Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное иммунохимическое и физико-химическое изучение фетоплацентарных, сывороточных и тканевых белков человека и обезьян

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное иммунохимическое и физико-химическое изучение фетоплацентарных, сывороточных и тканевых белков человека и обезьян"

РГБ ОД

1 о МАЯ ^03

На правах рукописи

ГАЙНУЛЛИНА Людмила Халнулловна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ И ФИЗИКО-

ХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФЕТОПЛАЦЕНТАРНЫХ, СЫВОРОТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕКА И

ОБЕЗЬЯН

03. 00. 04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2000

Диссертация выполнена на кафедре биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики Астраханской государственной медицинской академии

Научный руководитель: К.м.н. доцент Д.М.Никулина

Официальные оппоненты: Д.м.н. профессор A.A. Терентьев Д.х.н. профессор Л.Д. Румш

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится «_»_2000 г. на заседании диссертационного совета К0841405 при РГМУ по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ Автореферат разослан «_»_2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Кандидат медицинских наук Т.Н.Клушина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Существует поразительное единство биохимической организации в пределах всего органического мира, возникшее в результате эволюции биомолекул от появления клетки до сложной и целостной системы многоклеточного организма. Это явление носит название биохимической универсальности. Известны многочисленные примеры идентичности функциональных блоков как у близких организмов, так и стоящих на разных уровнях эволюционной лестницы. При этом обнаруживается сходство функциональных белков, осуществляющих одноименные функции у многоклеточных и одноклеточных, у высших эукариот и прокариот (Уголев,1982, 1989; Перцева, 1990).

Отмечено, что в ряде биохимических систем эволюция совершается с одинаковой последовательностью в разных филогенетических ветвях. В итоге это даёт и некоторый общий онтогенез.

Биологическая роль специфических белков беременности до настоящего времени остается мало изученной. Установлено, что, во-первых, они обладают иммуносупрессивной или иммуномодулирующей активностью для поддержания статуса нормальной беременности. Во-вторых, для некоторых представителей этой группы белков описана связь со стероидными гормонами, фактором роста и другими биологически активными веществами (Терентьев,1988-1999). Имеющиеся литературные данные носят характер результатов исследования функции этих белков in vitro. Но по каждой из точек зрения имеются неоднозначные результаты и окончательное решение вопроса о биологической роли возможно лишь в опытах in vivo.

В этих целях необходимо обнаружение аналогов белков беременности у лабораторных животных. Подобные попытки предпринимались отечественными и зарубежными исследователями: Кривоносов С.К. (1985-1988), Зорин H.A. (1990-1995), Т-М Lin, S.Р. Haibert (1976-1978), Inaba (1981). Однако завершенных работ по этой проблеме не выявлено.

Цель исследования: Изучение общих закономерностей и различий в спектре фетоплацентарных, сывороточных и тканевых белков человека и обезьян, а также определение физико-химических параметров некоторых межорганных тканевых антигенов.

В задачи исследования входило:

1. Обнаружить аналоги сывороточных белков человека, в том числе белков беременности, в крови обезьян Macaca Rhesus, Macaca Cynomolgus, Macaca Fascicuiaris (резус, яванская, ла-пундер).

2. Идентифицировать специфические белки плаценты человека - трофобластспецифический бета-глобулин (ТБГ) и плацентарный лактоген человека (ПЛЧ) - в биологических объектах от обезьян.

3. Изучить белковый спектр экстрактов тканей органов, в том числе плаценты, а также сыворотки крови человека и обезьян.

4. Выявить термостабильные межорганные антигены (Ферри-тин (Ф), термостабильные межорганные (ТМ1 и ТМ2) в экстрактах тканей человека и обезьян.

5. Определить физико-химические параметры малоизученных ТМ1 и ТМ2.

Научная новизна исследования: Впервые проведен широкий сравнительный иммунохимический и биохимический анализ фетоплацентарных, сывороточных и тканевых белков у человека и обезьян, выявлены видовые особенности и параллели при изучении белков в биологических объектах.

Установлено, что степень родства белков человека и их аналогов у обезьян различна: полная идентичность по СБАГ, а2МГ, Ig G и М, ТМ1, неполная по АФП, ТМ2, Ig А, крайне низкая по ПЛЧ и ТБГ.

Получены оригинальные данные по физико-химическим параметрам новых термостабильных антигенов - ТМ1 и ТМ2. Разработаны подходы к их выделению и очистке для последующего использования полученных препаратов в изготовлении иммунохимических тест-систем и в других лабораторных иссле-

дованиях.

Научно-практическая значимость работы: Сравнительный иммунохимический анализ структурного сходства и различия белков тесно связанных видов позволяет косвенно судить о процессах генетической перестройки организмов при видообразовании, проявляющейся в антигенной дифференциации. В практическом аспекте интересен факт применения специфических белков беременности для диагностики различных нормальных и патологических проявлений гравидарного состояния. Изучение термостабильных тканевых антигенов вносит вклад в разработку иммунохимических тестов на деструкцию тканей.

Самостоятельно смоделированные иммунодиффузион-ные тест-системы на ТБГ, СБАГ, ТМ1, ТМ2 могут быть использованы в лабораторных исследованиях и в практической медицине.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены на научных конференциях кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики, на конференции, посвященной 80-летию АГМА (1998), межвузовской конференции молодых ученых, посвященной 35-летию открытия АФП (Астрахань-Москва, 1999), конференциях РЕВ8 (1993,1995).

Результаты исследования используются в научной и практической работе кафедры биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики и УНДЦ АГМА. Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, имеется 3 рационализаторских предложения. Структура и объем работы: Диссертация изложена на 148 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследования), выводов, списка литературы. Иллюстративный материал представлен 15 таблицами, 37 рисунками. Библиография включает в себя 62 отечественных и 166 зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В качестве объекта выполненного исследования были выбраны белки, имеющие разное происхождение: материнское, плодовое и плацентарное. Был проведен поиск аналогов 11 сывороточных и тканевых белков у обезьян Macaca: Rhesus, Cynomolgus, Fascicularis. Среди них из фетоплацентарных - наиболее известные а-фетопротеин (АФП) и ТБГ. Последний имел изначально определение как белка беременности. Классическим белком беременности является связанный с беременностью а2-гликопротеин (СБАГ). Этот белок был также включен в наше исследование.

В настоящее время сравнительно небольшое число биологически активных белков, обнаруживаемых в плаценте, выделено в чистом виде и охарактеризовано. Среди множества белков плаценты, обозначенных Bohn как РР (placental proteins), хорошо известны хорионический гонадотропин, плацентарный лактоген, тканевой белок ферритин и некоторые другие. В объекты исследования были включены ПЛЧ и Ф.

Кроме того, изучали сывороточные альфаг-макрогло-булин (а2МГ), Ig A, G, М и тканевые ТМ1, ТМ2.

Белки определяли в сыворотке крови и экстрактах тканей человека и обезьян. Для идентификации изучаемых белков в образцах биологических объектах человека и обезьян использовали вариант двойной иммунодиффузии, в том числе метод Ouchterlony (1958) в модификации Н.И. Храмковой и Г.И. Абе-лева (1961). Антисыворотки к АФП, ПЛЧ и Ig М, G и А представляли собой коммерческие препараты. Самостоятельно иммунизацией кроликов получали антисыворотки к осг-МГ, ТБГ, СБАГ, ТМ1 и ТМ2. Исходным материалом для получения а2-МГ, ТБГ, СБАГ служила сыворотка крови беременных женщин со сроком беременности 38-40 недель. Для получения ТМ1 и ТМ2 - термостабильные экстракты тканей человека.

Всего протестировано 2802 образца биоматериа-ла(табл,1).

Таблица 1

Количественные показатели использованного в работе биологического материала

Исследуемый материал Количество

образцов исследований

Сыворотка крови человека:

доноров 98 487

беременных женщин 82 450

плодов разных сроков 10 35

Сыворотка крови обезьян:

молодых нерожавших самок 3 78

молодых рожавших и

многорожавших самок 6 156

беременных обезьян 6 234

кормящих самок 3 78

Амниотическая жидкость:

женщин 15 30

обезьян 2 14

Экстракт плаценты:

человека 10 43

обезьян 6 170

Экстракты разных тканей плодов:

человека 160 35

обезьян 30 510

Экстракты разных тканей взрослых:

человека 190 305

обезьян 16 177

В ходе работы было использовано 11 различных имму-нохимических и биохимических методов: экстракция, высаливание, диализ, иммунопреципитация в геле, иммуноэлектрофорез, иммуноферментный анализ (ИФА), нативный и денатурирующий электрофорез в ПААГ, спектрофотометрия, лиофилизация, металлофелат аффинную хроматография на Си(И), 2п(Н) и №(Н)-ИДК-гелях.

Результаты исследований и их обсуждение

В исследовании одним из центральных являлся вопрос об идентичности отдельных белков человека и обезьяны.

В основу решения этой задачи было положено то, что изменение первичной структуры белков находит отражение в соответствующих изменениях их антигенной специфичности. Благодаря этому возможно определять эволюционные изменения антигенного спектра индивидуальных белков На уровне отдельных четко выявляемых детерминант.

Мы применяли иммунохимические методы, обладающие высокой разрешающей способностью. Иммунодиффузионный анализ (ИДА) является незаменимым в этих целях по сравнению с другими иммунохимическими методами, особенно подходят оранжировки анализа в штампах «четверка» и «семерка».

В таблице 2 приведены полученные результаты иммуно-химической идентификации индивидуальных белков человека у обезьян.

Как было сказано выше, о выявленных аналогах судят по наличию идентичности в иммунодиффузионном анализе между компонентами сравниваемых биологических жидкостей. Исходя из этого, мы констатировали наличие реакции трех типов:

• полной иммунохимической идентичности, когда формировалась единая линия преципитации (рис1 А);

• неполной, но с достаточно высокой степенью идентичности, когда при формировании мощной общей линии преципитации наблюдалось образование небольших или более выраженных шпор (рис 1Б);

• неполной, со слабой степенью идентичности, когда формируемый в агаре преципитат представлял собой очень тонкую линию по сравнению со стандартом и имел мощную шпору или наблюдалось размывание линии преципитации стандарта со стороны лунки с исследуемым раствором (рис 1В).

Установлено, что полной идентичностью обладают СБАГ, а2-МГ, JgG, JgM и ТМ2, неполной - АФП, ТМ1, очень низкой - ТБГ, ПЛЧ.

Таблица 2

Иммунохимическая идентификация у обезьян аналогов фетоплацентарных, сывороточных и тканевых белков человека

Наличие Характеристика идентичности

Белок аналога у Неполная с числом

человека обезьян Полная общих детерминант

высоким низким

1 2 3 4 5

1.АФП + +

2.ТБГ + +

З.ПЛЧ + +

4.СБАГ + +

5.сх2-МГ + +

6.^0 + +

+ +

+ +

9.Ферритин + Н е определяли

10.ТМ-1 + +

11.ТМ-2 + +

А

Б

В

Рис1. Типы реакций иммунологической идентификации в ИДА белков человека и их аналогов у обезьян

Результаты иммунохимического анализа (полная идентичность) свидетельствуют о наличии у обезьян аналога СБАГ человека (рис 1А).

Также как и Lin, мы обнаружили этот белок в некоторых образцах небеременных самок на уровне концентрации беременных обезьян (20 мг/л), хотя в сыворотке крови беременных обезьян уровень этого белка мог достигать 80 мг/л (рис 2).

СБАГ был выявлен во всех исследуемых образцах крови небеременных обезьян (от 5 до 20 мг/л), тогда как у человека (небеременных, здоровых женщин и мужчин) этот белок выявляется, в среднем, в 30% случаев, на уровне чувствительности ИДА тест-системы (5 мг/л).

1 - сыворотка крови беременных обезьян

(цельный раствор); 2,3, 4, 5, 6 - исследуемый биоматериал в разведении 1/2, 1/4, 1/8, 1/16; В центральной лунке - специфическая антисыворотка на СБАГ

Рис 2. Определение концентрации СБАГ в сыворотке крови беременных обезьян.

Обнаружение .высокого уровня СБАГ в крови небеременных обезьян является ярким фактом, который может служить основой для обсуждения эволюционных изменений иммуноре-активности организма, так как у человека этот белок в подобной концентрации присутствует только при изменении реактивности: при беременности, а также при воспалении и опухолях.

Высокий уровень СБАГ в крови небеременных самок можно предположительно объяснить с разных позиций: во-первых, не исключено, что этот белок является филогенетически древним (распространенным) и его основная функция активнее востребована у животных, стоящих на более низких ступенях эволюционной лестницы, а у человека заменена другими структурами и этот белок становится вспомогательным (дополни-

тельным) звеном защиты; во-вторых, более прозаическая причина может заключаться в том, что практически все обезьяны имеют хронические воспалительные заболевания, которые и вызывают усиленную продукцию СБАГ.

CÍ2 МГ является одним из хорошо изученных у обезьян белков. По данным Goodman, Pouchelet и соавт. а2-МГ человека имеет, по крайней мере, на одну детерминанту больше, чем соответствующий белок макаки-резус.

Мы не получили выраженных различий при сравнении а2-МГ человека с обезьяньим аналогом. Этот белок был обнаружен практически во всех экстрактах тканей взрослых особей и плодов обезьян, но в разной концентрации.

У обезьян при беременности концентрация а2 МГ по данным James не изменяется или даже снижается, у беременных женщин его уровень заметно повышается. Приведенные сведения аналогичны описанной картине по СБАГ. Подобный факт еще более убеждает в генетическом родстве этих двух сывороточных белков, несмотря на то, что а2 МГ является нормальным белком сыворотки крови, с СБАГ - минорным.

На основании того, что сравнение антигенной специфичности белков позволяет судить о темпах эволюционных изменений отдельных генов, можно предположить, что структурные гены СБАГ и а2-МГ являются наиболее стабильными в течение эволюционного времени.

К этой группе белков можно отнести также иммуноглобулины классов G, М человека. Иммунохимическим анализом мы получили результат их идентичности аналогам взрослых обезьян как в сыворотках крови, так и экстрактах. Ig А имеет неполную идентичность с аналогом обезьян.

Человеческий АФП обладает высокой степенью идентичности с его аналогом у обезьян и выявлен нами в большинстве экстрактов тканей плодов (легкое, печень, сердце, почка, желудок, надпочечники, щитовидная железа, тонкий и толстый кишечник, мочевой пузырь, матка, тимус, селезенка, мозг, яичники и другие.).

Выявлен он также и в амниотической жидкости. Концен-

трация там его невелика и, несмотря на то, что линия преципитации находится в зоне эквивалента, она не выглядит полностью идентичной массивной линии преципитации между антисывороткой и фракцией экстракта плаценты (25% осадок сульфата аммония). Имеется едва заметная «шпора». Расслоение линии преципитации отмечается при анализе экстрактов печени, толстого кишечника и яичников плодов обезьян. В другом случае экстракт печени дает четкую «шпору» (рис 1 Б). Наличие неполной идентичности отмечает в своих исследованиях также Gitlin, по мнению которого АФП обезьяны недостает некоторых антигенных детерминант АФП человека. С его и нашими результатами не совпадают данные Hull с соавторами, описывающими получение идентичной линии преципитации между сывороткой крови плодов человека и обезьяны с антисывороткой к АФП человека.

Следует также отметить, что на уровне чувствительности метода (в пределах 5 мг/л) АФП не выявлен в нативной плаценте обезьян, в крайне низкой концентрации он определялся в мозге и толстом кишечнике.

Можно предположить, что филогенетически этот белок также является достаточно старым и мало эволюционирующим.

Самые неоднозначные сведения в литературе имеются по ТБГ. Результаты наших исследований, быстрее всего, подтверждают данные Glenn и соавт., которые описали наличие вещества в сыворотке крови резуса-матери, илшунологически сходного ТБГ, но не идентичного ему, хотя качественная картина концентрации ТБГ-подобного вещества в процессе беременности резуса очень похожа на картину концентраций ТБГ во время беременности у женщин.

Мы не обнаружили присутствия ТБГ человека ни в сыворотке крови беременных особей, ни в амниотической жидкости обезьян. Однако в ИДА (с антисывороткой к ТБГ человека) экстрактов плаценты обезьян наблюдается феномен задержки линии преципитации, что косвенно может свидетельствовать о наличии в плаценте очень низких концентраций этого белка или его аналога. В экстрактах тканей взрослых обезьян ТБГ нами

также не обнаружен.

Низкая концентрация ТБГ и в плаценте человека объясняется секрецией этого белка в кровь матери, где он и осуществляет свою, по-видимому, основную функцию.

Также как и ТБГ, ПЛЧ не имеет четкого аналога у обезьян. Мы получили реакцию весьма слабо выраженной идентичности, хотя не исключено что в полученной картине играет существенную роль чрезвычайно низкие концентрации ПЛЧ-подобной субстанции в плаценте обезьян (рис 3).

1.4 - ПЛЧ человека (тест-антиген)

2.5 - экстракт плаценты человека 3 - экстракт плаценты обезьяны

25% САФ 6 - экстракт плаценты обезьяны

В центральной лунке - моноспецифическая антисыворотка на ПЛЧ Рис 3. Выявление ПЛЧ человека в плаценте обезьян

С позиций филогенетической дивергенции гомологичных белков и соответствующих им генов ТБГ, обладающий им-муномодулирующими свойствами, и гормон -ПЛЧ являются самыми молодыми белками из всех исследованных нами.

Мы остановились на поиске у обезьян аналогов межорганных тканевых белков, а именно: Ф и двух малоизученных антигенов - ТМ1 и ТМ2 (Никулина и соавт., 1985-1995), так как все три белка являются термостабильными субстанциями, что является опорным признаком для сравнительного эволюционного анализа. Концентрация этих белков в биологических жидкостях увеличивается при деструктивных патологических процессах в организме человека.

Ферритин методом ИФА выявлен в тканях взрослых обезьян и плодов в разной концентрации.

Иммунодиффузионными методами ТМ1 и ТМ2 параллельно определяли в биологических жидкостях, экстрактах

практически всех органов человека и обезьян, как взрослых особей, так и плодов. ТМ1 выявлен не во всех экстрактах органов человека и частота выявления колеблется от 5 до 100% случаев. Вероятно, наблюдаемый результат может зависеть от предела чувствительности метода, если концентрация этого белка в указанных органах ниже 5 мг/ л.

Тем же методом ТМ1 выявлен во всех биологических объектах от обезьян. Однако частота его выявления в органах, ТМ1-отрицательных у человека, очень низка, что свидетельствует о параллельных количественных закономерностях распределения ТМ1 по органам человека и обезьяны. Как правило, наблюдалась неполная идентичность ТМ1 с выявленным аналогом у обезьяны.

ТМ2 выявлен во всех органах человека и обезьян в 100% случаев с полной иммунохимической идентичностью.

По распределению термостабильных белков в тканях различных органов человека и обезьян отмечена частично сходная мозаичность. Так, Ф и ТМ1 не выявлены в мозге и тимусе. Ф не выявлен или выявлен в крайне низкой концентрации также в селезенке, сердце, плаценте, щитовидной железе, мочевом пузыре (от 0 до 4.87 нг/мл), а ТМ1 - в надпочечниках, в тонком и толстом кишечнике, коже. Этот факт подтверждает описанные факты непараллельного выявления этих белков при патологических состояниях. Ф в высокой концентрации (от 212.62 до 417.27 нг/мл ) присутствует в печени, почке, тонком кишечнике.

Как и все авторы, исследовавшие белковый спектр сыворотки крови обезьян (Анненков, 1974; ЬИтап, 1981), мы выявили различия в белковых спектрах не только сыворотки крови, но и тканевых экстрактов различных тканей человека и обезьян при электрофоретическом разделении в ПААГ. Эти различия в сыворотке крови были неоднозначны по зонам при одинаковом количестве последних. Сравнительная оценка полученных результатов свидетельствует об отличии спектров белков низших обезьян от спектров белков человека по числу выявляемых фракций.

Данных в литературе по изучению белкового спектра тканей различных органов обезьян мы не встретили. Нами выявлены четкие межорганные различия по числу выявляемых фракций и по содержанию белков в них (рис 4, 5).

Рис 4.Электрофоретическое разделение биологических объектов человека и обезьян в 10%-ном ДДС-№ ПААГ. 1- экстракт желудка плода обезьяны; 2 - экстракт яичников плода; 3 экстракт мочевого пузыря плода обезьяны; 4 - термостабильный экстракт яичка человека; 5 - маркеры; 6 -сыворотка крови обезьяны; 7 -сыворотка крови беременной женщины; 8- сыворотка крови донора; 9 - экстракт сердца человек; 10 - экстракт легкого человека.

Рис 5. Электрофоретическое разделение биологических объектов обезьян и человека в 10%-ном ДЦС-Ыа ПААГ.

1- экстракт печени обезьяны; 2 - экстракт яичка человека; 3 -экстракт поджелудочной железы человека; 4 - экстракт мозга человека; 5 - маркеры; 6 - экстракт поджелудочной железы обезьяны; 7 - экстракт мозга обезьяны; 8 - экстракт печени обезьяны; 9 - экстракт тимуса обезьяны; 10. - экстракт яичников плода обезьяны; 11. - плаценты обезьяны; 12. - экстракт толстого кишечника плода обезьяны.

Подробно изучены биохимические характеристики ТМ1 и ТМ2 (электрофоретическая подвижность, коэффициент диффузии, молекулярная масса и пр.).

Относительная электрофоретическая подвижность, рассчитанная по альбумину в иммуноэлектрофореграмме у ТМ1 равна 0,5, а у ТМ2 - 0,58. Коэффициент диффузии в агаровом геле составил у ТМ1 - 2,65' 107 и у ТМ2 5,40 1 07 см2У''сек', то есть линия преципитации ТМ1 находится ближе к траншее с антисывороткой, а ТМ2 - к лунке с антигеном (рис 6).

I- алтисыворотка против нормальных белков сыворотки крови человека П-антисыворотка против термостабиль ной фракции почки

1 - сыворотка крови человека (донорская)

2 - термостабильная фракция экстрак та почки

3 - экстракт нативной почки

4 - экстракт поджелудочной железы

5 - декстран

Рис б.Определение электрофоретической подвижности ТМ1и ТМ2 методом иммуноэлектрофореза

Оба белка имеют близкую по значению молекулярную массу: ТМ1 - около 24 и ТМ2 - 22 кДа (рис 7).

Albumin, Boving 66,0 кДа.

Albumin, Egg 45,0 кДа

Glyceraldehyde - 3 - Phosphat

Dehydrogenase Carbonic Anhydrase Tripsinogen Trypsin Ingibitor a -Lactalbumin

36,0 кДа 29,0 кДа 24,0 кДа 20,0 кДа 14,2 кДа

Рис 7. SDS-электрофорез ТМ1, ТМ2 в ПААГ параллельно с белками-маркерами известной молекулярной массы (Sigma).

При большом сходстве по отношению к денатурирующим, осаждающим агентам (высокая температура, сульфат аммония) и электрофоретической подвижности ТМ1 и ТМ2 отличаются друг от друга и от ферритина не только по распределению в органах, но и по таким физико-химическим свойствам, как сродство к металлам и отношение к индикаторным красителям.

ТМ1 и ТМ2 полностью сорбировались на меди (рис 8, 9).

рп 2 «аг"~4"

Рис 8. Электрофоретическое выявление подвижности ТМ-1 и ТМ-2 во фракциях, полученных при разных условиях металлохелат аффинной хроматографии - Си(Н) форма.

1- термостабильный экстракт почки человека, содержащий ТМ-1 и ТМ-2; 2 -несорбированная фракция МХАХ (Си(П) форма); 3 - маркеры; 4 - фракция МХАХ, элюируемая при рН 5 в условиях рабочего буфера (Си(П) форма); 5 -фракция МХАХ, элюируемая при рН 4 в условиях рабочего буфера (Си(П) форма); 6 - фракция МХАХ, элюируемая 50 мМ имидазолом в условиях рабочего буфера (Си(Н) форма).

ТМ1 полностью сорбировался на никеле. ТМ2, хотя и сорбировался, но непрочно связывался и десорбировался не только 50 мМ имидазолом, но и частично рабочим буфером. ТМ2 выявлялся практически во всех фракциях элюции с №-ИДК-геля. Фракции, десорбируемые с 2п(Н)-ИДК-геля рабочим буфером и 2 мМ имидазолом, содержат оба белка, тогда как фракция, элюируемая 10 мМ имидазолом - только ТМ2. Следовательно, ТМ2 лучше удерживается на колонке с никелем (рис 10,11).

Эти данные могут быть использованы при выделении и очистке этих двух новых антигенов, имеющих по предварительным данным диагностическое значение подобное ферритину -маркеру деструктивных процессов в организме.

Рис 9.Металлохелат аффинная хроматография термостабильного экстракта почки человека на ИДК-агарозе в Си(И) форме. Элюенты: 1- 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 7.4, содержащий 0,2 М МаС1; 2- тот же буфер, рН 5; 3- тот же буфнр, рН 4; 4- 50 мМ имидазол, приготовленный на рабочем буфере.

Я 1-Й

Рис 10. Электрофоретическое выявление подвижности ТМ-1 и ТМ-2 во фракциях, полученных при разных условиях метал-лохелат аффинной хроматографии - Си(Н) и N1 (II) форма 1- термостабильный экстракт почки человека, содержащий ТМ-1 и ТМ-2; 2 -фракция МХАХ, элюируемая 50 мМ имидазолом (Си(Н) форма);3 - фракция МХАХ, элюируемая 10 мМ имидазолом (Си(П) форма); 4 - маркеры; 5 - фракция несорбированого белка МХАХ (N¡(11) форма); 6 - фракция МХАХ, элюируемая 50 мМ имидазолом N¡(11) форма).

Рис 11. Металлохелат аффинная хроматография термостабильного экстракта почки человека в N¡(11) форме, снятой 50 мМ имидазолом (Cu(II) форма) Элюенты: 1-0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН7.4, содержащий 0,2 М NaCI; 2 - 5 мМ имидазол в том же буфере; 3-10 мМ имидазол в том же буфере; 4- 25 мМ имидазол в том же буфере; 5-50 мМ имидазол в том же буфере.

С целью дифференцирования ТМ1, ТМ2 и Ф был применен специфический метод окраски (реакция образования берлинской лазури), давший отрицательный результат с ТМ1 и ТМ2.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Применение специфических белков беременности для диагностики различных нормальных и патологических состояний при беременности у человека и обезьян.

2. Для выделения и очистки термостабильных межорганных антигенов ТМ1 и ТМ2 с целью изготовления иммунохими-ческих тестов на деструкцию тканей.

ВЫВОДЫ

1. Все 11 изученных фетоплацентарных, сывороточных и тканевых белков человека имеют разной степени идентичности аналоги у обезьян Macaca: Rhesus, Cynomolgus, Fascicularis (резус, яванского и лапундер), о чем свидетельствуют результаты сравнительного иммунохимического анализа.

2. Определение степени родства этих белков и их аналогов у макак установило, что иммунологически полной идентично-

стью обладает один из белков беременности (СБАГ), три сывороточных белка (0С2МГ, IgG, М) и один тканевой антиген (ТМ1); неполной идентичностью - фетальный белок (АФП), сывороточный IgA, тканевой антиген (ТМ2); очень низкой -плацентарные белки с выраженной биологической активностью (ТБГ и ПЛГ).

3. Обнаруженные во всех случаях перекрестные иммунологические реакции между изучаемыми белками человека и их аналогами у обезьян, а также выявленные количественные различия в белковых спектрах крови и тканей двух биологических видов свидетельствуют о филогенетической дивергенции гомологичных белков и соответствующих им генов. С этих позиций самыми молодыми белками являются ТБГ, обладающий иммуномодулирующими свойствами, и гормон -ПЛЧ.

4. Масаса Rhesus, Cynomolgus, Fascicularis могут служить хорошими моделями для изучения биологического и клинического значения СБАГ, а2МГ, IgG и М, TM 1.

5. ТМ1 и ТМ2 отличаются друг от друга и от ферритина по распределению в органах, по физико-химическим свойствам, сродству к металлам и отношению к индикаторным красителям.

6. Полученные биохимические характеристики ТМ1 и ТМ2 могут быть использованы при выделении и очистке этих двух новых антигенов, имеющих по предварительным данным диагностическое значение, подобное ферритину - маркеру деструктивных процессов в организме.

Список работ, опубликованых по теме диссертации:

1. Коханов A.B., Гайнуллина JI.X. Белки беременности животных, их диагностическое значение // Сборник научных трудов СГУ. - Саратов. - 1990.

2. Коханов A.B., Гайнуллина Л.Х. Способ адаптации под им-муноферментный анализ отечественных планшетов для им-

мунологических реакций. Рац. предложение № 973 от 18.04.90. г. Астрахань.

3. Коханов А.В., Алиев Р.З., Гайнуллина JI.X. Способ иммобилизации красителей для аффинной хроматографии. Рац. предложение № 997 от21.01.91. г. Астрахань.

4. Коханов А.В., Гайнуллина JI.X. Нетрадиционные аффинные сорбенты для выделения антигенов репродуктивной системы // Тезисы докладов областной научно-практической конференции сотрудников АГМИ и врачей Астраханской обл. -Астрахань. - 1990.

5. Коханов А.В., Кулагин П.П., Гайнуллина JI.X. Способ подготовки клинического материала к биологическим исследованиям. Рац. предложение № 998 от 04.03.91. г. Астрахань.

6. Коханов А.В., Гайнуллина Л.Х. Антигены репродуктивной системы млекопитающих и их значение для экологического мониторинга // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции "Влияние антропогенных факторов на морфогенез и структурные преобразования органов" - Астрахань. -1991.

7. Никулина Д.М., Гайнуллина JI.X., Сахарова Т.В., Степанов Б.Г. Изучение белков беременности у приматов // Тезисы докладов юбилейной научно-практической конференции сотрудников АГМИ и врачей Астраханской обл. - Астрахань. -1993.

8. Nikulina D.M., Vorobyeva Т.В., Gainullina L.Kh. - Tissue protein as destruction indicators // FEBS Lett. - 1993.

9. Stepanov B.G., Nikulina D.M., Kriventsev Yu.A., Vorobyova T.B., Gainullina L.Kh. - Getting antibody to pregnancy-associated alpha-2-glycoprotein (a2-PAG)// FEBS Lett. - 1995.

10. Гайнуллина JI.X. Идентификация и определение диагностической значимости межорганных антигенов // Тезисы докладов научно-практической конференции, посвященной 80-летию АГМА. - Астрахань. - 1998.

11. Гайнуллина JI.X., Кузьминский И.П. Изучение физико-химических свойств термостабильных межорганных антигенов // Материалы межвузовской научной конференции "Белки - маркеры патологических состояний". - Астрахань -Москва. - 1999.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гайнуллина, Людмила Халиулловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.и.

ГЛАВА 1. Сравнительное изучение белков разных видов животных ключ к решению проблем эволюции (обзор литературы).

1.1. Этапы биохимической эволюции и принцип функциональной стабильности блоков у различных организмов.

1.2. Термостабильность белков - пример эволюционной адаптации к окружающей среде.

1.3. Филогенез как отражение эволюции вида.

1.4. Изучение плацентарных и ассоциированных с беременностью белков у приматов.

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Поиск аналогов фетоплацентарных, сывороточных и тканевых белков человека в биологических объектах от обезьян.

3.1.1.Изучение АФП, СБАГ, ТБГ, ПЛЧ человека в биологических объектах от обезьян.

3.1.2. Изучение а2МГ, 1д классов 1,С,М человека в биологических объектах от обезьян.

3.1.3. Изучение Ф, ТМ1, ТМ2 человека в биологических объектах от обезьян.

3.2. Сравнительное изучение белкового спектра экстрактов тканей различных органов и сыворотки крови человека и обезьян.

3.2.1. Сравнительное электрофоретическое изучение белкового спектра сыворотки крови человека и обезьян.

3.2.2. . Сравнительное электрофоретическое изучение белкового спектра экстрактов тканей человека и обезьян.

3.3. Изучение физико-химических и иммунохимических свойств ТМ1 и ТМ2.

3.3.1. Отношение к осаждающим агентам.

3.3.2. Анализ электрофоретической подвижности ТМ1 и ТМ2.

3.3.3. Определение молекулярной массы ТМ1 и ТМ2.

3.3.4. Металлохелат аффинная хроматография ТМ1 и ТМ2.

3.3.5. Специфические методы окраски.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное иммунохимическое и физико-химическое изучение фетоплацентарных, сывороточных и тканевых белков человека и обезьян"

Актуальность исследования. Известны многочисленные примеры идентичности транспортных, трансформационных, регуляторных, сократительных и других функциональных блоков как у близких организмов, так и стоящих на разных уровнях эволюционной лестницы. При этом обнаруживается сходство функциональных белков, осуществляющих одноименные функции у многоклеточных и одноклеточных, у высших эукариоти прокариот (Уголев, 1982, 1989; Перцева, 1990).

Биологическая роль специфических белков беременности до настоящего времени остается мало изученной. Имеющиеся литературные данные носят характер результатов исследования функции этих белков in vitro. Установлено, что, во-первых, они обладают иммуносу-прессивной или иммуномодулирующей активностью для поддержания статуса нормальной беременности. Во-вторых, для некоторых представителей этой группы белков описана связь со стероидными гормонами, фактором роста и другими биологически активными веществами (Терентьев,1988). Но по каждой из точек зрения имеются неоднозначные данные и окончательное решение вопроса о биологической роли возможно лишь в опытах in vivo.

В этих целях необходимо обнаружение аналогов белков беременности у лабораторных животных. Подобные попытки предпринимались отечественными и зарубежными исследователями: Кривоносов С.К. (1985-1988), Зорин H.A. (1990-1995), Т-М Lin, SP. Haibert (19761978). Однако завершенных работ по этой проблеме не выявлено.

Поиск аналогичных биомолекул у представителей различных видов интересен и для решения более узких теоретических задач биологии и медицины. Например, сравнительное изучение структуры аналогичных по физико-химическим параметрам молекул позволяет установить возможную зависимость определенной биологической роли от наличия общих структурных фрагментов (Иванова В.П., 1992).

В практическом аспекте интересен факт применения специфических белков беременности для диагностики различных нормальных и патологических проявлений гравидарного состояния. Не исключено практическое приложение найденных у животных (особенно обезьян) белковых аналогов в медицинской практике на основании установленной биологической роли.

К специфическим белкам беременности человека относятся такие сывороточные и тканевые белки, как альфа-фетопротеин (АФП), связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (СБАГ), трофобла-стический бета-глобулин (ТБГ), хорионический гонадотропин (ХГ), плацентарный лактоген (ПЛЧ) и другие. Особый интерес исследователей проявляется по отношению к белкам, специфичным для трофобласта и продуцируемым эмбрионом, так называемым фетоплацентарным белкам. В настоящее время только сравнительно небольшое число биологически активных белков, обнаруживаемых в плаценте, выделены в чистом виде и охарактеризованы. Среди множества белков плаценты, обозначенных Bohn как РР (placental proteins), наиболее известны вышеназванные ХГ, ПЛЧ, а также тканевой белок ферритин (Ф).

Некоторые белки плаценты явно идентичны или, по крайней мере, очень сходны с соответствующими функциональными белками, имеющимися в других органах и жидкостях человека, что позволяет предполагать наличие идентичных генов в функционально различных клетках одного организма.

Поскольку изменение первичной структуры белков находит отражение в соответствующих изменениях их антигенной специфичности, можно ожидать, что сравнительный иммунохимический анализ структурного сходства и различия белков тесно связанных видов позволит косвенно судить о процессах генетической перестройки организмов при видообразовании, проявляющейся в антигенной дифференциации, что и было положено в основу данной работы.

Цель исследования:

Изучение общих закономерностей и различий в спектре фетоп-лацентарных, сывороточных и тканевых белков человека и обезьян, а также определение физико-химических параметров некоторых межорганных тканевых антигенов.

В задачи исследования входило:

1. Обнаружить аналоги сывороточных белков человека, в том числе белков беременности, в крови обезьян Macaca mu.ia.-Ha. ( Macaca flemesitinói, Macaca Fascicularis (резус, яванская, лапундер).

2. Идентифицировать специфические белки плаценты человека (ТБГ, ПЛЧ) в биологических объектах от обезьян.

3. Изучить белковый спектр экстрактов тканей органов, в том числе плаценты, а также сыворотки крови человека и обезьян.

4. Выявить термостабильные межорганные антигены (Ф, ТМ1 и ТМ2) в экстрактах тканей человека и обезьян.

5. Определить физико-химические параметры малоизученных ТМ1 и ТМ2.

Научная новизна исследования.

Впервые проведен широкий сравнительный иммунохимический и биохимический анализ фетоплацентарных, сывороточных и тканевых белков у человека и обезьян, выявлены видовые особенности и параллели при изучении белков в биологических объектах.

Установлено, что степень родства белков человека и их аналогов у обезьян различна: полная идентичность по СБАГ, а2МГ, lg G,M, ТМ1, неполная по АФП, ТМ2, lg А, крайне низкая по ПЛЧ и ТБГ.

Получены оригинальные данные по физико-химическим параметрам новых термостабильных антигенов - ТМ1 и ТМ2.

Разработаны новые подходы к выделению и очистке ТМ1.ТМ2.

Научно-практическая значимость работы.

Сравнительный иммунохимический анализ структурного сходства и различия белков тесно связанных видов позволяет косвенно судить о процессах генетической перестройки организмов при видообразовании.

Самостоятельно смоделированные иммунодиффузионные тест-системы на ТБГ, СБАГ, ТМ1, ТМ2 могут быть использованы в лабораторных исследованиях и в практической медицине: известна диагностическая значимость определения ТБГ, СБАГ в акушерстве и онкологии; ТМ1 и ТМ2 по предварительным данным являются маркером деструкции тканей.

Внедрение результатов в практику.

Материалы диссертации доложены на научных конференциях кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики, на конференции, посвященной 80-летию АГМА (1998), межвузовской конференции молодых ученых, посвященной 35-летию открытия АФП (Астрахань-Москва, 1999), конференциях РЕВв (1994^,1995).

Результаты исследования используются в научной и практической работе кафедры биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики и УНДЦ АГМА.

Диссертация изложена на 148 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований обсуждения результатов исследования), выводов, списка литературы. Иллюстрированный материал представлен 15 таблицами, 37 рисунками. Библиография включает в себя 62 отечественных и 166 зарубежных автора.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гайнуллина, Людмила Халиулловна

ВЫВОДЫ

1. Все 11 изученных фетоплацентарных, сывороточных и тканевых белков человека имеют разной степени идентичности аналоги у обезьян Macaca: lfíuüH¿ , jflemestrina , Fascicularis (резус, яванской и лапундер), о чем свидетельствуют результаты сравнительного иммунохимического анализа.

2. Определение степени родства этих белков и их аналогов у макак установило, что иммунологически полной идентичностью обладает один из белков беременности (СБАГ), три сывороточных белка (а2МГ, IgG, М) и один тканевой антиген (ТМ1); неполной идентичностью - фетальный белок (АФП), тканевой антиген (ТМ2); очень низкой - плацентарные белки с выраженной биологической активностью (ТБГ и ПЛЧ).

3. Обнаруженные во всех случаях перекрестные иммунологические реакции между изучаемыми белками человека и их аналогами у обезьян, а также выявленные количественные различия в белковых спектрах крови и тканей двух биологических видов свидетельствуют о филогенетической дивергенции гомологичных белков и соответствующих им генов. С этих позиций самыми молодыми белками являются ТБГ, обладающий иммуномодулирующими свойствами, и гормон - ПЛЧ.

4. Macaca ITЫЫН flemestrcna. , Fascicularis могут служить хорошими моделями для изучения биологического и клинического значения СБАГ, а2МГ, IgG и М, ТМ1.

5. ТМ1 и ТМ2 отличаются друг от друга и от ферритина по распределению в органах, по физико-химическим свойствам, сродству к металлам и отношению к индикаторным красителям.

6. Полученные биохимические характеристики ТМ1 и ТМ2 могут быть использованы при выделении и очистке этих двух новых антигенов, имеющих по предварительным данным диагностическое зна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гайнуллина, Людмила Халиулловна, Астрахань

1. Александров В.Я. - Клетки, макромолекулы и температура - Л.: Наука, 1975.-329 С.

2. Абелев Г.И. Модификация метода преципитации в агаре для сравнения двух систем антиген - антитело // Бюлл. экспер. биол. и мед. -1960. -№3. - С. 115-118.

3. Анненков Г.А. Белки сыворотки крови приматов // Москва.: Медицина, 1974. - 147с.

4. Баранов O.K. Иммунохимический анализ эволюции белков // Успехи совр. биол. - 1972. - Т. 74. - В. 3. - №6. - С. 420 - 438.

5. Биология маркеров рака и беременности // Киев.: Наук, думка. -1990. -252с.

6. Брем А.Э. Жизнь животных. Т.1. Млекопитающие // М.: Терра, 1992.-524 с.

7. Бычкова В. Е., Птицын О.Б. Состояние расплавленной глобулы белковых молекул становится скорее правилом, чем исключением // Биофиз. - 1993. - Т. 38. - №1. - С.58 - 66.

8. Васильева В. С., Глушанкова М. А., Жирмунский A.B. Теплоустойчивость клеток и мышечной альдолазы систематически близких видов двухстворчатых моллюсков и морских ежей в связи с условиями существования // Биология моря. - 1982. - Т.6. - №1. - С. 41 - 45.

9. Воробьева Т.Б. Иммунохимические тесты на эмбриоспеци-фические и плацентарные белки в скрининге и мониторинге переношенной беременности //Автореф. дисс. канд. мед. наук. - Астрахань. - 1991. - 141с.

10. Галвазитская О.В., Рева Б.А., Финкельштейн A.B. Достижение белковой цепью энергетического минимума не требует полного перебора конформации // Молек. биол. - 1994. - Т.28. - №6. - С. 1412 -1427.

11. Галвазитская О.В., Финкельштейн А. В. Самоорганизация белковой цепи ускоряется с повышением стабильности ее нативной структуры. Численный эксперимент // Молекул, биол. - 1995. - Т. 29. -№2. - С. 317-325.

12. Гончарова Е. И., Пинаев Г. П. Белки цитоскелета эритроцитов // Цитология. - 1988. - Т. 30. - №1. - С. 5 -18.

13. Даванков И.А., Навратил Дж., Уолтон X. Лигандообменная хроматография // М.: Мир, 1989. - 360 с.

14. Жуков-Варежников H.H., Полоплелов И.И., Мазина Н.М. -Проблема гетерогенных антигенов и ее значение для биологии // Успехи совр. биол. 1972. - Т. 74. - Вып. 1. - №4. - С. 54 - 67.

15. Жуковский А.П. Термостабильность структуры белков в на-тивном состоянии и механизм ее поддержания // Биофиз. - 1987. - Т. 32. -№4. - С. 583 - 587.

16. Иванова В.П. Выявление и анализ биологических свойств новых иммуномодулирующих пептидов // Автореф. дисс. канд. мед. наук., Санкт-Петербург. - 1992. - С. 1 - 20.

17. Завадский Л.М., Колчинский Э.И. Эволюция эволюции // Л.: Наука, 1977.-264 с.

18. Заварзин A.A. Основы сравнительной гистологии - М.; Л.: Изд-воЛГУ, 1985.-400 с.

19. Заварзин A.A. Труды по теории параллелизма и эволюционной динамике тканей II Л.: Наука, 1986. - 196 с.

20. Зорин H.A., Жабин С.Г., Лыкова О.Ф., Белогорлова Т.И. Чири-кова Т.С. Сравнительное изучение ассоциированного с беременностьюпротеина А и его аналогов у животных // Онтогенез. 1995. - Т. 26. - №2. -С. 119-124.

21. Кирпичников B.C. Биохимический полиморфизм и проблема так называемой эволюции // Усп. совр. биол. - 1972. - Т. 74. - В. 2. - №5. -С. 231-246.

22. Коржуев П. Влияние высокой температуры на трипсин теплокровных и холоднокровных позвоночных животных // Физиол. журн. -1936. - Т. 21. - №3. - С. 433 - 437.

23. Лопатин С.А., Варламов В.П. Новые тенденции в металло-хелатной аффинной хроматографии // Прикл. биох. и микробиол. - 1995. -Т. 31. - №3 . - С. 259-266.

24. Лопатин С.А., Варламов В.П., Даванков В.А. Лигандообмен-ная хроматография белков и ферментов И Биоорг. химия. - 1990. - Т. 16. - № 6. - С. 726 - 750.

25. Лютова М. И. Устойчивость реакции Хилла к различным повреждающим воздействиям у двух сортов пшеницы Triticum aestivum (,Poaceae) II Ботан. журн. - 1982. - Т. 67. - №4. - С. 433 - 439.

26. Медведь Л.В., Тиктопуло Е.И., Привалов П.Л., Варецкая Т.В. -Микроколориметрические исследования температурных переходов в фибриногене и его протеолитических фрагментах // Молек. биол. 1980. -Т. 14. №4. - С. 835-840.

27. Мухин Е. Н., Гинс В. К., Куликов A.B., Лихтенштейн Г. И. Теплоустойчивость ферредоксинов высших растений в связи с активностью в реакции фотовосстановления НАДФ // Физиол. растений. - 1973. -Т. 20.-№5.-С. 1007- 1012.

28. Насонов Д.Н., Александров В.Я. Реакция живого вещества на внешние воздействия. Денатурационная теория повреждения и раздражения // М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1940. - 252 с.

29. Никулина Д.М. Иммунохимическое, физико-химическое и клиническое изучение ß-i-глобулина "зоны беременности" // Автореф. дисс. канд. наук. - Астрахань. -1977. -144 с.

30. Никулина Д.М. Иммунохимическое изучение водорастворимых антигенов семенников человека // Краткие тезисы докладов к 66-йнаучной конференции медиков Астраханской области. Астрахань.: Изд-воАГМА, 1985. - С. 192- 197.

31. Опарин А.И. Происхождение жизни // М.: Наука, 1924. - 63 с.

32. Перцева М.Н. Существует ли эволюционное родство между хемосигнальными системами эукариотов и прокариотов // Ж. эвол. био-хим. и физиол. - 1990. - Т. 26. - С. 505 - 513.

33. Привалов П. Л. Энергетика структуры белковых молекул // Биофизика. - 1985. - Т. 30. - №4. - С. 722 - 733.

34. Птицын О.Б. Многоцентровый механизм самоорганизации глобулярных белков и кооперативность их денатурации и ренатурации // Докл. АН СССР, 1975. - Т. 223. - №5. - С. 1253 - 1255.

35. Развитие эволюционной теории в СССР (1917-1970-е годы) // Под ред. С. Р. Микулинского, Ю. И. Полянского. Л.: Наука, 1983. -614с.

36. Северцов A.B. Морфологические закономерности эволюции // М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1945. - 610 с.

37. Северцов А. Н. Современные задачи эволюционной теории // М.: Наука, 1945. - 155 с.

38. Северцов A.C. Основы теории эволюции // М.: Наука, 1987.450 с.

39. Структура и стабильность биологических макромолекул // М.: Мир, 1973,- 400 с.

40. Татаринов Ю.С., Масюкевич В.Н. Иммунохимическая идентификация нового бета-1-глобулина в сыворотке крови беременных женщин // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1970. - Т. 69. - №6. - с. 66 - 68.

41. Татаринов Ю.С., Масюкевич В.Н., Меснянкина Н.В., Парфенова Л.Ф. Иммунохимическая идентификация нового альфа2-глобулина в сыворотке крови беременных женщин //Акуш. и гинек. - 1970. - № 9. - с. 25 - 28.

42. Татаринов Ю.С., Фалалеева Д.М., Калашников В.В. Имму-нофлюоресцентное изучение бета1-глобулина в плаценте в ранние и поздние сроки беременности // Акуш и гинек. - 1975. - №7. - С. 63 - 68.

43. Тимофеев-Ресовский Н.В., Яблоков A.B. Микроэволюция. Элементарные явления, материал и факторы эволюционного процесса // М.: Наука, 1974.-304 с.

44. Тимофеев-Ресовский Н.В., Воронцов H.H., Яблоков A.B. -Краткий очерк теории эволюции // М.: Наука, 1977. 297 с.

45. Терентьев A.A., Молдагазиева Н.Т., Тагирова А.К., Татаринов Ю.С. Аффинная хроматография альфа-фетопротеина на иммобилизованных эстрогенах // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1988. - №4. - С. 422 -423.

46. Уголев А. М. Естественные технологии биологических систем //Л.: Наука, 1987. - 560 с.

47. Уголев А. М. Принципы организации и эволюции биологических систем /АЭволюц. биохим. и физиол. - 1989. - Т. 25. - №2. - С. 215 -234.

48. Уголев A.M. Гипотеза о возможности эволюции и специализации функций на основе рекомбинации и транспозиции элементарных функциональных блоков // Ж. эвол. биохим. и физиол. - 1982. - Т. 18. -№6. - С. 11-26

49. Уголев A.M. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций //П.: Наука, 1985. - 544 с.

50. Ушаков Б.П.- Эволюционное значение температурных адап-таций животных // Успехи совр. биол. 1982. - Т. 93. - №2. - С. 302 -319.

51. Фельдман Н.Л., Каменцева И.Е. Теплоустойчивость изо-ферментов малатдегидрогеназы из листьев огурца и дыни // Физиол. растений. - 1982. - Т.29. - №6. - С. 1037 - 1044.

52. Храмкова Н.И., Абелев Г.И. Пределы чувствительности метода преципитации в агаре // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1961. - №12. -С. 107- 109.

53. Цалкова Т.Н., Привалов П.Л. Исследование доменной организации кальмодулина // Молек. биол. - 1983. - Т. 17. - №2. - С. 314 -321.

54. Цалкова Т.Н., Привалов П.Л. Наличие кооперативной структуры у триптических фрагментов тропонина С // Молек. биол. - 1983. - Т. 17. - №5. - С.1042- 1047.

55. Шмальгаузен И.И. Пути и закономерности эволюционного процесса // М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1986. - 232с.

56. Шмальгаузен И.И. Факторы эволюции // М.: Наука, 1968.451 с.

57. Шноль С. Э. Физико-химические факторы биологической эволюции // М.: Наука, 1979. - 370 с.

58. Шныров В. Л. Исследование температурной стабильности родопсинов различного происхождения // Автореф. канд. дис. Пущино, 1979. - С. 3 - 20. (Ин-т биол. физики АН СССР).

59. Щеголева Т.Ю., Колесников В.Г. Теплоиндуцированные переходы в белках // Биофиз. - 1997. - Т. 42. - №4. - С. 834 - 839.

60. Яблоков А. В., Юсупов А. Г. Эволюционное учение // М.: Высшая школа, 1976. - 335 с.б) иностранная литература

61. Abraham K.I., Joshi P.N. Isolation of calotropain Fl // J. Chromatogr. - 1979. - T. 168. - P. 284.

62. Alahiotis S., Miller S., Berger E. Natural selection at the GDH locus in Drosophila // Nature. - 1977. - V. 269. - P. 144 - 145.

63. Andersson L. -1 mmobilized metal ion affinity chromatography. // ISI Atlas Sci. Biochem. 1988. - V. 1. - P. 318 - 322.

64. Andersson L., Porath J. Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe3+) affinity chromatography//Anal. Biochem. - 1986. -V. 154. - №2.-P. 250 -254.

65. Andersson L., Sulkowski E.- Evolution of the interaction of protein a-amino groups with M(ll) by immobilized metal ion affinity chromotography // J. Chromatogr. 1986. - V. - 604. - P. 13 -17.

66. Антитела. Методы // M.: Мир, 1991. 285 с.

67. Antonelli M.L., Bucci R., Carunchio V. An Application of the ligandge exchandge chromatography to the analysis of protein components // J. Liquid Chromatogr. - 1980. - T. 3. - P. 885 - 890.

68. Bagshawe K.D., Lequin R.M., Sizaret P., Tatarinov Y.S. -Pregnancy ß1-glycoprotein and chorionic gonadotropin in serum of patients with trophoblastic and non-trophoblastic tumours // Eus. J. Cancer. 1978. -T. 14. - P. 1331 - 1338.

69. Bauer K. Age detemination by immunolofical techniques of the last common ancestor of men and champanzee // Humangenetik. - 1972. - T. 17.-P. 253-260.

70. Berg K., Heron J. SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis of purified human leucocyte interferon and the antiviral and anticellular activities of the different interferon species // J. Gen. Virol. - 1980. - T. 50. - P. 440 -447.

71. Blancelot A., Wilson V., Wood D., Jeffereys A. The seel myoglobin gene : an unusually long globulin geen // Nature. - 1983. - Feb. 24. - V. 301. - №5902. - P. 732 - 734.

72. Bohn H. Detection and characterization of pregnancy proteins in the human placenta and their quantitative immunochemical determination in sera from pregnant women // Arch. Gynecol. - 1971. - V. 210. - P. 440 -457.

73. Bohn H. Charakterisierung der schwangerschafts-assoziierten Glykoprotein als akute Phase-Protein // Arch. Gynakol. - 1972. - T. 213. - P. 52 - 54.

74. Bohn H. Isolierung, Charakterisierung und quantitative immunologische bestimmurng des steroid-bindinden ß-globulins // Blut. -1974. -T. 29. - P. 17-24.

75. Bohn H., Weinmann E. Immunologische unterbreehung der Schwangerschaft bei äffen mit antikorpern gegen, des menschiche schwangerschaft-spezifische ßi-glykoprotein (SPi)//Arcy. Gynaekol. - 1974. -T. 217. -P. 209-315.

76. Bohn H., Sedlacek H. Eine vergeichende Untersuchung von plazentaspeczifischen proteinen bei mensch und subhumanen primaten // Ares. Gynakol. - 1975. - T. 2. - P. 105 -121.

77. Bohn H. The protein antigens of human placenta as basis for development of contraction vaccine // Proc. 3rd Int. Symp. Immunology of Reproduction, Varna. - 1975. - P. 111 -125.

78. Bohn H., Winckler W. Isolierung, Charakterisierung des schwangerschafts- assziierten alpha-2- glykoproteins (alpha-2-PAG) // Blut. -1976!-T. 33. - P. 377-388.

79. Bohn H., Bauer H.W. Schwangerschafts- assziierbes ct2-glykoprotein (0C2-PAG): Bedeung seiner bestimmung dei malignen erkrankugen // Laboratoriumriumscatter. - 1979. - T. 29. - P. -119 -126.

80. Bohn H.- Placental and pregnency proteins. In Lehmann FG (ed)Cancio embryonic proteins // Elsevier (North-Holland) Biomedical Press, Amsterdam, 1979. - V. 1. - P. 289 - 299.

81. Bohn H., Inaba N., Lüben G. New placental proteins and their potential diognostic significance as tumor markers // Oncoder. Bio. Med. -1980. -T. 2. - P. 141 -153.

82. Bohn H. New placental and pregnency protein as possible markers in oncology // Kin. Wochenschr. - 1980. - T. 58. - P. 489 - 509.

83. Bollin E., Sulkowski E. Metal chelate affinity chromatography of hamster interferon //Arch. Virol. - 1978. - T. 149 - 152.

84. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Anal. Biochem. - 1976. -V. 72. - P. 348 - 254.

85. Braunstein G.D., Asch R.H. Pregnancy specific beta-1-glycoprotein concentrations throughout pregnancy in the rhesus monkey // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1986. - T. 62. - P. 1264 - 2370.

86. Bychkova V. E., Ptitsyn О. B. The molden globule in vitro and in vivo // Chemtracts Biochem. Mol. Biol. -1993. -V. 4. - P. 133 - 163.

87. Camacho C. J., Thirumalai D. Rinetics and thermodynamic of folding in model proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - V. 90. - P. 36 -38.

88. Cederholm-Williams S.A., Porter N. W. Identification of the plasminogen activator secreted by human fibroblasts // Brit. J. Dermatol. -1984. - V. 110. - №2. - P. 423 - 429.

89. Chen С. H., Bernts D. S. - Comparison of the stability of phycocyanins from thermophilic, mesophilic, psychrophilic and halophilic algae // Biophys. Chem. - 1978. - V. 8. - P. 203 - 213.

90. Cherry L.M., Case S.M., Wilson A.C. Frog perspective on the morphological difference between humans and chimpanzees // Science. -1978.-T. 200.-P 209-211.

91. Colombani P. M. Cyclosporin A binding to calmodulin : a possible site of action on T lymphocytes // Scince. - 1985. - V. 228. - P. 337 -339.

92. Cooke N.H.C., Viavattene R.L., Eksteen R., Wong W.S., Davies G., Karger B.L. Use of metal ions for selective separation in highperformance liquid chromatography // J. Chromatogr. - 1978. - T. 149. - P. 391 - 398.

93. Craik C. S., Bachman S. R., Beychok S. Characterization of globin domains : heme binding to the central exon product // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1980. - V. 77. - №3. - P. 1384 - 1388.

94. Davankov V.A., Rogozhin S. V., Semechkin A.V. Ligand-exchang chromatography // in Chemistry and Technologt of High Molecular Weight Compounds, ed Moscow, 1973. - V.4. - P. 5.

95. Davankov V.A., Semechkin A.V. Ligand-exchang chromatography//J. Chromatogr. - 1977. -T. 141. - P. 313-318.

96. Davis B.J. Disc electrophoresis. 2. Metod and application to human serum protein //Ann. N.J. Acad. Sci. - 1964. -T. -121. - P. 400-440.

97. Denko E.I., Kislyuk I. M., Shukhtina H. G. Primary thermostability of cells and a problem of adaptation of plants to conditions о f cold climate // Flora. -1981. - Bd. 171. - S. 419-455.

98. Dolgikh D. A., Gilmanshin R. J., Brazhnikov E. V., Bychkova V. E., Semisotov G.V., Venyaminov S.Yu., Ptitsyn O.B. Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure ? // FEBS Lett. - 1981. - V. 136. - P. 311 -315.

99. Edy V.B., Billian A., De Sommer P. Purification of fibroblast interferon by zinc chelate affinity chromatography // J. Biol. Chem. - 1977. - T. 252. - P. 5934.

100. Fitch W.M., Langly C.H. Protein evolution and the molecular clock // Fed. Proc. - 1976. - T. 25. - P. 2092 - 2097.

101. Эволюция//M.: Мир, 1981. -264c.

102. Флоркен M. Биохимическая эволюция // M.: Изд-во иностр. лит., 1947. - 176 с.

103. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека. ТТ. 1. 2. 3. // М:. Мир, 1990, Т. 3.

104. Эйген М. Самоорганизация материи и эволюция биологических макромолекул // М.: Мир, 1973. - 160 с.

105. Go М. Correlation of DNA exonic regions with protein structural units in haemoglobin//Nature. - 1981. - V. 291. - №5810. - P. 90 - 92.

106. Goodman M. Immunochemistry of the primates and primate evolution//Ann. N.Y.Acad. Sci. - 1962. - V. 102. - P. 219-220.

107. Goodman M., Pruchodko W. et al. Molecular systrmatics of Macaques//Amer. J. Phys. Antherop. - 1970. - V. 33. - P. 131-135.

108. Goodman V. Evolution of the immunologic species specificity of human serum proteins//Hum. Biol. - 1962. - V. 34.- P. 104 - 108.

109. Goodman V. Problems of primate systematics attacked by the serological study of proteins. In : Taxonomic Biochemistry and Serology // Kansas. - 1964.-P. 467.

110. Goodman V. Serological analysis of the systematics of recent hominoids//Hum. Biol.- 1963. - V. 35. - P. 377- 384.

111. Grabar P., Williams C.P. Methode permettant tetude cunjuguse des propriétés electriphoretigues et immunichimigues d un melange de proteines. Application au serum sanguin // Biochim. Biophys. Acta. 1953. -V. 10 . - P. 193-203.

112. Грант В. Эволюция организмов // M.: Мир, 1980. - 408 с.

113. Grudzinskas G., Gordon Y.B., Jeffrey D. D., Chard T. Specific and sensitive determination of pregnancy-specific-(31-glycoprotein by radioimmunoassay// Lancet. - 1977. - T. 1. - P. 24 - 28.

114. Gusdon J.P., Witherow C.C. The effect of active immunization agant placental proteins on pregnency in monkey // Am. J. Obstet Gynec. -1976.-T. 126. - P. 308-312.

115. Hames B.D., Rickwood D. Gel electrophoresis of Proteins // Practicfl Approach, IRL Press, Oxford. -1981. - P. 5 -10.

116. Hansson H., Kagedal L. Adsorption and desorption of proteins in menai chelate affinity chromatography. Purification of albumin // J. Chromatogr. -1981. - T.215. - P. 333.

117. Hodgen G.D., Dufau M.L., Catt K.J., Tullner W. Estrogens, progesterone and chorionic gonadotropin in pregnant rhesus monkeys // Endocrinol. - 1972. - T. 9. - P. 896 - 900.

118. Hodgen G.D., Tullner W.W., Vaitukaitis J.L., Ward D.N., Ross G.T. Specific radioimmunoassay of chorionic gonadotropin duringimplantation in rhesus monkeys // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1974. - T. 39. -P. 457-461.

119. Иммуноглобулины//M.: Мир, 1981. -495 c.

120. Inaba N., Renk I., Bohn H. Immunohistochemical location of placental protein (PP8,'PP9, PP10, PP11, PP12) in human term placentae // Arch. Gynecol. - 1980. -T. 230. - P. 109-121.

121. Inaba N., Renk I., Ax W., Weinmann E., Schoottler H., Bohn H. -Immunohistochemical Detection of pregnancy and placental proteins in human and cynomolgus monkey (Macaca Fascicularis) peripheral blood cell // Blut. 1981.-T. 43.-P. 315-323.

122. Иннис У., Ингрем Д. Жизнь микроорганизмов при низких температурах: механизмы и молекулярные аспекты И В кн.: Жизнь микробов в экстремальных условиях. - М.: Мир, 1981. - С. 89 - 123.

123. Jolles J., Dianoux А. С., Hermonn J. Niemann В., Jolles P. -Relationship between the cystine and tryptophan contents of 5 different lysozymese and their heat stability and specific activity // Biochem. Biophys. Acta. 1966. - V. 128. - P. 568 - 570.

124. Jonston I .A., Walesby N. J., Davison W., Goldspink G. -Temperature adaptation in myosin of Antarctic fish // Nature. 1975. - V. 254. - P. 74 - 75.

125. Кальвин M. Химическая эволюция. Молекулярная эволюция, ведущая к возникновению живых систем на Земле и других планетах // М.: Мир, 1971. -257 с.

126. Кейлоу П. Принципы эволюции // М.: Мир, 1986. - 406 с.

127. Kato Y., Nakamura К., Hashimoto. High-performance metal chelate affinity chromatography of proteins // J. Chromatogr. - 1986. - T. 354. - P. 511 -517.

128. Kerr С. В. Genetics of human blood coagulation // Genet. -1965. -V. 2. - P. 254.

129. Kimura M. The neutral theory of molecular evolution // Cambridge University Press. - Cambridge, 1983. -240 c.

130. Khazeli M.B., Mitra R.S. Cadmium-binding component in Escherichia coli during accomodation to low levels of this ion // Appl. Environ. Micron. -1981.-T. 41. - P. 46-50.

131. King M.C., Wilson A.C. Evolution at two levels in human and champanzees// Science. - 1975. - T. 198. - P. 107 -110.

132. Klee C.B., Crouch Т.Н., Richman P.G. Calmodulin // Ann. Rev. Bioch. - 1980. - V. 49. - P. 489 - 515.

133. Klopper A. Specific pregnency proteins // In Martini, James VHI (ads). The Endocrinology of Pregnency and Parturition Academic Press, New York, 1983. - P. 127.

134. Крепе E.M. О путях развития эволюционной биохимии. Эволюционная физиология, ч. 1. // М.: Наука, 1979. - С. 394 - 425.

135. Купер Э. Сравнительная иммунология // М.: Мир, 1980.422 с.

136. Kurecki Т., Kress L.F., Laskowski М. Purification of human plasma a2-macroglobulin and ai-proteinase inhibitor using zinc chelatechromatography // Analyt. Biochem. - 1979. - V. 99. - №2. - P. 415 -420.

137. Kuwajima K. The molten globule state as a clue for understanding the folding and cooperativity of globular prot ein structure // Proteins : structure, function, genetics. - 1989. - V. 6. - P. 87 - 103.

138. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680 - 685.

139. Libreton J. P. Purification of the human plasma alpha2-SH glycoprotein by zinc chelate affinity chromatography // FEBS. - 1977. - T. 80. -№2. - P. 351 - 354.

140. Leder A., Miller H. I., Hamer D. H. Compasition of cloned mouse alpha - and beta - globulin genes : conservation of intervening sequence locations and extragenic homology // Prik. Nats. Acad. Sci. USA.1978. V. 7. - №12. - P. 6187 - 6191.

141. Lin T.M., Halbert S.P., Kiefer D„ Spellacy W. N. Three pregnancy-accociayed human plasma proteins purification, monospecific antisera and immunological identification // Int. Arch. Allergy. - 1974. - V. 47. -P. 35 - 53.

142. Lin T.M., Halbert S.P., Spellacy W. N. Measurement of pregnancy-associated plasma proteins during human gestation //J. CI. Invest. - 1974. -V. 57. - P. 576-582.

143. Lin T.M., Halbert S.P., Gall S. Characterization of four human pregnancy-associated plasma proteins //Amer. J. Obstet. Genecol. - 1974. -T. 118. V.-P. 223-236.

144. Lin T.M., Halbert S.P. Immunolodia comparison of various human pregnancy-associated plasma proteins // Int. Archs. All. Appl. Immun. -1975,- T. 48.-P. 101 -115.

145. Lin T.M., Halbert S.P. Pregnency zone protein analoque in pregnant and non-pregnant primates and its decrease during pregnancy in some monkey speices // Clin. Exp. Immunol. - 1976. - T. 26. - P. 609 - 622.

146. Lin T.M., Halbert S.P., Spellacy W. N„ Gall S. Human pregnancy-associated plasma proteins during the post-partum period //Am. J. Obstet. Genec. - 1976. - T. 124. - P. 382 - 387.

147. Lin T.M., Halbert S.P. Immunological relationships of human and subhuman primate pregnancy-associated plasma proteins // Int. . Archs. Allergy appl. Immun. - 1978. - T. 56. - P. 207 - 223.

148. Lindemans J., Van Kapel J., Abels J. Purification of human transcobalamin ll-cyanocobalamin by affinity chromatography using thermolabile immobilization of cyanocobalamin // Biochem. Biophys. Acta.1979.-T. 579. P. 40 - 49.

149. Левонтин P. Генетические основы эволюции // М.: Мир, 1978.-350 с.

150. Lonnerdal В., Carlsson J., Porath J. Isolation of lactoferrin from human milk by metal chelate affinity chromatography // FEBS Lett. - 1977. -T. 75. - P. 80 - 98.

151. Low P.S. Structure and function of the cytoplasmic domain of band 3 center of erythrocyte membrane-peripheral protein interaction // Biochem, Biophys. Acta. - 1986. -V. 864. - P. 145 - 167.

152. Luben G., Scutze., Bohn H. Ciculating levels of placental propeiins PP7 and PP8 in various cancer conditions // In Peefrs H (ed) Protides of biological fluids 27 th Collequium. Pergamon Press, Oxford, New-York, 1979.-P. 253.

153. Lutova M. I., Feldman N. L. Genotypic temperature adaptation of cellular function and proteins in two Zostera species // Oecologia. - 1981. -V. 49. - P. 92-95.

154. Medved L. V., Gorkun О. V., Privalov P.L. Structural organization of C-terminal parts of fibrinogen A alpha-chains // FEBS Lett. -1983. - Aug. 22. - V. 160,- №1-2. - P. 291 -295.

155. Meisler M. H., Gumucio P. L. Pancreatic amylase: molecular genetic and evolution // Molecular and cellular basis of digestion. Ed. P. Desnulle., - Amsyerda. Elsevier, 1986. - P. 249-263.

156. Майер Э. Популяции, виды и эволюция // М.: Мир, 1974.250 с.

157. Murthy A. S.N., Mains R.E., Eipper В.А. Purification and characterization of peptidylycine a-amidating monooxygenase from bovine neurointermediate pituitary // J. Biol. Chem. - 1981. - V. 256. - №13. - P. 7035-7041.

158. Muszynska G., Andersson L., Porath J. Selective adsorption of phosphoproteins on gel-immobilized ferric chelate // Biochem. - 1986. - V. 25.- № 22. P. 6850 - 6853.

159. Nikulina D.M. Blood - brain barrier condition eluation in brain disorders // 23rd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies - Basel, August 13 - 18. - 1995. - P. 175.

160. Nex E. A new principle in biospecific affinity chromatography used for purification of cobalamin-binding proteins // Biochem. Biophys. Acta. - 1975.-T. 179.-P. 189-203.

161. Nex E. Purification of rabbit transcobalamin II by ligand affinity chromatography // Can. Physiol. Pharmacol. - 1977. - T. 55. - P. 923 - 930.

162. Nex E., Olesen H. Purification and characterization of rabbit haptocorrin // Biochem. Biophys. Acta. -1981. - T. 667. - P. 370 - 378.

163. Novokhatny V.V., Kudinov S.A., Privalov P.L. Domains in human plasminogen // J. Mol. Biol. - 1984. - V. 279. - P. 215 - 232.

164. Ouchterlony O. Diffusion-in-gel metod for ummunological analysis // Progress in Allergy. - 1958. V. - P. 1 -10.

165. Pervais S., Brew K. Homology of p-lactglobulin, serum rethinol-binding protein and protein HC // Scince. - 1985. - V. - 228. - P. 335 - 337.

166. Популяционная биология и эволюция. М.: Мир, 1982. - 488с.

167. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metal chelate affinity chromatograhy, a new approach to protein fractionation // Nature. -1975. - V. 258. - № 5536. - P. 598 - 599.

168. Porath J., Olin B. Immobilized metal ion affinity chromatography of biomaterials. Serum protein affinities for gel-immobilized iron and nickel ions // Biochem. - 1983. - V. 22. - № 7. - P. 1621 - 1630.

169. Pope V.Z., Pope C.E., Beck L.R. SP1 secretion by baboon embryos in vitro // Placenta. -1984. - T. 5 . - P. 403 - 408.

170. Практическая химия белка. M.: Мир, 1989. - 623 с.

171. Privalov P. L. Stability of proteins: proteins which do not present a single cooperative system //Adv. Protein Chem. - 1982. - V. 35. - P. 1 -104.

172. Privalov P. L. Stability of proteins: small globular proteins // Adv. Protein Chem. - 1979. - V. 33. - P. 167 - 241.

173. Privalov P. L., Mateo P. L., Kchechinashvili N. N. et al. -Comparative thermodynamic study of pepsinogen and pepsin structure // J. Mol. Biol. -1981.- V. 152. №2. - P. 445 - 464.

174. Privalov P. L., Medved L. V. Domains in the fibrinogen molecular//J. Mol. Biol. - 1982. - Aug. 25. -V. 159. - №4. - P. 665-683.

175. Ptitsyn О. B. Protein folding: hypothesis and experiments // J. Protein Chem. - 1987. - V. 6. - P. 273 - 293.

176. Ptitsyn О. B. The molten globule state // Protein folding. New York : W. H. Freeman and Cj, 1992. - P. 243 - 300.

177. Ptitsyn О. В., Bychkova V. E., Uversky V. N. Kinetic and equilibrium folding intermediates // Phil. Trans. Soc. Ser. B. - 1995. - V. 348. -P. 35-41.

178. Рэфф P., Кофмен Т. Эмбрионы, гены и эволюция // М.: Мир, 1986.-404 с.

179. Ramley Е.М., Houston M.L., Harris J.W.S. Interactions of the trophoblastic and matermal tissues in three closely primate species // Am. J. Obstet. Gynecol. - 1976. - T. 124. - P. 647 - 650.

180. Rutanen E.M., Seppa M. Pregnany-specific (31-glycoprotein in trophoblastic disease // J. Cli. Endocrinol Metab. - 1980. - T. 50. - V. 81. - P. 81 - 89.

181. Ryley H. Isolation and partial characterization of a thiol proteinase ingibitor from plasma // Biochem. Biophys. Res. Commmun. -1979. -T. 89. - P. 870-876.

182. Salacinaki P.R.P., Mc Lean C., Sykes J.E.C., Clement-Jones V.V., Lowwry P.J. Jodination of glycjproteins and peptides using a solid-phas oxidizing agent 1, 3, 4, 6-tetrachloro-3a,6a-diphenyl (Jodogen) // Anal. Bioch. -1981. -T. 117-P. 136- 140.

183. Salier J.P., Martin J.P., McPhee H., Hochstrasser K. -Purification of the human serum inter-a-trypsin ingibitor by zinc chelate and hydrophobic interaction chromatographies //Anal. Biochem. 1980. - T. 109. -P. 273 - 279.

184. Scully M.F., Kakkar V.V. Zn2++-Chelate chromatography of human fibrinogen // BST. -1981. - T. 9. - P. 335.

185. Schulz G. E. Protein - Differenzierung: Entwicklung neuartigen Proteine // in Laufe der Evoluion, Angewandte Chemire, 1981. - V. - 93. - C. 143-151.

186. Sell S. Alpha - fetoprotein // Cancer markers. - New York. -Human Press, 1980. - 293 p.

187. Скоупс P. Методы очистки белков // M.: Мир, 1985. - 358 с.

188. Shaw D., West С.Е. The isolation of methionine and ethionine by silver ligand chromatography and application to methionine-containing peptides //J. Chromatogr. - 1980. -T. 200. - P. 185 - 192.

189. Schwabe C., Warr G.W. A polyphelitic view of evolution : the genetic potentiol hypothesis // Perspect. Biol, and Med. - 1984. - V. - 27. -№3. - P. 465 - 485.

190. Shing Y. W., Akagi J. M., Himes R. H. Psychrophilic, mesophilic and thermophilic triosephosphate isomerases from three Clostridial species // J. Bacterid. 1975. - V. 122. - P. 170 - 184.

191. Spektor T. Refinement of the Comasse Blue metod of protein quantitation //Anal. Biochem. - 1978. -V. 86. - P. 141 -146.

192. Stevens V.C., Bohn H., Powell J.E. Serum levels of a placental protein during gectation in the baboon //Am. J. Obstet. Gynecol. - 1976. - P. 51 - 54.

193. Szabo D.G., Then G.W., Csabo I.F. Isolution of pregnancy-associated rhesus monkey // Gynecol. - 1977. - T. 356 - 476.

194. Sulkowski E. Immobilized metal-ion affinity chromatography: imidazole protein pump and cyromatographie sequelae. I. Proton Pump. // J. of Molecular recognition. - 1996. - V. 9. - P. 389 - 393.

195. Sulkowski E. Immobilized metal-ion affinity chromatography: imidazole protein pump and chromatographie. II. Chromatography Sequelae. // J. of Molecular recognition. - 1996. - V. 9. - P. 494 - 498.

196. Taguchi H., Homaoki M., Matsuzowa H., Ohta T. Heat-stable extracellular proteolytic' enzyme produced by Thermus caldophilus strain GK24, an extremely thermophilic bacterium // J. Biochem. - 1983. - V. 93. - P. 7-13.

197. Тейлор Д.Ф. Выделение белков // В. кн. "Белки" М.: И. Л. -1967.-Т.-№1,-С. 156.

198. Tang J. Evolution in the structure and function of carboxyl proteases // J. Mol. Cell. Biolchem. - 1979. - V. 26. - №2. - P. 93 - 109.

199. Tatarinov Y. S., Sokolov A.V. Development of a radioimmunoasseys for pregnancy specific (31 -glycoprotein and its measurement in serum of patients with trophoblatic and non-trophoblastic tumours // Int. J. Cancer. - 1979. - T. 19. - P. 16.

200. Torres A.R., Peterson E.A., Evans W. H., Mage M.G., Wilson S.W. Fractionation of granule proteins of granulocytes by copper chelate chromatography // Biochem. Biophys. Acta. - 1979. - T. 576. - P. 385 - 390.

201. Tsalkova T. N., Privalov P. L. Thermodynamic stydy of domain organization in troponin С and calmodulin // J. Mol. Biol. - 1985. - V. 181. -№4. - P. 533 - 544.

202. Tullner W.W., Hertz R. Comparative aspects of chorionic gonadotropin production in non-human primates // Medical Primatology (ed by E.I. Goldsmith and J.Moor-Jandwski) Kargee Basel. -1971. - P. 553.

203. Van Kapel J., Loef B.G., Lindemans J., Abels J. An improved metod for lage scale purification of human holo-transcobalamin II // Biochem. Biophys. Acta. -1981. - T. 676. - P. 307 - 310.

204. Vijayalakshmu M. A., Krishnan S. Immobilized metal ion affinity chromatography of bio molecules: Principles and parspectives // Biosciences. - 1987. - V. - №4. - P. 89 - 92.

205. Vijayalakshmu M. A. Pseudobiospecific ligand affinity chromatography // Trends Biotechnol. - 1989. - V. 71. - №3. - P. 71 - 76.

206. Вилли К., Детье В. Биология. Биологические процессы и законы // М.: Мир, 1978. -450 с.

207. Von Schoultz В., Stigbrand Т., Marinsson K., Holmgren N. -Demonstration of analodues to the human pregnancy zone proteins in animals //Acta Endocrinol. 1976. - T. 81. - P. 379 - 383.

208. Walsh S„ Wolf R.C., Meyer R.K., Aubert M.L., Friesen H.G. -Chorionic gonadotropin, chorionic somatomammotropin and prolactin in the uterine venia and peripheral plasma of pregnant rhesus monkeys // Endocrinol. 1977. - T. 100. - P. 851.

209. Weeds A. G., McLachlan A. D. Stractural homology of myosin alkali light chains, troponic С and carp calcium bindind proteins // Nature. -1974. - V. 252. - № 5485. - P. 646 - 649.

210. Weerasinghe K., Scully M.F., Kakkar V.V. Purification of human clotting Factor XII by Zn2+ - chelate chromatography // BST. - 1981. -T. 9. - P. 336 - 340.

211. West A.B., Isaak C. A., Carboni J. M., Morrow J. S. et al. -Localization of vielin, a cytoplasmic domein of band 3 : center of erythrocyte membrane- peripheral protein interaction // Biochim. Biophys. Acta. 1986. -V. 864. - P. 145- 167.

212. Wetlaufer D. B. Nucleation, rapid folding, and globular intrachain regions in proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1973. - V. 70. -P. 697.

213. Wilson A.C., Carlson S.S., White T.J. Biochemical evolution // Ann. Rev. Biochem. - 1977. - T. 46. - P. 573 - 639.147

214. Wilson A.C., Carlson S.S., White T.J., Cherry L.M. Molecular evolution and cytogenetic evolution // In: Molecular Human Cytogenetics. Academic Press, New York, 1977. - P. 375 - 393.

215. Wolf R.C., Meyer R.K. Gonadotropins and gonadal hormones // Comparative Reproduction of no-human Primates. -1971. - P. 557.

216. Wunderwald P., Schrenk W. J., Porat H. Removal of Endoproteinases from biological fluids by "Sandwich affinity chromatography" with a2-macroglobulin bound to zinc chelate-Sepharose // J. Biol. Chem. -1983. -V. -5. №1. - P.31- 42.

217. Выражаю глубокую благодарность научному руководителю настоящей работы профессору АГМА Никулиной Д. М.

218. Искренне признательна зав. лабораторией "Инженерии ферментов" Центра "Биоинженерия" РАН, д. х. н. Варламову В.П. за помощь в работе, а также всем коллегам за постоянную поддержку.