопротетвдвых гормонов обладают неодинаковой устойчивостью в диссоциирующем буфере, содержащем БН-восстанавливещий агент дитиотрейтол. Готеродаморы ЛГ свиньи в диссоциирующем буфэра, содержащем БО мМ. ДТТ, распадались па субъединицы даже баз прогревания (рис. 4). Диалогичное поведеииэ демонстрировали другие гликопротешювые гормоны шекопитавдах.

Одииго гэтеродшори ИТ сэврюгн и гликопротекновых гормонов сома оказались устойчне« в тех дэ условиях. С другой стороны, для гормонов млекопитающих било достаточно прогревания в диссоциирующем буфэро, но содерждом восстановителя, в кипящей водяной бане для лорошого разрешения зоня суОъодшшц на электрофореграм«9. В то го прзмл "5СГ человека п гликапротешюшо гормош, костистых рыб и с!"ФлОий распадались на субъеданици толькб после прогревания п диссоциирующем буфера, содэркащом нэ менее 10 кМ ДТТ.

ВИД:

ПРЕПАРАТ:

ДТТ: о

100 С :

свгаил

СЕВРПГА

лг I г I | гтг

- + -II— I I + - -II — - + —II—

+ - + - + - +

а,р-Д11«А2Р— ; О • О • ^

СУБЪЕДШШН|

1 п

о

г'пс. 4. Устойчивость гетэродимэроя гликопротеиновых гормонов при длск-электрофорэзо в "плюс'' - "кииуо" варианта в. 17а ПААГ о ДСН в зависимости от прксутстствяя в дяссоцтфундем буфэрэ ЕО п'1 -ДТТ..

Учгттая нвковалвгшнШ характер сзпйп, сбъодгшянцэй а- и р-суб'ьэдешпци в гэтеродюгэр, колпо прэдполоо-зггь,' что в различных -глзхкопротэишаи гормонах значения дасульфздшж связей для •повдорзвнния опродэлэпвоЗ копформациа области полшюптяддой цопи субъедшищ, участвующей во взаимодействии, неодинаково. Еоокопю, что неодинакова доступность или прочность отдолышх дисульфадиш: связей в разных глпнопротеиношх гормонах, что в скою очзродь влияет на устойчивость готеродшгорншс фор-1 ■ 1{ действию Еосстанпвливаюзщх агентов.

Б. Пркмэпопко яплвс',-,,глшус" электрофореза для хпракторпоипп спэцпфачпостп аптатол протаю глпкспротоппсгтзх горютов.

Блотишунопороксидазшй анализ п сочетании о разработанной наш

I

системой "плюс"-"минус" электрофореза в присутствии ДСН показал, что гетеродимери глккопротешювих гормонов, р. также их субъедшшцд после электрофореза с ДСН сохраняют антигенную активность иатившх гормонов. Это позволило использовать данный метод для исследования специфичности антител против гдииопротеиношх гормонов ц локализации полокительно реагирукцкх антигенных детерминант в гетеродимерах или а- и ß-субъедтгацах, избегая трудоемких процедур очистки субъединиц, а в некоторых случаях и с»ц горкомов,"' что является необходимым при определе!с$к специфичности антител катода® РИЛ И ELISA.

Дашшм методом проведен скрининг четирех антисывороток кролика: против лг К PC, ФСГ свиньи, ЛГ к ФСГ человека. Рис. 5 иллюстрирует определение специфичности антисивортки против ЛР КРС методом блотикмунойерментного анализа после "шжС'-'Чатус" электрофореза. Антисыворотка против ЛГ КРС демонстрирует сшрокуп перекрестную реактивность как с гликопротеиновиш гормонами КРС, так и некоторых других видов (свиньи и кита). Интерэсшш свойством данной онтисиворотки против ЛГ КРС является са одинаково сильное взаимодействие как с а-субъединицей гликопротеиновах гормонов КРС, так к с а-субъедшащей ЛГ к ФСГ гетеролопгошх видов, что расходится с классической концепцией о високой' видовая'

ВИД : СВИНЬЯ КРС Ш

ПРЕПАРАТ: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

* I:—И—И—И—Н—Ч—П—1Н—И"1

а,р-дю-А ' О О - О

слбьвднущи{ О . •

Рис. 5. БлотишунофэрментНый анализ глнкопротеинових' гормонов после плюс"-"минус" электрофореза, а.■ - обработка нитроцеллкшюзной реплики кроличьей антисывороткой против ЛГ КРС в разведении 1 : 250. Цифрами обозначены препараты гликопротеиновых гормонов; 1,5-экстракт гипофиза; 2, 6 - суьмарннй препарат гликопротещових гормонов гипофиза; 3, 7, 9 - ЛГ; 4 - ФСГ; 6 - ТТГ.

специфичности а-субъединщы (Reichert et al., 1970). С другой стороны данная антисыворотка одинаково сильно взаимодействовала со специфическими- ß-субъединицами как ЛГ, так и ТТГ и ФСГ. Использованный способ блотиммуноферментного анализа такяе дает гоомояность осуществлять специфическую детекцию гликопротеинових гормонов и нэочкценвдх гшофязарных экстрактах.

Исслэдоташю антисывороток против ФСГ свиньи, ЛГ и ФСГ человека а блотижуисформентном анализе такав позволило определить спектр перекрестных роакциз даших антасывороток, локализовать в каждом случае перекрестнореагируищие антигенные детерминанты в а- или р-субьединяцах, определить различие в специфичности исследованных антител.

S. Сбгно антагепляз даторгзшанта в глпкспротеинових гормонах ' ретшх издоз псзэспо-плах, кяяшшеиив блотшгмунофзргагггам анализом.

Глпнопротеиновые горлош з пределах одного luiacca часто обнаруживают кирокое перекрестное реагирование. 'Одаако да'^ при покеда лнсокочувствятельного радиогамуниого анализа достаточно редко удается обнаружить общие антигенные детерминанты между гллкопротешювюаи гормонами представителей разных классов ливотных, в особенности неаду такими филогенетически удаленными классами, как илекопптаизие и рыбы (Pierce et al., 1976; Burzawa-Gerard et al., 1979.)

В данной работе'проведен сравнительный иммулозошячеЬкий анализ гонадотропнна представителя наиболее древней группы рыб. -костно-хрящевсЯ рыбы севрюга с гонадотропинаш других классов позвоночных. Блогж.гдуноферлентный анализ гликопротеинових гормонов с полученной у ггролика антасывороткоа против ГТГ севрюга выявил общие антигенные детерминанта в ГЗТ севрюги и в гликопротезшовых гормонах слекопитащих (рзс.б). Сравнение выявляемых антпсывороткоЛ зон на нитроцеллюлозноА решшке в "плис" и "минус" траках для различных гликопротеиновых горюнов млекопитающих и электрофоретпческих зон для тех е:э горлонов после окраски ПЛАТ серебром (рас. 1 я 3) однозначно свидетельствует о том, что а- и ß-субъедашщы, а такке гетеродпмеры ГТГ севрюга, ЛГ свиньи, КРС и кита содержат антигенные детерминанты, узнаваемые данной антисывороткой. Взаимодействие антисывороткн с аЛГ свиньи, КРС и

кита слабее, чем с соответствующие р-субъедишщ&чи и гетеродимерами. В случае ЮГ свшьи . перекрестная реакция полшиганальных антител против ГТГ севрюги наблюдается только с гетеродимером и а-субъедшшцей. Препарат ПГ КРС, видимо, загрязнен ЛГ. Антисыворотка в. данном случае реагирует только с общей а-суСъединицей и примесью ЭЛГ, поскольку полоса, соответствующая по электрофоретической подвижности ртГГ КРС ' (рис. I) на иитроцсллялозноЯ реплике не выявляется.

Картина взаимодействия антисыворотки с ФСГ свиньи и ТТГ КРС в Слотишуноферлонтшм анализе указывает на отсутствие оСэде антигенных детерминант в кх р-субъедашщах и в рГТГ саврзп:. О случае ХГЧ и суммарного препарата гликопротенновыя гормонов человека ентксиворотка против ГТГ севркги проявляла слабую реактивность в отношении а-субъедшшцы и готеродсмера взаимодействовала с р-суоъедкницей.

и но

ВИД

ПРЕПАРАТ 100°С

СЕВ-' ЧЕЛО-

НОГА СВИНЬЯ КРС КИТ ВЕК

гтг1 лг есг' лг ттг ' лг ' хг '

а.р-ДЖЕР] .

+ - + «Л " . .

т! ?

* * I

А

- + - 4

- 4-

+

+

о

1

сувъдашшу|Г ц

'У¡Г \>о ПЪП'

... -\и и

Рис. б. Блотю.шунофе}змент1шЯ анализ гликопротеинових горионов гаслс "шшс"-"минус" электрофореза. Катроцеялллозная решка электрофореграммы обработана антнашороткой -кролика псотиз ГТГ севрюги в разведении 1 : 200. •" . ■

•и

Изложенные данные. позволяют ухвзрздать»' что сссмздовапаал антисыворотка против ГТГ севрягп содер:ат два разных пула антител. Один из кпс специфично взаимодействует с оОцей о-субгедииицсС гликопротешювых гормонов млекопитающих и человека, а другой - со специфической р-субъедшицей лг млекопитающих. Результате блотиммунафермзнтиого анализа свидетельствуют о преимущественном антигенном сходстве ГТГ севрюги с ЛГ, чем с друпан гликопротеииовыми горловамиЛдлекопитакщих.'

¡Идентичность выявляемых в блотиммунофэрментнсм анализе общих антигешшх детерминант антиснворотками против независимо получении препаратов ГТГ-севрюги, взятыш у разных кроликов, а такие у мнии позволяют думать о том. что полученные результаты являются закономерными и не связаны с индивидуальными особенностями !2"]упизнрованннх гсюотшх.

Г^оталмуиофэрмэцтшй анализ после "плюо"-"Ш!нус" электрофореза свидетельствует о том, что гипофпзарние экстракты трех видов у 0 и одного вида о?,ф!бий содержат белки, подобш1е но электрофоре тическому поведений глжопротеиновым гормонам и перэкрестнореаглрующие с полишюнальншл гнтителамл против ГТГ севрюга (рис. 7). Поскольку исследований подвергали цельные гатсфгазрные экстракты костистых раб и амфибий, трудно сказать, какому конкретно типу гормона (ГТГ, GTH-1, GTH-2, или ТТГ, а в-случае амфабий - ЛГ, ФСГ или ТТГ) принадлежат устеновдекше обдие антигенные детерминанты. Однако !л:с:::-зстйеш:ость полос, выявляемых антксывороткой на нитроцеллалозной реплике в •зоне субъ^дигащ ("плюс"- треки) я в зоне готеродпмера (";,зшус"-треки) позволяет предгголояить, что в перекрестной реакции м.огут участвовать обе а- и р-с;-'ъедлнлш и более одного типа гликопротеинового гормона.

ЕЙД: СЕВРЮГА СС*.5 ШША * СЕВРЗВГА СУДАК ЛЕД

Рпс. 7. Блотпкмуноферлэнтзшй анализ экстосктоэ гипофизов некоторчх видов костистых рыб н с.зфябй, а toicks 1ТГ севрюга после "плюс" -"CTiyc" электрофореза. Нятроцеллплозная реплика электрофореграммы обработана антисывороткоЗ против ГТГ севрюги в разведении 1 : 200.

7. Общдз «штсгенша датор^пкпла, шшпошо в глжспротолкзгаг; гормонах цлектешуаЕ^, icoctectüs paö, t^pß'J! п ГТГ сопрет цзтодо^ рздйожцргнэго ESCJSSS.

Для поиске перекрестно реагирувдей антигенной детер:дша1гш, общей одновременно для.всех четарек тексошшческпх груш ksboteux (костно-хрящеых п костистых puö, агфкзий и шекопнтощих) fci^i применили котод радаонмзунного анализа.

С целью создания система Рйд, адекватной для тестированы гетерологичшга гормонов, ш исследовали взаимодействие [1251]-ЛГ КРС и [1251)-ГТГ севрюга с онтасивороткой протш ЯГ КРС п автисывороткоП против ГТГ соврал; в прямо!.: RIü. 70, - SO % t -13 -ЛГ КРС и [,25и-ГТГ севрата пращпштировало с соотвзтствук;::!] гомологичной ентисывороткой, титр которой.б обоих случаях составлял 0,6 х Ю-4. Оба антигена таккэ оказались способшж прецигштпроват.ъ с гетерологпчншл антисывороткеш (112б11-ЛГ КРС - с анткйшороисоа против ГТГ севрюги к [1251)-ГТГ .севрзгп - с снтесывороткоД протки ЛГ КРС) с макгашальшм уровней преципнтацки 35 - 10 Z кочэшго антигена (рлс. 0).

■ разведение антисывороток

Рес. 8. Титрование кроличьих антксывороток против ЯГ КРС и?даот'.т ГТГ севрюги с-гомологичным и гетерологичным антигеном (t "1 ] -ГТГ севрюги и Г1]-ДГ КРС). По оси абсцисс отложены разведения антиснвороток в логарифмическом масштабе, по оси ординат - процент связанной антителами метки (В).

Для доказательства гормопальной природы радиоактивности прэципятатов, получаемых в случае геторологичных антисшюроток, мы использовали радиоимлунопреципитациошый анализ (РИПА). Поскольку РППА, оуцествлешшй при помощи "плюс',~иминус'' варианта элэктрофореза в ПААГ с ДСН, однозначно доказал гормональную природу пшунопрещпштатов и существование перекрестно-реагирующих ситигенных детерлинант в ГТГ севрюги и ЛГ млекопнтакцих (рис.9) ш попытались охарактеризовать специфичность этих- детэрлина : в коннурэнтко!,! PÍIA.

■ В двух гомологичных систмах ([12б1]ЛГ КРС - антисыворотка '

против ЛГ КРС, [12б1]ГТГ севрюги - антисшзоротка против ГТГ

сэврвп!) только соответствующие гомологичные немеченые гор?юны были

GTTOccCirj конкурентно ингпбировать связывание меченых антигенов.

Напротив,• обо гетеролопгошэ систо;щ (['^ИЛГ КРС - антисыворотка'

1 _

против ГТГ севрюги, [ 13ГТГ севрюга - антисиворотка против ЛГ ЯРС) сказались пряблпзитэлыга одинаково чувствительна к гпгиблрованнв связывшш двумя' гсрмонемн ГТГ сейркги и ЛГ КРС. Пэрзая гетерологлчная система была ac;r.i выбрана для более дэтальюго исследования тарэхрестного реагирования гликспротеиновых гормонов от разных ЕЛД0В жвотных.

Как видно па р*м. 9 глшсспротекновш гормона ряда плзкопитахггдх, гсшофизархам Екстракта двух видов рцб я одного вида л'лйпКй конкурентно щггабировалл связывание ' 112513ЛГ КРС с плтлсывороткой против ГТГ севрзги. Параллельность кривых пзгкбированпя связывания печеного ант,trena для ИТ севрзоги, ЛГ КГС, ЛГ п <ЮГ свпньи , а таюэ для тапофизарзых. окстрантов двух видов рпб - леща Utrcnís brama) и кеты (CnccrhyncTaio teta) и одного вида с;.:$ибяй (Еага temporaria) ' снздотэльствуот об идентичности сбнаругкваемой об^эй антпгошюй дэтэряшгшты. Соответствующая кривая для ЛГ юта непараллельна стандарту, что моает свидетельствовать об отличия данной дэтеряшанти от антигенной доторзизта, узнапсемоЗ плтиснвороткоН против ГТГ сесрпга в других глхггопротеннохшз гормонах.

ГОРМОНЫ:

125

I I) ЛГ КРС

125

t I] ГТГсеврюги

АНГИСЫВОРОТКИ:

Оез

100 С0:

ИММУННЫЕ • КОГ/ЛЛЕКСЫ

против

преципитации ЛГКРС

|-А-1 |-А-1 L

против против ГТГ севрюга ГТГ севрюги

+ - +

Г)

I !

- 4- - +

без ецшытация А—11—■

т

тив КРС л-1

- +

V

ар-даЕР

СУБЪЦЩИШш(

/; г

Г

С.

.-•У

С, s

Л

г\

й I

ts »> 1 Y *

. .. . к,

fric." 9. ; Радаою,;му1юпр&щяЕ1тадаоыый анализ' 112б11-ГТГ севряга и [12&ï ] -ЛГ КРС с аитисшюрфтками против ЛГ КРС и ИТ севрюги. Представлен радиоавтограф алектрофэреграюш поело раздолзнил в 17й ПЛАТ с дси. Обработка образцов: в "плвс-треках" - кипячение в диссоциирующем буфере, в "цлнус-треках" - шг-убгцая в том х;е буфере при 20? С.

разпеденне экстракта

10. Конкурентна ТЛк глпхоаротенноЕЫх гор-'сноз и- гапофнзарннх тзкстрактоз з^ гетеролопгагсЗ системе - гятгсыворотка против ГГГ севрюга - [1л5Г3.1Г 1СРС- По оси ординат от.та::ел процент связывания г.'зчепого озгагепэ з присутстзин немеченого антигена с алтгсжороткоЗ ггроЕЗ ЛТ севрюга (В/В0). 1Ъ осл абсцисс внизу отделена зоавентрашм геке^епого гсргджа з яг э л>гарп*маческом гззсптаСе, вверху - розвелзшм гппогязаргкх зкстркстоз.

следует ст:,:эгать, тго гата^агерниз сг.стрети зссьгл других глдоз еостзсязх рнб, црсзадлвгета таиреа рггпл семействам, сказались пе способипп- пзггснрозать свяггнзаа^е ггзчепого антигена п дснпоЗ гетеродопппсй спстсгз, щгпэ:.1 оян аз них (пшофазарный сг.стракт су дека) голсеттэлызо реагировал с сетлсыЕоротхоЗ против ГГГ севрпга з ояостглунс^эркэвтас!! шаггзе. Сразнеи® перекрестной рэактиЕЕоста, оСнаруппваемоа в ксащреютсм РИА з гетарологичной с::сте::з и з Олотгзс.^укофэрггентногз шаюзз с оившвороткоЯ прот:!в ПТ севрюга свидетельствует о различвоЗ ссзшфгзносгл разных систем Е25згвохпгггеского еешгаза я о вокасетоЗ вездентячзостз антигенных

детерминант, узнаваемых в этих системах.

Таким образом, методом конкурентного рИА в гетерологичной системе I 11-ЛГ КРС - антисыворогка против ГТГ севрюги обнаружена антигенная детерминанта, общая одновременно для четырех классов позвоночных животных (млекопитающих, амфибий, костистых и костно-хряшевих рыб).

В целом сравнительный иымунохимический анализ выявил выравненное антигенное сходство ИТ севрюги с гликопротеиновыш гормонами млекопитающих, преимущественно с ЛГ, а такш с гликопротешювыми гормонами некоторых костистых рыб и амфибий. Совместно с Ы. Gawlnowlca (Columbia University, USA) нами получеш предварительные результаты аминокислотного сикаенса ГТГ севрюги, свидетельствующие о его структурном сходстве с гликопротенновыкп гормонам« млекопитакадх. Идентифицированные &4 аминокислоты а-субъедшшци обнаруживают около 7СК гомологии с а-субъедишца;,и гликопротеиновых гормонов млекопитаицих и аГТГ карпа. Опредэлзни такг;о 17 из первых 20 аминокислот N-конца рГТГ севрюги, которые' обнаруживают общие последовательности с рФСГ и рЛГ млекопитающих, о также о рГТГ карпа Продолжение исследований по определению аминокислотной последовательности ГТГ севрюга позволит болов точно установить его. структурное сходство с тем или щам типом гликопротеиновых гормонов других видов позвоночных шшоишх.

Широкая перекрестная реактивность ГТГ ¡севрюга с гликопротеиыовыми гормонами представителей разных таксонов открывает возможность использования ГТГ примитивных рыб в качеств:? модели для исследования эволюционных взаимоотношений • в ряду гликопротеиновых гормонов.

ЕШОДЫ

1. Разработана новая схема очистки гликопротеиновых гормонов на окрашенном сорбенте. Получены суммарные препараты гликопротеиновых гормонов человека, КРС, свиньи, ГТГ севрюга, а таете ЛГ И £<Т свиньи, ЛГ и ТТГ КРС.

2. Впервые показано, что гликопротэшовые гормоны гипофиза (ЛГ, ФСГ, ТТГ) свиньи, КРС, кита и человека, а такг,з ХГ человека и гипофнзарнчй ИГ севрюги в система диск-электрофореза в ПААГ с ДСН мигрируют в виде диссоциированных а- и р-субьедяшщ или в виде

гетеродимеров в зависимости от температуры и от наличия SH-восстановителей на этапе диссоциации в ДСП. Индивидуальные гормоны от различных видов позвоночных отличаются по степени устойчивости к диссоциации гетеродимеров.

3.- Предложенная новая "плюс"-"минус" модификация электрофореза в ПААГ с ДСН, заключающаяся в параллельном разделении в соседних дорожках ПААГ субъедитщ и димеров гликопротеиновых гормонов, является удобным способом детекции отдельных ■гликопротешювых гормонов как в очищенных препаратах, так и в сложных белковых смесях, что позволяет контролировать содержание гликопротеиновых гормонов во фракциях в процессе очистки.

4. Сочетание "плюс-минус" электрофореза в ПААГ с ДСН с блотиммукоферментным анализом позволяет исследовать специфичность антител по отношению к димерам и субъедишщам широкого спектра' гликопротеиновых гормонов, что продемонстрировано на примере четырех антисывороток: против ЛГ КРС, ФСГ свиньи, против ЙГ и ФСГ человека.

5. Впервые описана широкая перекрестная реактивность .полшслоналышх антител кролика и мыши протип ГТГ севрюги с гликопротеиновыми гормонами млекопитающих, костистых рыб . и амфибий. Одна из локализованных перекрестных детерминант расположена в а-субъедшпще всех проанализированных гликопротеиновых гормонов млекопитающих, а другая - в р-субгедкшаде ЛГ и отсутствует в гормонах человека. В составе ГТГ севрюга тазе® найдена антигенная детерминанта, общая для четырех групп позвоночных животных: костно-хргапевых и костистых рыб, амфибий и млэкопитащих.

CiriCClt РАБОТ, СПУБЛПЯСВЩШ ПО ТГГ.З ДЕХСЕРТЛЦЙЯ

1. Говорун '1.С., Осипова Т.А., Хплько С.Н., Мартынов A.B., Булатов A.A.. Электрофоретический анализ гликопротешювых гормонов человека п их субъединиц.// Биологические пауки - 1992 - № 7

2. IDiillco S.W., Govorun M.S., Xira30va U.A., Kusnetsov A.A., Gonoharov В.?..Pituitary gonadotropic horroono from a Chondrooteon floh, atairod oturgson (Aoipsnser otellatus Pall). Ccnmon antigenic dsterainants in pieoine end naraalian gonad«-tropins.// Abatraota of 15th oonferenoo о 1 Europoen сс-mparativo ondocrir.ol., 19S0, Leuven,

p.201 .