Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение биологических свойств LEISHMANIA MAJOR , L.TURANICA и L.GERBILLI IN VITRO, разработка регламента их культивирования

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение биологических свойств LEISHMANIA MAJOR , L.TURANICA и L.GERBILLI IN VITRO, разработка регламента их культивирования"

. ; - . 1 • \ ' .'

На правах рукописи

СЫСОЕВ ВЛАДИМИР ВИТАЛЬЕВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ LEISHMANIA MAJOR , L.TURANICA И L.GERBILLI IN VITRO .РАЗРАБОТКА РЕГЛАМЕНТА ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ.

03.00.19- паразитология, гельминтология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наух

МОСКВА 1997

Работа выполнена и Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского МЗ РФ

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Стрелкова М. В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Калинникова В.Д.

доктор биологических наук проф. Наумов Р.Л.

Ведущая организация: Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Зашита состоится 1997 г. в /¿?, часов на заседании

диссертационного совета Д. 176.02.01 при Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. И.Е. Марциновского по адресу: 119830, Москва, ул. Малая Пироговская, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан,^? 1997г.

Ученый секретарь Фролова А.А

диссертационного совета

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы. Природные очаги кожного лейшманиои (КЛ) анимают огромные пространства ннутриконпшетальных пустынь В Центральной и Средней Л чин. До последив!" времени лейшманий, шркулируютнх п гггих onaiax, относили к одному пилу - Leishmania major fakimov, Shoknor, 1914 (Келлина, 1965; Стрел к ma, Глисеев , 1982). Исключение составляли данные китайских исследователей, которые в 1964 году >бнаружшш у большой песчанки лейшманий, не naïuiennwx для человека, и выделили их в самостоятельный вид - L.geibilli (Wang et.al., 1964).

В 1990 году было доказано, что паразиты, ранее определявшиеся как b.major, в действительности принадлежат к трем видам - Lmajor s.str., L.turamca sp.nov. и L.gerbilli (Strelkova et. al., 1990). Три вида лейшманий шляются паразитами большой песчанки, но только L.major в новом понимании татогенна для человека и вызывает заболевание зоонозным кожным тейшманиозом. Ареалы распространения L.major, 1 tunnica и L.gerbilli на шачителыюй части территории перекрываются, а зараженность больших тесчанок одновременно L.major и L.turanica может доспи ать 25% (Стрелкова, 1991). Виды лейшманий морфологически неотличим1-! друг от друга, способны размножаться на одних и тех же питательных средах, и могут быть идентифицированы только биохимическими или генеппегщми методами.

Новые данные о таксономическом статусе лейигчший и их разном )пидемиолотческом значении заставили исследователей пересмотреть прежние данные о возбудителе, с целью определения возможности их использования с мвых таксономических позиций, а также проводить специальные исследования для получения новых данных об этих видах. В настоящей работе зпервые была поставлена задача провести сравнительные исследования культур грех видов лейшманий in vitro на искусственных питательных средах для тол учения новых данных по каждому из трех видов лейшманий.

Культивирование лейшманий лежит в основе практически всех направлений исследований - от эколого-популяшюнных до генетико-

биохимических, н являются одним из важных этапов при проведении видоидентификашш паразитов - основы диагностики и эпиданализа (Стрелкова ссоавт., 1993; Rolland et.al., 1994).

Очевидно, что для успешного поддержания культур лейшманий на искусственных питательных средах необходимо разработать дифференциальный регламент культивирования паразитов. Для этого необходимо знание биологических свойств каждого из видов, а также характера роста на искусственных питательных средах, влияние на рост изменения условий и приемов культивирования, изменений, происходящих при длительном культивировании лейшманий и др.

Симпатрия лейшманий в природных очагах КЛ приводит к тому, что при выделении изолятов от больших песчанок на одну и ту же питательную среду могут попадать два вида лейшманий. Судьба промастигот лейшманий разных видов при их совместном культивировании до сих пор была не ясна. Сама же возможность культивирования смеси позволяет экспериментально изучить характер и механизмы взаимовлияния этих паразитов.

Настоящая работа выполнялась как самостоятельный раздел НИР ИМПиТМ им. Е.И.Марциновского, а также как раздел проекта 1NTAS 944673.

Цель работы: провести сравнительное изучение биологических свойств Lmajor, Lturanica и Lgerbilli при их раздельном и (отчасти) совместном культивировании на искусственных питательных средах, разработать регламент культивирования для длительного поддержания штаммов и наращивания биомассы.

Задачи исследования:

• подобрать методику, позволяющую объективно оценивать рост промастигот лейшманий на искусственных питательных средах и проводить сравнительные исследования разных видов;

• сравнить рост культур L.major, L.turanica и L.getbilii при их культивировании на среде NNN;

• сравнить морфогенез иггаммов и клонов L.major и L.turanica на среде NNN II течении одного пассажа;

• оценить влияние условий и приемов культивирования на рост трех пилон лейшманий;

• сравнить свойства и характеристики разных по происхождению культур одного вида - клоповых и штаммовых, спежевылеленных и длительно культивируемых;

• изучить особенности роста и качественные изменения смеси L.major и L.turanica при культивировании ее на среде NNN;

• исследовать характер взаимодействия L.major и L.turanica при их совместном размножении.

Научная новизна: Впервые показано, что L.major, L.turanica и L.gerbilli имеют четкие видовые различия при их культивировании на искусственных питательных средах. Установлено, что L.turanica практически всегда имеет преимущество в росте, по сравнению с L.major и L.gerbilli, Рагтичня в характеристиках роста устойчивы при изменении условий и приемов культивирования. Изучение искусственных смесей L major и L.turanica показало, что клоны L.turanica имеют преимущество в росте перед клонами L.major. Впервые описан механизм взаимодействия между L.major и Lturanica при их совместном размножении.

Практическая значимость работы: знание особенностей культивирования на питательных средах трех видов лейшманий позволяет корректировать условия получения биомассы паразитов для их идентификагпгн как биометолом (тестирование на животных), так и различными молекулярно-генетическимн методами (изоэнэимный электрофорез белков, ПЦР), а при длительном поддержании штаммов более рационально использовать компоненты сред.

Додвжсцца^-Кьшосимые. .на. защщ:

1. При культивировании на искусственных питательных средах показана дискретность свойств Ь.та]ог, ЬЛигашса и Ь^егЫШ, которая проявляется е .различии их потенш1алов размножения и реакции видов на изменение условий и приемов культивирования.

2. На основании данных о характере размножения 3 видов на искусственных питательных средах разработай диффференцированный регламент их культивирования.

3. На клоповом уровне Ьлигашса имеет явное преимущество перед Ь.тарг в условиях искусственной симпатрии, т.е. при культивировании смеси этих двух видов.

Апробация работы. Основные фрагменты диссертации доложены на: заседаниях московской секции РОНР ( Москва, 1992,1993 ), УШ Международном съезде паразитологов ( Измир, Турция 1994 ), на ученом совете ИМПиТМ им. Е.И. Маршшовского (Москва, 1997), на коллоквиумах отдела медицинской протозоологии ИМПиТМ ( Москва, 1992, 1993, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

^ Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, {глав, выводов, списка литературы. Объем диссертации 107 страниц

г

машинописного текста, включая 3 рисунка, 12 таблиц. Списох литературы включает 40 отечественных и 84 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ и МЕТОДЫ.

Объекты исследований. В исследованиях были использованы 27 штаммов и 3 клона из хранящихся в криобанке ИМПиТМ им. Е.И.Марциновского и относящихся к трем видам лейшманий Ьлпарг, Ьлигашса и Ь^сгЫШ, а также 42 клона, выделенных нами в ходе исследований. Большая часть штаммов и клонов лейшманий были свежевьщсленными, т.е. прошли 1-3 пассажа после выделения или изъятия из криобанка. Два штамма

- Ncal P и "gerbilli" - относились к длительно культивируемым, их культишфопали на питательных средах в течении нескольких десятков лет прежде, чем они были помещены в криобанк. К длительно культивируемым мы отнесли и клон 3720, который перед использованием и опыте пассировали на искусственных питательных средах течении I гола.

МйГРДИ.JU®ae»40jiarintj.11одсчет количества лсГглмишй прот>дили в камере Горяева ежедневно в течении первых 8 дней, потом на 19 и 28 день.

Для описания роста (увеличения числа промаши от) культуры мы использовали показатели (Фрешни Р., 1989):

• удельная скорость роста час*' , она характеризует скорость увеличения численности популяции в течении фазы экспоненциального роста в пересчете на одну особь в единицу времени;

у

• скорость размножения: k=0.332 Ig^T она показывает максимальную

Лн

численность в пересчете на количество случаев репликации инокулята.

Соответствие роста лейшманий экспоненциальному «кону проверяли по критерию Колмогорова при доверительном уровне 95% Для статистических расчетов результатов опытов использовали программу "<~татграф". Степень влияния условий культивирования на рост лейшманий определяли по % отклонения показателей роста от среднего.

Сравнение роста трех видов проводили культивируя их на среде NNN -агар Diico blood base, жидкая фаза - среда 199, вспраст инокулята -7 дней, температура - 24'С, число клеток в инокуляте - 500 тыс. в 1 мл.

Исследования морфогенеза культур L.major и L.turanica проводили у 6 клонов на протяжении пассажа - с 7 по 29 день, и у 40 агсачмов и клонов на 7 день культивирования. Промастиготы для приготовления мазков брали с твердой фазы среды. Мазки фиксировали метиловым спиртом, окрашивали по Романовскому и просматривали на световом микроскопе.

Для оценки влияния условий культивирования на рост трех видов лейшманий изменяли следующие параметры: засевная доза - 50, 250 и 500 тыс.

промастигот и I мл жидкой фазы среды; температура - 20,24 и 28'С; жидкая фаза среды - среда 199 и 10% гемолизированная кроличья кровь; марка агара -Difco blood agar base, Sigma bacteriological agar, Oxoid bacteriological agar и агар Медбиоп рома; возраст инокулята - 7,14,21 и 28 дней.

Для оценки внутривидовой изменчивости видов лейшманий на при мере L.major и L.gerbilli сравнили рост свежевыделенных и длительно культивируемых штаммов в стандартных условиях, а также при изменении условий и приемов культивирования. Рост клоповых и штаммовых культур сравнивали на примере L.turanica.

искусственную смесь двух видов в соотношении 1:1. Характер роста смеси регистрировали в течении 5 пассажей. Для определения качественного состава смеси проводили клонирование, начиная со второго пассажа. Клонирование осуществляли с помощью микроманипулятора Фонбрюна, по методике, разработанной Алексеевым А.Н. и Сафьяновой В.М. (Алексеев, Сафьянсва, 1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Сравнение роста Ь.тарг, ЬЛигашеа и Ь^егЫШ на среде NNN в стандартных условиях.

Исследования показали, что при культивировании в стандартных условиях удельная скорость роста и скорость размножения ЬЛигашса выше, чем [..та^г, а Ь.тззог выше, чем Ь^егЬЦП (табл.1). Разница была статистически достоверна.

Тлблииа I

Характеристики роста трех пилон лейшманин о стандартных условиях (Срсла - NNN, агар - Ditto, жидкая фаза - среда Г>9, 2 ГС, возраст инокулята - 7 - дней, число клеток в «по кул яте - 500 гыс.)

Виды Штамм Число опытов П v1 л ж и тельяоеть ф.пм. чаем У,-,-льни скорость роста*, Олрость размножения**

лагфти эхепонгнц. t чае

Lturanica KD - 51 25 <24 134 4 0,033 7.5

L. major Neal-P 5 28.Я 129.6 7 6

Tog, Khair 10 <а4 177.6 0.024 6.3

L. gerbilii Getbiili 8 <24 I3W 0,026 6.2

KD-555, V1NR-6 7 <24 134.4 0,024 5.7

Ошибка колебалась от 0 0002 до 0.001 час"1 ** Ошибка колебалась от 0.5 до 1.5

Сравнение скорости морфогенеза культур L.majnr и L.turanica.

Промастиготы лейшманий при культивировании на питательных средах проходят ряд последовательно сменяющихся морфологических форм начиная с коротких, темных, сильно базофильньгх промастигот, которые затем замещаются удлиненными просветляющимися, сигарообразными светлыми и в конце концов - метациклическими (т.е. светлыми, мелкими и заостренными с обоих концов клетками) формами (Калинникова, Савина, Сафьяноаа, 1987).

Сравнение скорости морфогенеза у клонов Lmajnr и L.turanica на протяжении пассажа - с 7 по 29 лень, показывает, что для клонов L.turanica характерна более быстрая смена морфологических форм. Эти данные продтвердились и при сравнении большого числа ¡стонов и штаммов на 7-й день культивирования. Доля мета циклических промастигот у Lturanica достигала 80-90 %, тогда как у L.major на 7-й день доля мета циклических форм

обычно не превышала нескольких процентов и основная масса лромастигот была представлена темными и просветляющимися формами, т.е. начальными клетками морфогенеза. Из 11 культур Lmajor только низковнрулентные штамм Pod и клон 3498' отличались более высоким содержанием метациклических промастигот к 7 дню - до 30%.

Влияние на рост L. major, L.turanica и L.gerbilli условий и приемов культивирования.

Анализ влияния величины зассвной дозы на рост лейшманий показал (табл.2), что удельная скорость роста не зависит от этого фактора -

Таблица 2

Характеристики роста трех видов лейшманий, влияние марки агара и засевной

дозы

(Среда - NNN, жидкая фаза - среда 199, 24°С, возраст инокулята - 7 дней)

Марка Число Продолжительность Удельная Скорое!

Виды агара клеток в Число фазы, часы скорость раэмнож!

инохуляте, опытов роста*. ния**

тыс. лагфазы экспоненц час"1

L~ tur&mca DifVo 500 (0 <24 156 0,033 7,5

Oxoid 500 4 <24 156 0.033 6,8

50 3 43 216 0,033 9,9

Sigma 500 2 <24 96 0.043 6,1

250 2 <24 96 0,043 6,2

50 2 ' <24 144 0,043 8,2

МБП— 500 2 <24 120 0,045 4,9

250 2 " <24 144 0,045 7,8

50 2 <24 144 0.045 7,9

L. major Difco 500 3 28,8 144 0,032 7,6

250 2 <24 144 0.032 3,3

Oxoid 250 4 <24 120 0,032 5,6

50 3 48 168 0,032 6,6

Sigma 250 7 33,6 132 0,032 6,1

МБП'*' 500 2 144 120 0,026 5,2

250 4 <24 144 0,026 8,0

L. serbUli Difco 500 5 <24 144 0,026 6,2

250 3 <24 144 0,026 5,1

О ко id 250 3 <24 120 0,030 5,4

50 5 24 168 0,030 5.5

Si.ema 250 6 <24 156 0,027 5.7

МБП- 250 5 <24 156 0,025 5,1

* Ошибка колебалась от 0.001 до 0.0005 час"'

•• Ошибка колебалась от 0.2 до 1.2

*** Медбиопром, Россия

коэффишюнт корреляции 0.01 при критическом значении П. 16 при 5% ошибке. Скорость размножения тем выше, чем меньше часетшяя до<а (зто наблюдается в 75% случаев).

Диализ шшчштч^мпсратуры на рост^ейшмлний (табл.3) показал.

что все три вида способны размножаться ¡и у'пго в диапазоне температур от 20'Г

до 28'С. При зтом только при 24 С большая часть гтромастигот соответствуют

н

норме по размеру, форме и подважбетн. При 20'С клетки м.гтоподвижны, а при 28'С регистрировалось большое количество раздутых клеток. При 24'и 28'С удельная скорость роста п скорость размножения ЬШгашса была, как правило выше, чем Ь.таЗог, а Ь.та;ог выше, чем ЬдогЫШ. При 20'С Ь.та]ог, имела преимущество перед остальными вилами, а при 28'С свежевыделенные штаммы Ь^егЫШ значительно превосходили по значению удельной скорости роста как Ь.та]ог, так и ЬДигашса.

ТаблишЗ

Характеристики роста трех вило» лейшманий при разных температурах (Среда - ^,NN, агар - Э^со, жидкая Фаза - среда 199, возраст инокулята - 7 дней, число клеток п инокуляте - 500 тыс.)

Пр>лолжитслькосп Удельная Скорость

Виды Штамм Темпера Число фазы, часы с пор* ч:гь размноже-

-тура С опытом роста*. ния**

л;ифаз ы экспонекц. лас'1

1..шгап1с;» КО - 51 20 7 <24 124.8 0.022 3,6

24 25 <24 134.4 0,033 7.5

28 7 <24 144 О.ОЗЗ 4,7

Ь. тлрг 20 5 21 15* ' ОЛИ 4,9

24 5 129.6 0,032 7,6

28 7 <24 144 0.031 4,4

Ров, 20 10 24 177.6 0.025 4,4

К1шг 24 10 <24 177.6 0,024 6,3

28 6 <24 120 0,027 4,7

Ь. ОегЬП]! 20 6 '24 156 0,020 2,7

аегыш

24 8 <24 139 2 0,026 6,2

28 7 <24 199.2 0,023 4,1

КО-555, 20 11 40.8 91.2 0,020 2,9

\lNR-6 24 7 <24 134.4 0,024 5,7

28 5 24 88.8 0,035 V

Ошибка колебалась от 0.0002 до 0.001 час"' Ошибка колебалась от 0.5 до 1.5

При изменении температуры удельная скорость роста у Ь.£егЫШ изменялась на 23%, у Ьдигашса - на 25%, а у Ь.пг^'ог - на.5%. Скорость размножения Нигашса при изменении температуры изменялась на 42%, ЬдегЫШ -на 41%, а 1..пц)ог на 29%.

При изменении жидкой фазы (табл.4) оказалось, что в большинстве случаев удельная скорость роста и скорость размножения у Ь.Шгатса больше, чем у Ьпг^ог, а у Ь.тарг больше, чем у Ь^егЫШ. При использовании коммерческой среды 199 в качестве жидкой фазы рост лейшманий был более активный, чем при использовании 10% гемолизированной кроличьей крови. Только у штаммов 1_£сгЫШ использование 10% гемолизированной кроличьей крови приводило к

Таблица 4

Характеристики роста трех видов лейшманий при использовании в качестве жидкой фазы сред 199 и 10% гемолизированной кроличьей крови Среда - КМЫ, агар - 01П;о, 24°С, число клеток в инокуляте - 500 тыс.)

Вид Штамм Возраст Среда Число Продолжитель- Удельная Скорость

иноку- опытов ность фазы, схорость размно-

лята часы роста*. жения"

лаг экспоиенц. час"1

[лигапкэ КО-51 7 199 25 <24 134.4 0.033 7.5

10% ГК 12 <24 132 0.032 4.8

28 199 14 <24 153.6 0.032 7.0

10% ГК 8 26.4 187.2 0.018 3.8

ита^ог ИЫР 7 199 5 28.8 129.6 0.032 7.6

¡0% ГК 8 <24 120 0.022 3.0

28 199 5 <24 120 0.030 5.3

10% ГК 5 81.6 108 0.026 4.9

Ров 7 199 5 <24 177.6 0.024 6.3

10% ГК 8 <24 168 0.025 5.6

N3* 28 199 12 <24 151.2 0.026 5.7

10% ГК 9 <24 175.1 0.020 4.2

1_£егЫШ ЕегЬЦИ 7 199 9 <24 139.2 0.026 6.2

10% ГК 5 <24 144 0.024 4.6

28 199 5 <24 96 0.024 4.2

10% ГК 5 <24 132 0.017 2.9

КО-555 7 199 9 <24 134.4 0.024 5.7

\lNR-6 10% ГК 5 <24 148.8 0.027 4.4

28 199 5 <24 144 0.018 4.9

10% ГК 6 26.4 180 0.011 2.7

* Ошибка колебалась от 0.001 до 0.0005 час'1

** Ошибка холсбалась от 0.2 до 1.2

»сличению удельной скорости роста. Наибольшая вариабельность удельной корости роста была у Lgerbilli (26%), наименьшая - у Lniajor (17%), L.turanica анимала промежуточное положение (24%); скорость размножения при изменении сидкой фазы среды у L major изменялась на 35%, у L.turanica - на 41%, Lgerbilli -

Измеяе1Ш?_мавк)1_ агара (табл.2) подтвердило подученные прежде данные - удельная скорость роста и скорость размножения L.turanica были выше у L.major, а у L.major выше, чем у L.gerbilli независимо от марки используемого агара. Вариабельность значений удельной скорости роста составляла у L.turanica 17%, у L.major 15%, а у Lgerbilli 11%. Скорость размножения L.turanica при изменении марки агара изменялись на 15 % , L.major на - 41%, а Lgerbilli - на 7%.

При изменении возраста инокулятз (табл.5) удельная скорость оста у L.turanica была несколько выше, чем у двух других видов. Скорость азмножения у L.turanica была больше, чем у L.major, а у L.major больше, чем у ..gerbilli. Возраст инокулята практически не влияет на удельную скорость роста, L.turanica - вариабельность этого показателя составляет веет 2%, у L.major онс\ оставляет 4%, а у Lgerbilli 19%. Скорость размножения изменялась у L.turanica :а 16%, у L.major на 25%, и у Lgerbilli на 26%.

Внутривидовая изменчивость лейшманнй при их культивировании на искусственных питателг пых средах.

-аммов L.major и L.gerbilli проводили, сравнивая рост у L.major -гжевыделенных штаммов Pog и Khaii, и длительно культивируемого штамма Neal у L.gerbilli - свежевыделеннмх штаммов MNR-6 и KD-555 и длительно льтивируемого штамма gerbilli.

Результаты опытов показали, что удельная скорость роста длительно льтивируемых штаммов обычно выше, чем свежсвыделенных - у Lmajor на24%, ' Lgeibilli на 3%. Скорость размножения у длительно культивируемых штаммов

Таблица 5

Характеристики роста трех видов лейшманий при разных возрастах инокулята (Среда - NN1^, згар - Э^со, жидкая фаза - среда 199, 24°С, число клеток в инокуляте - 500 тыс.)

Продолжительность фазы. Удельная Ско

Виды Штамм Возраст Число часы скорость раэм;

ииокулята опытов роста*, -HI

лагфаэц экспонекц. час'1

L. turaúca KD-5I 7 25 <24 134.4 0.033 7

14 7 <24 120 0.032 5

21 6 <24 108 0.032 5

28 14 <24 153.6 0.032 7

L májor Neal P 7 5 28,8 129.6 0.032 7

14 6 <24 108 0.032 5

21 7 <24 88.8 0.032 4

28 5 <24 120 0.030 5

Pog-, 7 5 <24 177.6 0.024 6

Kliair 14 7 <24 129.6 0.024 4

21 5 <24 91.2 0 022 3

28 12 <24 151.2 0.026 5

L, gerbüli GeibiUi 7 9 <24 139.2 0.026 6

14 6 <24 96 0.030 3

21 5 <24 105.6 0.023 3

28 5 <24 56 0.028 4

KD-555, 7 9 <24 134.4 0.024 5

MNR-6 14 6 <24 108 0.029 4

21 8 <24 120 0.029 4

28 5 <24 144 0.018 4

■ ■ * ■ I

* Ошибка колебаласьот 0.0005 до 0.002 час' ,

** Ошибка колебалась от 0.5 до 1.5

Ь.т^ог была выше, чем у свежевыделенных, на 5%, а у Ь^егЫШ скорость размножения длительно культивируемых штаммов была ниже на 3%.

Однако, преимущество в росте Ь.та^г перед Ь.зегЫШ сохранялось -удельная скорость роста и скорость размножения у Ь.тарг были выше на 20% и 12% соответственно. Также сохранилась меньшая зависимость показателей роста Ь.тарг по сравнению с Ъ^егЫШ от условий и приемов культивирования.

Сравнение роста разных по вирулентности штаммов Ь.тарг. Из трех исследованных видов только Ь-пцрг способна заражать человека, однако известно, что штаммы этого вида теряют вирулентность при длительном культивировании на искусственных питательных средах (Белова , 1962;

КоиГтапп с1 а1., 1978; МсСагТЬу-Витке е! а1. 1991). Для тою, чтобы изучить динамику изменения характеристик роста и ее шаимоенчзь с ннрулентностью у штаммов 1..та)ог при длительном хульппшроюнни на искусственных питательных средах мы сравнили в стандарты! ix условиях культивирования"рост высоковируленгного штамма Рор и низковируленпюго субиттаммл PogI (вирулентность которою мы искусственно сни ¡или. культивируя его в течении 7-10 пассажей), а также авнрулентного штамма N631 Р (1абл.6).

Максимальные значения удельной скорости роста были у авирулешного штамма N£31 Р, минимальные - у сысоковирулентного штат« Pog, субштамм Pogl занимал промежуточное положение. Скорость размножения была максимальна у штамма №а1 Р, минимальна у Рой1, Pog занимал промежуточное положение. Вариабельность удельной скорости роста Мса1 Р составляла 3%, PogI - 15%, - 5%.

Таблица 6

Характеристики роста разных по янруленгжи'пг штаммов Ьта^г (Среда NN1^1, твердая фаза - агар ГЖсо, жидкая фта - срсла 199;24 С. возраст

пнокулята- 7 дней)

HJla мм j РоВ* Род- Ne.il Р

Вирулентность | высокая ничкам авирчлентен

Число опытов 1 5 10 5

Лагфаза, часы <24 <24 28.8

Фата экспон.роста, часы 177/) 132 129.6

Удельная скорость роста, час"1 0,024 0,027 0,032

Скорость размножения 6,3 4,6 7,6

* 1-3 пассаж ** 7 - 10 пассаж

Сравнение характеристик роста штаммопых и клоповых культур Нигашса проводили, сравнивая рост: 5 клонов, выделенных непосредственно

перед экспериментами, длительно культивируемого клона 3720, а также штамма КО-51 (табл.7).

Полученные результаты показали, что средние значения удельной скорости роста клоновых и шгаммовых культур одинаковы, а скорость размножения штамма на 21% выше, чем у клонов. Исключение составляет длительно культивируемый клон 3720, скорость размножения которого такая же, как и штаммой культуры. Разброс значений удельной скорости роста в разных опытах у всех клоновых культур был больше, чем у штамма - 9% и 4% соответственно, у одного клона разброс значений этого показателя - 2%. Вариабельность значений скорости размножения клоновых культур, исключая клон 3720, меньше, чем у иггаммовой культуры -3% и 15% соответственно.

Таблица7

Характеристики роста клоновых и штаммовой культур Ье^таша Шгашса

Ш гамм/клон Число опытов Продолжительность фазы, часы Удельная скорость роста*, час"' Скорость размножения**

лаг экспоненц.

Штамм КД-51 7 <24 153.6 0.033 7.5

Клон 3720 4 <24 168 О.ОЗЗ 7.7

Клон 8621 о <24 120 ' 0.033 5.6

Кчон 8625 3 <24 120 0.032 5.6

Клон 8630 3 <24 * 120 О.ОЗЗ 5.6

Клон 8633 3 <24 120 0.032 5.6

Клон 8636 3 <24 120 О.ОЗЗ 5.6

* Ошибка колебалась от 0.002 ч"до 0.0005 ч' ** Ошибка колебалась от 0.2 до 1.5

Характеристики роста и изменение клопового состава смеси итаммов L.major и L.turanica.

Для приготовления счсссН исполыовали сне.леныделенные игтаммы: ..major - PogH L.turanica - KD-51 (табл.8). Оиьпи мок пали, что удельная корость роста и скорость разложения смеси пшгылись от этих юказателей у монокультур L.majorn L.turanica, и только на пятом пассаже

Таблица X

Характеристики роста смеси Leislimania major и L.turanica (Среда - NNN, агар - Difco, 24с'С, число клеток в инокуляте - 500 тыс.)

Продолжитель- Удельная Скорость

Смесь 1:1 Возраст Пас- Число ность фазы, скорость размноже -

иноку- саж опытов часы роста, ния

дята

лаг экспонен. час"1

I., major ( Pog) + 7 1 5 24 168 0.028 6,7

.. turanica (KD-51) 2 5 <24 144 0.022 4,5

ЖИЛКПЧ ф.ЯТЛ 10% 3 5 <24 151.2 (1.018 3,9

гсмчли Н1|К1Нан- 4 5 24 144 0,025 5,2

If.nl KpOIib 5 5 24 120 0,032 6,5

L. major ( Pog) + 7 1 .5 24 120 0.031 5,3

.. tuianica (KD-51) 2 5 24 ¡44 0.028 5,9

жидкая фаза 3 5 <24 168 0,019 4.5

:реда199 •1 5 <24 144 и,Ч2Ч 3.7

5 5 <24 144 0.03! 3,5

L. major ( Pog) + 19 I 5 <24 120 0,037 6,4

.. turanica (KD-51) 2 5 <24 168 0,030 6,3

жидкая фаза 3 5 <24 156 0,028 6,9

:реда199 5 <24 144 0.029 6,1

5 5 <24 120 0.031 5,3

Контр<> 1Ь

Жидкая фаза 10% гемолизированная кроличья кровь

L. major 7 8 <24 168 0.025 5.6

28 9 <24 175.2 0.020 4.2

L. turanica 7 12 <24 132 0.032 .4.8

28 X 26.4 187.2 0 018 3.S

Жидкая фата Сркиа I 99

L. major 7 5 <24 177.6 0.024 6.3

19 5 <24 168 0.025 3.7

28 12 <24 151.2 0.026 5.7

L. turanica 7 25 <24 134.4 0,033 7.5

19 5 <24 144 0,031 6.4

28 14 <24 153.6 0,032 7.0

удельная скорость роста смеси стала примерно раина удельной скорости рост^онокультуры Ь.Шгашса. Значения удельной скорости роста и скорости размножения смеси ни на одном пассаже не были равны среднему значению эпос показателей для монокультур двух видов.

Клонирование смесей Ь.тарг и Ь.Шгатса показало, что из 27 полученных после первого пассажа клонов лишь один был идентифицирован как 1~тарг, т.е. Ь.та]ог был вьггеснен из смеси очень рано.

Для изучения характера взаимовлияния Ь.шарг и Нигашса стерильно отмытые промастиготы 1,.та.]0г инокулировали в среду, в которой перед этим в течении 7 дней культивировали Ыигашса (кондиционированная

Таблица9

Влияние кондиционированной среды на характеристики роста Ь.та^г и

Ьлигатса.

(Среда Ь'ИЫ, твердая фаза - агар 01Гсо, 24 С, возраст инокулята - 7

дней)

Виды, Жид- Число лаг фаза. экспоненци Удельная Скорость

ишмми кая экспери часы альная ^ скорость размноже

фаза -ментов фала, часы роста -ния

жидкая фаза -среда 199

и Шгагнсл 1* 25 <24 134.4 0,033 7,5

К1>-51 И"' 5 <24 96 0,033 4,5

III--- 6 <24 96 0,026 3,7

L. пкуог I* 10 <24 177.6 0,024 6,3

Рс« 11" 6 <24 96 0,024 3,5

ш— 6 <24 103.2 0,029 5,0

жидкая фаза - 10% гемолизированная кровь

Шгашса I* 12 <24 132 0,032 4,8

КО-51 111— 5 <24 120 0,025 2,0

Ь. тл)ог 1* 8 <24 . 175.2 0,025 5,6

Роя III— 5 24 72 0,028 3,0

• Контроль;

" Культ1шир0вание промастигот лейшманий в среде,в которой перед этим I течении 7-ми дней размножались промастиготы того же вида-

*** Культивирование промастигот лейшманий в среде,в которой перед этим в течении 7-ми дней размножались промастиготы дру! от вида

среда), и наоборот промастиготы Lluranica циркулировали" в среду, кондиционированную [..major. В контроле промастпготы инокулнровали в среду, в которой перед этим размножались промастиготы того же вида. В ряде опытов полученную кондиционированную питательную среду перед использованием в опыте фильтровали чере? филыр с диаметром пор 0 22 мкм (табл.9).

Оказалось, что рост L.turanica в среде, кчндициониромнной L.major ингибируется- удельная скорость роста и скорость размножения L.turanica снижалась, а рост L.major в среде, кондиционированной L.turanica, наоборот усиливается. Этот феномен наблюдался при использовании любого типа кондиционированной среды, в том числе и фильтрованной.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Сра в] те ни[е_био дохл 'ie с ких.с вой ctb_L л) ai^^L.turanica и L-isik^iJnjiLro.

При сравнении роста на питательной среде 3-х видов лейшманий мы использовали показатель "удельная скорость роста", который характеризует скорость увеличения численности популяции в данных условиях и позволяет оценить эффективность функционирования физиологических ретуляторных механизмов вида (Варфоломеев, Калюжный, 1990) и показатель "скорость размножения", который характеризует эффективность использования клетками имеющихся в питательной среде ресурсов (Фрешни, 19S9).

Практически во всех проведенных опытах удельная скорость роста и скорость размножения у L.turanica была больше, чем у L major, a y Lmajor больше, чем у L.gerbilli, что свидетельствует о большем потенциале размножения L.turanica по сравнению с L.major и L gerbilli и большей эффективности использования Lturanica питательных ресурсов среды. При этом наиболее чувствительным видом к изменению условий и приемов

культивирования оказался L.gerbilii, наименее чувствительным - L.majoi Lturanica занимала промежуточное положение.

Па основе полученных данных мы можем описать некоторы •свойства каждого из видов лейшманий in vitro.

• Lturanica характеризуется высоким потенциалом размножения, пр

л

изменении условий обитания происходят изменения скорости увйгчени численности популяции и эффективности использования питательны ресурсов, адаптация метаболизма клеток к новым условиям обитания, по видимому, довольно быстрая;

• L.major характеризуется невысоким потенциалом размножения, пр изменении условий культивирования скорость увеличения численност популяшм и эффективность использования пищевых ресурсов у L.majc изменяются слабо, что обусловлено, по-видимому, длительной, н эффективной перестройкой метаболизма клеток;

• Lgerbilli характеризуется низким потенциалом размножения, пр изменении условий культивирования у L.gerbilii происходят значительны изменения скорости увеличения численности популяции и эффективност использования пищевых ресурсов, адаптация метаболизма клеток к новы условиям, по-видимому, длительная и малоэффективная. Однако, пр попадании в благоприятные условия обитания скорость увеличени численности популяции у L.gerbilli может резко возрастать.

Различия в потенциале размножения трех видов лейшманий хорош коррелируют с их распространением по биотопам - наиболее широк распространенным видом в популяциях большой песчанки являете Lturanica, a L.major и L.gerbilii распространены локально, в строг определенных условиях (Елисеев с соавт., 1991; Стрелкова с соавт., 1993). Наш результаты показали, что наибольшими потенциалом размножения способностью выживать в различных условиях in vitro характеризуется имени ' Lturanica, а у Lmajor и Lgerbilli потенциал размножения ниже, что ставу некоторые ограничения для способности этих видов успешно выживать различных условиях in vitro.

В пределах срсянеази.неких очагов ЗКЛ эпизоотии, вызываемые L.major, всегда протекают на фоне иш юогии, вызываемых I turanica. Имеются доказательства того, что шнпищни, iji.i и.таемые 2-мя пилами лен'.пманий, плияют друг на друга (Елисеев с сианг., 1901).

Проведенная серия опытов гю изучению симпатрин 1 major и L.turanica in vitro докатала, что L.turanica количественно преобладает в смеси уже после 1-го пассажа. Специальные эксперименты ik- культивированию L.major и L.turanica п кондиционированной среде позволяют предположить, что причины увеличения поли L turanica после первого пассата заключаются не только и том, что L.turanica имеет преимущество в росте по сравнению с L.major. Видимо, L.turanica выделяет в питательную среду фактор который приводит к резкому ускорению развития культуры L.major и, следовательно, более быстрому ее старению. Из-за этого лишь небольшое количество клеток может сохраниться в смеси более 4 недель. Влияние L.major на L.turanica приводит к снижению скорости рачвития культуры этого вила, что позволяет ей сохраниться в среде более продолжительное время.

Жизненный цикл леишманип включает п себя обязательною смену хозяев - млекопитающее- москит. При смене сред обитания (млекошпаюшее-москит, млекопитающее-питательная среда) у лейшчаний происходит трансформация амаечнгот в промастиготы, это наиболее уязвимый период в жизненном цикле паразита. Известно, что в это время происходит о!мнранис большого числа клеток паразита (Laison , Shaw, 1988) Сохранившаяся, наиболее приспособленная час!Ь микропонуляции, предпччтяет co6<ni набор клонов, каждый из которых может характеризоваться индивидуальными свойствами (патогенность, антигенные свойства и т.д.) (Емельянова, 1988; Келлина с соавт., 19.1!1). Наши данные о высокой вариабельности у ¡ельной скорости роста н скорости размножения клоповых культур Lturanica также свидетельствуют о разнообразии свойств клонов. Меньший разброс значений этих показателей у штаммовой культуры определяется,видимо, нивелированием межклоновых различий при их совместном размножении за счет взаимовлияния клонов друг на друга или кондиционирования ими питательной среды.

В ходе культивирования штаммов лейшманий адаптация более приспособленных к существованию на питательной среде клонов продолжается. Одним из показателей этого процесса служат установленный нами более высокий потенциал размножения длительно культивируемых штаммов и клонов, по сравнению со свежевыделенными.

Регламент культивирования Ь.тарг, ЬЛигаш'са к Ь.&сгЫШ,

Полученные в работе данные позволяют оценить возможности размножения каждого из видов на искусственных питательных средах и подобрать оптимальные условия как для культивирования каждого из видов, так и для культивирования всех трех видов для наращивания биомассы или длительного поддержания штаммов.

1_.та]ог имеет не высокие значения и удельной скорости роста (среднее значение - 0.02840.004 ч*') и скорости размножения (среднее значение - 5.011.0). Наибольшее влияние на рост промастигот Ь.птарг оказывает смена жидкой фазы среды - при этом удельная скорость роста и скорость размножения изменяются на 4-31% и 33-60% соответственно, наименьшее -температура, при этом удельная скорость роста и скорость размножения изменяются на 3-11 % и 30-42%.

Анализ роста штаммов Ь.Шгашса показал, что этот вид имеет высокие значения и удельной скорости роста (среднее значение - 0.03210.0045 ч') и скорости размножения (среднее значение - 5.3*1.3). Наибольшее влияние на рост промастигот Ьлигатса оказывает жидкая фаза среда, при этом удельная скорость роста и скорость размножения изменяются на 44% и 46%, наименьшее - возраст инокулята, удельная скорость роста при его изменении изменяется только на 3%,-а скорость размножения - на 31%.

Ь^егЫШ' имеет относительно низкую скорость увеличения численности популяции (среднее значение удельной скорости роста - 0.0244 0.005 ч"*) и плотность промастигот в среде (среднее значение скорости размножения - 4.4* I. Г). Наибольшее влияние на рост промастигот Ь^егЫШ оказывает температура культивирования - при этом ее удельная скорость роста

и скорость размножения изменяются на 23-43% и 49-56% соответственно, наименьшее - жилкая фаты среды, при ее тменении показатели роста изменяются изменяются - lia Х-19% и 23-44% соответственно.

Основной задачей при дтительном поддержании штаммов лейшманий является увеличение времени сохранения жизнеспособности промастигот в культуре. Очевидно, что для rroro необходимо спи шть скорость развития культур и полобрать компоненты среды и ус.'в чшя, позволяющие промастиготам наиболее полно использовать питательные ресурсы среды.

Для всех трех видов этим условиям наиболее удовлетворяют:

• среда - твердая фаза Difco blood agarbase, жидкая фаза 10% гемолизированая кроличья кровь,

• возраст инокулята - 28 дней,

• температура культивирования - 24'С,

• засевная доза - 500 тыс. промастигот в 1 мл жидкой фазы среды, но не менее 50 тыс.

• пассажи рекомендуется делать 1 раз п 4 недели

При наращивании биомассы лейшманий основной задачей является получение высокой численности клеток на фазе стационарного роста в течении как можно короткого времени. Для этого необходимо, чтобы удельная скорость роста и скорость размножения культур были максимальны.

Для всех грех видов этим условиям наиболее удовлетворяют:

• среда - твердая фаза Sigma bacteriological agar, жилкая фаза среда 199,

• возраст инокулята - 14 дней,

• температура культивирования - 24'С,

« засевная доза - 500 тыс. промастигот в 1 мл жидкой фазы среды, но не менее 250 тыс.

Выявленные видоспецифические особенности размножения каждого из видов позволяют нам предложить следующие дифференцированные регламенты культивирования:

Lmajor среда - твердая фаза Sigma bacteriological agar, жидкая фаза - среда 199, возраст инокулята - 7 дней, температура культивирования -20-22'С, эасевная доза - 500 тыс. промастигот в I мл жидкой фазы среды.

Lturanica: среда - твердая фаза Sigma bacteriological agar, жидкая фаза - среда 199, возраст инокулята - 7 дней, температура культивирования -24'С, засевная доза - 500 тыс. промастигот в 1 мл жидкой фазы среды.

L.gerbilli: среда - твердая фаза Oxoid bacteriological agar, жидкая фаза -10% гемолизированая кроличья кровь, возраст инокулята - 14 дней, температура культивирования - 26 - 28'С, засевная доза - 500 тыс. промастиго! в ! мл жидкой фазы среды.

Анализ качественного состава смеси при ее культивировании на искусственных питательных средах показал, что сохранить в ней промаститоты Lmajor в течении сколько-нибудь длительного времени не представляется возможным. В связи с этим рекомендуется производить хриопрезервацию изолятов в течении первых 7-10 дней культивирования или фиксировать их 70%спиртом для дальнейшей идентификации методом полимеразной цепной реакции.

Выводы.

1. Три вида лейшманий: Ь.пг^'ог, ЬДигашса и Ь^егЫШ имеют четкие видовые различия при 1« культивировании на искусственных питательных средах.

2. При размножении на среде МЫЫ удельная скорость роста и скорость размножения максимальна у Ьдигашса, минимальна у Ь^егЫШ, Ьгг^ог занимает промежуточное положение. Это преимущество ЬДигашса, как правило, сохраняет и при изменении условий и приемов культивирования -температуры, возрзста инокулята, жидкой фазы среды и марки агара. Изменение вышеперечисленных факторов оказывает наибольшее влияние на

>ост L.geitiilli, наименьшее на рост L.major, L.turanica занимает промежуточное толожение.

3. Скорость морфогенез штаммоных и клоповых культур L.turanica тыше, чем L.major.

4. Спойства и характеристики L.major, L.turanica и L.gerbilli при их размножении на искусственных питательных средах:

• L.major характеризуется невысоким потенция том размножения, 'гго :тавит некоторые ограничения при культивировании этою видя и для его распространения в различных условиях в природе. Адаптация к новым условиям цлительная, при этом скорость увеличения численности популяции у L.major изменяются слабо, что обусловлено, по-видимому, высокой эффективностью перестройки метаболизма клеток;

• L.turanica характеризуется высоким потенциалом размножения, что позволяет ей выживать в различных условиям in vitro и к природе. Адаптации к новым условиям быстрая, при этом происходят изменения скорости увеличения численности популяции, адаптация метаболизма клеток к новым условиям обитания, по-видимому, допольио эффективная;

• L.gerbilli характеризуется низким потенциалом размножения, что ограничивает возможность ее успешного культивирования и размножения в различных условиях а природе. Адаптации к новым условиям у L gerbilli длительная, при этом происходят значительные шмепения увеличения численности пепуляцш», адаптация метаболизма клеток к новым условиям, по-видимому, малоэффективная, однако при попадании п благоприятные условия скорость увеличения численности популяции у L.gcrbiili рез<о возрастает.

5. При культивировании на искусственных питательных средах смеси L.major и L.turanica, клоны L.turanica имеют преимущество перед клонами L.major.

6. На основе полученных данных раз работаны общие приемы и дифференцированный регламент культивирования L.major, Lturanica и L.gerbilli для длительного поддержания штаммов и наращивания биомассы, а

также рекомендации для сохранения в изолятах из очагов, в которых возможно присутствие L.major и L.turanica, обоих видов паразитов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано б работ.

1. Сысоев В.В. Сравнение роста Lmajor, Lturanica и Lgerbilli на среде NNN.// Мед. паразитол. - 1994. - N1. - C.I4-18.

2. Сысоев В.В. Влияние температуры на рост промастигот лейшманий разных видов.// Мед. паразитол. - 1994. - N2. - С. 13-17.

З.Стрелкова М.В., Булат С.А., Сысоев В.В.// Идентификация маркерных штаммов Leishmania major, L.turanica , Lgerbilli методом палимеразной цепной реакции с универсальными праймерами.// Мед. паразитол. - 1992. - N1. - С.21-22.

4.Стрелкова М.В., Елисеев Л.Н., Понировский E.H., ЕрохинП.И., Ракицкая ТА, Валев1п Т.А., Сысоев В.В., Алленов В.А., Адамишина Т.А., Дергачева Т.И. Изознзимная идентификация изолятов лейшманий, выделенных от большой песчанки, москитов и больных людей в очагах зоонозного кожного лейшманиоза в Туркмении»// Мед. паразитол. - 1993 - N5. - С.34-37.

5.Sysoev V.V. Leishmania promastigotes growth on the NNN medium.// VIII International Congress of Parasitology., Ismir-Turkey, 1994, p.415.

6. Sysoev V.V., Mertsalov I.B. Interaction between Lmajor and L.turanica promastigotes in vitro.//I I European Congress of Protistology and VIII European Conference on Ciliate Biology., Clermont-Ferrant - France, 1995, p.85.

Внедрение . Материалы диссертации используются в научно исследовательской работе в Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского МЗРФ (акт об использовании от 20 марта 1996 г.) Они могут быть использованы при культивировании лейшманий в ряде других научных учреждений, занимающихся этой проблемой. Методические принципы изложены в приведенных выше публикациях по теме диссертации.