Бесклеточная система трансляции на основе представителя трипаносоматид Leishmania tarentolae. Создание оптимальной матрицы для трансляции in vitro

Муреев, Сергей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бесклеточная система трансляции на основе представителя трипаносоматид Leishmania tarentolae. Создание оптимальной матрицы для трансляции in vitro
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Бесклеточная система трансляции на основе представителя трипаносоматид Leishmania tarentolae. Создание оптимальной матрицы для трансляции in vitro"

На правах рукописи

МУРЕЕВ Сергей Владимирович

Бесклеточная система трансляции на основе представителя трипаносоматид Leishmania tarentolae. Создание оптимальной матрицы для трансляции in vitro.

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

uudüBG773

003060773

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им М В Ломоносова, г Москва и на базе Института молекулярной физиологии им Макса-Планка (Дортмунд, Германия, руководитель группы Александров А Е)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

доктор биологических наук, профессор

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биохимии им АН Баха РАН

Защита состоится «31» мая 2007 года в 10 ч на заседании диссертационного совета Д 501 001 76 при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им А H Белозерского, ауд 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им MB Ломоносова

Автореферат разослаапреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

Колесников Александр Александрович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ.

доктор биологических наук, профессор

Колб Вячеслав Адамович

кандидат биологических наук

Кульбачинский Андрей Владимирович

доктор биологических наук

H О. Калинина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

С завершением многочисленных проектов по секвенированию геномов разных организмов, изучение генной-экспрессии выходит на новый уровень структурно-функциональной характеристики кодируемых геномом белков В силу огромного набора открытых рамок считывания, обнаруженных в процессе секвенировния, прогресс в анализе соответствующих полипептидов напрямую зависит от их высокоэффективной наработки в достаточном количестве для структурного и функционального анализа

В настоящее время используются три основные стратегии получения белков для исследований химический синтез, in vivo экспрессия и m vitro экспрессия

Химический синтез не применим для синтеза длинных полипептидов Несмотря на более чем тридцатилетнюю историю, универсальная система экспрессии эукариотических белков так и не была разработана Технические ограничения связанные с необходимостью быстрой и продуктивной наработки белков для анализа вынудили исследователей вернуться к наиболее эффективной системе на основе Е coli, однако лишь 15% эукариотических белков могли быть проэкспрессированы в своей функционально-активной форме

Эукариотические системы экспрессии ш vivo основанные на культуре клеток млекопитающих, насекомых, трансгенных растениях и животных имеют значительные ограничения дороговизна, трудоемкость Дешевая и относительно гибкая система на основе Saccharomyces cerevisiae характеризуется относительно низким выходом и отсутствием желаемого типа пост-трансляционных модификаций Использование других дрожжевых представителей (l'ichia postons) наталкивается на препятствия связанные с активацией системы отрицательной обратной связи при гиперпродукции белка При создании новой эукариотической системы разумным могла бы быть замена РНК-полимеразы II менее контролируемыми и более эффективными односубъединичными фаговыми полимеразами Т7, SP6 и т д Однако в данном случае проблематичным представляется кэпирование РНК, так как фаговые полимеразы не обладают свойством сопряжения транскрипции и процессинга (Moteki, S 2002)

Бесклеточные системы дают возможность работать с широким спектром РНК-матриц, которые лишены регуляторных модификаций Из множества прикладных

задач in vitro система позволяет экспрессировать токсичные белков, включению модифицированных аминокислот и внесению необходимых добавок для экспрессии мембранных и других труднорастворимых белков, селективному изотопному мечению Несмотря на видимую универсальность, бесклеточные системы имеют ряд ограничений а) низкая эффективность экспрессии в batch-формате по сравнению с in vivo продукцией, b) дороговизна применения высокопродуктивной проточной системы, с) отсутствие универсальных регуляторных элементов (UTRs) для трансляции любых открытых рамок считывания в любой in vitro системе

Наибольшее распространение получили системы на основе экстракта Е coh, зародышей пшеницы (WGE) и лизата ретикулоцитов кролика (RRL) благодаря максимальному отношению выгодных свойств к стоимости получения белкового продукта Под полезными свойствами понимают высокую эффйективность синтеза белков в их функционально-активной форме, отсутствие эндогенного уровня трансляции

Бесклеточная эукариотическая система трансляции на основе трипаносоматид могла бы обладать преимуществами по сравнению с вышеперечисленными системами благодаря нескольким факторам а) легкой процедуре наработки клеточной биомассы и разрушения клеток Ь) присутствию идентичной 5'-концевой последовательности стайс-лидера (SL) на всех зрелых РНК трипаносоматид, допускающей использование анти-SL олигонуклеотида для подавления фонового уровня трансляции

Цель работы состоит в ответе на следующие вопросы

- Возможно ли применение анти-SL олигонуклеотида вместо микрококковой нуклеазы для эффективного и селективного подавления эндогенной (фоновой) грансляции в клеточном экстракте L tarentolae 9

- Возможно ли повысить эффективность транс чяции, используя РНК матрицы с последовательностью 5'UTR, лишенной вторичной структуры

Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе впервые получен экстракт L tarentolae способный к трансляции гетерологичных матриц

Апробирован метод подавления эндогенного (фонового) уровня трансляции с помощью антисмыслового олигонуклеотида к последовательности сплайс-лидера

Полученные результаты позволяют приблизиться к пониманию механизмов инициации трансляции, а так же проблеме создания матриц с универсальной лидерной последовательностью функционально независящей от структуры самой РНК и обеспечивающей высокую продукцию белков как в m vivo, так и в in vitro системах разных организмов

Апробация работы

Доклад по теме диссертации был заслушан на заседании кафедры молекулярной биологии Московского государственного университета им М В Ломоносова, а так же на регулярно проводимых семинарах Института молекулярной физиологии им Макса Планка (Дортмунд, Германия) Материалы исследований, представленных в работе, были представлены на конференции британского общества паразитологов (Budweiser, Czech Republic, 2004 г ) По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы

Структура диссертации: диссертация состоит из следующих глав 1) «Введение» 2) «Обзор литературы», 3) «Материалы и методы исследований», 4) «Результаты и их обсуждение» Работа завершается выводами и списком цитируемой

литературы (_ссылка) Работу иллюстрируют _ рисунка и _ таблиц(ы)

Общий объем диссертации_страниц(ы)

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Гпава 1 Оптимизация параметров получения клеточного экстракта

Поиск наиболее щадящего метода разрушения клеток (агепМае

Разрушение клеток является одним из важнейших этапов в получении трансляционного экстракта Нарушение внутриклеточной компартментализации, как правило, сопровождается освобождением множества потенциальных трансляционных ингибиторов, нуклеаз, протеаз, а так же, активацией ряда стресс-индуцируемых киназ, что приводит к снижению эффективности или угнетению аппарата трансляции От выбора щадящего, по-отношению к органеллам, способа разрушения во-многом зависит функциональность получаемого экстракта

В данной работе в качестве критерия использовали степень целостности внешней митохондриальной мембраны, отражающей общую сохранность мембранных органелл в процессе разрушения, поскольку ее интактность достаточно легко нарушается в процессе приготовления клеточного экстракта

Для мониторинга целостности митохондриальной мембраны трипаносоматид определяли активность сукцинат цитохром с-редуктазного комплекса, локализованного во внутренней мит мембране и экспонированного в межмембранное пространство Митохондриальные фракции получали зональным центрифугированием из градиента перколла или осаждали дифференциальным центрифугированием из сахарозы Метод детекции основан на увеличении коэффициента зкстинкции (X 550нм; при восстановлении цитохрома с (цит с) сукцинатом при участии редуктазного комплекса Вывод о степени целостности внешней митохондриальной мембраны делали по отношению активности цит с -редуктазного комплекса в митохондриальном препарате к активности в том же препарате обработанном детергентом общей активностью препарата, обработанного детергентом Выраженную разницу в активности показали образцы полученные при разрушении клеток азотной кавитацией (Рис 1 1\1) Образцы градиентных фракций К, Р и ?,. так же, подвергались процедуре окрашивания кинетопластной ДНК ЭАР1 На Рис 2 представлены результаты окрашивания,

свидетельствующие о практически полной деконденеации митохондриальной ДНК н препаратах флюидайзера тогда как препараты Р и N демонстрировали содержание компактных кинетоп ластов (заметно преобладающих в N по сравнен ию с Р).

N G ■»

1 иг ÎÛ4 - а л ' □ в :

V ........ . es р 1 пи А—

3 *1 S>

Рнс. 1. Возрастание абсорбции цтп. ¿* при длине волны 550 ям и процессе восстановления в мктохондрйвльиых препаратах дифференциального центрифугирования после разрушения клсюк следующими способами: N - азотная кавигацияг Г - разрушение прессом Фрэнча, V. - с нспольз, флюидайзера, С измельчение в ступке, Р в гомогенизаторе Потгера, В - стеклянными шариками в миксере, 5 - обработка ультразвуком в 50 к 100 раундов, соотв. По оси ординат отложены относительные сд. абсорбции при 550 им.; во остпн абсцисс время общей продолжителностыо 300 с.

Рнс. 2. Флуоресцентная микроскопия образцов кинстоиласюн после окраски DA 14: К -кон i рол iiп ые образ i p.i клеткок L SarentoUïe^ стрелки большего размера указывают на окрашенное DAPI ядро, тогда как стрелки меньшего указывают на компакт ый

кинетопласт (увел.). Z. F, N окрал te ни ые DAPI Образцы,

соответствующих градиентных фракций,

На основе полученных результатов можно заключить, что метод азотной кавитации является одним из наиболее щадящих способов разрушения клеток, способствующих большей сохранности митохондриальпых мембран (Рис. 1, 2).

Гпава 2, Трансляция в экстракте L. taranioiae (LtE)

Оценка способности экстракт з L ierentoiae к эндогенной трансляционной активности и инициации трансляции на зкзоеенно-веодимой гомологичной РНК.

а) Принимая за основу процедуру, применяемую для получения экстракта зародышей пшеницы (Erickson, Bf obéi 1983), была оптимизирован« схема получения трансляционного экстракта L laremolae. Клетки L. tarmtoletû в поздней log-фазе осаждали центрифугированием, промывали, ре суспендировал и в буфере для экстракции, содержащем 250 мМ сахарозу, 45 мМ Hcpcs-KÜH pH 7.6, 10(1 мМ К'ОЛс, 3 иМ Mg(OAc)2. 5 мМ DTT и проводил« азотную кавитацию. После двух стадий последовательного центрифугирования полученный пост-чикросомальчый 30000g супернагант подвергали гель-фильтрации дяя удаления йшкомолекудафиш компонентов и стандартизации по СОЛЯМ, колонки уравновешивали буфером (см. выше) без сакардау. Фракции А5У5 > 0.5 (по Брэдфорду) объединяли, разделяли на аликвоты и хранит зашражентат. "На Рис. 3 (I) представлены результаты включения [С'1] Leu в продукты трансляции к ¿iE. Для контроля, суммарную мРНК !.. torentolae транслировали а экстракте пшеницы (WGE) „Promega" (Рис. 3 В). Обработка Li Е микрококковой нуклеазой (мН) (20 ед/мл) 20 мин при 20° С приводила к полному исчезновению эндогенного синтеза (fi /-); добавление гомологичной РНК восстанавливал» синтез лишь частично (II /т).

Ряс. 3 РадноаЕгтогряф ; С': i Leu меченвдх Приду™В трансляции в зкетракге пшеницы (А, В) и L. larentetae (ï , 11); Л - контроль: Tpausii; bmv PKK в экстракте пшеницы (wge), Ii - wge-трансияция суммарной мРНК L iwentotae\ +-/-гомологичная РНК дойавлена, либо нет в реакцию, в кол-не 1 мкг/мкл (2.5 мкг/резктщд); 1 i-pzvcjisiixs з ipAm с / turentolve (LtE), TT -траислящИ в LtE, обработанном микрококконой нук.тсазоЙ ( м i ' ) (20 гд/мл).

Ь) Так как при выбранных условиях микрококковая нуклеаза сильно снижала эффективность трансляции (Рис. 3 1( (-), П( (■)) на следующем этапе провели оптимизацию условий обработки экстракта мН. В качестве переменной величины была выбрана концентрация нуклеазы в реакционной смеси, которую нарь про вали от 0,2 ед. до 200 ед./мл экстракта (Рис. 4). Из рисунка видно, что концентрация 20 ед./мл. действительно, оказывала угнетающий эффект, тогда как. 4 ед./мл являлась, оптимальной в данных условиях.

мН Гед7ил)! 0.2 4 2!) 21)0

* РШ f: ' "" РШ "pîtïï PUR "" PUR' с

УРН . + . + Jj + - -}. -f* _ + _ + s

Ряс. 4 Радиоавтограф [С Iмеченых прод} к :-.л! трансляции о LIE, обработанном мнкрококковой куклеазой (мН) при ргхтлтьх концентрациях : ; .¡;:с . «ад фигурным к скобками); -h- Г9М0РОГПТНЗЯ ')!\ .::с либо нет, в кол-зе 0мкгЛлкл I. ' мкг/реакннн);

каждая фигурная скобка объединяет дорожки с одинаковой концентрацией PUR трансляция в экстракте обработанном пуромиашлом до гель-фидал-рацин; * - означает, что обработка экстракта м H проаодилась после тс.1! t-.-iblïJ [ Р.тра [ [И [т; WGF- - контроль: трел. i."yм млр ] ; т.; \ мРНК L. rarentohia m

wge.

На основании приведенных данных можно заключить, что экстракт L hireritolue, получаемый вышеописанным .методом, трансляционно-активея и обладает способностью к инициации трансляции на суммарной гомологичной «РНК.

Применение антисмыслового олигонукпеотида к последовательности сплайс-лидера, для подавления трансляции SL-несущих РИК

D результате тране-сплайсиига все зрелые мРНК heishmanli» содержат Идентичную 39 нт сплайс-лидерную (SL) последовательность и î'-концевом положении. Применение анти-Xi олнгонуклеашдз может обладать способностью к

потенциальному подавлению эндогенного синтеза в Zffi через блокировку 5'-конца мРНК для связывания с инициаторным комплексом трансляции

В качестве модельной системы для исследования эффективности ингибирования трансляции суммарной мРНК L tarentolae антисмысловым олигонуклеотидом к последовательности SL т vitro, был выбран экстракт зародышей пшеницы Было подобрано два олигонуклеотида различной длины, комплементарные последовательности SL 35-членный, обозначенный а&£(5_39) и 14-членный аЖ(1_14)

Для ответа на вопрос о специфичности aSL в ингибировании трансляции РНК, содержащих SL, синтетические матрицы brav и o_gfp_s (см ниже)

а£Ц5_39) мкМ 0.2 2 0 20

__А____Л.____Л__

t f \ г ^

+ + + +

Рис S Радиоавтограф [С14] Leu -меченых продуктов WGE-трансляции двух синтетических РНК (bmv & ogfps) в присутствии суммарных мРНК L tarentola и aSL, в концентрациях, приведенных над фигурными скобками, все пробы содержали 0 5 мкг bmv РНК и 1 мкг ogfps РНК, пробы, отмеченные «+», дополнительно содержали I мкг суммарной мРНК L tarentola, 0° и Н -инкубированы на льду или прогреты при 68°, соответственно

транслировали в WGE в присутствии суммарной мРНК L tarentolae и очигонуклеотида aSZ(5_39) В качестве синтетических РНК использовали РНК bromo mosaic virus (bmv) и РНК o_gfp_s, содержащую наиболее оптимальную для трансляции в WGE комбинацию 5' UTR (untranslated region) обелина и. 3' UTR, производного РНК

белка оболочки вируса сателлита вируса мозайки табака (stnv - satellite tobacco лес го sis vims).

На Рис, 5 приведены результаты экспериментов: при сравнении трансляции двух синтетических РН К в отсутствии (дорожки перца« и последняя) и присутствии суммарной м РНК (вторая дорожка). При добавлений aSi(5 39) заметно Щективное снижение интенсивности фонового маченпя соответствующие продуктов ¡суммарной мРНК, достигающее максимума при 20 мкМ олигонуклеотида (Рис, 5). Добавление aSL{ I _14) но приводило к эффективному подавлению эндогенной трансляции при аналогичных аЩ5 39} концентрациях (Рис. 7 □}. Стоит так же отметить, что <ъ5Х(5_39) ингибировал трансляцию и при О" (Рис. 5. 0°).

Трансляция гетеролозичных РНК а aSL-обработанном экстракте L ta rental а е

a) экстракт L. tarentoiae обрабатывали пЛ7,(5_39) а конце]прениях 5 и 20 мкМ. Из рис. 6 (А) следует, что добавление (15£(5_39) в концентрации 5 мк\! значительно снижает фоновую трансляцию (Рис. 6 А 1,2) и приводит к полному ее исчезновению при концентрации 20 мкМ (Рис. 6 А 1,3), Такая концентрация является избыточной По отношению к эндогенному уровню мРНШ и дополнительное добавление 0.5 мкг суммарной fa РНК не восстанавливало фоновую трансляцию до исходного уровня (Рис. б В).

b) следующим шагом проводили трансляцию гетеро логичных РНК а системе экотгскта L tarentolae, Использовали РНК o_gi'p_s (см.. выше) и fR[j!Sl_gi'p и [RES2___gfp: Появление продукта РНК o_gfp_s становится заметным лишь при трансляции в экстрактах L. iarentolae с и.Ч.-сниженным эндогенным уровнем синтеза (Рис, 7 А а, Ь, с). Количество продукта о gfp s при трансляции к WGE

А Б

12 3 12 3

Рис. 6, Радиоавтограф [C!4jT,eu -меченых продуктов трансляции в экстракте L. tarentolae и Т ¡^обработанном (I) и обработанном 5 (2) и 20 (3) мкМ п$Ц5_31)). А -эндогенный синтен. в — дополнительно внесено 0,5 мкг суммарной mPITK tarentolae.

12 ►

86>

47> >

2» 2»

abe

1 S 1 5 1 5

<-J £Ji

Лй

■Ле«

• -Г

а Ь с

1 5 1 8 i S

А# В# с#

Ы) ш во

¡Í

-'■г*1

Рис 7 Радиоавтограф [С ]Ьеи-меченых продуктов трансляции РНК (А),

1ЯЕЗ]ф (В) и р (С) в экстракте £

гагепШае, необработанном (о) обработанном 5 (6) и 20 (с) мкМ а5Х(5_39), В - включение при трансляции о_§1р_з РНК в экстракте обработанном а5£(1_14) РНК взяты в реакцию в количествах 1 и 5 мкг (указаны над дорожками), ё - независимый эксперимент с использованием экстракта с, РНК взяты в реакцию в кол-ве 5 мкг, -т - гомологичная суммарная тРНК не добавлена, wge — контрольная трансляция в экстракте пшеницы соответствующих РНК 5 мхг/реакцию \vgeH-1 мкг/реакдию)

находилось в более чем 100 кратном избытке по отношению к выходу EGFP в XíF (Рис 7 А, А#) Однако, как видно из Рис 7 (В, В#, С#) РНК, несущие IRES элементы L guycmensis (IRESÍ) и L major (IRESII), характеризовались сходным уровнем белковой продукции в обеих системах (Рис 7 В, В#, С#) Интересно отметить, что, будучи экспрессированными in vivo в клетках L tarentolae, IRESl_gfp и IRES2_gfp РНК не обеспечивали детектируемого выхода EGFP

На основе приведенных результатов можно заключить, что LtE обладает способностью инициировать трансляцию не только на гомологичной РНК, но и на гетерологичных матрицах

Использование нерадиоактивного лейцина, позволившее выровнять концентрацию Leu с остальными аминокислотами, привело к более чем 10-и кратному увеличению в количестве синтезируемого продукта по сравнению с количеством, полученным в экспериментах с радиоактивным мечением Это дало возможность для использования флуоресцентного метода EGFP-детекции (Рис 8 )

Рис, 8. прямее флуоресцентное 11ААГ сканирование продукта трансляции 2.5 мкг PI [К o_gfp_s (А) и IRES/gfp (В) НЕ и WGE 1,2- выход продукта через 40 чин а 2 ч после качала реакции.J."я количественной характеристики выхода продукта справа приведены флуороскакы того ¡кс геля содержащие образцы е&ф MJ пост но Fl коиц.

(предел: I шел (egtpVполосу) На Рис. S представлены сравнительные результаты накоплен™ catfp продукта через 40' и 2 ч Выход ÜGFP после 2 ч реакции для обоих вариантов ['НК в LtE или РНК IRESlgfp в WGF оценивался и несколько нмол на рекцию, что соответствует десяткам пмол в мл или 1-4 мкг/мл продукта. Трансляция РНК o_gfp s в WGE обеспечивала 50-500 кратное преимущество в удельном количестве продукта, выход которого соответствовал десяткам нмол уже после первых 40 мин реакции (см. Рис, 8) и достигал около 100 мкг/мл к концу реакции.

Для кинетических характеристик белкового синтеза в UY. провели оценку выхода продукта и стабильности РНК со временем. Выло показано, что РНК остается стабильной и выход продукта возрастает в течении 1 ч. Двух-часовая инкубация приводила к полной деградации !Ч 1К (данные не приведены).

Сравнение эффективностей трансляции а LtE, после обработки aSL-о.пигонунпеотидом и микрококковой нуклеазой

[Ja рис. 9 (А) представлено сравнение эффективности трансляции гетерологичной РНК и образцах /,(13, обработанного иSL и микрококковой

aSL. мН

нуклеазой, соответственно Из рис 9 (В) видно порядковое преимущество в

эффективности трансляции в экстракте LtE, обработанном 20 мкМ aSL по сравнению с экстрактом, обработанным микрококковой нуклеазой

На основе полученных результатов можно заключить, что aSL- обработанный экстракт L tarentolqe сцособен поддерживать продуктивную трансляцию гетерологичных РНК в течении 1-15 ч, обеспечивая до 01 мкг продукта на 25 мкл реакционной смеси (~ 4 мкг на мл), что в отношении IRES

содержащих РНК сравнимо с уровнем, достижимым при трансляции в экстракте зародышей пшеницы

Рис 9 Радиоавтограф [С ]Ьеи-меченых продуктов трансляции 1 мкг о^рв РНК (А), прямое флуоресцентное ПААГ сканирование продуктов трансляции 2 5 мкг РНК ЖЕЖ/гф (В) в необработанном (-/-), обработанном сйЬ (+/-) или микрококковой нуклеазой (-/+) экстракте Ь (агепШае, микрококковая нуклеаза (мН) при конц 4 ед/мл, а8Ц5_39) -20 мкМ, НК - реакционная смесь, не сод РНК, 'Й'ОЕ -трансляция в экстракте пшеницы, - 5 мкМ айЬ(5 39), **-( трансляцию проводили в постмитохондриальном супернатанте

Гпава 3 Создание оптимальных матриц для трансляции т vitro

Одним из преимуществ бесклеточной системы трасляции является возможность отхода от основных механизмов клеточного контроля с их заменой на регуляцию через концентрации субстратов Лимитирующей стадией белкового синтеза является инициация трансляции, состоящая в ассоциации сложного энзиматичеокого комплекса со своими субстратами, одним из которых выступает РНК Таким образом, любая РНК могла бы быть потенциально экспрессирована в системе т vitro вне зависимости от ее собственных свойств (напр комбинации

UTR, присутствие кэп или поли-А) при достижении оптимальной концентрации, при которой специфические механизмы регуляции будут отходить на второй план Однако данный принцип не работает в реальной т vitro системе В большинстве случаев, сочетание UTR эффективное в одной системе с данной открытой рамкой считывания (ОРС) оказывается неэффективным в другой системе или в комбинации с другой ОРС

Повышение скорости самой медленной стадии сложного процесса приводит к повышению скорости всего процесса На основе данных литературы лимитирующей стадией процесса инициации трансляции, вероятнее всего, является ассоциация сложного прединициаторного комплекса (пИК) с РНК

Точный механизм ассоциации прединициаторного комплекса (пИК) с мРНК до сих пор остается не вполне ясным Известно, что одним из факторов, лимитирующих формирование 4SS комплекса, является структура 5-UTR (Kozak, 1980, 1989) Таким образом, мы предположили, что понижая порог ассоциации пИК с РНК через изменение структуры 5'-UTR, можно повысить эффективность инициации трансляции, а, следовательно, и общий уровень белкового синтеза

Наряду с направлением по снижению порога ассоциации рибосомы с мРНК, в рамках задачи по оптимизации матрицы, так же, были проделаны шаги направленные на повышение эффективности узнавания старт-кодона путем оптимизации «контекстового» триплета перед AUG

Влияние неструктурированного 5-UTR на эффективность трансляции соответствующей РНК-матрицы

Известно, что гомополимерные уридиловые последовательности не образуют элементы вторичной структуры (ВС) (Saenger 1984, Seol 2004) В противоположность полиуридиловой последовательности, рибонуклеиновые кислоты на основе по ти-А и поли-С, обладающие внутримолекулярным стэкингом, представлены в растворе в спиральной однонитевой конформации (Saenger 1984) Использование РНК - A(UC)7UAUG(CU)ioC (Saenger 1984), содержащей старт-кодон и широко применяющейся в кинетических исследованиях в качестве модели РНК, лишенной ВС, в качестве 5' лидера затруднено вследствие вовлечения последней во ВС в составе мРНК Те же проблемы возникают при моделировании обедненных ВС 5'-лидеров некоторых вирусных РНК в составе гетерологичных

матриц и часто обуславливаются присутствием небольшого процента G,C остатков в последовательности лидера

При создании серии плазмидных конструкций, направляющих транскрипцию РНК с неструктурированным 5' - UTR («окном») мы руководствовались следующими предпосылками

a) выбором последовательности наименее склонной к формированию ВС элементов как внутри себя, так и в составе гетерологичных матриц (Рис 10 В,С)

b) окружением старт-кодона неструктурированной областью - «окно» ~ 50 и ~ 30 нуклеотидов выше и ниже AUG, соответственно (Рис 10 А), поскольку для

I II

Г г

|ntt(attm);ttaUATGtmttattt8ttttatttmatttttttatt ИШМ ATG НИ MFFIYFIFYFFI sgsgsgs MVS..

Рис 10 А -схема 5-области РНК hp/o/w, включающей альтернативный старт внутри потенциально лишенной ВС области „окна" (w) (последовательность на схеме), В - компьютерная модель hp_o_w_gip_ мРНК, прямоугольником выделен 5*-участок, увеличенный на схеме С, hp — элемент стабильной шпильки, о - 5'UTR обелина (obelm), участок кодирующий сершьглициновый спейсер (spacer), фрагмент ОРС egfp показаны прямоугольниками, альтернативные старты трансляции обозначены стрелками (I и II) и на структурной схеме обведеьы

правильного позиционирования прединициаторный комплекс нуждается в

дополнительном расплетании ~ 15 нт участка РНК ниже старг-кодона, тогда как, для 80S элонгационного комплекса ВС РНК уже не является препятствием

Для создания всех необходимых конструкций (см рис i 1) в данной серии экспериментов использовалась схема клонирования «от сложного к простому» Необходимые варианты UTR получали путем выборочной делеции структурных модулей сложно-составного 5'UTR исходной плазмиды hp_o_w_gfp_ (Рис 10 А), включающего следующие структурные элементы участок стабильной шпильки (hp), обелиновый 5'-UTR (о) и область неструктурированного «окна» (w), отделенного от оригинальной ОРС egfp (gfp) короткой спейсерной последовательностью (s) (Рис 10 А) Компьютерное моделирование hp_o_w_gfp_ показало невовлеченность области «окна» во внутренние ВС взаимодействия в составе полноразмерной мРНК (Рис 10 В,С)

На первом этапе оценивали эффективность трансляции РНК матриц BI, В2, ВЗ (Рис 11), содержащих полное «окно» - o_w_gfp_, 5'-часть «окна» - o_(5')w_gfp_ и З'-часть «окна» - o_(3')w_gfp, соответственно Все три варианта матриц в 5'-концевом положении несли последователность обелинового лидера, необходимую для обеспечения контроля с использованием аналогичной РНК o_gfp_ (Рис И, В), полностью лишенной неструктурированной области Последнее важно поскольку все варианты матриц содержат 120 нт векторную последовательность вместо 3'-UfR stnv, что при равных условиях должно приводить к снижению эффективности трансляции относительно соответствующего «полного» варианта o_gfp_s (А), вследствие отсутствия эффекта кооперативности в усилении трансляции при комбинации 3 -UTR stnv с 5'-дидерной последовательностью обелина Действительно, при сравнении эффективностей трансляции для А и В (Рис 11) отчетливо заметно 5-10 кратное снижение выхода соответствующего продукта

На рис 11 показан в несколько раз более высокий выход продукта В2 °_(5')w_gfp_ по сравнению с В1 и В4, включающих «полное» «окно» или только З'-часть неструктурированной последовательности (Рис 11 Bl, В2, ВЗ) Тем не менее, эффективность трансляции в случае В2 остается на порядок ниже при сравнении с уровнем белкового синтеза, обеспечиваемым конструкцией А с вирусным З'-UTR в WGE, тогда как LíF, транслирует обе матрицы на сходном уровне (Рис 11 А, В2) Необходимо отметить, что, несмотря на короткую длину,

последовательность 5'-UTR обелина целиком вовлечена во ВС, образуя несколько шпилечных элементов (Рис 10 В, С) Таким образом, следующим шагом были получены варианты, лишенные обелинового лидера и проверены на способность повышения эффективности трансляции (5')w_gfp_ (Рис 11 ВЗ) и w_gfp_ На Рис 11 видно, что полное освобождение 5'-конца от элементов ВС приводило к ~ 10-кратному (относительно В) увеличению в количестве синтезируемого продукта в случае ВЗ, при трансляции в обеих системах (Рис 11 ВЗ), тогда как в случае w_gfp_, выход возрастал менее чем в 2 раза (данные не приведены) Таким образом, транскрипт ВЗ, содержащий 5'-участок «окна» в крайнем 5'-концевом положении обеспечивал самый высокий выход продукта в обеих системах, соизмеримый с получаемым при трансляциии РНК o_gfp_s в WGE (Рис 11 А) Несмотря на множественные экспериментальные данные, указывающие на принципиальную важность свободного 5-конца 5'-UTR для заякоривания пИК на мРНК в составе 48S комплекса получение конкретной схемы этого процесса лимитировано отсутсвием четкого понимания механизма привлечения пИК на мРНК в целом Порядковое усиление трансляции лишь при полном освобождении 5'-конца последовательности неструктурированного лидера от элементов ВС лишний раз доказывает, что процесс заякоривания пИК на мРНК проходит с участием свободного 5'-конца молекулы вне зависимости от нахождения основной части UTR в неструктурированном состоянии Например стабилизация вторичной структуры UTR введением шпильки (AG = -60 ккал/'мол) снижала трансляцию в несколько раз (относительно В) в случае С2 и блокировала окончательно в случае С1 иСЗ

Важно отметить закономерность выбора сайта инициации трансляции для рассмотренных вариантов РНК-матриц первый AUG являлся менее предпочтительным если за ним следовал З'-участок последовательности «окна» как в случае транскриптов В1 и В4 (Рис 11) Напротив, в случае конструкции С2, В2, ВЗ первый AUG, фланкированный областью спейсера, выступал инициаторным, направляя трансляцию egfp продукта большей мол массы, удлиненного последовательностью .спейсера (Рис 11 С2, В2, ВЗ) Как видно из рис 11 доступный 5'-конец РНК, действительно, необходим для эффективной инициации

трансляции, вне зависимости от общего уровня неструктурированное™ У-31 ИДсрной области.

Приведенные на рис. 11 экспериментальные данные ставят ряд вопросов:

- Почему конструкция, содержащая лишь Ж-часть неструктурированной последовательности (Рис. 11 R2, ВЗ) обеспечивает гораздо более высокий выход продукта чем вариант, содержащий полное «окно»?

- Почему первый AUG ко дон не промотирует связывание пИК, будучи окруженным неструктурированными последовательностями с обеих сторон, Принимая во внимание высокую вероятность его контактирования с лИК в процессе сканирования от 5'-конца через 5'-UTR к AUG II ОРС egfp (Рис, 10 А) ?

А -О- «Iflij-X

в -О-

В1 -04 » >S'

Б2 -od* -s-вщ-

вз -г—£ -s-e В4 -о- # hs-ДЦ

с;с* So-«Я

WGE

А С' С В С1 51 С2 В2 ВЗ С4 В4

egfp

о л

О ¡J

Ж-' ■ 1

..- l s^i:л; -

LUE

А С Q в 01 В'. С2 Б2 ВЗ С4 S4

i, Ii

egfp

Рис. 11, Схематическое изображение используемых вариантов конструкций с разнообразными комбинациями элементов 5'-UTR (лев. часть). Прямое флуоресцентное сканирование продуктов трансляции разных вариантов РНК (4 мкг/25 мкл) в экстракте пшеницы (WGE, верх.) и Leishmania (f,fF. »ил) после фракционирования в £5% ПААГ (прав, часть), о - обелинокая лндерная область: X - 3UTR. производный РНК sinv; & фрагмент, кодирующий спейсериый отрезок; кругом обозЕтачсн стартовый колон: прямоугольники обозначают последовательность «окна» и ОРС egfp. соответственно; стрелка указывает начало синтезируемого продукта; Л о gfp__&, В -34JTR stnv замещен на 120 нт последовательность вектора; В1 - o_w_gfp_; Б2 - nw_gfp_; ВЗ - 5*w_gfpj В4 -o_3*w_gfp_j С hpj&jsfpj C1 - hp_o_w_gfp j C2 - hp_n>_5'w_gfp ; С4 - hp_o_3Tw_gfp_ С* - дефектная шпилька, утрагайшан большею часть 3-фрагмента правого плеча, с сохранением трех пар оснований, прилежащих к петле; спраиа показаны количественньге стандарты EGFP в мкг.

В качестве гипотетического ответа на первый вопрос можно предположить роль ВС как одного из основных факторов, влияющих на скорость процесса инициации трансляции При сравнении характера окружения действительных стартов трансляции в конструкциях В1 и В4 с таковым в В2 и ВЗ, отмеченных стрелками на рис И можно заключить, что в случае В1 и В4 AUG-кодон фланкирован участками ВС как с 5' так и с 3' стороны последовательность спейсера (s) и ОРС egfp, соответственно (Рис 10 С), но в случае В2 и ВЗ - только с 3' стороны началом ОРС egfp Степень погруженности старт-кодона в элементы ВС, являющаяся единственным различием между вариантами Bl, В2 и ВЗ, видимо, является определяющим фактором влияющим на кинетику процесса инициации трансляции Аналогично, степень ингибирования трансляции egfp возрастает при последовательной стабилизации ВС 5'-конца UTR сначала 5'UTR обелина и, наконец, шпилькой

Три гипотезы было выдвинуто для объяснения дифференциального кодонового узнавания для ответа на второй вопрос 1) AUG II обладает большим предпочтением по отношению к AUG I (Рис 10 А) в силу более «сильного» контекста, 2) из-за ограничений, накладываемых генетическим кодом, 3'-участок последовательности «окна» комбинированный остатками A/U (кодирует гидрофобный лидер, содержащий повторяющиеся блоки фенилаланина (Рис 10 А), возможно, запирающий рибосому и т о, «замораживающий» процесс инициации трансляции, 3) работы по кинетическим характеристикам отдельных стадий процесса инициации трансляции в системе с минимальным набором факторов инициации указали наличие медленной стадии, связанной с гидролизом GTP при локализации старт-кодона, что, возможно, предполагает необходимость присутствия ВС ниже AUG в качестве фактора, замедляющего миграцию пИК и повышающего процессивность в узнавании старт-кодоьа

Для проверки первых двух гипотез, были созданы и проверены соответствующие конструкции с модифицированной последовательностью «окна»

Трансляция РНК матриц, несущих оптимальный npe-AUG контекст и относительно легкоплавкий З'-участок «окна», кодирующий гидрофильную лидерную последовательность

Создание РНК матриц, обладающих оптимальным npe-AUG контекстом и участком ниже AUG, кодирующим i идрофильный белковый лидер, предполагает включение в последовательность G/C остатков G/C - остатки, как правило, обуславливают вовлечение соотв фрагмента в случайные удаленные взаимодействия внутри полноразмерной РНК молекулы Для преодоления данной проблемы нуклеотидная последовательность З'-участка «окна» была составлена таким образом, что способствовала формированию легкоплавкой внутренней ВС, кодирующей гидрофильный лидер (Рис А) и позволяющей успешно конкурировать с вовлечением в альтернативные элементы ВС внутри цепи РНК ВС З'-участка «окна» формировалась тремя шпилечными элементами, составленными из стабильного петлевого домена GUAA (Рис Ijj В), но короткого «стебелька» с низкой энтальпиеи образования (Рис С) Стабильный петлевой домен играл роль энтропийного фактора в стабилизации всей структуры, хорошо защищенной на компьютерной модели полноразмерной РНК-молекулы (Рис 13 D) Для исключения возможности, что эффект усиления трансляции обусловлен последовательность-специфическими взаимодействиями, в качестве

5'вввсшв ttte;tttta),0ttta

\.ACcATQ^CftGtaatqtataasqtctqtaaaqacaitaaaeacqtaaqtgaaACCATGGirGAqc е< . ,/ М TVMYKVCKDI KHVSET MVS.

s nun i<iaaes),z '

х \ 1 1 \ ' UNCG GNRA —* GUAA CUUG п В

гч

Чs' / ——1—---X s U 1

г \ '"■о»-*, к X* О

J^s А* ^ 45= 25 О

Рис ХЗ А - 5'~нетранслируемые участок, В - наиболее распространенные комбинации нт остатков петлевых доменов рРНК (стрелкой указан использующийся вариант), структурная модель 5'-учасгка (А верх), овалом выделен вышерасположенный AUG, AG в ккал/мол, D - компьютерная модель полноразмерной РНК, прямоугольником выделен 5s- участок (А)

альтернативного лидера использовали гомополимеряую поли-Л Иоследоватеяьносгъ(Рис. [3 А).

Трансляция чтих матриц н системах экстракта Leishmania и WGE (Рис. 14 С, D) сопровождалась высоким выходом продукта SO - 100 мкг/мл, сравнимым с уровнем, обеспечиваемым РНК с 5-частыо «окна» (Рис. 11 g) в -обеих системах (Рис. 14 В).

Несмотря на оптимальные условия инициации и 5-AUG («сильный;; контекст и отсутствие гидрофобного лидера), трансляция продукта инициировалась преимущественно с нижерас положенного старт-код она (Рис. 13 А Рис. 14 С, D). Лишь в случае ffiä_3_gfp_ матрицы наблюдалось наличие альтернативных продуктов (Рис. 14 С, а и Ь), однако с преобладанием ни зкомоле kvj i яр hoi -о.

Второе важное наблюдение состоит в разной зависимости уровня синтеза от концентрации РЖ для матриц с неструктурированным лидером (Рис. 14 В, С, DJ в сравнении с o_glp_s РНК (Рис. 14 А), oglps относительно эффективно транслируется при 0.5 мкг/мл мРНК. повышение концентрации мРМК до 4 мкг/мл не приводило к иыраженному усилению грансляции в WGE или снижало выход

WOE- LIE1 WQE Щ WGE' WGE LIE" LIE

123 1 гз т 2 i 7 : iï3iï3 i 2 э i" г э

»t 47 ►

га

го ►

Jiii WW

WGF- (.1С WOE

X 1231 23121 123

WGE- LfE- WOE LtB

1 2 3 1,J,Î 3 1 3 2 1 Ï 3 У^ ->

I *\ r.

47 ' 34 Ц 26 I

»►1С

Put, 14. Прямое ф.:'А(|хя:к'Н imv ПЛАГ сканирование. Нохошюннс продую* îpe нолями и щи грей временных точек: 1,23 - 25,50 н 75 мин. Л трансляция 0.5 ми (*) и 4 MKT РНК o.gfp s n жецмхтяк Lemhmania (IlE) и WGE; В 115 (*) и 4 нкг РЫК S'wgl'p_. С 0.5 (*) и 4 мкг РНК tlis_3_gfp_; D - 0.5 (*) и А мкг PIIK aflnji_3_gf>_ , Г- (i«ut_.l_gip_ (25" 0.5 MKT); Г'- o_gfp_s (25' 4ми); 1'" 5'w_gl"p_ (25' 4ии ); х, у - соответствующие vgfp стандарты (мкг); а и Ь - продукта Вницнщии с вьале- и анжераслоложенных стартовых колонов, соответственно.

продукта в Lib (Рис 14 А) Это согласуется с ранними наблюдениями и объясняется участием факторов eIF4F в инициации трансляции для матриц, содержащих 3'UTR (stnv) (Gazo, 2004, Shaloiko, 2004) Для матриц с неструктурированным 5'-UTR наблюдается противоположная ситуация (Рис 14 В, С, D) усиления синтеза белка с ростом концентрации мРНК Последнее, наряду с толерантностью к типу используемой последовательности ((aaaaa)n, (attttt)n, (tttta)„) свидетельствует о неспецифическом характере усиления трансляции за счет кинетического эффекта при повышении концентрации мРНК и позволяет сделать заключение об универсальном характере трансляции матриц с неструктурированным 5'-UTRs

По накоплению продукта со временем (рис 14 1, 2, 3) видно, что фаза быстрого накопления egfp приходится на первые 25 мин, что может указывать на, возможно, ускоренную нуклеазную деградацию неструктурированной области UTR

Предпочтение в узнавании старт-кодона в пользу AUG, расположенного на границе неструктурированного (5') и структурированного (3') участков РНК не зависело от контекста и свойств лидерного пептида, что позволяет предполагать существование кинетической задержки (Lorsch 1999, Algire 2002), необходимой при локализации стартового кодона и перехода (iMK в элонгационный комплекс

Использование РНК матриц с 5'-«окном» неструктурированной последовательности повысило выход продукта трансляции в ЫЕ в среднем в 20 раз (Рис А против B,C,D) и в несколько раз в WGE в сравнении с использованием o_gfp_s РНК, что позволило получить ~ 0 1 мг/мл egfp

Оптимизация триплета предшествующего AUG

Для изучения влияния последовательности триплета перед AUG на эффективность трансляции был создан набор из 64 плазмид со всеми возможными триплетными вариантами перед ОРС egfp, окруженной 5'- и 3'- нетранслируемыми участками гена кальмодулина, включающими сайт транс-сплайсинга и полиаденилирования Генная кассета, содержащая кроме гена egfp маркер антибиотикоустойчивости, была интегрирована в SSU-локус дикого типа L tarentolae, в котором могла конститутивно транскрибироваться РНК-полимеразой I под контролем мощного промотора рибосомальных генов Для оценки

потенциального влияния прс-АТО на стабильность РНК. суммарная мРНК 15-н культур была проанализирована методом Норзсрн-гибридизации. Был показан

> <09 I эо -

Рис. 15. Величины флуоресцетуш EGFP дня вариантов линий L. t&entolae. Последовательности индивидуальных npe-ATG триплетов гтокачзны по оси х; wt - базальныи уровень фяуоресцскцЩ но ося у отмечены зйиичмиы о.е.ф.

сходный уровень чРНК EGFP во всех образцах. Сравнение экспрессии RCjI P дай всех 64 вариантой npe-ATG конструкций, трансфецнроканных в L tareniulae. выявило порядковые различия s уровне экспрессии (Рис. 15). 25 npe-ATG

1 III

Ml AUG AOS "JÛC uíXi

ClCC

Рис. 16. Уровни экспрессии Ds-red и THT-R в диком типе и т четырех трансфецированных линиях L tarcntolae продуктов варьируют в зависимости от npe-ATG (указан иод соответствующим и линиями). (А) — экспрессной ные уровни Ds-red показаны те относительных единица?: флуоресценции. (В) - уровни экспрессии TET-R показаны в единицах относительной плотности специфических полое.

характеризовались флуоресценцией превышающей 1 млн. о.е.ф (относительные сд. флуоресценции). Наибольшие уровни были получены для npc-ATG AU С, АСС. UUG, AAU и UGA, достигающие 1,5 млн. о.е.ф. В нескольких случаях (GUU, GGA, UCG, UCU) синтез EGFP не наблюдался совсем.

Для проверки универсальности свойств мРНК, сообщаемых вариациями npe-ATG контекста, «сильные» (AUC, АСС) и «слабые» (UCG и ССА) триплеты из предыдущего эксперимента были выбраны для анализа в сочетании с ОРСтетрациклинового репрессора TET-R и красного флуоресцентного белка - Ds-red Полученные результаты (см рис 16) показывают, что уровни экспрессии соответствующих продуктов варьировали внутри данной выборки npe-ATG и характеризовались полным отсутствием корреляции с соответствующими уровнями EGFP в аналогичных конструкциях, а также между собой

Интересно отметить присутствие UGA в числе «сильных» npe-AUG триплетов, учитывая редкую встречаемость стоп-кодонов в непосредственной близости к AUG Данное наблюдение может указывать на роль реинициации трансляции у Leishmania в регуляции генной экспрессии, учитывая что для эффективной реинициации короткая предшествующая ОРС должна находиться вблизи от стартового кодона (Kozak 2001)

ВЫВОДЫ

1 Бесклеточная система трансляции на основе представителя трипаносоматид L tarentolae способна к инициации трансляции на гетерологичных РНК матрицах

2 Применение antiSX олигонуклеотида позволило эффективно подавить трансляцию эндогенной РНК, не прибегая к методике с использованием микрококковой нуклеазы

3 Использование неструктурированного 5-UTR в составе РНК матриц приводит к возрастанию выхода белкового продукта в системе экстракта L tarentolae пропорционально увеличению количества вводимой матрицы Привнесение структурных элементов как в 5'- так и в З'-область 5'UTR приводит к угнетению белкового синтеза

4 Выявлена группа наиболее выгодных npe-AUG триплетов для экспрессии EGFP в клетках L tarentolae, однако эти триплеты не оказались универсальными в сочетании с другими открытыми рамками считывания (Tet-R, Ds-Red)

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1 Mureev, S, Kushnir, S , Kolesmkov, A, Breitimg, R, Alexandrov, К (2007) Construction and analysis of Leishmania tarentolae transgenic strains free of selection markers Mol Biochem Parasitol, 157 (1) (MOLBIO-D-07-00003)

2 Lukes, J, Paris, Z , Regmi, S , Breitling, R, Mureev, S, Kushnir, S, Pyatkov, К, Jirku M, Alexandrov, К (2006) Translational initiation in Leishmania tarentolae and Phytomonas serpens (Kinetoplastida) is strongly influenced bypre-ATG triplet and its 5_ sequence context Mol Biochem Parasitol, 148 (2), 125-32

3 Lukes, J, Regmi, S, Breitimg, R, Mureev, S Alexandrov, К Translation initiation in Leishmania tarentolae and Phytomonas serpens (Trypanosomatinaj is strongly influenced by pre-ATG triplet (2004) Тезисы докладов конференции британского общества паразитологов, Budweiser, Чехия 2004, Стр 78

4 Mureev, S, Breitling, R, Muller S & Alexandrov К Marker excision in Leishmania tarentolae (2004) Тезисы докладов конференции британского общества паразитологов, Budweiser, Чехия 2004, Стр 87

Подписано в печать 27.04 2007 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 п.л. Тираж 75 экз. Заказ № 662 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Муреев, Сергей Владимирович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Характеристики бесклеточных систем трансляции.

2.1.1 Бесклеточная система трансляции Е. coli.

2.1.2 Проблема фолдинга.

2.1.3 Лизат Ретикулоцитов Кролика RRL (rabbit reticulocyte lysate).

2.1.4 Система Экстракта Зародышей Пшеницы WGE (wheat germ extract)

2.1.5 Трансляционно-активные экстракты трипаносоматид.

2.2 Бесклеточная трансляция в проточной системе.

2.3 АТР-регенерирующие системы.

2.4 Применение бесклеточной системы.

2.4.1 Включение модифицированных аминокислот.

2.4.2 IN VITRO продукция мембранных белков.

2.4.3 Продуктивность и автоматизация. Применение in vitro системы экспрессии в геномике и протеомике.

2.4.4 Бесклеточная система трансляции используется для молекулярной эволюции.

2.5 активность EIF2 определяет уровень трансляции in vivo & in vitro.

2.6 Сплайс-лидер в инициации трансляции у трипаносоматид.

2.7 Использование anti-sence подхода для избирательного подавления трансляции.

2.8 Инициация трансляции.

2.8.1 Проблемы инициации трансляции эукариот.

2.8.2 AUG контекст.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Культивирование клеток Leishmania tarentolae.

3.1.1 Поддержание культуры клеток L. tarentolae.

3.1.2 Трансфекция Leishmania tarentolae.

3.2 Выделение митохондрий и анализ целостности внешней митохондриальной мембраны.

3.2.1 Способы разрушения клеток.

3.2.2 Процедура выделения митохондриальных фракций L. tarentolae.

3.2.3 Приготовление препаратов клеток и митохондрий для флуоресцентной микроскопии.

3.2.4 Измерение активности сукцинат-цитохром с дегидрогеназы и анализ целостности внешней митохондриальной мембраны.

3.3 Получение экстракта L. tarentolae и трансляция.

3.3.1 Процедура получения экстракта L. tarentolae.

3.3.2 Обработка экстракта для подавления эндогенной трансляции.

3.3.3 Постановка и проведение реакции in vitro трансляции.

3.3.4 Получение суммарных гомологичных мРНК и тРНК L. tarentolae.

3.4 Очистка EGFP и MALDI-TOF-macc спектроскопия.

3.5 Поиск пре-AUG триплетов для L. major.

3.6 Создание генноинженерных конструкций для геномной интеграции

3.6.1 Создание конструкций, содержащих ires-последовательность для геномной интеграции в тубулиновый локус Leishmania tarentolae.

3.6.2 Создание плазмид с 64 вариантами npe-ATG триплетов для геномной интеграции в SSU-локус.

3.6.3 Конструирование TET-R и DS-Red экспрессирующих плазмид.

3.7 Создание конструкций для in vitro экспрессии.

3.7.1 Конструкции содержащие IRES элемент в качестве 5 '-нетранслируемого участка.

3.7.2 Конструкции содержащие комбинацию обелинового 5 '-лидера с 3'-нетранслируемым участком сателлита вируса некроза табака.

3.7.3 Содание серии плазмид «ОКНА», содержащих дополнительный ATG в рамке с ОРС egfp, окруженный последовательностями полностью неструктурированных участков.

3.7.4 Содание серии плазмид «ОКНА», содержащих дополнительный ATG в рамке с ОРС egfp, окруженный последовательностями полностью (5') и частично (3') неструктурированных участков.

3.8 Методы Молекулярной Биологии.

3.8.1 Получение и трансформация компетентных клеток Е. coli.

3.8.2 Выделение плазмидной ДНК.

3.8.3 Расщепление ДНК эндонуклеазами.

3.8.4 Обработка продуктов эндонуклеазного расщепления ДНК полимеразой фага Т4 для достройки выступающих концов до «тупых».

3.8.5 ЛигированиеДНК.

3.8.6 Секвенирование ДНК.

3.8.7 ПЦР.

3.8.8 Норзерн-гибридизация.

3.8.9 Гибридизация по Вестерну.

3.8.10 Анализ продуктов трансляции.

3.8.11 Транскрипция in vitro.

3.8.12 Определение устойчивости РНК к нуклеазам VI &Т1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Оптимизация параметров получения клеточного экстракта.

4.1.1 Поиск наиболее щадящего метода разрушения клеток L. tarentolae

4.2 Трансляция в экстракте L. tarentolae (LiЕ).

4.2.1 Оценка способности экстракта L. tarentolae к эндогенной трансляционной активности и инициации трансляции на экзогенно-вводимой гомологичной РНК.

4.2.2 Применение антисмыслового олигонуклеотида к последовательности сплайс-лидера, для подавления трансляции SL-несущих РНК.

4.2.3 Трансляция гетерологичных РНК в aSL-обработанном экстракте L. tarentolae.

4.2.4 Сравнение эффективностей трансляции в LtE, после обработки aSL-олигонуклеотидом и микрококковой нуклеазой.

4.3 Экспрессия IRES-содержащих конструкций in vivo в составе генных кассет, интегрированных в геном L. tarentolae.

4.4 Создание оптимальных матриц для трансляции in vitro.

4.4.1 Влияние неструктурированного 5'- UTR на эффективность трансляции РНК-матрицы.

4.4.2 Трансляция РНК матриц, несущих оптимальный пре-А UG контекст и относительно легкоплавкий З'-участок «окна», кодирующий гидрофильную лидерную последовательность.

4.4.3 Сравнительный анализ степени структурных изменений, вызванных в РНК температурной денатурацией.

4.4.4 Оптимизация триплета, предшествующего A UG.

4.5 ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бесклеточная система трансляции на основе представителя трипаносоматид Leishmania tarentolae. Создание оптимальной матрицы для трансляции in vitro"

С завершением многочисленных проектов по секвенированию геномов разных организмов, изучение генной-экспрессии выходит на новый уровень структурно-функциональной характеристики кодируемых геномом белков. В силу огромного набора открытых рамок считывания, обнаруженных в процессе секвенировния, прогресс в анализе соответствующих полипептидов напрямую зависит от их высоко-эффективной наработки в достаточном количестве для структурного и функционального анализа.

В настоящее время используются три основные стратегии получения белков для исследований: химический синтез, in vivo экспрессия и in vitro экспрессия

Химический синтез не применим для синтеза длинных полипептидов. Несмотря на более чем тридцатилетнюю историю, универсальная система экспрессии эукариотических белков так и не была разработана. Технические ограничения связанные с необходимостью быстрой и продуктивной наработки белков для анализа вынудили исследователей вернуться к наиболее эффективной системе на основе Е. coli, однако лишь 15% эукариотических белков могли быть проэкспрессированы в своей функционально-активной форме.

Эукариотические системы экспрессии in vivo основанные на культуре клеток млекопитающих, насекомых, трансгенных растениях и животных имеют значительные ограничения: дороговизна, трудоемкость. Дешевая и относительно гибкая система на основе Saccharomyces cerevisiae характеризуется относительно низким выходом и отсутствием желаемого типа пост-трансляционных модификаций. Использование других дрожжевых представителей (Pichia pastoris) наталкивается на препятствия связанные с активацией системы отрицательной обратной связи при гиперпродукции белка. При создании новой эукариотической системы разумным могла бы быть замена РНК-полимеразы 11 менее контролируемыми и более эффективными односубъединичными фаговыми полимеразами Т7, SP6 и т.д. Однако в данном случае проблематичным представляется кэпирование РНК, так как фаговые полимеразы не обладают свойством сопряжения транскрипции и процессинга (Moteki and Price, 2002).

Бесклеточные системы дают возможность работать с широким спектром РНК-матриц, лишенных основных регуляторных модификаций. Из множества прикладных задач in vitro система позволяет экспрессировать токсичные белки, включать модифицированные аминокислоты, вносить необходимые добавки для экспрессии мембранных и других труднорастворимых белков и селективно метить изотопами. Несмотря на видимую универсальность, бесклеточные системы имеют ряд ограничений: а) низкая эффективность экспрессии в batch-формате по сравнению с in vivo продукцией, b) дороговизна применения высокопродуктивной проточной системы, с) отсутствие универсальных регуляторных элементов (UTRs) для трансляции любых открытых рамок считывания в любой in vitro системе.

Наибольшее распространение получили системы на основе экстракта Е. coli, зародышей пшеницы (WGE) и лизата ретикулоцитов кролика (RRL) благодаря максимальному отношению выгодных свойств к стоимости получения белкового продукта. Под полезными свойствами понимают высокую эффективность синтеза белков в их функционально-активной форме, отсутствие эндогенного уровня трансляции.

Бесклеточная эукариотическая система трансляции на основе трипаносоматид могла бы обладать преимуществами по сравнению с вышеперечисленными системами благодаря нескольким факторам: а) легкой процедуре наработки клеточной биомассы и разрушения клеток Ь) присутствию идентичной 5-концевой последовательности сплайс-лидера (SL) на всех зрелых РНК трипаносоматид, допускающей использование анти-SL олигонуклеотида для подавления фонового уровня трансляции.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Муреев, Сергей Владимирович

4.5 ВЫВОДЫ

1. Бесклеточная система трансляции на основе представителя трипаносоматид L. tarentolae способна к инициации трансляции на гетерологичных РНК матрицах.

2. Применение anti6Z олигонуклеотида позволило эффективно подавить трансляцию эндогенной РНК, не прибегая к методике с использованием микрококковой нуклеазы.

3. Использование неструктурированного 5'-UTR в составе РНК матриц приводит к возрастанию выхода белкового продукта в системе экстракта L. tarentolae пропорционально увеличению количества вводимой матрицы. Привнесение структурных элементов как в 5'- так и в З'-область 5'UTR приводит к угнетению белкового синтеза.

4. Выявлена группа наиболее выгодных npe-AUG триплетов для экспрессии EGFP в клетках L. tarentolae, однако эти триплеты не оказались универсальными в сочетании с другими открытыми рамками считывания (Tet-R; DS-Red).

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор считает своим долгом выразить глубокую благодарность своим научным руководителям, Александру Александровичу Колесникову и Александрову Кириллу Евгеньевичу за отзывчивость, помощь при постановке экспериментов, интерпретации результатов и написании статей и диссертации. Я безмерно признателен Мерзляк Екатерине за ее дружбу, отзывчивость, моральую поддержку в трудные минуты, неоценимую помощь в обсуждении и редактировании материалов диссертации. По прошествии нескольких лет, начиная с момента дипломной работы, я смело могу назвать ее одним из своих учителей. Слова глубокой благодарности я хотел бы адресовать Игорю Грановскому за помощь на начальном этапе работы и, в особенности, Шалойко Любови Анатольевне, без которой эта работа, вероятно, никогда не была бы сделана, за ее живое участие и интересные и полезные беседы. Я черезвычайно благодарен своим коллегам, Кушнир Сюзанне, за ценные практические советы в каждодневной экспериментальной работе, Райнхарду Брайтлингу за ценные советы, Кырстеа Иону, за помощь в проведении экспериментов и веселую дружескую атмосферу. Я очень признателен Малеевой Юлии Владимировне, Лупиловой Наталье, Эммериху Михаю Газдагу, Кристин Делон, Игнатьеву Александру, Васильевой Юле, Андрею Закальскому, Аймельту Ицену, Тиму Бергбредэ, Гохеан Нейлакши и By Тамми за помощь и идеальный климат для приятной и эффективной работы. Я также хотел бы поблагодарить аспирантов группы Юлиуса Лукаша: Жденека Париса, Сандеша Регми и Милана Йирку, часть результатов корторых, я использовал при написании диссертации, а так же, Карен Браунинг за любезное предоставление генноинженерных конструкций.

Я очень признателен коллективам кафедр молекулярной биологии и биоорганической химии за великолепное образование, полученное мной за время обучения и последующей работы на биологическом факультете. Хотелось также поблагодарить всех сотрудников отдела структурной биологии института Макса-Планка, Дортмунд, Германия, и, отдельно, его заведующего, Роджера Гуди за идеальные условия работы и доброжелательное отношение. И, в заключении, я выражаю глубочайшую благодарность своим родителям за все то, неоценимое, что они сделали для меня и продолжают делать сегодня.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Муреев, Сергей Владимирович, Москва

1. Adelman, М. R., D. D. Sabatini, and G. Blobel. 1973. Ribosome-membrane interaction. Nondestructive disassembly of rat liver rough microsomes into ribosomal and membranous components. J Cell Biol 56:206-29.

2. Agabian, N. 1990. Trans splicing of nuclear pre-mRNAs. Cell 61:1157-60.

3. Agrawal, R. K., P. Penczek, R. A. Grassucci, Y. 1996. Direct visualization of A-, P-,and E-site transfer RNAs in the Escherichia coli ribosome. Science 271:1000-2.

4. Ahn, B. Y., and B. Moss. 1989. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5' ends of vaccinia virus late mRNAs. J Virol 63:226-32.

5. Algire, M. A., D. Maag, P. Savio,. 2002. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. Rna 8:382-97.

6. Angelopoulos, E. 1970. Pellicular microtubules in the family Trypanosomatidae. J Protozool 17:39-51.1.

7. Arrick, B. A., A. L. Lee, R. L. Grendell, and R. Derynck. 1991. Inhibition of translation of transforming growth factor-beta 3 mRNA by its 5' untranslated region. Mol Cell Biol 11:4306-13.

8. Asano, K., and A. G. Hinnebusch. 2001. Protein interactions important in eukaryotic translation initiation. Methods Mol Biol 177:179-98.

9. Asano, K., L. Phan, L. Valasek, L. W. Schoenfeld, A. 2001. A multifactor complex of elFl, eIF2, eIF3, eIF5, and tRNA(i)Metpromotes initiation complex assembly and couples GTP hydrolysis to AUG recognition. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 66:403-15.

10. Avenaud, P., M. Castroviejo, S. Claret, J. Rosenbaum, F. Megraud, and A. Menard.2004. Expression and activity of the cytolethal distending toxin of Helicobacter hepaticus. Biochem Biophys Res Commun 318:739-45.

11. Bablanian, R., and A. K. Banerjee. 1986. Poly(riboadenylic acid) preferentially inhibits in vitro translation of cellular mRNAs compared with vaccinia virus mRNAs: possible role in vaccinia virus cytopathology. Proc Natl Acad Sci U S A 83:1290-4.

12. Bader, M., and T. F. Sarre. 1986. A (re)initiation-dependent cell-free protein-synthesis system from mouse erythroleukemia cells. Eur J Biochem 161:103-9.

13. Baird, G. S., D. A. Zacharias, and R. Y. Tsien. 2000. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization ofDsRed, a redfluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sci U SA97:11984-9.

14. Balkow, К., T. Hunt, and R. J. Jackson. 1975. Control of protein synthesis in reticulocyte lysates: the effect of nucleotide triphosphates on formation of the translational repressor. Biochem Biophys Res Commun 67:366-75.

15. Baranov, V. I., and A. S. Spirin. 1993. Gene expression in cell-free system on preparative scale. Methods Enzymol 217:123-42.

16. Barbieri, L., M. G. Battelli, and F. Stirpe. 1993. Ribosome-inactivating proteins from plants. Biochim Biophys Acta 1154:237-82.

17. Berens, C., and W. Hillen. 2003. Gene regulation by tetracyclines. Constraints of resistance regulation in bacteria shape TetR for application in eukaryotes. Eur J Biochem 270:3109-21.

18. Bermudez, R, F. Dagger, J. A. D'Aquino, G. Benaim, and K. Dawidowicz. 1997.

19. Characterization of mitochondrial electron-transfer in Leishmania mexicana. Mol Biochem Parasitol 90:43-54.

20. Berthelot, К., M. Muldoon, L. Rajkowitsch, J. Hughes, and J. E. McCarthy. 2004.

21. Dynamics andprocessivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Mol Microbiol 51:987-1001.

22. Betton, J. M. 2003. Rapid translation system (RTS): a promising alternative for recombinant protein production. Curr Protein Pept Sci 4:73-80.

23. Beverley, S. M., and С. E. Clayton. 1993. Transfection of Leishmania and Trypanosoma brucei by electroporation. Methods Mol Biol 21:333-48.

24. Bevis, B. J., and B. S. Glick. 2002. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). Nat Biotechnol 20:83-7.

25. Bi, X., J. Ren, and D. J. Goss. 2000. Wheat germ translation initiation factor eIF4B affects eIF4A and eIFiso4F helicase activity by increasing the A TP binding affinity ofeIF4A. Biochemistry 39:5758-65

26. Boehringer, D., R. Thermann, A. Ostareck-Lederer, J. D. Lewis, and H. Stark. 2005. Structure of the hepatitis С Virus IRES bound to the human 80S ribosome: remodeling of the HCV IRES. Structure 13:1695-706.

27. Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive methodfor the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-54.

28. Bramblett, G. Т., R. Kambadur, and M. Flavin. 1989. Immunocytochemical studies with antibodies to three proteins prominent in the isolated microtubule cytoskeleton of a trypanosomatid. Cell Motil Cytoskeleton 13:145-57.

29. Brawerman, G. 1981. The Role of the poly(A) sequence in mammalian messenger RNA. CRC Crit Rev Biochem 10:1-38.

30. Breitling, R., S. Klingner, N. Callewaert, R. Pietrucha, A. Geyer, G. Ehrlich, 2002. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expr Purif 25:209-18.

31. Brummer, J., H. Thole, and K. Kloppstech. 1994. Hordothionins inhibit protein synthesis at the level of initiation in the wheat-germ system. Eur J Biochem 219:425-33.

32. Buchberger В., W. Mutter, A. Roder. 2002. Matrix reactor: A new scalable reactor principle for cell-free protein-expression. In: Spirin AS. (ed.) Cell-free translation systems, pp. 121-130

33. Burrows, D., and I. Sarankov. 1999. A decrease in harm: a new concept for Russian public health. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol: 107-8.

34. Busso, D., R. Kim, and S. H. Kim. 2003. Expression of soluble recombinant proteins in a cell-free system using a 96-wellformat. J Biochem Biophys Methods 55:233-40.

35. Calhoun, K. A., and J. R. Swartz. 2005. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnol Bioeng 90:606-13.

36. Calhoun, K. A., and J. R. Swartz. 2005. An economical methodfor cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog 21:114653.

37. Campbell, D. A., S. Thomas, and N. R. Sturm. 2003. Transcription in kinetoplastid protozoa: why be normal? Microbes Infect 5:1231-40.

38. Carroll, R., and J. Lucas-Lenard. 1993. Preparation of a cell-free translation system with minimal loss of initiation factor eIF-2/eIF-2B activity. Anal Biochem 212:1723.

39. Cavener, D. R. 1987. Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila and vertebrates. Nucleic Acids Res 15:1353-61.

40. Cazenave, C., P. Frank, and W. Busen. 1993. Characterization of ribonuclease H activities present in two cell-free protein synthesizing systems, the wheat germ extract and the rabbit reticulocyte lysate. Biochimie 75:113-22.

41. Chen, C. Y., and P. Sarnow. 1995. Initiation of protein synthesis by the eukaryotic translational apparatus on circular RNAs. Science 268:415-7.

42. Chen, D., S. Sarid, and E. Katchalski. 1968. The role of water stress in the inactivation of messenger RNA of germinating wheat embryos. Proc Natl Acad Sci U S A 61:1378-83.

43. Chen, H. Z., and G. Zubay. 1983. Prokaryotic coupled transcription-translation. Methods Enzymol 101:674-90.

44. Chen. 2000. In transaltion control of gene expression, pp 529-546, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

45. Chesters, J. K. 1966. Protein synthesis by cell-free extracts of Crithidia oncopelti. Biochim Biophys Acta 114:385-97.

46. Christie, J. M., P. Reymond, G. K. Powell, P. Bernasconi, A. A. Raibekas, E. Liscum, and W. R. Briggs. 1998. Arabidopsis NPH1: a flavoprotein with the properties of a photoreceptor for phototropism. Science 282:1698-701.

47. Chumpolkulwong, N., C. Hori-Takemoto, T. Hosaka, T. Inaoka, T. Kigawa, M.

48. Shirouzu, K. Ochi, and S. Yokoyama. 2004. Effects of Escherichia coli ribosomal protein SI2 mutations on cell-free protein synthesis. Eur J Biochem 271:1127-34.

49. Clayton, С. E. 1999. Genetic manipulation ofkinetoplastida. Parasitol Today 15:372-8.

50. Clemens, M. J., and U. A. Bommer. 1999. Translational control: the cancer connection. Int J Biochem Cell Biol 31:1-23.

51. Clemens, M. J., V. M. Pain, S. T. Wong, and E. C. Henshaw. 1982. Phosphorylation inhibits guanine nucleotide exchange on eukaryotic initiation factor 2. Nature 296:93-5.

52. Cohen, H. M., D. S. Tawfik, and A. D. Griffiths. 2004. Altering the sequence specificity of Haelll methyltransferase by directed evolution using in vitro compartmentalization. Protein Eng Des Sel 17:3-11.

53. Colilla, F. J., A. Rocher, and E. Mendez. 1990. gamma-Purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm. FEBS Lett 270:191-4.

54. Cornelissen, A. W., M. P. Verspieren, J. J. Toulme, B. W. Swinkels, and P. Borst.1986. The common 5' terminal sequence on trypanosome mRNAs: a target for anti-messenger oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res 14:5605-14.

55. Cornish, V. W., D. R. Benson, C. A. Altenbach, K. Hideg, W. L. Hubbell, and P. G. Schultz. 1994. Site-specific incorporation of biophysical probes into proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 91:2910-4.

56. Craig, A. W., A. Haghighat, A. T. Yu, and N. Sonenberg. 1998. Interaction of polyadenylate-bindingprotein with the eIF4G homologue PAIP enhances translation. Nature 392:520-3.

57. Cross, M., M. C. Taylor, and P. Borst. 1998. Frequent loss of the active site during variant surface glycoprotein expression site switching in vitro in Trypanosoma brucei. Mol Cell Biol 18:198-205.

58. Cuatrecasas, P., S. Fuchs, and С. B. Anfinsen. 1967. Catalytic properties andspecificity of the extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. J Biol Chem 242:1541-7.

59. Daoud, A., and P. N. Usherwood. 1975. Action ofkainic acid on a glutamatergic synapse. Comp Biochem Physiol С 52:51-3.

60. Dever, Т. E. 1999. Translation initiation: adept at adapting. Trends Biochem Sci 24:398-403.

61. DeVries, J. К., and G. Zubay. 1967. DNA-directedpeptide synthesis. II. The synthesis of the alpha-fragment of the enzyme beta-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A 57:1010-2.

62. Dhalia, R., C. R. Reis, E. R. Freire, P. O. Rocha, R. Katz, J. R. Muniz, N. Standart,and O. P. de Melo Neto. 2005. Translation initiation in Leishmania major: characterisation of multiple eIF4F submit homologues. Mol Biochem Parasitol 140:23-41.

63. Drocourt, D., T. Calmels, J. P. Reynes, M. Baron, and G. Tiraby. 1990. Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance. Nucleic Acids Res 18:4009.

64. Duszenko, M., X. Kang, U. Bohme, R. Homke, and M. Lehner. 1999. In vitrotranslation in a cell-free system from Trypanosoma brucei yields glycosylated and glycosylphosphatidylinositol-anchoredproteins. Eur J Biochem 266:789-97.

65. Duse, M., R. Merlini, R. Gardenghi, and V. Porteri. 1998. Oxatomide in the treatment of atopic dermatitis. Minerva Pediatr 50:359-65.

66. Elbaz, Y., S. Steiner-Mordoch, T. Danieli, and S. Schuldiner. 2004. In vitro synthesis offully functional EmrE, a multidrug transporter, and study of its oligomer ic state. Proc Natl Acad Sci U S A 101:1519-24.

67. Ellman, J., D. Mendel, S. Anthony-Cahill, C. J. Noren, and P. G. Schultz. 1991.

68. Biosynthetic methodfor introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins. Methods Enzymol 202:301-36.

69. Endo, Y., Т. Oka, K. Ogata, and Y. Natori. 1993. Production of dihydrofolatereductase by an improved continuous flow cell-free translation system using wheat germ extract. Tokushima J Exp Med 40:13-7.

70. Endo, Y., S. Otsuzuki, K. Ito, and K. Miura. 1992. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. J Biotechnol 25:22130.

71. Erickson, A. H., and G. Blobel. 1983. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods Enzymol 96:38-50.

72. Falcone, D., and D. W. Andrews. 1991. Both the 5' untranslated region and thesequences surrounding the start site contribute to efficient initiation of translation in vitro. Mol Cell Biol 11:2656-64.

73. Fahey, R. C., D. L. Di Stefano, G. P. Meier, and R. N. Bryan. 1980. Role of Hydration State and Thiol-Disulfide Status in the Control of Thermal Stability and Protein Synthesis in Wheat Embryo. Plant Physiol 65:1062-1066.

74. Farrell, P. J., K. Balkow, T. Hunt, R. J. Jackson, and H. Trachsel. 1977.

75. Phosphorylation of initiation factor elF-2 and the control of reticulocyte protein synthesis. Cell 11:187-200.

76. Favre, D., and B. Muellhaupt. 2005. Reactivation of creatine kinase by dithiothreitol prior to use in an in vitro translation extract. Altex 22:259-64.

77. Feng, Y., L. E. Gunter, E. L. Organ, and D. R. Cavener. 1991. Translation initiation in Drosophila melanogaster is reduced by mutations upstream of the A UG initiator codon. Mol Cell Biol 11:2149-53.

78. Fraser, C. S., and J. A. Doudna. 2007. Structural and mechanistic insights into hepatitis С viral translation initiation. Nat Rev Microbiol 5:29-38.

79. Gallie, D. R. 1991. The cap and poly(A) tail function synergistically to regulate mRNA translational efficiency. Genes Dev 5:2108-16.

80. Gallie, D. R. 1998. A tale of two termini: a functional interaction between the termini of an mRNA is a prerequisite for efficient translation initiation. Gene 216:1-11.

81. Ganoza, M. С., E. C. Kofoid, P. Marliere, and B. G. Louis. 1987. Potential secondary structure at translation-initiation sites. Nucleic Acids Res 15:345-60.

82. Ganoza, M. C., and B. G. Louis. 1994. Potential secondary structure at thetranslational start domain of eukaryotic andprokaryotic mRNAs. Biochimie 76:428-39.

83. Gao, H., M. J. Ayub, M. J. Levin, and J. Frank. 2005. The structure of the 80Sribosome from Trypanosoma cruzi reveals unique rRNA components. Proc Natl Acad Sci US A 102:10206-11.

84. Gavrilova, L. P., О. E. Kostiashkina, V. E. Koteliansky, N. M. Rutkevitch, and A. S. Spirin. 1976. Factor-free ("non-enzymic") andfactor-dependent systems of translation of polyuridylic acid by Escherichia coli ribosomes. J Mol Biol 101:53752.

85. Gavrilova, L. P., and A. S. Spirin. 1971. Stimulation of "non-enzymic" translocation in ribosomes by p-chloromercuribenzoate. FEBS Lett 17:324-326.

86. Ghadessy, F. J., J. L. Ong, and P. Holliger. 2001. Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication. Proc Natl Acad Sci U S A 98:45527.

87. Gingras, А. С., B. Raught, and N. Sonenberg. 1999. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem 68:913-63.

88. Gradi, A., H. Imataka, Y. V. Svitkin, E. Rom, B. Raught, S. Morino, and N.

89. Sonenberg. 1998. A novel functional human eukaryotic translation initiation factor 4G. Mol Cell Biol 18:334-42.

90. Grifo, J. A., S. M. Tahara, M. A. Morgan, A. J. Shatkin, and W. C. Merrick. 1983.

91. New initiation factor activity requiredfor globin mRNA translation. J Biol Chem 258:5804-10.

92. Gross, M., and M. S. Rubino. 1989. Regulation of eukaryotic initiation factor-2B activity by polyamines and amino acid starvation in rabbit reticulocyte lysate. J Biol Chem 264:21879-84.

93. Gudkov, А. Т., M. V. Ozerova, V. M. Shiryaev, and A. S. Spirin. 2005. 5'-poly(A) sequence as an effective leader for translation in eukaryotic cell-free systems. Biotechnol Bioeng 91:468-73.

94. Guignard, L., K. Ozawa, S. E. Pursglove, G. Otting, and N. E. Dixon. 2002. NMR analysis of in vitro-synthesizedproteins without purification: a high-throughput approach. FEBS Lett 524:159-62.

95. Haeuptle, M. Т., R. Frank, and B. Dobberstein. 1986. Translation arrest by oligodeoxynucleotides complementary to mRNA coding sequences yields polypeptides of predetermined length. Nucleic Acids Res 14:1427-48.

96. Hall, M. N., J. Gabay, M. Debarbouille, and M. Schwartz. 1982. A role for mRNA secondary structure in the control of translation initiation. Nature 295:616-8.

97. Hamilton, R., С. К. Watanabe, and H. A. deBoer. 1987. Compilation and comparison of the sequence context around the AUG startcodons in Saccharomyces cerevisiae mRNAs. Nucleic Acids Res 15:3581-93.

98. Hamlin, J., and I. Zabin. 1972. -Galactosidase: immunological activity of ribosome-bound, growing polypeptide chains. Proc Natl Acad Sci U S A 69:412-6.

99. Hanes, J., and A. Pluckthun. 1997. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc Natl Acad Sci U S A 94:4937-42.

100. Harding, H. P., Y. Zhang, and D. Ron. 1999. Protein translation andfolding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature 397:271-4.

101. Hartl, F. U., and M. Hayer-Hartl. 2002. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science 295:1852-8.

102. He, H., T. von der Haar, C. R. Singh, M. Ii, B. Li, A. G. Hinnebusch, J. E.

103. McCarthy, and K. Asano. 2003. The yeast eukaryotic initiation factor 4G (eIF4G) HEAT domain interacts with elFl and eIF5 and is involved in stringent AUG selection. Mol Cell Biol 23:5431-45.

104. Hentschel, С. C., and M. L. Birnstiel. 1981. The organization and expression ofhistone gene families. Cell 25:301-13.

105. Hentze, M. W. 1997. eIF4G: a multipurpose ribosome adapter? Science 275:500-1.

106. Hershey J.W.B., Mathews M.B., and Sonenberg N., In Translational Control eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. New York)

107. Hershey, J. W. B. & Merrick, W. C. in Translational Control of Gene Expression (eds Sonenberg, N. et al.) 33-188 (Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 2000)

108. Hershey J.W., Merrick, W.C., 2000. Pathway and mechanism of initiation ofprotein synthesis. In Translational Control of Gene Expression, Sonenberg N Cold Spring Harbor, NY, USA

109. Herskovits, A. A., and E. Bibi. 2000. Association of Escherichia coli ribosomes with the inner membrane requires the signal recognition particle receptor but is independent of the signal recognition particle. Proc Natl Acad Sci U S A 97:46216.

110. Hinnebusch, A. G. 1993. Gene-specific translational control of the yeast GCN4 gene by phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2. Mol Microbiol 10:215-23.

111. Hoagland, M. В., E. B. Keller, and P. C. Zamecnik. 1956. Enzymatic carboxyl activation of amino acids. J Biol Chem 218:345-58.

112. Hoffmann, M., С. Nemetz, К. Madin, and В. Buchberger. 2004. Rapid translation system: a novel cell-free way from gene to protein. Biotechnol Annu Rev 10:1-30.

113. Hongo, M., S. Ohara, S. Asaki, Y. Goto, H. Sakurada, D. Shibuya, and T. Kimpara.1988. Analysis of ambulatory 24-hour intragastric pH monitoring—comparison of the effects of cimetidine 200 mg QID and 800 mg UID. Nippon Shokakibyo Gakkai Zasshi 85:659-66.

114. Hori, H., S. Kubota, K. Watanabe, J. M. Kim, T. Ogasawara, T. Sawasaki, and Y. Endo. 2003. Aquifex aeolicus tRNA (Gml8) methyltransferase has unique substrate specificity. TRNA recognition mechanism of the enzyme. J Biol Chem 278:2508190.

115. Horvath, A., M. Nebohacova, J. Lukes, and D. A. Maslov. 2002. Unusual polypeptide synthesis in the kinetoplast-mitochondria from Leishmania tarentolae. Identification of individual de novo translation products. J Biol Chem 277:722230.

116. Huber, T. W. 1985. The automicrobic system for detection of bacteriuria. Efficacy of revised urine identification cards. Am J Clin Pathol 84:637-42.

117. Hughes, A. L., and H. Piontkivska. 2003. Phylogeny ofTrypanosomatidae and Bodonidae (Kinetoplastida) based on 18S rRNA: evidence for paraphyly of Trypanosoma and six other genera. Mol Biol Evol 20:644-52.

118. Huttenhofer, A., and H. F. Noller. 1994. Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes. Embo J 13:3892-901.1.eda, К., H. Nakazawa, A. Shimo-Oka, K. Ishio, S. Miyata, Y. Hosokawa, S.

119. Jack, H. M., J. Berg, and M. Wabl. 1989. Translation affects immunoglobulin mRNA stability. Eur J Immunol 19:843-7.

120. Jackson, R.J., 1996. A comparative view of initiation site selection mechanisms. In Translational Control. Edited by Hershey JWB, Mathews MB, Sonenberg N. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 71-112

121. Jackson, R. J., P. Herbert, E. A. Campbell, and T. Hunt. 1983. The roles of sugar phosphates and thiol-reducing systems in the control of reticulocyte protein synthesis. Eur J Biochem 131:313-24.

122. Jackson, R. J., and T. Hunt. 1983. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods Enzymol 96:50-74.

123. Jackson, R. J., and T. Hunt. 1978. The use ofhexose phosphates to support protein synthesis and generate gamma-32P.ATP in reticulocyte lysates. FEBS Lett 93:235-8.

124. Jewett, M. C., and J. R. Swartz. 2004. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng 86:19-26.

125. Jewett, M. C., and J. R. Swartz. 2004. Rapid expression and purification of 100 nmol quantities of active protein using cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog 20:102-9.

126. Jewett, M. C., and J. R. Swartz. 2004. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng 87:465-72.

127. Jiang, X., Y. Ookubo, I. Fujii, H. Nakano, and T. Yamane. 2002. Expression of Fab fragment of catalytic antibody 6D9 in an Escherichia coli in vitro coupled transcription/translation system. FEBS Lett 514:290-4.

128. Jivotovskaya, A. V., L. Valasek, A. G. Hinnebusch, and К. H. Nielsen. 2006. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S submits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol 26:135572.

129. Jobling, S. A., and L. Gehrke. 1987. Enhanced translation of chimaeric messenger RNAs containing a plant viral untranslated leader sequence. Nature 325:622-5.

130. Johnson, Т., J. Zhu, and R. M. Wartell. 1998. Differences between DNA base pair stacking energies are conserved over a wide range of ionic conditions. Biochemistry 37:12343-50.

131. Johnson F.B., H. Stern. 1957. Mass isolation of viable wheat embryos. Nature 179:160161.

132. Joshi, С. P., H. Zhou, X. Huang, and V. L. Chiang. 1997. Context sequences of translation initiation codon in plants. Plant Mol Biol 35:993-1001.

133. Jurado, P., D. Ritz, J. Beckwith, V. de Lorenzo, and L. A. Fernandez. 2002.

134. Production offunctional single-chain Fv antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol 320:1-10.

135. Kahan, D., A. C. Zahalsky, and S. H. Hutner. 1968. Protein synthesis in cell-free preparation of Crithidiafasciculata. J Protozool 15:385-90.

136. Kahvejian, A., Y. V. Svitkin, R. Sukarieh, M. N. M'Boutchou, and N. Sonenberg.2005. Mammalianpoly(A)-bindingprotein is a eukaryotic translation initiation factor, which acts via multiple mechanisms. Genes Dev 19:104-13.

137. Kanno, Т., К. Kasai, Y. Ikejiri-Kanno, K. Wakasa, and Y. Tozawa. 2004. In vitro reconstitution of rice anthranilate synthase: distinct functional properties of the alpha submits OASA1 andOASA2. Plant Mol Biol 54:11-22.

138. Kaufman,R.J., 2000. Double-stranded-RNA-activatedprotein kinase. In transaltion control of gene expression pp 529-546, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

139. Kawarasaki, Y., S. Kasahara, N. Kodera, T. Shinbata, S. Sekiguchi, H. Nakano, and T. Yamane. 2000. A trimmed viral cap-independent translation enhancing sequence for rapid in vitro gene expression. Biotechnol Prog 16:517-21.

140. Kawarasaki, Y., T. Kawai, H. Nakano, and T. Yamane. 1995. A long-lived batch reaction system of cell-free protein synthesis. Anal Biochem 226:320-4.

141. Kawarasaki, Y., H. Nakano, and T. Yamane. 1998. Phosphatase-immunodepleted cell-free protein synthesis system. J Biotechnol 61:199-208.

142. Kawarasaki, Y., H. Nakano, and T. Yamane. 1994. Prolonged cell-free proteinsynthesis in a batch system using wheat germ extract. Biosci Biotechnol Biochem 58:1911-3.

143. Kawasaki, E. S. 1985. Quantitative hybridization-arrest of mRNA in Xenopus oocytes using single-stranded complementary DNA or oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res 13:4991-5004.

144. Keefe, A. D., and J. W. Szostak. 2001. Functional proteins from a random-sequence library. Nature 410:715-8.

145. Kerekatte, V., B. D. Keiper, C. Badorff, A. Cai, K. U. Knowlton, and R. E. Rhoads.1999. Cleavage ofPoly(A)-bindingprotein by coxsackievirus 2A protease in vitro and in vivo: another mechanism for host protein synthesis shutojf? J Virol 73:70917.

146. Kiefer, H. 2003. In vitro folding of alpha-helical membrane proteins. Biochim Biophys Acta 1610:57-62.

147. Kigawa, Т., Y. Muto, and S. Yokoyama. 1995. Cell-free synthesis and amino acid-selective stable isotope labeling ofproteins for NMR analysis. J Biomol NMR 6:129-34.

148. Kigawa, Т., Т. Yabuki, N. Matsuda, T. Matsuda, R. Nakajima, A. Tanaka, and S. Yokoyama. 2004. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. J Struct Funct Genomics 5:63-8.

149. Kigawa, Т., Т. Yabuki, and S. Yokoyama. 1999. Large-scale protein preparation using the cell-free synthesis. Tanpakushitsu Kakusan Koso 44:598-605.

150. Kigawa, Т., Т. Yabuki, Y. Yoshida, M. Tsutsui, Y. Ito, T. Shibata, and S.

151. Yokoyama. 1999. Cell-free production and stable-isotope labeling of milligram quantities of proteins. FEBS Lett 442:15-9.

152. Kiho, Y., and A. Rich. 1964. Induced Enzyme Formed On Bacterial Polyribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A 51:111-8.

153. Kim, D. M., and C. Y. Choi. 1996. A semicontinuousprokaryotic coupledtranscription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnol Prog 12:645-9.

154. Kim, D. M., T. Kigawa, C. Y. Choi, and S. Yokoyama. 1996. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem 239:881-6.

155. Kim, D. M., and J. R. Swartz. 2000. Prolonging cell-free protein synthesis by selective reagent additions. Biotechnol Prog 16:385-90.

156. Kim, D. M., and J. R. Swartz. 1999. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng 66:180-8.

157. Kim, D. M., and J. R. Swartz. 2001. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng 74:30916.

158. Kim, T. W., D. M. Kim, and C. Y. Choi. 2006. Rapid production of milligramquantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. J Biotechnol 124:373-80.

159. Klammt, C., F. Lohr, B. Schafer, W. Haase, V. Dotsch, H. Ruterjans, C. Glaubitz, and F. Bernhard. 2004. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. Eur J Biochem 271:568-80.

160. Kolb, V. A., E. V. Makeyev, and A. S. Spirin. 2000. Co-translational folding of an eukaryotic multidomain protein in aprokaryotic translation system. J Biol Chem 275:16597-601.

161. Kolb, V. A., E. V. Makeyev, and A. S. Spirin. 1994. Folding of firefly luciferase during translation in a cell-free system. Embo J 13:3631-7.

162. Konarska, M., W. Filipowicz, H. Domdey, and H. J. Gross. 1981. Binding of ribosomes to linear and circular forms of the 5'-terminal leader fragment of tobacco-mosaic-virus RNA. Eur J Biochem 114:221-7.

163. Korneeva, N. L., E. A. First, C. A. Benoit, and R. E. Rhoads. 2005. Interaction between the NH2-teminal domain of eIF4A and the central domain of eIF4G modulates RNA-stimulatedATPase activity. J Biol Chem 280:1872-81.

164. Korneeva, N. L., B. J. Lamphear, F. L. Hennigan, W. C. Merrick, and R. E. Rhoads.2001. Characterization of the two eIF4A-binding sites on human eIF4G-I. J Biol Chem 276:2872-9.

165. Korneeva, N. L., B. J. Lamphear, F. L. Hennigan, and R. E. Rhoads. 2000. Mutually cooperative binding of eukaryotic translation initiation factor (elF) 3 and eIF4A to human eIF4G-l. J Biol Chem 275:41369-76.

166. Kovtun, A. A., N. E. Shirokikh, A. T. Gudkov, and A. S. Spirin. 2007. The leader sequence of tobacco mosaic virus RNA devoid of Watson-Crick secondary structure possesses a cooperatively melted, compact conformation. Biochem Biophys Res Commun.

167. Kozak, M. 1980b. Evaluation of the "scanning model" for initiation ofprotein synthesis in eucaryotes. Cell 22:7-8.

168. Kozak, M. 1990. Evaluation of the fidelity of initiation of translation in reticulocyte lysates from commercial sources. Nucleic Acids Res 18:2828.

169. Kozak, M. 1989a. The scanning model for translation: an update. J Cell Biol 108:22941.

170. Kozak, M., and A. J. Shatkin. 1977. Sequences and properties of two ribosome binding sites from the small size class of reovirus messenger RNA. J Biol Chem 252:6895908.

171. Kozak, M. 1980a. Influence of mRNA secondary structure on binding and migration of 40S ribosomal submits. Cell 19:79-90.

172. Kozak, M. 1981. Possible role offlanking nucleotides in recognition of the A UG initiator codon by eukaryotic ribosomes. Nucleic Acids Res 9:5233-52.

173. Kozak, M. 1986a. Influences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A 83:2850-4.

174. Kozak, M. 1986b. Point mutations define a sequence flanking the A UG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 44:283-92.

175. Kozak, M. 1987a. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Res 15:8125-48.

176. Kozak, M. 1987b. At least six nucleotides preceding the A UG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J Mol Biol 196:947-50.

177. Kozak, M. 1989b. Circumstances and mechanisms of inhibition of translation by secondary structure in eucaryotic mRNAs. Mol Cell Biol 9:5134-42.

178. Kozak, M. 1991. Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. J Biol Chem 266:19867-70.

179. Kozak, M. 1994. Determinants of translational fidelity and efficiency in vertebrate mRNAs. Biochimie 76:815-21.

180. Kozak, M. 1999. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene 234:187208.

181. Kozak, M. 2001. Constraints on reinitiation of translation in mammals. Nucleic Acids Res 29:5226-32.

182. Kozak, M. 2005. Regulation of translation via mRNA structure in prokaryotes and eukaryotes. Gene 361:13-37.

183. Kuem, J. W., T. W. Kim, C. G. Park, C. Y. Choi, and D. M. Kim. 2006. Oxalate enhances protein synthesis in cell-free synthesis system utilizing 3-phosphoglycerate as energy source. J Biosci Bioeng 101:162-5.

184. Kushnir, S., K. Gase, R. Breitling, and K. Alexandrov. 2005. Development of an inducible protein expression system based on the protozoan host Leishmania tarentolae. Protein Expr Purif 42:37-46.

185. Madhubala, R., and A. E. Pegg. 1992. Inhibition of ornithine decarboxylase and S-adenosylmethionine decarboxylase synthesis by antisense oligodeoxynucleotides. Mol Cell Biochem 118:191-5.

186. Madin, К., Т. Sawasaki, N. Kamura, К. Takai, Т. Ogasawara, К. Yazaki, Т. Takei, К. Miura, and Y. Endo. 2004. Formation of circular polyribosomes in wheat germ cell-free protein synthesis system. FEBS Lett 562:155-9.

187. Madin, К., T. Sawasaki, T. Ogasawara, and Y. Endo. 2000. A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A 97:559-64.

188. Mager, J., and F. Lipmann. 1958. Amino Acid Incorporation And The Reversion Of Its Initial Phase With Cell-Free Tetrahymena Preparations. Proc Natl Acad Sci U S A 44:305-9.

189. Maher, L. J., 3rd, and B. J. Dolnick. 1987. Specific hybridization arrest of dihydrofolate reductase mRNA in vitro using anti-sense RNA or anti-sense oligonucleotides. Arch Biochem Biophys 253:214-20.

190. Mair, G., E. Ullu, and C. Tschudi. 2000. Cotranscriptional cap 4 formation on the Trypanosoma brucei spliced leader RNA. J Biol Chem 275:28994-9.

191. Mamaev, S., J. Olejnik, E. K. Olejnik, and K. J. Rothschild. 2004. Cell-free Nterminalprotein labeling using initiator suppressor tRNA. Anal Biochem 326:2532.

192. Marcus, A., D. Efron, and D. P. Weeks. 1974. The wheat embryo cell-free system. Methods Enzymol 30:749-54.

193. Marcus, A., and J. Feeley. 1966. Ribosome Activation And Polysome Formation In Vitro: Requirement For Atp. Proc Natl Acad Sci U S A 56:1770-1777.

194. Marcus, A., and D. P. Weeks. 1971. Preformed messenger of quiescent wheat embryos. Biochem J 124:6P-7P.

195. Marinos, I. C., D.N. Fife. 1971. Ultrastructural changes in wheat embryos during a "presowing. drought hardening" treatment. Protoplasma (Wien) 74: 381-396

196. Martemyanov, К. A., V. A. Shirokov, О. V. Kurnasov, A. T. Gudkov, and A. S.

197. Spirin. 2001. Cell-free production of biologically active polypeptides: application to the synthesis of antibacterial peptide cecropin. Protein Expr Purif 21:456-61.

198. Martin, G. A., R. Kawaguchi, Y. Lam, A. DeGiovanni, M. Fukushima, and W.

199. Mutter. 2001. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. Biotechniques 31:948-50, 952-3.

200. Martinez-Calvillo, S., S. Yan, D. Nguyen, M. Fox, K. Stuart, and P. J. Myler. 2003. Transcription of Leishmania major Friedlin chromosome 1 initiates in both directions within a single region. Mol Cell 11:1291-9.

201. Mathews M.B., N. Sonenberg, and J.W.B. Hershey. 1996. Origins and targets of translational control. In Translational Control (Mathews MB Sonenberg, N. and Hershey, J.W.B. eds). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press: pp. 1-29

202. Matsuda, D., and T. W. Dreher. 2006. Close spacing of AUG initiation codons confers dicistronic character on a eukaryotic mRNA. Rna 12:1338-49.

203. Matsushita, M. 1959. On the protein formation and the changes of the amounts of RNA and ribonuclease activity in the grains during the ripening process of wheat. Mem. Res. Inst. Food Sci.,Kyoto University, Japan 19: 1-5

204. Mattheakis, L. C., R. R. Bhatt, and W. J. Dower. 1994. An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-6.

205. Matveev, S. V., L. M. Vinokurov, L. A. Shaloiko, C. Davies, E. A. Matveeva, and B. Alakhov Yu. 1996. Effect of the ATP level on the overall protein biosynthesis rate in a wheat germ cell-free system. Biochim Biophys Acta 1293:207-12.

206. McCallum, C. D., H. Do, A. E. Johnson, and J. Frydman. 2000. The interaction of the chaperonin tailless complex polypeptide 1 (TCP1) ring complex (TRiC) with ribosome-bound nascent chains examined using photo-cross-linking. J Cell Biol 149:591-602.

207. Merk, H., W. Stiege, K. Tsumoto, I. Kumagai, and V. A. Erdmann. 1999. Cell-free expression of two single-chain monoclonal antibodies against lysozyme: effect of domain arrangement on the expression. J Biochem (Tokyo) 125:328-33.

208. Merkel, J. S., G. A. Michaud, M. Salcius, B. Schweitzer, and P. F. Predki. 2005. Functional protein microarrays: just how functional are they? Curr Opin Biotechnol 16:447-52.

209. Meulewaeter, F., X. Danthinne, M. Van Montagu, and M. Cornelissen. 1998. 5'- and 3'-sequences of satellite tobacco necrosis virus RNA promoting translation in tobacco. Plant J 14:169-76.

210. Michel-Reydellet, N., K. Calhoun, and J. Swartz. 2004. Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome. Metab Eng 6:197-203.

211. Michel-Reydellet, N., K. Woodrow, and J. Swartz. 2005. Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts. J Mol Microbiol Biotechnol 9:26-34.

212. Miyamoto-Sato, E., N. Nemoto, K. Kobayashi, and H. Yanagawa. 2000. Specific bonding ofpuromycin to full-length protein at the C-terminus. Nucleic Acids Res 28:1176-82.

213. Miyazaki, Т., M. Ono, W. M. Qu, M. C. Zhang, S. Mori, S. Nakatsuru, Y.

214. Nakamura, T. Sawasaki, Y. Endo, and M. Nose. 2005. Implication of allelic polymorphism of osteopontin in the development of lupus nephritis in MRL/lpr mice. Eur J Immunol 35:1510-20.

215. Moreno, S. N., H. S. Ip, and G. A. Cross. 1991. An mRNA-dependent in vitrotranslation system from Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol 46:265-74.

216. Morino, S., H. Imataka, Y. V. Svitkin, Т. V. Pestova, and N. Sonenberg. 2000.

217. Eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) binding site and the middle one-third of eIF4GI constitute the core domain for cap-dependent translation, and the C-terminal one-thirdfunctions as a modulatory region. Mol Cell Biol 20:468-77.

218. Morita, E. H., M. Shimizu, T. Ogasawara, Y. Endo, R. Tanaka, and T. Kohno. 2004. A novel way of amino acid-specific assignment in (I)H-(I5)N HSQC spectra with a wheat germ cell-free protein synthesis system. J Biomol NMR 30:37-45.

219. Morley, S. J., W. J. Buhl, and R. J. Jackson. 1985. A rabbit reticulocyte factor which stimulates protein synthesis in several mammalian cell-free systems. Biochim Biophys Acta 825:57-69.

220. Moteki, S., and D. Price. 2002. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Mol Cell 10:599-609.

221. Munroe, D., and A. Jacobson. 1990. mRNA poly(A) tail, a 3' enhancer of translational initiation. Mol Cell Biol 10:3441-55.

222. Munson, L. M., G. D. Stormo, R. L. Niece, and W. S. Reznikoff. 1984. lacZ translation initiation mutations. J Mol Biol 177:663-83.

223. Nakano, H., T. Shinbata, R. Okumura, S. Sekiguchi, M. Fujishiro, and T. Yamane.1999. Efficient coupled transcription/translation from PCR template by a hollow-fiber membrane bioreactor. Biotechnol Bioeng 64:194-9.

224. Nakano, H., Т. Tanaka, Y. Kawarasaki, and T. Yamane. 1994. An increased rate of cell-free protein synthesis by condensing wheat-germ extract with ultrafiltration membranes. Biosci Biotechnol Biochem 58:631-4.

225. Nemoto, N., E. Miyamoto-Sato, Y. Husimi, and H. Yanagawa. 1997. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3 '-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. FEBS Lett 414:405-8.

226. Nemoto, N., E. Miyamoto-Sato, and H. Yanagawa. 1999. Fluorescence labeling of the C-terminus of proteins with a puromycin analogue in cell-free translation systems. FEBS Lett 462:43-6.

227. Netzer, W. J., and F. U. Hartl. 1997. Recombination ofprotein domains facilitated by co-translationalfolding in eukaryotes. Nature 388:343-9.

228. Nicola, A. V., W. Chen, and A. Helenius. 1999. Co-translational folding of an alphavirus capsid protein in the cytosol of living cells. Nat Cell Biol 1:341-5.

229. Nirenberg, M. W., and J. H. Matthaei. 1961. The dependence of cell-free proteinsynthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A 47:1588-602.

230. Noren, C. J., S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, and P. G. Schultz. 1989. A general methodfor site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science 244:182-8.

231. Oberer, M., A. Marintchev, and G. Wagner. 2005. Structural basis for the enhancement ofeIF4A helicase activity by eIF4G. Genes Dev 19:2212-23.

232. Oguro, A., T. Ohtsu, Y. V. Svitkin, N. Sonenberg, and Y. Nakamura. 2003. RNA aptamers to initiation factor 4A helicase hinder cap-dependent translation by blocking ATP hydrolysis. Rna 9:394-407.

233. Okada, Т., M. Sugihara, A. N. Bondar, M. Elstner, P. Entel, and V. Buss. 2004. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 A crystal structure. J Mol Biol 342:571-83.

234. Oldfleld, S., and C. G. Proud. 1992. Purification, phosphorylation and control of the guanine-nucleotide-exchange factor from rabbit reticulocyte lysates. Eur J Biochem 208:73-81.

235. Palmiter, R. D. 1973. Ovalbumin messenger ribonucleic acid translation. Comparable rates of polypeptide initiation and elongation on ovalbumin and globin messenger ribonucleic acid in a rabbit reticulocyte lysate. J Biol Chem 248:2095-106.

236. Pap, M., and G. M. Cooper. 2002. Role of translation initiation factor 2 В in control of cell survival by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3beta signaling pathway. Mol Cell Biol 22:578-86.

237. Pelham, H. R., and R. J. Jackson. 1976. An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur J Biochem 67:247-56.

238. Pesole, G., C. Gissi, G. Grillo, F. LicciuIIi, S. Liuni, and C. Saccone. 2000. Analysis of oligonucleotide AUG start codon context in eukariotic mRNAs. Gene 261:85-91.

239. Pestova, Т. V., S. I. Borukhov, and C. U. Hellen. 1998. Eukaryotic ribosomes require initiation factors 1 and 1A to locate initiation codons. Nature 394:854-9.

240. Pestova, Т. V., and V. G. Kolupaeva. 2002. The roles of individual eukaryotictranslation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Genes Dev 16:2906-22.

241. Pestova, Т. V., V. G. Kolupaeva, I. B. Lomakin, E. V. Pilipenko, I. N. Shatsky, V. I. Ago), and C. U. Hellen. 2001 .Molecular mechanisms of translation initiation in eukaryotes. Proc Natl Acad Sci U S A 98:7029-36.

242. Piron, M., P. Vende, J. Cohen, and D. Poncet. 1998. Rotavirus RNA-bindingprotein NSP3 interacts with eIF4GI and evicts the poly (A) binding protein from eIF4F. Embo J 17:5811-21.

243. Pollard, К. M., E. K. Chan, B. J. Grant, K. F. Sullivan, E. M. Tan, and C. A. Glass.1990. In vitro posttranslational modification oflamin В clonedfrom a human T-cell line. Mol Cell Biol 10:2164-75.

244. Preiss, Т., and M. W. Hentze. 1998. Dual function of the messenger RNA cap structure inpoly(A)-tail-promoted translation in yeast. Nature 392:516-20.

245. Pornillos, O., Y. J. Chen, A. P. Chen, and G. Chang. 2005. X-ray structure of the EmrE multidrug transporter in complex with a substrate. Science 310:1950-3.

246. Presper, К. A., and E. C. Heath. 1986. Biosynthesis and processing of a variant surface glycoprotein from Trypanosoma brucei brucei. Arch Biochem Biophys 246:460-8.

247. Preugschat, F., D. R. Averett, В. E. Clarke, and D. J. Porter. 1996. A steady-state and pre-steady-state kinetic analysis of the NTPase activity associated with the hepatitis С virus NS3 helicase domain. J Biol Chem 271:24449-57.

248. Prevot, D., D. Decimo, С. H. Herbreteau, F. Roux, J. Garin, J. L. Darlix, and T. Ohlmann. 2003. Characterization of a novel RNA-binding region of elF4Gl critical for ribosomal scanning. Embo J 22:1909-21.

249. Pudi, R., S. Abhiman, N. Srinivasan, and S. Das. 2003. Hepatitis С virus internal ribosome entry site-mediated translation is stimulated by specific interaction of independent regions of human La autoantigen. J Biol Chem 278:12231 -40.

250. Ramachandiran, V., G. Kramer, and B. Hardesty. 2000. Expression of different coding sequences in cell-free bacterial and eukaryotic systems indicates translational pausing on Escherichia coli ribosomes. FEBS Lett 482:185-8.

251. Raman, P., V. Cherezov, and M. Caffrey. 2006. The Membrane Protein Data Bank. Cell Mol Life Sci 63:36-51.

252. Ready, M. P., D. T. Brown, and J. D. Robertus. 1986. Extracellular localization of pokeweed antiviral protein. Proc Natl Acad Sci U S A 83:5053-6.

253. Requena, J. M., L. Quijada, M. Soto, and C. Alonso. 2003. Conserved nucleotides surrounding the trans-splicing acceptor site and the translation initiation codon in Leishmania genes. Exp Parasitol 103:78-81.

254. Richter-Cook, N. J., Т. E. Dever, J. O. Hensold, and W. C. Merrick. 1998.

255. Purification and characterization of a new eukaryotic protein translation factor. Eukaryotic initiation factor 4H. J Biol Chem 273:7579-87.

256. Roberts, В. E., and В. M. Paterson. 1973. Efficient translation of tobacco mosaic virus RNA and rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ. Proc Natl Acad Sci U S A 70:2330-4.

257. Robinson, К. A., and S. M. Beverley. 2003. Improvements in transfection efficiency and tests of RNA interference (RNAi) approaches in the protozoan parasite Leishmania. Mol Biochem Parasitol 128:217-28.

258. Rogers, G. W., Jr., N. J. Richter, and W. C. Merrick. 1999. Biochemical and kinetic characterization of the RNA helicase activity of eukaryotic initiation factor 4A. J Biol Chem 274:12236-44.

259. Rogers, K. L., I. D. Grice, and L. R. Griffiths. 2001. Modulation of in vitro platelet 5-HTrelease by species of Erythrina and Cymbopogon. Life Sci 69:1817-29.

260. Rovis, L., and S. Baekkeskov. 1980. Sub-cellular fractionation of Trypanosoma brucei. Isolation and characterization of plasma membranes. Parasitology 80:507-24.

261. Ryabova, L. A., D. Desplancq, A. S. Spirin, and A. Pluckthun. 1997. Functional antibody production using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones. Nat Biotechnol 15:79-84.

262. Ryabova, L. A., S. A. Ortlepp, and V. I. Baranov. 1989. Preparative synthesis of globin in a continuous cell-free translation system from rabbit reticulocytes. Nucleic Acids Res 17:4412.

263. Ryabova, L. A., L. M. Vinokurov, E. A. Shekhovtsova, Y. B. Alakhov, and A. S. Spirin. 1995. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem 226:184-6.

264. Saenger, W., 1984. Principles of Nucleic Acid Structure. Springer-Verlag New York Inc. New York, NY USA.

265. Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1992. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. 1977. Biotechnology 24:104-8.

266. Santhamma, K. R., and A. Bhaduri. 1995. Characterization of the respiratory chain of Leishmania donovanipromastigotes. Mol Biochem Parasitol 75:43-53.

267. Savabi, F., C. L. Carpenter, C. Mohan, and S. P. Bessman. 1988. The polysome as a terminal for the creatine phosphate energy shuttle. Biochem Med Metab Biol 40:291-8.

268. Sawasaki, Т., Y. Hasegawa, R. Morishita, M. Seki, K. Shinozaki, and Y. Endo. 2004. Genome-scale, biochemical annotation method based on the wheat germ cell-free protein synthesis system. Phytochemistry 65:1549-55.

269. Sawasaki, Т., Y. Hasegawa, M. Tsuchimochi, N. Kamura, T. Ogasawara, T.

270. Kuroita, and Y. Endo. 2002. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Lett 514:102-5.

271. Sawasaki, Т., Т. Ogasawara, R. Morishita, and Y. Endo. 2002. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A 99:14652-7.

272. Scheffter, S. M., Y. T. Ro, I. K. Chung, and J. L. Patterson. 1995. The complete sequence of Leishmania RNA virus LRV2-1, a virus of an Old World parasite strain. Virology 212:84-90.

273. Scheper, G. C., A. A. Thomas, and R. van Wijk. 1998. Inactivation of eukaryotic initiation factor 2B in vitro by heat shock. Biochem J 334 (Pt 2):463-7.

274. Schreier, M. H., and T. Staehelin. 1973. Translation of duck-globin messenger RNA in a partially purified mammalian cell-free system. Eur J Biochem 34:213-8.

275. Schultes, E. A., A. Spasic, U. Mohanty, and D. P. Bartel. 2005. Compact and ordered collapse of randomly generated RNA sequences. Nat Struct Mol Biol 12:1130-6.

276. Schultz, G. A., D. Chen, and E. Katchalski. 1972. Localization of a messenger RNA in a ribosomal fraction from ungerminated wheat embryos. J Mol Biol 66:379-90.

277. Schweet, R., H. Lamfrom, and E. Allen. 1958. The Synthesis Of Hemoglobin In A Cell-Free System. Proc Natl Acad Sci U S A 44:1029-35.

278. Seol, Y., G. M. Skinner, and K. Visscher. 2004. Elastic properties of a single-stranded charged homopolymeric ribonucleotide. Phys Rev Lett 93:118102.

279. Shaloiko, L. A., I. E. Granovsky, Т. V. Ivashina, V. N. Ksenzenko, V. A. Shirokov, and A. S. Spirin. 2004. Effective non-viral leader for cap-independent translation in a eukaryotic cell-free system. Biotechnol Bioeng 88:730-9.

280. Shimizu, Y., A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, and T. Ueda. 2001. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol 19:751-5.

281. Smith, D. W. 1975. Reticulocyte transfer RNA and hemoglobin synthesis. Science 190:529-35.

282. Sonenberg, N. 1993. Remarks on the mechanism of ribosome binding to eukaryotic mRNAs. Gene Expr 3:317-23.

283. Sonnemann, J., and R. Mutzel. 1995. Cytosolic nucleoside diphosphate kinaseassociated with the translation apparatus may provide GTP for protein synthesis. Biochem Biophys Res Commun 209:490-6.

284. Spena, A., E. Krause, and B. Dobberstein. 1985. Translation efficiency of zein mRNA is reduced by hybridformation between the 5'- and 3'-untranslated region. Embo J 4:2153-8.

285. Spirin, A. S. 2002. Ribosome as a molecular machine. FEBS Lett 514:2-10.

286. Spirin, A.S., 1999. Ribosomes. Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York.

287. Spirin, A. S., V. I. Baranov, L. A. Ryabova, S. Y. Ovodov, and Y. B. Alakhov. 1988. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science 242:1162-4.

288. Stanton, J. D., and K. Mensa-Wilmot. 2006. AUG-proximal nucleotides regulate protein synthesis in Leishmania tropica. Mol Microbiol 61:691-703.

289. Stein, J. M. 1975. The effect of adrenaline and of alpha- and beta-adrenergic blocking agents on ATP concentration and on incorporation of 32Pi into ATP in rat fat cells. Biochem Pharmacol 24:1659-62.

290. Stofer, E., C. Chipot, R. Lavery. 1999. Free energy calculations of Watson-Crick base pairing in aqueous solution. J. Am. Chem. Soc. 121: 9503-9508.

291. Stuart, K. D., R. Weeks, L. Guilbride, and P. J. Myler. 1992. Molecular organization of Leishmania RNA virus 1. Proc Natl Acad Sci U S A 89:8596-600.

292. Sturm, N. R., and D. A. Campbell. 1999. The role of intron structures in trans-splicing and cap 4 formation for the Leishmania spliced leader RNA. J Biol Chem 274:19361-7.

293. Sturm, N. R., J. Fleischmann, and D. A. Campbell. 1998. Efficient trans-splicing of mutated spliced leader exons in Leishmania tarentolae. J Biol Chem 273:18689-92.

294. Sullivan, W. J., Jr., J. Narasimhan, M. M. Bhatti, and R. C. Wek. 2004. Parasite-specific elF2 (eukaryotic initiation factor-2) kinase requiredfor stress-induced translation control. Biochem J 380:523-31.

295. Suzuki, Y., D. Ishihara, M. Sasaki, H. Nakagawa, H. Hata, T. Tsunoda, M.

296. Watanabe, Т. Ко mats u, T. Ota, T. Isogai, A. Suyama, and S. Sugano. 2000. Statistical analysis of the 5' untranslated region of human mRNA using "Oligo-Capped" cDNA libraries. Genomics 64:286-97.

297. Taniguchi, Т., and C. Weissmann. 1978. Inhibition of Qbeta RNA 70Sribosome initiation complex formation by an oligonucleotide complementary to the 3' terminal region ofE. coli 16S ribosomal RNA. Nature 275:770-2.

298. Tarun, S. Z., Jr., S. E. Wells, J. A. Deardorff, and A. B. Sachs. 1997. Translation initiation factor eIF4G mediates in vitro poly(A) tail-dependent translation. Proc Natl Acad Sci U S A 94:9046-51.

299. Tawfik, D. S., and A. D. Griffiths. 1998. Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat Biotechnol 16:652-6.

300. Thomas, A. A., G. C. Scheper, and H. O. Voorma. 1992. Hypothesis: is eukaryotic initiation factor 2 the scanning factor? New Biol 4:404-7.

301. Tisdale, H.D., 1967. Preparations of Succinate-Cytochrome с Reductase and the Cytochrome с oxidase. Methods Enzyrnol. 10:138370-376.

302. Toulme, J. J., H. M. Krisch, N. Loreau, N. T. Thuong, and C. Helene. 1986. Specific inhibition of mRNA translation by complementary oligonucleotides covalently linked to intercalating agents. Proc Natl Acad Sci U S A 83:1227-31.

303. Trudel, M., J. Dondon, M. Grunberg-Manago, J. Finelli, and R. H. Buckingham.1981. Effect of oligonucleotide AGAGGAGGU on protein synthesis in vitro. Biochimie 63:235-40.

304. Tsuboi, Т. 2005. Malaria transmission-blocking vaccine development. Seikagaku 77:646-9.

305. Tsumoto, К., K. Ogasahara, Y. Ueda, K. Watanabe, K. Yutani, and I. Kumagai.1995. Role ofTyr residues in the contact region of anti-lysozyme monoclonal antibody HyHELlO for antigen binding. J Biol Chem 270:18551-7.

306. Ullu, E., and C. Tschudi. 1990. Permeable trypanosome cells as a model system for transcription and trans-splicing. Nucleic Acids Res 18:3319-26.

307. Ullu, E., and C. Tschudi. 1991. Trans splicing in trypanosomes requires methylation of the 5' end of the spliced leader RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 88:10074-8.

308. Utsumi, Т., J. Kuranami, E. Tou, A. Ide, K. Akimaru, M. C. Hung, and J.

309. Klostergaard. 1996. In vitro synthesis of an N-myristoylatedfusion protein that binds to the liposomal surface. Arch Biochem Biophys 326:179-84.

310. Utsumi, Т., M. Sato, K. Nakano, D. Takemura, H. Iwata, and R. Ishisaka. 2001.

311. Amino acid residue penultimate to the amino-terminal gly residue strongly affects two cotranslationalprotein modifications, N-myristoylation andN-acetylation. J Biol Chem 276:10505-13.

312. Vidugiriene, J., S. Vainauskas, A. E. Johnson, and A. K. Menon. 2001 .Endoplasmic reticulum proteins involved in glycosylphosphatidylinositol-anchor attachment: photocrosslinking studies in a cell-free system. Eur J Biochem 268:2290-300.

313. Wang, L., A. Brock, B. Herberich, and P. G. Schultz. 2001. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science 292:498-500.

314. Wang, L., A. Brock, and P. G. Schultz. 2002. Adding L-3-(2-Naphthyl)alanine to the genetic code of E. coli. J Am Chem Soc 124:1836-7.

315. Wang, X., F. E. Paulin, L. E. Campbell, E. Gomez, K. O'Brien, N. Morrice, and C. G. Proud. 2001. Eukaryotic initiation factor 2B: identification of multiple phosphorylation sites in the epsilon-subunit and their functions in vivo. Embo J 20:4349-59.

316. Weeks, D. P., and A. Marcus. 1971. Preformed messenger of quiescent wheat embryos. Biochim Biophys Acta 232:671-84.

317. White, S. H., and W. C. Wimley. 1999. Membrane protein folding and stability: physical principles. Annu Rev Biophys Biomol Struct 28:319-65.

318. Wirtz, E., C. Hartmann, and C. Clayton. 1994. Gene expression mediated bybacteriophage T3 and T7 RNA polymerases in transgenic trypanosomes. Nucleic Acids Res 22:3887-94.

319. Wojtczak, L., H. Zaluska, A. Wroniszewska, and A. B. Wojtczak. 1972. Assay for the intactness of the outer membrane in isolated mitochondria. Acta Biochim Pol 19:227-34.

320. Yamauchi, K. 1991. The sequence flanking translational initiation site in protozoa. Nucleic Acids Res 19:2715-20.

321. Yin, G., and J. R. Swartz. 2004. Enhancing multiple disulfide bonded protein folding in a cell-free system. Biotechnol Bioeng 86:188-95.

322. Yoffe, Y., J. Zuberek, M. Lewdorowicz, Z. Zeira, C. Keasar, I. Orr-Dahan, M. Jankowska-Anyszka, J. Stepinski, E. Darzynkiewicz, and M. Shapira. 2004. Cap-binding activity of an eIF4E homologfrom Leishmania. Rna 10:1764-75.

323. Yun, D. F., Т. M. Laz, J. M. Clements, and F. Sherman. 1996. mRNA sequences influencing translation and the selection of AUG initiator codons in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol 19:1225-39.

324. Zeiner, G. M., N. R. Sturm, and D. A. Campbell. 2003. The Leishmania tarentolae spliced leader contains determinants for association with polysomes. J Biol Chem 278:38269-75.

325. Zelazny, A. M., D. P. Fedorko, L. Li, F. A. Neva, and S. H. Fischer. 2005. Evaluation of 7SL RNA gene sequences for the identification of Leishmania spp. Am J Trop Med Hyg 72:415-20.

326. Zhou, J. M., S. Fujita, M. Warashina, T. Baba, and K. Taira. 2002. A novel strategy by the action of ricin that connects phenotype and genotype without loss of the diversity of libraries. J Am Chem Soc 124:538-43.

327. Zhu, H., and M. Snyder. 2003. Protein chip technology. Curr Opin Chem Biol 7:55-63.

328. Zinn, К., A. Keller, L. A. Whittemore, and T. Maniatis. 1988. 2-Aminopurine selectively inhibits the induction ofbeta-interferon, c-fos, and c-myc gene expression. Science 240:210-3.

329. Zubay, G. 1973. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet 7:267-87.

330. Zucker, W. V., and H. M. Schulman. 1968. Stimulation of globin-chain initiation by hemin in the reticulocyte cell-free system. Proc Natl Acad Sci U S A 59:582-9.

Информация о работе

Муреев, Сергей Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Бесклеточная система трансляции на основе представителя трипаносоматид Leishmania tarentolae. Создание оптимальной матрицы для трансляции in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы