Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ АКТИВНЫХ ШТАММОВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ АКТИВНЫХ ШТАММОВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ"



МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ нмени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи Для служебного пользования

о

Экз. №_

СПИЦЫНЛ Дина Нурмухаметовна

СРАВНИТЕЛЬНОЙ ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ АКТИВНЫХ ШТАММОВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЯ

(03.00.07 — микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1982

Работа выполнена в лаборатории селекции и физиологии микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института биосинтеза белковых веществ Главного управления микробиологической промышленности при Совете Министров СССР.

Научные руководители: доктор биологических наук Н. Б. Градова, доктор биологических наук С."А. Коновалов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. К. Шильникова (Москва), кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Днсслер Е. Н. (Москва),

Ведущее учреждение — Московский государственный университет нм. М. В. Ломоносова.

Зашита диссертации состоится 1982 г. в «ЛЭ » час. на заседании Специализированного совета К 120.35.06 по микробиологии в Московской сельскохозяйственной академии им, К. А. Тимирязева но адресу: 127550, Москва, И-550, ул. Тимирязевская, 49, Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « .МА^^-..... 1982 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета -к, б. н., доцент

м

"■■ ■ --t,"' - ■■■jV.■ - * *i •.■■","**•:>;*'->■',■■■.

: ОБЩАЯ^ХАРЛКТЕРИСТИКЛ!

■,ä В «Основных; направлениях экономического' и ¡социального , ' развития СССР на 1981— .1985,годы шна'период доП990.,го- ,-...Л -да» предусматривается увеличение выпуска продукции микро: : биологического синтеза к 1985 ,году., вт1;8—-1,9. раза, оСра- - . .'■; "щается вн и м а н ii е, н а; зн а ч 11 т ел ьн ое у в ели че н не - п р о из водства кормового белка,.на,создание ^высокопродуктивных-штаммо»: ^ микроорганизмов-продуцентов. -.v^r'fv i ' ■ . ■ ■■Д'Vf

v За последние годы; в нашей' стране создано производство : • получения кормовой'биомассы из очищенных жндких'парафиЧ«::;- С . £ -иов нефти при использовании в качестве продуцента.дрожжей " •рода Candida. Л • ■' ..^¿v*;;'; . iv 'Л

- Рядом исследователей:, по к аза НО что;; углевод о р О ДО К1IСЛ Я- , 7* щне бактерии по сравнению *с>р6жжами'обладают рядом npe-'^.N^if ■нмуществ как продуценты для получения ^елка/од ноклеточ-^J.- ; пых: более высокой скор остью'роста и большим-экономичсским '

коэффициентом усвоения углеводородов; а также, большим со-• \ Г ■держанием в клетках сырого протеина ™-(Ertola|et oll., ■ 1965; ■ Г" % -Fuhs, 1961; Wagner,et all;; 1969; Позмогова/Хахатов;1 1970; ; .Чепнго с соавт., 1974). , ■ .. v.-. ;V<;..<.- ¡■•¡--:„. . =

Среди бактерий наиболее изучены в качестве- продуцентов*-," : \бномассы штаммй:.Mycobacterium, MicrocpccusrH'Arthrobacter ^ (Позмогова,1СахатЬв,.1970;.Попова с соавт;;',1973; Головлев, ': ."'-i : 1971; Квасников, Исакова, 1978; Мельник, 1980)..;-Бактёри'и .рода Pseudomonas с этой точкп зрения' пе исследованы. В то ; -же время изучение утлеводородокнсляющнх.псевдомонад в ка- :• •честие перспективных; продуцентов белка одноклеточных пред-, / V Вставляет большой ¡интерес, поскольку .известно .их широкое, рас-1 пространение впрнроде, способность активно окислять'широ--кий спектр алканов и углеводородов других классов(розано-Л;)* ;ва, Кузнецов;* 1974; ПозмЬгова; 1971; Демидова с,соавт.*/>1973; ; ' 7 Фонкен, Джонсон,- I97G);': /. ' ' - Ь;. г ц :>

: v Псевдомонады являются наиболее, изученными втенетпче- а ,

- ском отношении среди ^тлеводородокнляющих мпкроорганнз-щ' '

■мов, что .н дрет 0CBpswpi9ißi4Äft4aTpiL ветствуюцщ

Ги ^шШШМ:

1ать г их как доноры соот-1

ч-г^шшдяргиэ^^ТВИ^РЦззн!"!:- углеводородокис-

\ ь, ;охоз ' ачадемии

лшоишх штаммов микроорганизмов методом ген ной '.инженерии (Chemical Engineering news, 1975; Fall et alt., 1979)/ ,Цель и задачи и сс л едо в ан и я : Н а сто я та я работа посвящена." ii изучению практически) важных физиологических ¡свойств угле-'"? *\по д о р'о ду т 11 л изи ру ю Щ11хба кте р ] I ft рода Pseudomonas в сравне-minie наиболее изученными - бактериями рода Arthrobacter с ;;целью определения перспективности использования-псевдомо-W ;иад для полу.чения белка одноклеточных. ■ . Г J -.< Задачей работы явилось: : " 1 „¿г

— выделение из природы и селекция высокопродуктивных* углеводородокнеляющнх.штаммов)!.'бактерий ;рода Pseudomonas;/^--'" ' "'. .. . . " ^{rrc-irr шученне;в сравненшггс бактериями рода Arthrobacter

таких~практнческн ценных физиологических; свойств штамма бактерий . рода Pseudomonas, .как ассимиляциян-алканов раз-нопьмолекулярного вёсагвлнянне .условий культивирования^, на' усвоен нс.-1тлеводородов;ч изучение: продуктов метаболизма* ' ^и-нх влияния на разни тн ё культу р ;сод ерж ан небе л канби о л о -'гнческая ценность биомассы. .-гй'" . с.¿Г'; ■ '.^«Научная, новизна работы.В пер выев сравнительном аспек-

изучены;¡такие промышленио'ценные физиологические -„свойства активных углеводородокисляюших штаммов бактерий рода Pseudomonas и Arthrobacter,* как. кинетика роста, со... став: биомассы,,баланс.-углерода ..„при - окислении.Ьлканов, со-встав и влияние,пр0дуктов:метаб0лизма на:"нх рост, и на осно-',-ванни анализа:результатов, полученных другими, исследовате-'-..лями,^сопоставлены С; та ковымн:дл я; углеводородокисляюших / -дрожжей рода; Candidas Впервые изучен-фракционный состав ' ;и:влняние;продуктон метаболизма: на рост активных углеводо-родокнеляющнх .бактерий. Выявлено более высокое,содержание фракции,органических кислот,в продуктах :метаболнзма :' изученных бактерий в сравнении с установленными для. углево* •дородокнеляющнх,дрожжей рода .Сап(1Ыа";(ГрйдоваjCiCoaBT., 1974),.что(свидетел||ствует,о,большей неекоордшшрованябсти ■ синтеза окендаз смешанных функций н ацилкиназы.в клетках *; .бактерий;' но. сравнению,с-дрожжами :_;(Senez, Azoulay,; 1961). Л}:. Выявлены, общие закономерности характера влияния^продуктов; метаболизм а на рост изученных штаммов углеводородокисляюших "бактерий н установленные ранее, для, дрожжей \ -рода. Saccharoinyces {Finn. 196C)4i-ii .углеводородокисляюших " v ;■дpoжжeй,poдa;,Candidaч^ (Градова с соавт.,,1974) — стимулирующее* действие продуктов мётаболнзма'в низкой концентра* ,'Цни и угнетающее — в концентрациях,выше критической; ' ' . »^я' Прнгнспользованин радиометрического : метода: в '.оценке ;баланса;углерода подтверждена, бол ьш а я.эффекти в ноет ькон- '

трукти в j юго, обмена при. утилизации Углеводородов бактерия-ми по;сравиешш с д р ожж а мир од а £ a n d i d а..;; * г j- ..

В ы яр л ен ыр а з л и чн я >изу ч енн ых ;б акт epii й- к:и н ди вид у а л ь?; ным алканам. Показано; у снление 1о кй сл й те ль но й * а ктивн ости Ps. fluorescens по сравнению с Arthrobacteif. gl ob i form i s~ npi i использовании н-алканов с-длиной углероднойцепн-С£—См'н ВЫШе <jjg. ' : •

• Подтверждены на бактериях рода Pseudomonas и Arthro-bacter данные I об участии лнпндов ..в метаболизме', алкапов микроорганизмами, полученные Давидовой и др.{1977) для дрожжей рода Candida. • ■ . . , ; .'.'С А

.„ Показано различкое'соотношение белка и небелковых азот- ' содержащих соединений* в клетках, бактерий,рода Pseudomo-' nas и ArthroBacter. Установлено, что.в белке изученных бакте*-' рнй преобладают ще'ло'чёрастворимие белки. " ] h\ . .,- Практическое значение работы. Определение аминокислотного и фракционного; состава .белка, штаммов ^Arthrobacter н Pseudomonas, а также ихнсследованне с помощью тест-орга-. иизма Tetrahymena pyriformis ,W. показали, высокую, биологи-* ческую ценность.бномассьг данных бактерий. - *>, / >■ '.„

Установленные;различня. в1 ассимиляции^.ii окнсленни'алка* нов изученными углеводородокнсляющнм»'штаммамиjÄrthro--bacter globiformis HjPs..fluorescens показали . практические', преимущества использования бактерий Arthrobacter для - получения белка одноклеточных и целесообразность дальнейшей селекционной работы среди штаммов этого рода. - . ,., ,,

Результаты "изучения продуктов метаболизма и их влияния на развитие бактерий явились научной основой для разработки технологических процессов получения,абактернальцой биомассы нз н-парафшюп с рециркуляцией"культуральной. жидкости и использованы при разработке технолог!1ческого регламента получения,биомассы Arthrobacter;gtobiformis из н-пара-финов в опытных условиях, , , V ' ' ' *

Показана i. перспективность использования -^бактерий рода Pseudomonas для окисления трудноутнлнзнруемых,микроорганизмами углеводородов с длиной углеродной цепи ниже.Сц и выше Сш, например,'при очистке сточных-вод, содержащих ' углеводороды, ¿а также для разрушения углеводородов, загрязняющих водоемы;Н почву. -----"

Публикации; : По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.';,'"1 ■■ ;F*y-ri:" ' '*■ ■■'

■ Апробация.;Материалы диссертационной работы докладывались неоднократно на Ученом совете:института ВИИИсин-■ тезбелок. '■ -.'' - ",

Структура"« объем диссертации. Диссертация изложена на 171 странице машинописи ^состоит из введения,:обзора литературы (глава глав экспериментальных, псследова: 'ний, обсуждения-результатов,-выводов ib списка/литературы. ' Содержит 43 рйсунка и 27 таблиц. Список.цнтиро'ваннон лнте-

pdiypbf содержит 142 отечественныхн 78 иностранных itdif-менований. ! ■ ■

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1 Выделение активных5. углеводородокнсляющих бактерий проводили методом накопительных культур в элективных условиях.

В качестве объекта исследования использовали селекционированный углеводородокнсляющий штамм бактерий Ps. fluorescëns, а также штаммы Arthrobacter globlformis Д-1, и it отдельных опытах дрожжи рода Candida, полученные из коллекции института ВНИИ синтез белок. *

Идентификацию бактерий проводили в соответствии с определителем Bergey's Manual (1974) к Красильиикова (1949). . ■ Бактерии культивировали на синтетической среде при использовании в качестве источника углерода н-парафннов и индивидуальных углеводородов в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды на качалках или-ферментерах (Vp = 10—15 л), рН среды 7,0—7,2 при температуре, оптимальной для исследуемых штаммов: 32°С для Ps. fluorescens и 40° С для Arthrobac-ter (*lobiformis. - * '

Бактерии выращивали в условиях периодического и непрерывного культивирова иия. Рост., контролировали турбидимет,-ричёским и .весовым методами, Концентрацию органических кислот определяли.методом потенциометрнческого,.титрования '{Корчемная с соавт., 1966);„содеранне азотав биомассе—по методу Кьельдаля (Мешкова с соавт., I960), аминокислотный состав —на аминокислотном анализаторе марки,,Muttichrom (Рябчик с соавт.,: 1971 ) ; липиды -т по методу Фолча .{Folch ,et all., 1957). Содержание 14С в различных фракциях.: среды, а также в ■ б и ом а с с еи. ее. фракциях .определяли; радиометрическим методом на установке, типа ПП-8 с, торцовым, счетчиком Т-25-БФЛ или на жндкостно-сцинцпляционном спектрометре МарК-2.., .....' . „;■,...)'... , . ■ ; ir;

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ " Г Выделение бактерий, окисляющих углеводороды *

' Бактерии выделяли методом' накопительных культур из •различных природных образцов (почв, ила сточных канав, озо-керитовых пород, растительности "на нефтяных пластах и т. д.) "¿отобранных, в , M а й ко пек о м, Уз бе кс ко м, Борцславском нефтяных, месторождениях^ Копёльской: низменности „Украин-хкой'ССР,1 из карьеров п о добыче торфа . Волынской области, ■из активного ила очистных сооружений Уфимского нефтеперерабатывающего завода. Выделение бактерий.проводили на ми-

иералыюй среде, при, исп о л ьз о в а н и ii^ н ; п а р à ф i i но в , в j к а ^еств е единственного х ]¡сто«iннка углер о д а и энèp'r ш r.Y" * Температуpa" культивирования^ 30ТТ732°С, *рНб,5—-7,0.; И з,25^ на коп отельных культур было выделено 3 наиболее активных .штамма",* ofV »носящихся к родам Mycobacterium к Ps eud omon a's В резу л ь'та -те' сравнительной оценки1 выделенных *' культур.'был "отобран наиболее активный мезофнльный ' у'г л ев о до р од о к и с л я ющн н штамм бактерий,.! идентифицированный; к а к,Р send о ni ori a s fluorescens, продуктивность которого" равна"'*продуктивности термотолерантного штамма* Arthrobacter gl ob i f orm î s /шт. Д-1 » используемого д л я a з p a С от к и t ,т ex ï ip л оги че ског о про цесса jio-лучения биомассы" из углеводородов'. " ^ V'^ 'V' -

Физиологические особенности штаммов Ps, fluorescens и Arthrobactèr globlfoririis Д-1 : : vr '';ч

Отношение бактерий-к н-алканам. Изучено развитие бактерий на н-алканах~ с длиной углеродной цепи от Се до Сгг| Показано, что на н-алканах с длиной углеродной цепи С8—Сш обе культуры практически не развиваются (рис. là). Наибольшее накопление бномассц изученных штаммов наблюдалось при выращиванщгна н-алканах от Сц до'С^. Прн увеличении длины углеродной.1 цепи алканов до Сго—гС^г накопление биомассы Arthrobacter globîformis шт. Д-Гснпжается »¿значительно по сравнению с таковой , на н-алканах Cjs—Cià,' в то время как накопленне'бибмассы Ps. flûofescèns резко снижается на углеводородах как с большей, так и с меньшей дли-; ной углеродной цели. Проведенные исследования-' показали, что снижение концентрации биомассы коррелирует с увеличением концентрации продуктов метаболизма, накапливаемых в культуральной жидкости,- Максимальное удельное1 накопление органических кнслотг при развитии изученных бактерий наблюдается ira углеводо'родах * с длиной- углеродной^ цепи Q—Сц и С£0—Си (рис. 16), что соответствует рапее получент ним данным при изучении углеводородокпсляюишх дрожжей рода Candida (Градова. Кру.чннина, 1966) . Повышение уровня накопления органических кислот при окислении углеводородов С9—Сц il BumejCis свидетельствует о большей нескоорднни-рованностн синтеза г ферментов, осуществляющих первичное окисление данных алканов и гидролиз. ацилкофермента Л. Штамм. Ps. fluorescens обладает большенпо сравнению с Arthrobacter globîformis шт. Д-1 окислительной активностью по отношению как к более легким, так и более тяжёлым углеводородам изученного спектра (рис.1б). Количество органических кислот в среде,при развитии Ps. fluorescens на углеводородах Сэ и С«1 соответственно ii 15 ji 11 раз больше, чем.npii росте Arthrobacter globiformis-шт. Д-1 на данных'.углеводородах, что свидетельствует.о более " высоком уровне^энергетнче-

ского обмена у псевдомонад по сравнению с артробактёром. " Изучение внеклеточного и внутриклеточного 'баланса угле; рода* при ассимиляции , I -14 С-о ктаде к а н а. Изучение кинетики ■ пот реблен li н' 1 •'4 С-о кта д ек а на'ба кте рн ям н^о бес печ и в а ющег о, наиболее активное развитие изученных штаммов, показало, что меченый углерод из культуральной среды к началу стационарной фазы развития практически полностью используется (рис. 2а;'б, кривая 2) й количество использованного из среды 1-мС-'6ктадекана составляет в этот период 99,8—100%.

Максимальное включение меченого углерода в биомассу (кривая 3} наблюдается в логарифмической' фазе' роста и составляет 75—76% от исходной активности. -> Наибольшее количество водорастворимых продуктов метаболизма (кривая 4) накапливается в культуральной жидкости также в логарифмической фазе роста, оставаясь постоянным в стационарной фазе, и составляет 22—24%' от исходной активности; ; ■. * ' ;

^Интенсивное выделение |4СО« бактериями начинается в ло-гарифми'ческой'фазе и продолжается с одинаковой скоростью и в стационарной фазе развития (кривая 5)ь Коэффициент использования, показывающий количество ассимилированного 1-14С-октадекана, при этом достигает максимальной величины 100%.

.- Величина показателя эффективности использования субстрата (К »ф; иен* ) в логарифмической фазе роста Arthrobacter globiformis и Ps. fluorescens . достигает соответственно 78 и •75%. . . . ...

.,<- Сравнительная оценка- конструктивного обмена изученных бактериальных штаммов л дрожжей показала, что полезное использование углеводородов, направленное на бноснитетиче-ские процессы, у боктернй на 22—23% выше, чем у, углеводо-родокнеляюших дрожжей рода Candida (Рачииский, Давидова,- 1970). ' , . . - При исследовании динамики распределения НС по компонентам бактериальных клеток выявлено, что в логарифмической фазе роста в бактериальной клетке начинается активный синтезбёлковых веществ:- Содержание меченого углерода в белках в период логарифмической фазы роста возрастает с 33,1;до'54,3% в клетках Arthrobacter globiformis шт. Д-1 и от 25до 72% в клетках Ps. fluorescens и сохраняется в стацио-нарной'фазе. "

Влаг-фазе в клетках бактерий наблюдается активный синтез липидов из 1-мС-октадекана'. В начале фазы логарифмического роста относительное содержание НС в лннидах постепенно уменьшается от 65,3 до 8,3% в клетках • Ps. fluorescens и от 63,8.до 21,3%'- в клетках артробактера.Усиленныйсинтез

щ

¥ #

0,6 ¥

а-л-/

1

3 р /о Н /г }з»}$/б

-1.- : Число отомобуглере^а £ молекуле алкано? ■■..

tfi.ua-Шо

та

/546 /7 /<5 {0202//Н

чЧ'Л; Число агпом^чглереЗа

' - ',,•; , *: > -¿молекуле : ■ ; >

Рис, I. Рост (в) и удеяъио© накопление ОрХ'вКИЧвОКИХ КИС-0'.лот в культуральной вреде (б) при зирааизании ва средах с н-алканаыи (1 об.%). .. .

ит/меех

О 8

4 6 в 10 /4 <6 : ■ : ВрвМй %иас

5 . 4

з

. z

/те-

ше-

40 4&

Время <С,час [ '^l:,

1С. 2. Кинетика poeta Ш, использования ^'С-октадекояа (Z), включения в биомассу (3), в водорасгворииые про-■ ; дукты (4), в летучие продукты (5) в процессе, роста , Arthxobaeter globiíornls : вт, Д-Т (aj ;И: ■ Pev o.í ■ íluoxesceae ■'■ (б). Д-'■

б

шт.Д-4

Р$./£иог£$сеп$

74» фас М- .. . 48 Т^ас

; Рио» 3. Влияние нативпого (а), и термически обработанного (б) ; "Д . •' .фильтрата культуральной яедкостя на рост бактерий. ■■ Концентрация органических кислот в среде (ыг/л): ■ : : V 1 -'621; 2 - 617; 3 - 345; 4- 207; 5 - контроль. ;

лнпидов в лаг-фазе свидетельствует об участии их в анаболизме углерода н-алканов.' Полученные *данные .коррелируют с данными, полученными для углеводородокнсляющнх дрожжей (Тонева-Давидова, 1980).

Анализ зависимости суммарной величины белковой н лн-индной фракций-от времени культивирования полностью подтверждает перераспределение относительного содержания меченого углерода в органических компонентах в процессе онтогенеза культуры. Сумма белков и лнпидов во всех фазах роста остается практически постоянной и составляет для Ре. Пиогеэ-сепз около 86%, а для артробактера— 70%. Изменяется только соотношение,белков и лнпидов в пределах этой суммы.

Влияние состава среды на рост бактерий. Изучение влиянии источника азота на'рост бактерий показало, что лучшей формой азота для изученных штаммов является аммонийная форма.

Изучение влияния различного соотношения азота и фосфора в среде на развитие артробактера показало, что этот фактор оказывает существенное влияние на скорость роста и соотношение конструктивного и энергетического обмена в клетках бактерий.

При отсутствии лимита азота изученный штамм развивается с большей скоростью при соотношении азота н фосфора в среде 12:1, Независимо от уровня содержания азота (420—, .1680 мг/л) при уменьшении соотношения азота и фосфора в среде наблюдается снижение удельной скорости роста бактерий от ц„,«с. = 0,58 до 0,23 час.-1. При этом относительное снижение скорости роста тем выше, чем больше содержание фосфора в среде. , ,

При отсутствии лимитирования азотом и фосфором максимальный выход биомассы (97,4%) и содержание сырого протеина (69,6%) наблюдается при соотношении в среде N : Р = 3:1.

- Продукты метаболизма углеводородокнсляющнх бактерий. При.изучении влияния фильтрата культуралыюй жидкости на рост'бактернй показано различное влияние его в зависимости от концентрации продуктов метаболизма. Добавление к среде натнвного фильтрата культуралыюй жидкости в концентрации, соответствующей не более 500 мг/л органических кислот, оказывает стимулирующее влияние на развитие обеих культур (рис. За), При дальнейшем увеличении концентрации продуктов метаболизма до содержания органических кислот 620 мг/л наблюдается лишь некоторое сннженне стимулирующего воздействия. Закономерность стимулирования развития низкими концентрациями продуктов метаболизма в среде и ингнбнрова-ине при их концентрации, превышающей пороговые, характер-

на-для микроорганизмов различных систематических групп, использующих;разные углеродные субстратЫг{Градова, Третьякова, 1907; Третьякова>С;соавт.,"Л970;Ртп, 1966). • / Предварительная ^термическая 'обработка;., культуральной -жидкости снижает степень стимулирующего.воздействия)ее на рост изученных штаммов^бактернй::(рнсгЗб);.что свидетельствует.о содержании в культуральной; жидкости;Уермолабильных стимулирующих:веществ,1 вероятно,*,витаминной природы.:При добавлении термически.обработанной, культуральной жидко; стл: с концентрацией органических; кислоту выше 500 мг/л наблюдается сиижеинё. экономического:коэффициента усвоения углеводородов соответственное-79:и 113.%!"ДО;7.1" и 83% артрог б акте ром и псевдомонадамн.; Концентрация ^органических кислот 500 мг/л.является-в данных(условия^пороговой для обеих культур, выше которой :н а блюда ется. угнетениеих развития.

,: ■ Изучение фракционного состава продуктов метаболизма 'культуральной жидкости<артробактера:прн:росте его на среде с' 1-ыС-октадеканом показал о;. 6 что в -логарифмической фазе роста 1В культуральной;жидкостн: содержится 64% продуктов .метаболизма нейтральной;н:31% кислойшрнроды. н

' • При исследовании влияния фракции нейтральных и кислых продуктов метаболизма на рост" АгШгоЬас1ег д1оЫ{огш15 "шт. Д-1 выявлен тот же характер их воздействия, что п на рост углеводородокисляющих -дрожжей рода Сап(Н<1аь-(Градова с соавт,,'1968). Метаболиты кислой природы оказывают угнетающее.'действ не на рост и дыхание'артр об актера- (табл. 1), что объясняется, видимо, действием- нзвестного-регуляторного механизма «ингпбирование конечным продуктом». V ' Продукты метаболизма нейтральной,природы не оказывают нигнбирующего действия на' развнтиеартробактера и частично .потребляются,ими. .За 5 часов, ннбукацин бактерий было потреблено 30% ^ углерода нейтральных продуктов и лишь около 15%. углерода . кислых, продуктов., метаболизма. Это свидетельствует о<возможности .повышения выхода,биомассы при кул ьтпвированшг бактерий в'условиях лимитирования'процесса !) ы р а ЩИ ва Н11 я ^ угл е и од о'р о до м; что обеспечит потребление, из среды,продуктов метаболизма'нейтральной прн-

роды...........: ■ -

Полученные результаты'явнлисья основой для разработки ;технологического регламента получения бактериальной биомассы из н-иарафинов в опытных условиях, предусматриваю-.щего, культивирование .бактерий ! с рециркуляцией .культураль-.пой жидкости.

■':...'■".■ ta i .тина i ' кинетика роста Arthrobacter glob ¡¡о г mis шт. Д-1 на среде, содержащей 0;4% октадекана и "С-продукты метаболизма (распад/мин • мл)

НС* нейтральные продукты (1/г) "С-кислые продукты (1/г)

Час среда, % биомасса, „ ■*■■ - "С02, % среда, % биомасса, % "СО;. %

; 0 " 1 о 3 4 " 5 100 72.4 70.5 69,0 69.7 69.8 26,2 24,3 25,0 23,0 24,9 0,121 0,278 0 000 0,915 1,230 100 91,5 94,4 83,0 90,0 88,2 15,7 0,216 0,352. 0,438 0.712 0,866

Химический состав и биологическая ценность биомассы бактерий Arthrobacter globiformis шт. Д-1 и Ps. Huorescens

Выявлено, что биомасса Ps. fluorescens отличается более высоким содержанием сырого протеина по сравнению с Arthrobacter globiformis шт. Д-1, соответственно 75 и 68%. " При развитии бактерий на индивидуальных алканах (Сц, Сгг)"наибольшее количество белка биомассе'Ps.1 fluorescens накапливается при усвоении бактериями'ундекана (78%) н постепенно снижается п-рн увеличении углеродной непн ал-канов до 58—35% . Содержание белка в биомассе Arthrobacter globiformis шт. Д-1 незначительно изменяется при культивировании на изученных алкацах и колеблется от 68 до 75%. Содержание белка в биомассе изученных бактерий зависит от скорости протока среды н от соотношения и среде азота н фос-.фора;"Увеличение скорости-'нротока1 среды от 0,125'до 0,5 час-1 приводило к уменьшению содержания'белка в биомассе от 59 до'45%;' -.'/'< ■■-;■

Выявлено снижение содержания сырого протеина в биомассе артробактера при лимите (фосфора в среде. С увеличением концентрации фосфора от 108 до 432 мг/л при концентрации азота 420—1680 мг/л или при изменении соотношения N : Р = 12 : Г до 1:1 наблюдалось увеличение содержание сирого протеина на 12—13%. .'■ " "

Сравнительное изучение содержания незаменимых аминокислот в биомассе не выявило существенных различий между изученными штаммами и ранее полученными данными по содержанию незаменимых аминокислот в белке углеводородо-: кисляюшнх дрожжей рода Candida (Чепцго с соавг., 1967).

О

t ■ к f" м' •* l' ' * . *

¡;: Исследования фракинонйо го со став a / бе л к a ' по ка з a л н, что основным компонентом; белка-углевЬдородокисляющнх бакте- ' ,рйй и дрожжей является^щелочёрастворимая фракция. Самое ^высокое сод е р ж а н ие это й^фр а кщ i и. 78 % ;о п ред е л é но. в б н о м а с -; ce Ps.; Îluorescens, в биомассе; артробактера — 62,5%, а в дрож-р жах — 47,1 %■■. Наименьшее содержание растворимой в'5%-ном : с-ТХУ фракции небелковых:азотсодержащих-соединений,' вклю-; ' 'чающих свободные; ну клеот'лды, аминокислоты,' соли аммония, сахара и т. д.; определепо.в бактёриях^Рэ. .Îluorescens (7,9%). Вбиомассе Arthrobacter .globiformis шт.Д-1 и в дрожжах у., C.'-salmonicola их содержание-в 2'раза-выше содержания в : биомассе Ps. fluorescèns il составляет Л7,0 и 18,9% соответст-,,'ве'пно; ' ■ : 1 ' ' '

> " Выявлено, что показатель*;биологической'ценности изучен-;ных штаммов бактерий ArjKrôb ас ter globiforrnis uPsHuores-' ; vcens, определенный с помощью ' тест-органнзма Tetràhymend ,4'pyriformis W, на 5—10%'выше: показателя биологической цен- **

• ностн бномассы:др6жжей;Сап(1|с1а15а1топ1СоШ ВСБ-779 и со- ; ставляет соответственно 97,9;90,3 и 85,1 %. Причем биомасса " артробактера обладает,большей биологической ценностью, чем;

. биомасса псевдомонад. . .. ' , '" t

""■Выявленные различия в конструктивном обмене у изучен-V,, пых штаммов по отношению к углеводородам Си и выше '.Си, а также различия' в' биологической - ценности биомассы; этих штаммов обосновывают целесообразность использования арт-.'О'робактера для получения бактернальной-бномассы кормового

• назначёния,a Ps; Îluorescens— в'процессах, требующих трансформацию субстрата^до* промежуточных'- продуктов метаболизма:' -• V?5- .. s. 1 '

":/'■"*. ' '* ;*т" * «Выводы* '

- ti ; ■ ,. ■ ; ;LV-T. .. ^ ^ -.-. . v. ,н - . .

; f' 1. Из почв и iдругих ^природных субстратов в накопитель- ных мезофильных культурахгна; средах с н-парафинамп преи-' существенно выделяются "штаммы'бактерий родов Pseudomo-v nas и Mycobacterium. Агрегатированный характер роста;выде* ---ленных штаммов' микобактёрий';не"поэволяет" рассматривать ~ "их в качестве.перспективных продуцентов;;Из выделенных*уг->, ;леводородокисляющ71х ,1 бактерий' 'отобран активный .штамм 1

Ps.'fîuorescens,* физиология роста которого изучалась для оп-: - ределеиия. эффективности его,использования'в качестве продуцента для получения белкагодноклёточных; на углеводородах в сравнении с.практически-ценным ; тёрмотолерантным штаммом Arthrobacter-globiforrnis; ■ : : . -V : ' - 2. Соотношение активности конструкторского и энергетиче-

- ского обмена у углеводбродокисляющнх штаммов Ps. .fluorés-. ,;cens и Arthrôbacter:gtobif6fmis„'WT.-Д?1 меняется в зависнмо-

10 1 ' . • * : -* ^ ч - ^

^■¿■.^ ' * ' ь -Гк • ^ . ' * 4

• ч * Ъ ' -j- " ► + • * Ï " " " i Г*-*** > '

стн от молекулярного веса углеводородов;"^используемых в ка--честве-единственного источника;углерода^й: энёргйн. Коэффи-ш!ёнт эффективного'использования углерода алканов, равный при росте на Cja—С|8-н-алкаиах 76—79%, снижается при уменьшении (Cs—Си) или увеличении (Сю—Си) молекулярного веса используемых.алканов. Степень снижения коэффициента эффективного использования углерода значительно выше у Ps: Huoresceris. . „ .'-'^ " ¿-i--^

3. Количество ^водорастворимых продуктов метаболизма , углеводородокисляющнх-бактерий зависит от штамма, концентрации биомассы и молекулярного веса используемых алканов. Концентрация органических кислот в культуральной жидкости Ps. fluorescens при развитии на алканах Св—СГГ-и Сго—С23 в 10—15 раз превышает таковую в культуральной жидкости iArthrobacter. globiformis шт.Д-1; v

4. .Продукты метаболизма представлены в основном соединениями кислой и нейтральной природы.1 Бактерии способны использовать продукты нейтральной и частично кислой природы в качестве источника углерода. V ч.: <eV. '

5. Характер влияния фильтрата культуральной жидкости •углеводородокисляющихбактерий на нх рост меняется- в зависимости от.концентрации органических кислот. Наблюдается'стимулирующее действие фильтрата при содержанки органических кислот до 500 мг/л (пороговая концентрация -600 мг/л) и угнетающее — при повышении их концентрации. .Термическая обработка фильтрата культуральной жидкости снижает, величину пороговой концентрации органических кис' лот... . ■ ' . ■ .

. 6. Бактерии Ps. Iluorescens и Arthrobacter glob ¡form is шт., Д-1 способны использовать азот в аммонийной и нитратной форме,: азот ^мочевины и аминокислот. При этом"'наиболее предпочтительными для роста-являются аммонийная форма азотами азот мочевины.' *

Соотношение в среде азота н фосфора оказывает влияние' на скорость г роста и эффективность биосинтетнческнх процессов. Наибольшая скорость роста и выход биомассы;обеспечиваются разным соотношением в среде азота и; фосфора, соответственно 12:1 и 3:1. Существенное, влияние на содержание белка ¿'биомассе оказывает не соотношение азота и фосфора " в среде, а их лимитирование. ■

7. Показана^ широкая фенотипическая изменчивость ripn-v-.>чака, содержания сырого протеина в биомассе изученных бактерий как в зависимости от фазы роста, так и от условий культивирования. Штамм.Ps. iluorescens характерпзуетсл более высоким уровнем" содержания сырого протеина в биомассе -П0'сравненик>;с артробактером, который соответственно равен 76,5—8],8% и 45,3—74,9%. Уровень, содержания сырого про-.

. .тенна;в биомассе■ коррелируете-ypoIІнe^f;-xöдëpжaйня^иcтнн7;:Y*;_ll Vhoto белка. Количество белковых и небелковых форм ¡азота! в , '

■ клетках Ps. fluorescens-H^Arthrobacter/globiforrriis шт.-Д-Г д Г ,со отв ет ств е н но р а в ho"76,5ii : i Дн;54 * ji; 17(%' Г > ¿7.: Ъ'i:;; V

^клетках нзучен1шх ,штаммовчлрактнческпи*постоянна .do всех , ■ фазах роста н равна :для Arthrobacterglobiformis шт/ Д-1 70%; " а для Ps. fluorescens.— 85%. Соотношение белковых и лнпнд- .'т t'jTbiX! фракций меняется в ^пределах этой: в*е.тнчины зависимо- т ■•"■CTII; от, фазы роста н условий; кул ьт и в 11 р ов а i ш я, ;>,ч то. п оз во л я управлять процессом^ 110 С1 1 н тез а - бе л ко В Ы X; веществ и лииидовЛ """

I Не 'выявлено -различи йв:. а м н нокне л от номе о ст а в е белка ; изученных; ш т а м м о в*,, ■; кото р ы й • -приближаетсяг К белковому

стандарту (белку куриного ;яйца);\Показано; „что*»„белке изу- v-: . ченных бактерий -преобладают,\щелочерастворимые фракции. «* -^kvJO. Биологическая ценность;/биомассы бактерий Ps. fluo-: rescensiH Arthrobacter. globiformis; шт. ^определенная-с по: мощью тест-организма.Tetrahymenapiriformis >\Vt, практически "равна таковой казенна ' и составляет;90,3 и,. 97,9%I-, соответст-"" •венно. ' *•" : ^tv.^^v'::'.''^ ^''- '

v.;-- 11.: Анализ результатов сравнительного)изучения нромыш-.ленно ценных физиологических свойств активных углеводород-окисляющих штаммов :Ps;:.fluorescensJi Arttirobacter globifor-' mis-шт. Д-! показывает^преимущество использования последнего, ¿'Качестве про ду цента» дл я . по л у че ii и я' - белка одноклеточ- -;ных,: a Ps. fluorescens ~~ в процессах;д11рактнческ11: ценным • -свойством для которых:-яоляется окислительная активность . микроорганизмов. / J '■--/Г" "

'"■IlK, ^Список работ/опубликованныхпо теме диссертации , '

■ .Гг^'-Спицына Д./Н./Давидовг^Е. Г., Градова Н.Б., Конова- ... ¿. валов С. А. Ассимиляция углеводородов бактериальными куль. турами MycococcuS: species и 'Pseudomonas species.— Прнкл. ч'бнохим. н мнкробнол., 1974, т. 10; к. 2, с.187—195. . j

;Спнцына Д. Н„.Градов а Н.-Б.,Рлзв1тш,>углеводород-окисляющих м н к р оо рга и из мо в-Му cococcu ssp .hPs eu do то п а £ • sp., на - индивидуальных углеводородах.—Микробиологическая ^ промышленность, 1977, Ii\C.: 2—^3. " Д'-Л--; : 'Л';«;:!^; ■Tiwii Спицына Д. И., Прадова Н Б .,Д а ви дов а ■ Е /П ро ду кт ьг ! метаболизма углеводородокн^1нющнх;'уштаммов-Mycococcus ■„■:■ ;Mactis;rH Pseudomonas fluorescens ;{н их влияние,;;на развитие ■■ культур, — Мнкробиологня,-.1977; т. -1б,5в;'0, с.,' 997—-1002. т-;

■ , ■■■ .'iL: • Ч. ■■'■■" V. К ;■■ = .: v 'V.Vf Объем п. л. f. '' '/¡Заказ 8 (ДСП)/'' . • ' ' Тираж 100 ' ,

4 .'^Типография Московской с.-х. академии им. К. Л. Тимирязева •„■

^ ■•;'■„*'-> 127550,-' i-tocü в а;11-550,1Там н р яз езск а я .ул.,Ч 4 - - - " • ■ >