Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ ПРОДУЦЕНТА НОВОБИОЦИНА ACT. SPEROIDE

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ ПРОДУЦЕНТА НОВОБИОЦИНА ACT. SPEROIDE"

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ : ■ : '

:■ На правах рукописи

1 ^

ИСКРА БИТАНОЗА. ИВАНОВА

: ' СРАВНИТЕЛЬНОЕ ; ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ФЕНДЕНТОВ У ■". ПРОДУЦЕНТА НОВОШОЦИНА ЛбЬ. $рйсьо1о1е5 ,

(Микробиология — ОЗ.00.07)-

Авто р е ф е р а т .

диссертации на соискание-ученой степени кандидата биологических наук. -

I

. \

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА * (974

1 . _ '

, работа выполнена на кафедре. ыакроОиологдя Биологического v /факультета МГУ.-'. ■ - . ■' " V.' ■

\ . Научные руководители: . - ,■'.•"■'■'■ ■'■.V ;

. доктор биологических наук, профессор Н;С.ЕГОРОВ " ■кандидат биологических наук / ; Е.Г.ТОЮПСВА ; •. ,"■','

. V: ■;■■■ Официальные оппонента: • ■■ ч '

доктор биологических наук ■ ' Г.Г.КАЖКОВА

.'кандидат биологических наук • ' , - Ю.Э.БАРКЖЕШЧ Ч:

Ведущее научно-ясследоватзльское учреждение Институт ло языскаяио новых антибиотиков. АМН СССР., ;.>.-.

Автореферат, разослав

Защита диссертации состоится " У " M-^-Mfyif ' 1974 г. в 15 час.иа заседания Секционного Ученого советапоботанике физио лого-биохшаческого: отделения Биологического факультета -МГУ, *;;' Ч... уУ:

""■■■/ Ваш отзыв;(в 3-х-экземплярах)-просим наараздять во адресу: Москва. В-234, Ленинские горы, Биодогичвовиа;факультет МГУ;'. Ученый совет. '.■'■ "'■ .""V- . Ч" л;г. ' С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета.:

Ученай секретарь '.. Чг-Г- - -Ч' ■.•■-■ ■■•.'■. ■ ■.■■" V ' ' . Н.С.АЛЕКСАНДРОВА

, I •

ч. Г:

вопрос о физиологическом значении антибиотиков для организмов , их продуцирующих, о месте этих биологически активных веществ б метаболизме продуцента £ причинах их накопления остается открытым. В работах последних дет исследователи все чаще приходят в выводу, что развивающиеся культуры актиномицетов не безразличны к образуемым ими антибиотикам и последние оказывают определенное влияние на организмы - продуцента.

Клеткам было бы очень невыгодно затрачивать энергии к материю на синтез ненужных и сложных соединений, Вероятнее всего, что антибиотики являются биологическими регуляторами, контролирую сщми активность различных ферментных систем клеток продуцентов.

Особый интерес представляет изучение Окосинтеза антибиотиков в связи с энергетическим, углеводным, лвдядным обменом клеток продуцентов. В этом плане были получеин интересные результаты по изучению биосинтеза полиеяовых антибиотиков, ленидиллв-НОВ, ТетраЦИКЛДИОВ И Др. С Xfcn&lOTa et «I. , 1969; B03t»l#k , Тодек . 1973; stark« , 1968; Corcoran . 1965; •olizllova «t »l. 1965).

Нами была поставлена задача изучения некоторых ферментов углеводного метаболизма у продуцента аовобиоцива Act.epheroia«» я его неактивного мутанта, ранее была установлена связь биосинтеза ноэобиоцина с фжавогенезом и окислительной способности мицелия (Торопова С.Г.. Егоров Н.С. и др., 1969).

Основными путями решения поставленной задачи были: - сравнительное изучение некоторых ферментов глгясл~за, пентозофосфатного пути распада глюкозы и цикла трикарбоноаах кислот у продуцента новоСиоцина Act.spheroid«« и его биоло-

Л-24 9ff

гически неактивного мутанта;

- аллянне новобиоиина, добавленного к среде перед засевом ее шцелиеи ва активность ферментов продуцента Act.spberoid«e и ere мутанта.

Объект и методы исследования

Объектом исследования служили продуцент новобиоцина Act. epheroidee штамм 35 и его неактивнвй ыутант Act, epfaeroidee штамм 144 (Кторов, Михайлова, Торопова, 1967). Для выращивания актаномицетов использовали две среды следующего состава (в %) : посевная среда - соевая мука 2, глюкоза 2, У-Ч^^ЗО^ _ 0,3, СаиОу - 0,3, К&С1 - 0,25, tCHgPO^ - 0,075, рН среда до стерилизации 6,8-7.0; синтетичная среда - - 0,6, КН2К>4 -U.2; MySOtf - ОД» цитрат 3-х замешенный - O.S.ZmSP^O.üOI, - 0,002, глюкоза - 5, pfí до стерилизации - 6,6. Культивирование проводили в колбах со 100 ил среди на круговых качалках {200-220 об/мин) при 28°С. Актшомицеты поддерживали на среде следующего состава (в %): кукурузный экстракт - Х,5, CaCQg -0,2, LfH^ígSO^ - 3, крахмал нерастворимый - ï, VaCl - 3, агар-2, рН до стерилизации 6,8-7,0.

для изучения влияния новобиоцина на обмен продуцента и его яеектвт& мутант антибиотик вносили в синтетическую среду черед засевом ое мицелием актиномидега s концентрациях от 10 100 мкг/мл.

йри постановке опитсв определяли: биомассу - по весу сухо-.г.целиг, нонобиоцЕй - биологически (Семенов, 1963; Егоров, j) и cue кт ¡jo .1 о то ме три че ски ( Hacks®«« , Smith t 1961),

белок по методу Лоури С Ьочгу , 1951). гшруват - колори-

метрическое определение не токи слот (Раасон, 1960).

¿йсклеточаый экс тракт получали механическим растиранием с кварцевым веской замороженных клеток в течение 5-10 минут (Левитов, Шкаикова, 1965).

Для олределения общее дегидрогеяазной активности использовали колориметрический метод, основанный на измерении оптической плотности формаэааа, образующего из соли 2,3,5 трифешл-тетразолиучхлорада (Мороз, 1962).

Гексокиаазу (Е.С.2.7.1.1.), альдолазу (Е.С.4.1.2.13), глюкозо-6-фосфатдегвдрогеказу (Е.С,1.1.1.49), транскетолазу 1Е.С.2,2.1.1) определяли спектрофотометрнчески (до Кочето-ву Г.А., 1971). Сукциватдегидрогеназную активность (Е.СЛ.3.99,0 определяли спектрофотоме трически с 2,6 дихлорфенолиадофенолом ( Увв£вг еъ *1., 1969), ыаяатдегидрогеназную активность (Е.С. 1.1.1.37) по окислении оксалацетата в присутствии НАДН при 340 нм ( товыа» , 1969), иэоцигратдегндрогеназаую активность по восстановление НАДФ при 340 нм ( Когпъеге 1955), пируватдегидрогена звую активность (Е.СЛ.2.4.1) по методу Тувберга (Глеыаа, 1Эо6; Ояв «1 »1., 1961). Глюкозооксидаэнув активность (Е.СЛЛ.ЗД определяла йодомег-рически по методу (Дегтярь, 1965).

Определение неорганического фосфора проводили по ( Ме11~На1 -ЬегЪе.Смеа, 1951 ) о оловом.

Результата и ах обсуждение

I. Сравнительное изучение активности ферментов углеводного метаболизма продуцента швоблодана и его яеакгавяого мутанта.

Была установлена связь биосинтеза новобиощша с фвавоге-незом и окислительной способностью мицелия в высказано предположение о взаимосвязи образования антибиотика с антиваостьо оиаслятельаых ферментов (Торопова, Егоров, 19ба ). Бела это так. то можно предположить, что образующий и кеобразуюшй новооиоции штамш Act. apheroidee могут отличаться во составу ферментов участвующих в биологическом окисления. Особый интерес пре-ставляяи ферменты простетичеокой группой которых является флавинадениндинукдеотид. Работу начали с общей да гидрогена зной активное» не разных субстратах: янтарной, шровиноградной, уксусной, молочной, яблочной и фумаровых мело тах. На всех субстрата», дегидрогеназная активность у продуцента выше, чем у мутанта (рис.1,2),

На уксусной и пяровиноградвой кислотах вабавдалв резкое повышение дегидрогеназной активности на 2 суток, а затем сни-кевне ее в последующий период развития, когда в среде начинается накопление антибиотика (см.рис.1).

У неактивного мутанта на всех испытанных субстратах наблюдали постепенное снижение дегидрогеназной активности в процессе роста актяяомицета.

Полученные результаты дала возможность установить разницу в активности ферментов у продуцента и его неактивного мутанта. В связи с этиы было начато сравнительное изучение активности некоторых ферментов углеводного обмена у продуцента новобиоци-на Act. spheroid«в и его неактивного мутанта. Работу начали с подбором условий наилучшего разрушения клеток актаяоми-цета. Е&ля использованы разные методы разрушения клеток Act. epheroidee : механически с кварцевым песком с замораживанием

ы 1

«1

Рис.I.Дегидрогеназвал активность на раа-яих субстратам у Jt>t. $p£t£teúlí¿

- - ягамм 35 1-3 - лвруват

---- атаки И4 2-4 - au.«tat

5 - новобиоцлн

Я? 96 m tywrfotme'i wot

-Рис. 2 . Де гвдроге назнал активность на разни* субстратах у Jct sphaeiJes

- - штамм 35 1-3 - еукцанаг

---- лтаин IW 2-4 - фушрат

и без заморакивания, на ультразвуковом дезинтеграторе. Лучшим способом разрушения для определения активности ферментов оказалось механическое раотярааяв мицелия с кварцевым песком поо-ле его замораживания. В дальнейшей работе использовали этот метод разрушения клеток.

При исследовании активности ферментов гликолиза у активного И неактивного штаммов Act. apberoidee были получены следующие зависимости: Измеряли активность гексокиаазы (Е.С,2.7.1.1) фермента ответственного за фосфорилирование глюкозы. Результаты представлены на рис. 3. Оказалось, характер кривых активностей фермента в динамике развития изученных культур одинаков. При этом активность фермента у итаюла образующего яовобиоцин всегда незначительао выше, чем у мутанта. Самуо высокую активность фермента наблюдали в первую фазу роста культур.

Результат« подученные при определении активности альдолазы [B.C. 4.1.2.13. ) показали, что только на первые сутки роста активность фермента у продуцента новобиоцина немного выше» чем у биологически неактивного мутанта и следовательно, расщепление фруктоза 1,6 дифосфата происходит одинаково.

Результаты по изучении) активности некоторых ферментов пентозофосфатного пути у Act. epheroidea показали интересные закономерности. Измеряли активность глюкозо-6~фосфатдегидро-геназы (Е.С. 1.1.1.49 ) и транскетолазы (Е.С. 2.2.1.1. ). Результата представлены на рис.5 и рис.6, из которых видно, что у необразуадего новобиоцин штамма 144 активность обоих ферментов в 3-4 раза ваше, чем у продуцента Act. epheroidea . Эта разлада более четко выражена в первую фазу роста актиноияцета.

g

4

5, №

Qk-

<¡5--

0,2-

-V

«f

fj

il в,01 • ■

e,m-

dm

0,Q0¡i S, OOS

H—

iUC^-iíüaiíeHeHae актавнос-тв гекаокинази

- а таим 35---- ягами 144

St 4$ 72%

Врш рота S чоео\

Рие.'иИэ неценна активности auwuüaau

- 1UTELUU 35---illTíiiW Î4+

' \ \ \ J t

s \ \ \ \ \ 1 mm

ЦВ5- ——-_ ---

Щ

- w

-1—---1 ■. -—(-1- -y-H- -y-1-

в а

19

Рис »5 »Иа и® венке активности гдикоао-б-фвсфат детидрогекаам

35 ---»г*м* 144

¿4 ft Ч& &

tfvN pem« Svem

йю.б.Изкеквнмв актжвносгв гргшск»-толааи

--- «таим 35 --- ктакк 144

Ише закономерности получили ори изучении активности пи-руватдегидрогеназн СЕ.С. 1.2.4.1. ). У продуцента новобиоци-на активность фермента в 2-3 раза ваш, чем у мутанта (рас.7), Существенно, что такая разница в активности фермента у изученных актааоиицетов наблюдается только в первае 24 чеса роста культуры, е затем резко снижается а активность фермента у обоих штаммов Act. «pberoidee становится практически одинаковой. Необходимо отметить, что снижение активности плруватдегидроге-назы у- Act. cpberoidte штамм 35 происходит яыенво тогда, когда в ыаделия а культуральной еидкостя начинается биосинтез антибиотика, хотя еще в очень незначительна! количествах (30-50 миг/мл).

В дальнейшей работе исследовали потребление пирувата изучаемыми штаммами Act. spheroid»» в острых опытах (в течение 3-х часов) с 12-ти, 24-х я 4д-ми часовым мицелием актвномипета. Полученные результаты представлена в табл. 1,2. Оказалось, что только в первые двенадцать часов развития мицелия изученные штамму различайся сс способности потреблять паруват из среды. В это время продуцент в 2 раза больше потребляет лируват, чем неактивный мутант, однако эта разница к 24 часам исчезает. Подученное результаты хорошо согласуются о активность» плрувагдегядро-геназы.

При исследовании активности ферментов цикла тршсарбоновмх кислот установили отличие у продуцента новобноцина A«t.apb*roid»* я его мутанта. В бесклеточных экстрактах у обоих штаммов измеряли активность следующих ферментов UTK: малатдегидрогеяазы (Е.С. 1.1.1.37. ), изоцатратдегидрогеназа (B.C. 1.1,1.42. ) и суютнатдегядрогеназв (Е.С. 1.3.99.x).

н-ть

Таблица I

Влияние новобвоцива, добавленного в среду перед аасевои ее мицелием актнномицета, на потребление шрувата хс*. ■рЬ*го1(1*а в мг/мг биомасса

Возраст Штамм 35 Штамм 144

мицелия Контроль Новобиоция в, ковдЛОО ыкр/МЛ Контроль Новобиоция в концЛСЮикг/мд

12 0,027 0,009 0,014 0,004

24 0,0X08 0,006 0,009 0,010

46 0,0037 0,0108 0,008 0,010

Таблице 2

Влияние аовобаоцива на потребление пярувата И8 среды Лсь. в острых опытах в

течение 3-х часов в мт/ш* биомасса

Возраст мицелия Штамм 35 Штамм Г44

Контроль Новобиоция Контроль Нов&биопиа

12 0,027 0,009 0,14 0,008

24 0,0108 0,0065 0,009 0,0096

48 0,0087 0,008 0,008 0,006

Из представленных на рис. 8,9, 10 результатов видно, что активность изоцитратдегидрогевази в 2-4 раза выю у образующего новобиоции штамма активность малатдегидрогеназн практически одинакова у изученных штаммов и мало изменяется в течение всего периода роста и развития актяаомидвтов.

Особый интерес представляют результата по сравнительному

5

е IS

X

Hl

ш

да

SW

ш

ioo4

L

V А *

s..

ч> с.

щ

№ I*" 16 1Ч I*" {О ■

г-

Ч'

г

а 1ч *>в м 96

Еле. .íí'j : ■ ' ijíifc активное tu napysat ¡¡fi

•4-

;'¡i¿",. 's. niy

------- .¡.таим 35

---и та им 144

M W *l M ежмягесглммл* Рис ♦ в. Из мв не н не активности еукцяяы»

двгидрогеназм -- о тайн 35 ---мташ» 144

Зк Ы 12 90

Й1С.9.Изиене^:; активности изодит-ратдеГидроге ¡-¡аэц

•--ятаил — - огам« Х'н

0,05 ДО-

ФЗ-0,02 ■ 0,01-

Ц И 12 <¡6

&рт роста & чаш

Рис ЛО.Ианенение а,.х;иности нала где гад рйгэнааы ------ лтами 35 — - ига»ш 144

изучению активности сукщшатдегидрогеназы у штаммов Actiпопусе« spheroid*я.

7 продуцента Act. epberoideo активность СДГ-азы в первую фазу роста (2-3 стгяи) в 2-3 раза ваше, чем у мутанта. Во вторую фазу роста, когда начинается биосинтез к накопление антибиотика в среде, наблюдали резкое снижение активности изучаемого фершента.

Гладозооксддазвая активность также очень сильно различается у обоих штаммов (Е.С. 1.1.5.4. ) Actinoayсеa spheroid«* (см.рис. II). Активность этого фермента у образующего новойио-цин штамма намного вике, чей у биологически неактивного мутанта. В посевном мицелии глюкозооксида зная активность у обоих штаммов одинакова и составляла 0,2 БЗ/ыг белка. После посева мицелия в сайтетическул среду у неактивного мутанта происходило резкое увеличение активности к 3 суткам рост«? а' лшоылцета. У продуцента лсг.врьвгошевглюкозооксидазная активность сразу же в первые сутки роста резко снижается и полностью исчезает во втору» фазу роста, когда в культуральной жидкости начинается образование новобиоцина.

Результаты по изучению А'ГФ-азноЙ активности выявили следующую закономерность (см.рис.12). Распад АТФ у активного штамма Act. sphereides происходит менее интенсивно в сравнении с неактивным мутантом яа протяжении всего роста и развития актиномицета. Особенно четко это выражено в начале второй фазы роста и развития, когда в среде начинается биосинтез антибиотика.

Установленное закономерности по изучению активности сукдиаатдегидрогеназы, глюкозооксидаэы и АТФ-азы дают возмож-

'о

рис»12<.Изиевеш«е активности АТФ&г« Рис. Из не не айв активсоти глюкозе -

- штаии ---атаки ущ оксида зи

—— «таим 35 ---штамп Ift*

яооть предполагать« что появившийся в миделия и культуральной жидкости новобиоцин возможно выполняет роль регулятора их активности.

2. Влияние новобиощша на активность ферыеатов

Ac tinoejc*a epheroidae

В связи с 8тим в дальнейшей нашей работе било проведено изучение действия различных концентраций новобиоцина на активность ряда ферментов. В раде работ было показано, что новобио-цив, добавленный в среду, перед началом культивирования продуцента Act. eph»roid«e з концентрациях 70-100 мкг/шс оказывал действие на углеводный обмеа, нарушалось потребление глюкозы, лимонной кислоты, происходило накопление кето-кислот и др. (Егоров Н.С., Юропова Е.Г. и др., 1968). Такие чувствительными к нему был синтез РНК а ДНК (Аль, Нури, Егоров B.C., 1968, 1969), щиохромн (Морозова Т.М., 1971).

Полученные результаты указывали на активную реакцию организма-п родудеа та на действие экзогенного антибиотика я позволили сделать предположение о том, что, возможно, новобиощн будет оказывать влияние на активность ферментов углеводного обмена Ac t.spbe roide•.

Было показано, что экзогенный всвобиоцив в концентрациях 30-50 ыкг/мл не оказывал действия на активность ферментов гликолиза гексокииаэу и альдолазу, а также и на ферменты пентоэо-фосфатного пути распада глшкоэи; траяскетолазу и глюкозо-6-фоо-фатдегидрогеназу• Не чувствительными к антибиотику оказались также нзоцитратдегидрогеназа и малатдегидрогеназа. Не было отмечено действия новобяоцина на активность АТФ-азн.

Чувствительными к действию антибиотика оказалась сукци-патдегидрогеназа, шаруватдегадрогена зы и глюкозооксидаза Ссм.рвс. 13, 14, 15),

оцло изучено влияние новобиоцина в количестве 100 мкг/мл для активного штамма и 70 мкг/мл для неактивного мутанта ври добавлении его в среду перед засевом ее миаелием актнномицетов ка активность сукцпнатдегидроге Еази (рис.12), Установлено, что активность фермента очень чувствительна к действию новобиоца-на, особенно в начале роста культуры. У неактивного мутанта новобяоцин не наменял активности йермента, несмотря на то, что рост актиномидета был немного подавлен.

Таким образом, подученные дзнные позполили отметить существенные различия в ективяости сукцинатдегидрогевазы у двух итаммов Аск.врЬего1йев , а также, что очень важво различную чувствительность этого фермента у изучаемых лтйме;ол яктиноми-цетор к ново о логину. Была установлена миниг-ольвая концентрация, влиявшая на ькгрв^ость фермента. Она составляла 30 мяг/мл Ссд|,рис.13).

необходимо подчеркнуть* что в этой концентрации новобио-вдл не оказывал действие на такие процессы, как рост продуцента потребление основных компонентов среды, образование амино-'-..юлог, органических кислот, фосфорный обмен и т.д. (Торовова ¿.Г. а лэ,, 1968; Егоров Н.С. и др., 1966, 1967). Но именно в -кошкьгра.чиях 30-40 мкг/мл антибиотик определялся в среде при нормальном росте и развитии продуцента, когда наблюдалось резкое снижение активности сукциаатдегидрогенаэн у продуцента.

Результаты до изучению влияния новобиоцина на активность глщозооксидазы представлены на рис. 15. Чувствительными к

M ■

Iя

№

*f

Й

S »

I

t h г

- штаии

--- «auu 144

I f»

«5

M

Kt

50Q,

w. seo

m iw,.

£4

4t

72 W

¿í*** ркм Stem

atauu ti5

______

штаки 144.

РасЛЗ.Ввмлнке новобаошны aa амяваосгь сукшнавде гид(>о,ге«аэн

1-4 контроль 2-3-5 добавлено ¿0-50-70нкт/ка новооноциьа

« * IS Kspnptm

' ê vâm

inc.Влияние ново&иоцмаа на агтиьниоуь йкруавтдй г идроге казн

1-1 контроль ¿-3-3-4-4 дс5аи.'1е«о _C-ii>-?0ккг/мл новобкоцкца

ÏA

w t. X

Ш

Cifr

Oit

Л

N

N

/ V

W w

\

s

/

/

«r

qs «a

ta

4t

14

48

П

S6

4Z0

m не ft н

&KW POCTñ 0СЛСАЛ

íkc.I5»Bim«fjte ногойаоцниа на амивнйсть глвкоэвоксидааы

- мтаим Эр — - к та мм 144

Ь-2 - юатрояъ 1а-2а - яовавлеио ТОнкг/нл иовобкощша,

действию новобиоцина оказались оба штамма. Антибиотик в концентрации 70 икг/ыя аолностьп подавлял активность фермента ва вервне-вторне сутки роста актиномицета л достигал значений характерных для контроля только на 3-4 сутки развития, когда практически экзогенный новобиощш исчезает из нуль тур альной жидкости.

Интересно отметить, что на 3-4 сугки роста продуцента в его культуральной жидкости накапливается 70-1 СЮ мкг/мл новобиоцина. Именно в это время исчезает активность глюкозооксидази у продуцента Act. spheroid«в С см.рис.II) а именно к таким концентрациям антибиотика оказался чувствителен фермент у неактивного мутанта.

Инне закономерности были получена при изменил влияния новобиоцина на активность пируватде гядрогенаэы у Act. epb*rold»a . Било отмечено 1см.рисЛ4) что активность этого фермента у продуцента в 2-3 раза выше, чем у мутанта. Существенно. что такая разница в активности фермента у изученных актаномицетов наблюдается только в первне 24 часа роста культур, а затем активность пируватдегидрогеназы у обоях штаммов Act. spheroid«а становится практически одинаковой. Новобяоция добавленный в среду в количествах 30 мкг/мл и выше в 2 раза снижает активность изучаемого фермента. При этом оказалось, что антибиотик оказывает действие именно в первые 24 часа роста и развития актиномицетов. Действие новобиоцина на активность пируватдегидрогеназы наблюдали не только in vivo , но и in vitro (при добавлении его в кювету непосредственно перед измерением). Результаты показаны в табл.З.

Твблица 3

Влияние ново б логина на активность пжруватдегидрогеназы у lot. apbarold*e in vitro

Активность в белка

Штамм 35_

Контроль Оонт

__

Контроль Оонт

10 20 30 50

700 700 700 700

450 400 350 300

270 270 270 270

190 170 ISO 150

Самое значительное снижение ферментной активности в 2 раза наблюдали в кювете при добавлении 50 мкг/мл яовобяояжаа.

на активность сукцияатдегидрогенаэы Act. eph«raide* при добавлении его в кювету непосредственно перед намерением.

При изучении влияния йовобиощша яа потребление пирувата из среда выявлено, что антибиотик подавляет этот процесс в первые 24 часа роста актияомицетов iтабл.1 я 2). К 48 часам роста культуры антибиотик не оказывает влияние на потребление пирувата»

Полученные результата по влиянию экзогенного новобиоцина на активность изученных ферментов показали, что чувствительными и антибиотику оказались только некоторые из них.

Сукцаватдегидрогеназа и глюкозооксидаза являются фяавопро-геадами. Ранее била установлена связь образования антибиотика с флавогенезом (Торопова Е.Г. и др. 1969). В этой свяая бело

Необходимо отметить, что новобиоцин не оказывал действие

интересно проверить влияние флавиаадениадануклеотида (ФАД) на активность сукцинатжегидрогеназы у Act. spberoide» in yí*o и in vitro .

Было устааовлено, что 30 мкг/мл новобиошша подавляет активность сукцвяатдегидрогеназа у продуцента » 2-4 раза доводя его до уровня активности фермента у неактивного мутанта (см. рис.13). Оказалось, что воли вместе с новобиощшом в среду добавить и ФАД в концентрациях 10-20 мкг/ил перед засевом ее мицелием актиномицета, то активность сукциват дегддрогенааа увеличивается и достигает уровня в контрольном варианте (табл.4).

Таблица 4

Влияние ФАД, добавленного перед засевом ее мицелием актиномицета, на активность сукцинатдегидрогенаэа

Возраст Активность СЛГ-езы в Е/мг белка

мицелия Контроль Добавлен яовобиоцин Новобиоцин 30 мкг/мл В ФАЛ

30 мкг/мл 10 мкг/мл 30 мкг/мл 30 маг/мл

12 часов 32 10 30 25 20

24 часов 80 20 30 56 S3

Если ФАД вносили в кювету непосредственно перед измерением активности сукдинатдвгвдрогенази. то было установлено, что ФАД повышает измеряемую активность в пробах мицелия растущих в присутствии экзогенного новобиошша (табл.5). Полученные результаты по изучению влияния ФАД на активность сукцинатдегидрогеназы показало!, что он снимает действие ново-биошна как in vivo , так я in vitro .

Таблица 5

Влияние ФАД на активность сукцикатдегидрогеназы i ■:tro

Возраст мицелия Активн.. :;гь СДГ-езы Е/мг белка

Контроль обычная реакционная счесь и кювету добавлено 3 мкг ФАД В кдовету добавлено 1,5 мкг ФАД

12 ч- va й1 10 30 30

о „ о ¿ 12 35 30

13 31 31

»1 о 4 И * 10 32 28

Обобщая шлученные результат по сравнительному изучению ферментов углеводного метаболизма у продуцента новобиоцина Act. epheroidee я его неактивного мутанта моино отметить некоторые закономерности . Активность ферментов гликолиза у обоих штаммов почта одинаковая, наблюдается повышенная активность ферментов цикла трикарбоновых кислот у образующего ново-блоцин штамма ACt.apberoidee . Использование глюкозы у неактивного мутанта преимущественно направлено по пзнтозному пути. Более высокая активность ферментов цикла трикартлоновых кислот,вероятно, связана с более высокими синтетическими способностями продуцента новобиоцина. Это подтверждается также более медленным распадом A№ у продуцента в начале второй фазы развития, когда начищается янтеясжвныИ биосинтез автздяотвка.

Результаты по изучению влияния новобиоцина на разные ферменты углеводного метаболизма показали, что чувствительными к вему оказались дярува тлегадроге на за, сукцинатдегидрогеназа

и глюкозооксидаэа.

Била установлено действие аоводяощва яя активность некоторых фермевтов как 1п т1уо , так и ш т!Лго • Одна из гипотез относительно механизма действия новобаоцина связана с тем, что антибиотик связывает ионы 1И«Н' (Брок, 1969). Пируватдегид-рогеназа является ферментом, чья активность сильно зависит от присутствия этих ионов. Возможно это одно из объяснений подавления активности пируватдегидрогеназы ш »1уо и уиго у Ас(.йр11*го1а*в .

Сукцинатдегидрогеназа и гликоэооксидаза являются флавонро-теидами, Новобиоция резко снижал активность изучаемых ферментов в первую фазу роста актиномицетов. Ьыло установлено,' что такие концентрации как 30 мкг/мл новобибцина подавляла активность сукцинатдегядрогеназы в 2-4 раза. Было отмечено, что ФАЛ снимает действие яовобиошша при добавлении его в культура л ыцгю среду перед засевом ее мицелием актинощщета. Таким образом очень вероятно, что ФАД и новобиоцин конкурируют друг с другом в метаболизме продуцента Аек. врьегохйвв . Вероятно, новобиоцин может включаться на место ФАД при сборке фермента уменьшая ее активность таким образом. Флавинадениндинуялеотмд внесенный в кювету непосредственно перед определением активности фермента в пробах мицелия предварительно выросшего в присутствии но-вобиоцнна влиял на активность сукди на тде гидроге на зы, повышая ее. Ш-видимому, в данном случае можно предполагать, что новобиоцин обладает неспецифическим аллостерическим действием в отношении сукцинатдегидрогеназы. В литературе имеются данные о таком действии некоторых антибиотиков, например, хдорамфеяикол (Коротяев, 1971).

ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнительное изучение активности ферментов гликолиза певтозофосфатного пути и цикла трикарбоновнх кислот

И ГЛПКОЗООКСИДаэЦ у двух штаммов Act, eph«roid»a продуцирующего и неородуцируюшего новобиошш. Активность ферыевтов гликолиза одинакова у обоих штаммов.

Активности ферментов певтозофосфатного пути: глюкозо-6-•фссфатдегидрогеаазн и травскетолаэн выше у неактивного мутанта Act.Bpberoides .

Активность Шфува тдагидрогевазн в 2-3 раза выше у штамма Act . spbcroides . продуцирующего антибиотик в первые 24 чеса культивирования.

Активность ферментов цикла трикарбоновнх кислот ыадат, изоцитрат» сукцвватдегядрогеназы выюе у продуцирующего ново-биоцин штамма Act. «pheroldea .

Активность глЕкозооксидази выше у биологического неактивного штамма Act. eph«roidee .

2. Изучено влияние новобиошша на актявность фериентов гликолиза, певтозофосфатного пути, цикла трикарбоновнх кислот л глюко эооксида эы. Иовобиошн в концентрациях 50-70 мкг/мл не , оказавал заметного действия на активность ферментов гликолиза пентозофосфатного пути.малат я взоцЕтретдегждрогевазу, однако, концентрация вовобиоцина, равная 20-30 икг/мл, оказывает действие на активность сукщшатдегидрогенааи, пяруватдегидрогеаазы, снижая их активность в 2-3 раза у продуцента вовобяощша.

Неактивна! nrram» Act, epheroid*a не чувствителен к действию указаниях концентраций нсвсбйоциеа.

.'■■■.. \ Новобиоцкя в ^ондевтракаях 70 мкг/мл оказывает действие на глюкозооксидаэу ттЕша( да сватезкрушего яовобвощш ~ ] - i свяязя ее активность1 до уровня у яродосеита Act. epb«roid«*.

'[■'■■■ ' 3..Ноэобаощщ оказыпвет действие'па активность сукциватда-"" ■ гидрогеаэза только" i» vivo , ó на «ктавсость перуватдегвдро- ; . геназы как. »Ivo , так ж Id vitro . V " '■■ ."■">" "' ;' ■ -

- ; . "■: - ..''4. Антибиотик избирательно лжгибкрует активаость ■

' ; ферментов, ^состав которых входят ФАД. .!■.'.

снимает ;;«ícTiite ковсбцоцава при внесении его в кулызгрйЛБву» среду. Это указывает ва то, что новобиоцин," ^ вероятно, выполняет роль регулятора активно с га ферментов у cotí-V . V ственвото продуцента в состав которых входит 5АД.' -r-i!..^ -

'г , ■ Материала диссертация опубликована, в следуявих , * v ; '

■'■'"■'•'.■' ' ■■■ ■■■■" работах: • Л;. , ■-л - ■-...".": ■.-■'■';■■'-."■

■ I. Тороаова Erl'., Егоров U.С.. Иванова И.В., Морозова Т.Н., - ■ 1970. Изучение некоторых ¡окиблителышх ферментов у сроду- ■. '"" ' V цента нсвзбиоцвва . Act. epheroid«*' .Антибиотики # II,стр.

967-ЭУГ. • .•" ■ '

' /;2. Егоров Н.С., Торовова'Е.Г., Иванова И.В,,' 1970. Влияние яо^ -'-.V - О- воСкоцкна ва окислительные фермевм-. Act. «ре « . 7-й Л '.".' Международный симпозиум во химии прародаых' соединейяй

изд. "алнатяе", Рига, стр.654-655«. ■/-.."■'.

3. Торопова Е.Г.» Егоров Н.С.. Иванова И.В..1ЭТЗ*;Изучение ... • i .■ -■''■* активности еукцияатдегядрогеаазы у продуцекта:давобяоци-

■. чи - . Act. ' aj>b«ro¿d*a ' • Антибиотики » 4, crp¿ 309-312. . ' . 4. Тороаова Е.Г.',. Иванова И.В.. Егоров Н.С.; .1974': . Активность V* ,' . .

■ : некоторых ферыеятову; lct.epb»roid»» и действие на них ■ - л " новобаоцина. Микробиология,' том X В, вып.З, стр.484-489. ,

' 'Материалы диссертация были долоиеая ва 7-м Международном ' симпозиуме-ш химии природам*»соединений. Рига,:1970:.

- ПОШСАНО В ПЕЧАТЬ 20ЛХ.197ЧГ... ' . \ " - ОБЪЕМ.1,5 печ.мст. Ф0Шг: Сг.?Л-0/1/16 ' /:'ЗШЗ: 19*3:ТОРА»:■ - ; -; ; ; ИЗДАТЕЛЬСТВО МГУ • lio ск i аК-5, у Л. Г я рцв иж. 5/7 ТИПОГРАФИЯ ИЗДИШЬСгаА МГУ Ыосх1*,Л«вГори