Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическое и иммунохимическое изучение валков семенной плазмы человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическое и иммунохимическое изучение валков семенной плазмы человека"

ЛИНИСГЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ

ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ , ^ ^ д УНИВЕРСИТЕТ

- ь ДЕК 199'* т пРавах рукописи

ииггодгэо Дпаксзйдр Ар^аяьагшч ЭХКГ.'ШБСКОЕг Б1 тГЛШЮХШИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ

&глкоз сг&вкиэа плдзеяы- человека

03.00.04 - Бмахюика

Автореферат

диссертации на ссясканко учзной степени дохгсрз^ледшдккских наук

Астрахань - 1994

Работа выполнена в Астраханском государственном медицинском институте им. A.B. Луначарского

Научный консультант - гкадемщ РАЕН, профессор

Ю.С. Татариноо

Официальные оппоненты: доетор кедициисхих наук, профсссс

А.А. Терентьев

доетор медицинских наук, профссс; О.П. Шевченхо

доктор медицинских наук, профеш Д.Д. Петруннн

Ведущее научное учрездену.о - Московский к«учиэч;гслс£02: тельский онкологический институт и:«!. П.А. Герцоиа

Защита диссертации состоится на заседания Специализированного Ученого Сссзта К; 3 Д 034.14.03 РГМУ (ул.' Островитянок. 1) "_"_ 1994 г. с 14 ч'ссз

С диссертацией можно озигноглитьсяс б«блг.зтс»5 РШУ (ул. Острозштшоаа, 1)

Автореферат разослан *_8_1S04 г-

Ученый секретарь Специализированного Созета доктор медицинских наук, профессор

пде te

ОЪЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Многие фундаментальные и прикладные вопросы ¿иологни и патологии репродукции связаны с выяснением строения, механизмов действия и функциональной взаимосвязи белков семенной плазмы человека. Белки семенной плазмы являются важнейшим компонентам системы жизнеобеспечения сперматозоидов. Среди этих белков велика доля ферментов и других регуляторов биологических процессов', обеспечивающих сохранение фер-тильности и последовательность биохимических реакций, сопро- -вождаю'дкх оплодотворение.

Важнейшим аспектом, определяющим актуальность изучения белков семенной плазмы/ является необходимость совершенствования лабораторной диагностики патологии мужской репродуктивной системы. А этой патологии по частоте, тяжести течения и социальным лоследствиям особое место занимают опухолевые к воспалительные заболевания предстательной железы и мужское бесплодие (С.А.Каган, 1974; Е.Б.Марке(нбах,1980; В.П.Чернышев,1985; В.И.Го-валло,1987; Л.С.Еассалык и соавт.,1989). Эти заболевания сопровождаются различными по природе и характеру, но совершенно опре-целенннми Изменениями белкового состава семенной плазмы и ее компонентов.

На пути создания высокоэффективных специфических методов лабораторной диагностики и перспективных патогенетических направлений лечения патологии мужской репродуктивной системы настоятельной необходимостью становятся знания о отроении и свойствах бэлков семенной плазмы.

До настоящего времени имеются разрозненные данные о белковом составе семенной плазмы, которые не отражают структурные и

функцианальные связи белковых и ферментных систем этой биологической жидкости / Т,Н.Устанкина,1974,1989; В.Д.Чернигов, 1985; О.П.Шевченко И соавт. ,1982,1983,1985; Hafcc R., ,1977; K.Tsai at nil, 1984;3onsaeng ot al,I98bpuptaS ct вД988; Chard С., 1991/. Имеются единичные работы по выделению и очистке белковых компонентов семенной плазмы и их детальному физико-химическому анализу/irfaug и et ,1979; i>ave B.et аД98в¡3kidGolH¿991; tedhy« е., 1991/. Практически не изучен белковый состав семенной плазма при опухолевой и воспалительной патологии пред- , ста тельной железы и мужском бесплодии и применении обнаруженных изменений в диагностических целях.

Цель работа. .Целью настоящего исследования.явилось идентификация, выделение и изучение физико-химических, иммунорми-ческих и биологических свойств .белков саманной плазмы, разработка высокочувствительная методов их обнаружения, оценка возможности использования тестов на белки семенной плазмы в диагностических целях.

Задачи исследования.

1. Дать общую характеристику белкового состава семенной плазмы человека.

2. Охарактеризовать важнейшие ферментные системы семенной плазмы человека /протеиназы, эстера.зы, фосфатазы/.

3. Идентифицировать некоторые важнейшие белки семенной плазмы и разработать опоообы их очистки. »

4. Провести детальный физико-химический анализ полученных чистых препаратов белков. ,

5.Разработать высокочувствительные иммуноформантные тесты на белка семенной плазмы.

6. Охарактеризовать динамику уровня белков семенной плазмы при опухолевых заболеваниях предстательной железы.

7. Выяснить изменения белкового состава семенной плазмы при нарушениях сперматогенеза и фертильности.

8. Провести сравнительный анализ белкового состава простатического сока при хроническом простатите.

9. Оценить возможность использования тестов на белки семенной плазмы в диагностике опухолей предстательной железы, хронического простатита и нарушений сперматогенеза.

Научная новизна.Представлена системная характеристика белкового состава семенной плазмы. Изучены важнейшие ферментативные системы семенной плазмы/ протеяназная, эстеразная, фосфатазная/ и получены новые данные об их иэоферментном составе, специфичности, ингибиторах. Идентифицировано шесть белковых компонентов семенной плазмы несывороточного происхождения: спермаспецифический ингибитор трипсина, цростатоспе-цифический антиген, специфическая кислая фосфатаза, скаферрин, карбоксилэстераза, садавоспермалышй антиген. Выяснена степень их специфичности и проведена количественная'оценка их содержания в семенной плазме здоровых мужчин.

Разработаны методы очиотки оаормасаецифичеохого ингибитора трипсинаскаферрина, карбоксилэстеразы, саливоспермаль-ного антигена.модифицирована схема•очиотки кислой фосфагазы.

Проведён детальный физико-хтпгческий анализ полученных чистых препаратов белков. Получены новые данные об аминокислотном и моносахарвдном составе спермаспецифического ингибитора трипсина, карбокоилэстеразы семенной плазмы, саливоспер-ыального антигена, скаферрина.

Обнаружено явление межмолекулярного взаимодействия белков семенной плазмы с полисахаридами, полиаминокислотами и белками, выяснены возможные механизмы этих явлений и их значение для теории репродукции и экспериментальных исследований. '

Выявлены направления изменения уровня белков семенной плазмы при нарушениях сперматогенеза. Показано, что хронический простатит вызывает стойкое изменение продукции ор-ганоспецифических белков простаты, секретируемых Bj семенную -плазму. .Определен характер антигендой перестройки секрета предстательной железы при опухолях простаты.

Разработаны 'иммуноферментные тесты для обнаружения кислой фосфатазы, сперматспецифическэго ингибитора трипсина, скаферрика. Показана возможность использования тестов на белки семенной плазмы в судебно-медицинской экспертизе.

Практическая ценность работы

1. Разработаны высоко чувствительные иммуноферментные тесты для выявления кислой фосфатазы, спермаспецифического ингибитора трипсина, лактоферрина /скаферрина/.

2. Предложены способы лабораторной диагностики рака предстательной железы,' основанной на определении концентрации спермаспецифического ингибитора трипсина и кислой фосфатазы в секрете простаты /A.C. & II692I2, A.C. К 1828272/,

а также сдоаьбы выделения и очистки спермаспецифического ин-/

гибитора трипсина /A.C. К 1489017/ и лактоферрина из семенной плазмы/ A.C. fö 1717234/.

3. Разработан способ определения фартильности эякулята /A.C. а 1409943/, а также опособ выделения сперматозоидов /A.C. » 1707234/.

4. Обнаружение специфических для семенной плазмы белков

/ кислая фзсфатаза, спермаспецифический ингибитор трипсина/ использовано нами при разработке способа обнаружения пятен спермы при судебно-медицинской экспертизе /A.C. 946549, A.C. :h 1682931/. Метод рекомендован к применению ЦНИИ судебной медицины и принят к производству. '

Основные положения, вынесенные, на защиту.

1. Сравнительная физико-химическая, структурная и функциональная характеристика белков семенной плазмы,схемы выделения и очистки некоторых белков /спермаспецнфа-ческого ингибитора трипсина, кислой фосфатази, саливо-спермзльнзго артягена, карбоксилзстврэзы семенной плазмы, скаферрина/.

2. Процесс малигнизацин предстательной железы сопровождается резким изменением количественного соотношения белков простатического сока.падает концентрация специфических гормонзависимых белков /кислой фосфатазн, спорма-специфического ингибитора трипсина, простатоспецифического антигена/ и относительно растет доля других белков. По данным иммунофврментного анализа опухоли простаты сопровождаются появлением в крови спермаспецифического ингибитора трипсина, кислой фосфатазы, простатоспецифического антигена и снижением уровня сывороточного лактоферзина.

3. Наруаэния сперматогенеза сопровождаются изменением уровня белков семенной плазмы, причем, если уровень кислой

' фосфатазы растет пропорционально снилсэнию числа сперматозоидов в эякуляте, то уровни спермаспецифического ингибитора трипсина п скаферрина падают.

4. Иммунохимические методу идентификации специфических белков семенной плазмы и, в частности, сяермаспецяфического ингибитора трипсина является надежным и эффективным способом выявления спермы в составе пятен при судебно-медицинской , экспертизе.'

Апробация работы. Результаты работы представлены и доложены на II Всесоюзной конференции "Структура и функция лязосом" / Новосибирск, 1980/, 6-й научно практической конференции ученых Дагестана /Махачкала ДУ85/; Международной кон- -ференции "Хроматография в биологии и медицине" /Москва,1986/; Всесовзной конференции ^Биохимия-медицине"/ Ленинград,1988/; Всесоюзной конференции "Эпидемиология, профилактика и ранняя диагностика злокачественных новообразований" /Томск,198?,1990/ Всероссийский съезд урологов /Москва, 1991/;. Всесоюзная конференция " Метабсяи—'ческие нарушения и их коррекция в онколо-нии" /Москва,1991/; кроме того результаты работу докладывались на научно-практических конференциях и сесоиях Астраханского медицинского института в 1984, 1985,1987,1988,1990 годах; а также УШ-th Meet. Int.Soc.Oncodevolopment Biol.tyed-Tall-1980; ХЭТП-4А Meet. ISOBM ,Moscow_I990; 4-th Intersci

• Wold Conference' on Infiада.,Geneva1991.

Публикации. По материалам десертации опубликована 41 научная работа, получены авторские свидетельства на 8 изобретений, изданы 2 методические рекомендации.

Структура и объем диссертации. Диссертация.изложена на 244 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения и выводцв«.Ока иллюстрирована 41 таблицей и 62 рисунками.

Указатель литературы включает 53 источника на русском и 268 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3 работе изучены образцы семенной плазмы здоровых мужчин и больных с■различными нарушениями сперматогенеза, опухолевой и воспалительной патологией- простаты, а также секрет предстательной келвзы этих же категорий больных, использованы также сыворотки крови здоровых и больных с заболеваниями мужской репродуктивной системы и опухолями других локализаций , другие биологические жидкости / молоко, слюна, *

спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, моча, слезы, желчь, пот/ и экстраты нормальных а патологически измененных органов и тканей.

Всего исследовано 589 образцов семенной плазмы, 614 образцов простатического сока, -161 образец опухолевой ткани, в том числе 335 экстрактов опухолей предстательной железы, а также 927 сывороток крови больных. Сбор материала осуществлялся в Астраханском областном кокно-венерологическом диспансере, в I областной.клинической больнице, городской консультации "Брак, и семья", в андрологическом отделении НИИ урологии МЗ РСФСР /г.Москва/, на кафедре урологии ЦИУ врачей /г.Москва/ и других лечебных я научно-исследовательских учреждениях г.Астрахани и Москвы.

Для качественного и количественного анализа белкового состава семенной плазмы, а также для выделения и очистки белков семенной плазмы применялись современные методы биохимии и иммунохимии: электрофорез в полиаклаамиднои геле

/Г.Маурер,1973; Л.0стерман,1981/, изоэлектряческэе фокусирование /Л.0стерман,1983/, различные виды хроматографии- гель-проникаюдая, ионообменная, гидрофобная,адсорбционная, газовая, высокоэффективная кидкостная, аздикнэя /Детерман Г.,1970, Я.Туркова,1980, Л.Остерман,1987/.

Очищенные препараты белков исследовали методами структурного анализа: определение аминокислотного состава гидролизатэв, определение амино и карбокси концевых аминокислот, ограниченный протеолиз и анализ полученных пептидов, ступенчатая дегра-" дация по Эдаану. Анализ углеводного компонента проводился методом газовой хроматографии триметилсяалированных производных мок.' сахаридов и и с помощью лектиков.

Преципатяруащие антисывротки получили иммунизацией кроликов семенной плазмой здоровых мужчин, а также больных бесплодием и опухолями предстательной железы, очищенными антигенами семенной плазмы и продуктами фракционирования экстрактов предота тельной железы и других органов.

Ишунохимические исследования проводили с использованием' известных иммунохкшческих методов - иммунодиффузия в агаре, яь муноэлектрофорез, двумерный иммуноэлектрофорез, количественный ишуноэлектрэфорез, иммуноферментный анализ/ Фримель X, ,1984; А.М.Уорди, Д.Т.УигерД981; НгоТ., Ленховер Г. ,1988/.

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

■ Сложный белковый спектр семенной плазмы имеет характерные электрэфэретяческие и хроматографаческие особеююсти. Вели ка -доля среднедалекулярных белковых компонентов /60-20 кД/, обладаодах в слабощелочной или нейтральной ореде высоким

положительным или высоким отрицательны;»! зарядом, что способствует формирования белкового буфера семенной плазмы.

При энзккологическом анализе охарактеризованы множественные фоомы эстераз семенной плазмы, насчитывающие до 10 эдектрофоретическ'Л различных компонентов, принадлежащих преимущественно к карбоксилэстеразам и арилэстераза.ч. При хроматографическом анализе выявлена гетерогенность карбоксил эстераз и по молекулярной массе /от 70 до 120 кД/.

Выявлено 4 протеолитических фермента' семенной плазмы,-причем три нейтральных протэиназн /ICO кД,50 кД, 35 кД/ и одна кислая /30-40 к Л/, аналогичная гастрикскну/ Seid У. et ail ,1984/. Среди нейтральных прзтеиназ, вероятно, присутствует простатоспецифический антиген, имею'дмй молеку-ляркуа массу около 35 кД и несущий большую долю прзтеолитн-ческого потенциала семенной плазмы/.'att îc.st ail ,1986/. Про-теиназа с молекулярной массой около 50 кД, пнгибируется ионами цинка, меди, ртути и по этим признакам аналогична ' коллагеказе семенной плэзмыДиуа H.et г.и ,1981/.

Наряду с протеиказамн, в семенной плазме, как в лк»5ой протеолитической система, присутствуют ингибиторы протеиназ. Нам удалось хроматографически разделить 4 компонента ингпби-руюзих трипсин. Аналогичных наблюдений в литературе не описано. Известно о существовании в семенной плазме высокомолекулярного 'лнгкбитора тиоловых протеиназ/;.« пгсata л ;12о'7/, кмеощего молекулярную массу около 90 кД. Нами показано наличие, как высокомолекулярного, так и низкомолекуляркогэ белкового ингибитора таоловых протаиказ/ около 20 кД/.

Оосфатазная система семенной плазмы человека накЗоле^

изученная ферментная система этой биологической жидкости. Нам:; подтверждены данные о электрофзретической гомогенности к.тслэй фосфатазы семенной плазмы в отличив от кислой фоофа-тазы предстательной железы, образующей при электрофорезе в аолиакриламидном геле не менее двух фракций. Еще заметнее различие тканевой к секреторной кислой фосфатазы при изоэлектрическом фокусировании в диапазоне pH 3-5. Секреторная форма имеет три компонента, а тканевая не менее шести с изоэлектрической точкой на 0,1-0,2 ниже секреторной. Очевидно, высокая гетерогенность тканевой форга кислой фосфатазы объясняется присутствием в препарате молекул, находящихся на различных стадиях пострибосомального арэцессинга, предшествующего секреции, а также не секретируемые ферменты лизосомаль-ного происхождения.

В отличие ОТ многих авторов/ Hermann et ellI9S8, Kawnagh J, et all 1989; Geller J.,1991/, нами в семенной плазме обнаружена активность щелочной фосфатазы, значительно / более чем в 20 раз/ уступающая кислофосфатазной. По электрофоретической подвижности щелочная фосфатаза семенной плазмы близка к костной и плацентарной. В составе щелочной фосфатазы семенной плазмы нами отмечено присутствие твртотабильного компонента, что подтверждает наличие плацентарноподобного изофермента в семенной плазме/KeLaugHiin P.et B?-I986-,Kajao а11Д989/. Часть активности щелочной фосфатазы может быть обусловлена и специфической кислой фосфатазой семенной плазмы, способной, как показано нами, проявлять ферменттативнув активность и в щелочной среде.

Иммунохимэтеский анализ делает сведения о белковом оосуаве

семенной плазмы, полученные электрофорезом и хроматографией, более полным:;. Выявлен обширна спектр сывороточных и несывз-роточных белков, показано наличие не менее 3 общих антигенов О о слюной человека и двух с женским молоком. Методам двумерного иммуноэлектрофзреза выявлено 3 специфических антигена семенной плазмы.

Детальный физико-химический и функциональный анализ белков семенной плазмы возможен только после выделения и очистки отдельных белков. Нам удалось идентифицировать,очистить и дать подробную физикохимическую характеристику 6 белкам. Впервые описан и охарактеризован специфический белок семенной плазмы-спермаспецифический ингибитор трипсина, синтезируемый в предстательной железе человека. Это гликопротеин, /углеводы около -1,8$/ с молекулярной массой 36,5 кД, изоэлек-трической точкой 7,2. Отщеплением по Эдману установлена Н -концевая последовательность: Лей-Гли-Ала-Гли. С-концевая аминокислота определена о помощью специфической карбокси-пептидазы и ев оказался треошш, В литературе белков семенной плазмы такого строения и функциональной характеристики im описано. Недавно обнаружен функционально аналогичный белок в семэшюй плазма гашопшх / АЬиед п. ot all ,1992/.

Другой специфический белок семенной плазмы- кислая

фосфата за, давно известен и хорошо изучен, но нам впервые о?'>ляч:!Д

уллось jiUfmHiC^n строении углеводного компонента тканевой л секреторной форм кислой фосфатазн. Кроме того, впервые ,/отаиовлон факт продукции специфической кислой фэсфатаои •узкзпяоД плазмы грудаоЯ г.элэзой в период лактации.

Зиделоняз п очистка яростатоспецифнческогз антигена проведена дал сравнения его о другими болваыа семенной

плазмы и для получения диагностических тест-систем. Показана иммунохимическая неидентичность простатоспецифического антигена и сходного с ним по физико-химическим свойствам сперлиспецифичвским ингибитором трипсина.

Выделение и очистка обнаруженного нам;) ингибитора тио-лэвых протеиназ показала, что это гликопротеин /6,21, углеводов/ с молекулярной массой 21 кД изоэлектрическрй точкой 5,3. Этот белок содержит более трети /39 й/ гидрофобных аминокислот, что значительно стабилизирует его структуру-он не теряет функциональных и иммукохимических свойств даже после прогревания при 85° в течение часа.-В семенную плазму этот белок ( поступает из яичек, однако он не специфичен для репродуктивной системы, так как выявлен также и в смешанной слюне человека. Аналогичный белок описан О.Шевченко и соавт./1982/, однако молекулярная масса альфа-I-термостабильного глобулина, описанного ей почта втрое выше, чем у нашего белка.

Впервые выделена и описана карбоксилэстераза семенной плазмы человека. Это белок с молекулярной массой 72 кД и изоэлектрической точкой 8,6. Чистый препарат этого белка имеет удельную эстеразную активность 187 ЕД/мг белка. Иммунохимический анализ показал широкое распространение карбоксилэстеразы в органах и тканях человеческого организма. Особенно высока его концентрация.в семенной плазме /41,0 мкг/ш /,' в щитовидной келезе /66,7 мкг/мл /ив женском молоке /14 мкг/мл /. Но обнаружен этот белок в слюне л в'сыворотке крови здоровых людей.

Проведена очистка известного белка семенной плазмы окаферрпна/ иммунозшмичеоки идентичного лактоферрину кен-

• ского молока/ и показано практически полное совпадение физико-химических свойств лактоферрина искаферрина за исключением электрофоретической подвижности и строения углеводного компонента.

3 табл.1 приведены основные сведения о физико-хнмнчес-ких свойствах очищенных препаратов белков семенной плазмы.

Таблица .'Я Физико-химические свойства чистых препаратов белков семенной плазмы.

Свойства : ПСА : ССИТ ; : КФ : : ССА : : КЭСЛ ; : СФ

Молекулярная масса /кд/ 33-34 36,5 НО 21 72 67

Изоэлектрическая точка 6,9 7,2 4,3 5,3 8,6 9,2

Электрофорети-чеокая подвижность . 0,46 0,42 0,7 0,92 0,12 0,47

N-концевая аминокислота НТВ ЛЕЙ МЕТ _ — гаи

% углеводов 6,9 4.8 8,2 6,2 6,3 7,3

Примечание: ПСА- простатоспецифический антиген; ССИ'Г-спермаспецифическнй ингибитор трипсина; КФ- кислая фос-фатаза; ССА- салгазоспермальннй антиген/ ингибитор тио-ловых протеиназ/; КЭСП-карбоксилэстераза семенной плазмы; СФ-скафвррйн.

Сравнительный анализ аминокислотного состава полученных белков /табл.2/ но выявляет каких-либо общих черт характерных для белков семенной плазмы, за исключением, довольно высокой доля гидрофобных/ алифатических/ аминлкис-

Таблица №2. Сравнительный аминокислотный состав белков семенной плазмы человека /мольй/

Название аминокислоты ССИТ ПСА кэсп ССА СФ

1.Аспарагиновая кислота 9,14 7,1 10,82 12,4 10,4

2.Треонин , 5,03 5,4 5,82 3,9 4,2

3.Серии 6,12 9,1 5,2 5,5 5,4

4.Глутаминовая кислота 13,65 10,4 10,4 14,0 11,8

б.Прэлин 5,53 6,9 6,8 . 6,2 5,8

6.Глицин * ' 6,6 10,7 5,7 6,7 8,6

7.Алании 8,9 ■ 5,8 11,2 8,6 9Д

8.Валин 6,83 8,5 6,8 8,4 7,0

Э.Цийгвин . 1,94 3,3 0,27 4,9 1,8

Ю.Метионин 2,09 1,55 1Д 1,01 0,49

П.Изолейцин 3,4 3,4 3,8 3,3 2,1

12.Лейцин .10,1 10,2 7,7 8,6 10,3

13.Тирозин 1,9 1,2 2,9 2,5 2,9

14.Фенилаланин 3.4 2,8 3,4 • 3,5 4,1

15.Гиотидян 3,7 4,4 5,8 2,6 1,9

16.Лизин 6,1 4,7 6,6 5,8 6,8

17.Аргинин 3,92 4,0 5,7 2,2 6,9

г 18.Триптофан не определял!!

Роочэт производили

из данных 24-х и 72-х часового гидролиза

лот - от 38,6 молЗ у саливоспермального антигена до 34 мол? У скаферрина. Известно, что мощное гидрофобное ядро способствует стабилизации белковой молекулы /И.В.Евразии, 13В5/ и, в частности,повышению ее термостабильности. Нами показано, что спермаспецифический ингибитор трипсина не теряет своих иммунохимических и ингибиторных свойств после прогревания при 80° в течение 30 минут. То же касается и ингибитора тиоловых протеиназ и скаферрина. Карбоксилэотераза семенной плазмы менее устойчива к высокой температуре, инактивируясь при 60°С. Протеиназная активность простатоспецифического антигена также утрачивается при тепловой обработке.

Интересные закономерности прослеживаются при сравнении моносахаридного состава углеводных компонентов выделенных белков.

Как видно из табл.3, у большинства белков семенной плазмы преобладающим углеводным компонентом/ в среднем около 44?»/ является галактоза и галактозамин.

Таблица.3. Сравнительный моносахаридный состав белков семенной плазмы человека.

Моносахариды /весовой %/ ССИТ КФ КЭСП СФ ПСА по Мапк П., 1983

Фукоза ' 0,3 0.9 0,4 - -

Манноза - 0,8 0,5 1.2 1.5

Галактоза 0,7 1Д 0,6 0.9 1.3

М-ацетил галактозамин 1.6 2,3 1.6 2.4 1.6

ДО-ацвтил глЕКОзамин 0.6 1,9 2.Г I.? 1.3

Сиаловыв каолоты 1,9 •1.2 1Д 1.1 1.1

Общее содержание 5.1 6,3 6,3 7.6 3.8

сахара

Так, кислая фосфатаза семенной плазмы имеет заметные различия с кислой фосфатазой, выделенной из предста-'тельноЯ железы />strowski w.et all ,1976/. Они состоят в значительном /более чем в 4 раза/ увеличении доли ¡галактозы и галак-тозамина.

Аналогичные данные получены и по скаферрину, иимунохи-мически идентичному лактоферрину человека. По литературным данным, в углеводном компоненте лактоферрика молока человека преобладает манноза и глюкоза над гексозаминами/цвтр j.ot all I972;'Ainsongh E.et aii,I99I/. По на'лим данным, в скаферрине преобладает галактозамин. Наши данные совпадают со сравнительным исследованием углеводного компонета семенного я сывороточного трансферрина /Daaiosand.ro A.et а1Д992/, которые показали более чем 3-х кратное увеличение галактозамкйа в семенном трансферрине. Эти наблюдения давт основание предположить существование особый системы гликозилированяя белков, секретируемых в семенную плазму.

Реальные условия функционирования белков значительно отличаются от традиционно используемых при изучении их : свойотв. Одним из основных отличий является высокая концентрация биополимеров в среде окружающей белок и взаимодействие о биологическими мембранами.

При изучении белков семенной плазм это обстоятельство приобретает особое значение, так как в сперме взаимодействие белковсо сперматозоидами, new собой и о другими эффекторами является непременным условием ' осуществления оплодотворяю^ функции.

Наш было проведено исследование полимерных.эффектов я мазмолекулярных взаимодействий. Показано, что выбор имму-

ноэлектрофореза в качестве метода регистрации межмолекулярных взаимодействий оправдал себя, так,как практически любые взаимодействия, влияющие на заряд или структуру белка отражаются на изменении электрофоретической подвижности /табл.4/.

Изменение электрофоретической подвижности белков семенной плазмы зависит как от строения белка, так и от природы эффектора, Наиболее заметное влияние меилолекулярные взаимодействия оказывают ка злэктрофэретическую подвижность спермаспеци-фического ингибитора трипсина и скаферрина /табл.4/ Электрзфэ-ретическиа свойства кислой фосфатазы практически не изменяются в присутствии эффекторов. Возможно, что образование комплексов происходит без изменения суммарного заряда и может проявляться в модификации активности и кинетических свойств фермента. 5го наглядно видно на лэвизганяи термзстабпдьиэсти карбоксн.псто-рзз!) з присутствии гепарина,

Влгллншэт на;!,: зргехгзрч зтнзечтся к разным грузам: и". -<лчрлд:!/га:;арпн, лзкстрлн сулага:, !'лалурзн.;ьая к::о\ с, "о..;;:: : лзлнзмннзкнслоты Д'л-зу.'лн, г.:-:.:оглог1ин; полилялин, лрот&млл/, ;:;лш г'-з галлов/ железо, цинк/.

Природа ззаимзд-эйстеня с -^еллар-'л: ."ото различна. С тл-ае игдшю вызвали ионгшмп механизма!.:и в-заиаодэйст-вня. Ь

присутствий нарастающих концентраций хлзрпдп натрия саоа.б-нзсть скаферрина и опермаспецифаческого внгвбптзра трипе,пи г. взаимодействию., например, с полилпзпнз.м прогрессивно о.них.-чвю.я, В основе взаимодействия с гепарином лезя? "-.злее олопшй механизм. Концентрация хлорида гатрия но влияет на зЗрвээван.1* кл-.м лексов скаферрина с гепарином до I М. После пони.ленил кзшюн> -рации до 1,5 М эта способность скачкообразно падает. Взамен, здесь имеет место дакткя-подобнэе взаимодействие гепаринч а углеводными,ксыпопантами скаферрина /Лунин И., а поегЛ:^!/.

т.з

Присутствие в смеси 0,2Я тритона Х-100 снимает эффектор-ное действие альбумина человека, гемоглобина лещади и желатины. Видимо, их взаимодействие с белками семенной плазмы обусловлено образованием гидрофобных связей.

Поскольку скаферрин относится к железосодержащим белкам, то. представляло интерес выяснить влияние хелатирования железа на способность белка к межмолекулярным взаимодействиям. Показано, что скаферрин имеет одинаковую динамику связывания полисахаридов и других эффекторов как в апоформе, так и после насыщения железом.

Нами.показано, что скаферрин, связанный с поверхностью сперматозоидов, не теряет онособности к межмолекулярным взаимодействиям. В частности, отмечается массивная агглютинация сперматозоидов при добавлении раствора гепарина. На основе этого явления нами разработан способ выделения сперматозоидов, осаждаемых в растворе гепарина /Авторск.свид. №1706628/. Можно также предположить, что некоторые виды спермагглютикя-ция, наблюдаемой при нарушениях фертильности у больных с воспалительными заболеваниями в мочеполовых путях, могут быть связаны о гиперсекрецией муцинов, белков и микробных эндотоксинов.

Известно, что реализация функция оплодотворения сопряжена о рядом биохимических процессов, происходящих в семенной плазме / ингябирование и активация протеиназ, протеолиз, активация ферментов головки оперматозоидов и т.п./. Описанные нами белки принимают в этих процессах то, или иное участив. Очевидно, образование ими комплексов о другими белками и поли»ле к троли та ми / в частности, полиаминами/ в физиоло-

•гических условиях может способствовать проявлению таких функциональных характеристик, которые не решстркрувсяна очищенных препаратах. Наблюдавшиеся нами эффекты обусловлены экранированием положительных и отрицательных зарядов и изменением гидрофобности. В любом случае это ведет к изменении свойств поверхности белков и, следовательно, функциональных характеристик.

На основания полученных нами данных о физико-химических свойствах белков семенной плазмы, их ферментативной активности, строении и межмолекулярных взаимодействиях мы попытались построить схему действия протеиназ семенной плазмы. _ .

В предстательной железе вырабатывается нейтральная протеиназа /простатоспецифический антиген/, которая неактивна и находится в комплексе со специфическим ингибитором /спермаспецифический ингибитор трипсина/. В семен-й.ых пузырьках синтезируется основной белок, выделяющийся ' в сперму, где и происходит процесс его коагуляции Lilya н., et ell ,1984/. Этот процесс, видимо, основан на заключении межмолекулярных ^ -глутамил-£ -лизиновых связей. Выделившийся в эякулят комплекс протеиназы с ингибитором диссоциирует и освобождается активная протеиназа. Диссоциации способствует снижение концентрации комплек- • са при выделении простатического сока в семенную плазму, поступление в сперму секрета семенных пузырьков, богатого муцинами,- способными связывать спермаспецифический ингибитор трипсина. Активная протеиназа осуществляет расщепление коагулировавшего основного белка. На более поэд-' них стадиях протеолиза, при закислении среды, активизируется кислая протеиназа /гастриксин/. Функция этого.фер-

мента состоит, видимо, в уничтожении остатков белков и в том числе ферментов семенной плазмы. Место действия гастриксина-елагалище и шейка матки, где рН= 3,5-4,0. Действие активаторов плазминогена осуществляется, вероятно', также в слизистой пробке шейки матки, способствуя прохождению сперматозоидов.

Возможно, эта схема не охватывает всех протеолчтичес-ких эффектов семенной плазмы, но описывает один из главных путей. В пользу образования ^ -глутамил-6-лизино'вых межмолекулярных связей говорит высокий процент лизина /12,Змол»Л/ и глутаминовой кислоты /18,6 моль^/ в основном белке семенных пузырьков. Образование комплексов простатоспецифнческнй антиген- спермаспецифическ::* ингибитор трипсина, кроме Функций этих белков /протеиназа и ингибитор трипсина соответствен' но/ подтверждает высокая гядрзфобкость сяершспоцкфэтоскэрэ кнгабцтора тркасика, прямо» наблюдение изменения ялзктрофо-роткчоской пэдв:ж;:эога скэрмосаоцифкчоскэго иил:б::го.:г сяш после добавления крекар«1й простатоскоцзфзческого ьнгпге на. Дяссоцкация кз:,-ллекса в сперда происходит, вероятно, под влиянием полионов/ полкакапы» муцшы/. Способность обрззови-вать комплексы спермаспецифпческого ингибитора трипсина с этим веществом доказана паки в электрофорегических исследованиях.

Выделение и очистка белков семенной плозмы позволила создать высокочувствительные иммуноферменшые тест-сиотемы на кислую фосфатазу, спермаспецифический ингибитор трипсина и скаферрин. Чувствительность тест-системы на кислую фосфатазу составила 2,5 нг/мл, тест-системы на спермаспецифический ингибитор трипсина 1,5 нг/мл и тест-системы на скаферрин-1,5 нг/шг. Эта чувствительность достаточна для того,чтобы

проводить определение уровня сперкальных белков в сыворотке крови здоровых и больных людей.

Таблица 5. Сыворотный уровень белков семенной плазмы при опухолевой и неопухолевой патологии мукской репродуктивной системы.

Спермаспецийи-ческий ингибитор трипсина. нг/мл Кислая фосфатаза нг/мл Скаферрин нг/мл

Здоровые мужчины 2,5+2,0 5,5+2,0 1112,0+73,0

Аденома предстательной железы 2Э;0±13,5 22,0+8,0 1480,0+360,0

Рак предстательной яелезы 82,0+26,0 120,0+22,0 620,0+140,0

Другие опухоли 8,5+2,5 8,0+2,0 1690,0+188,0

Хронический простатит 5,5+6,0 12,0+3,0 1450,0+300,0

Как видно из табл.5, содержание специфических белков се-

менной плазмы резко повыпается у болышх со злокачественными опухолями представтельной келезы. Согласно данным, привэдешгам в литературном обзоре на основе 22 литературных источников, уровень кислой фосфатазы повышен у 52,6^ больных раком простаты и у 10,25% больных аденомой предстательной зхелэзы. По нашим данным уровень кислой фосфатазы повышен у 67% больных раком простаты и у 17% больных аденомой предотсзельной железы. В' литературе нет данных по уровню кислой яелезы. 3 литературе нет данных по уровню кислой фосфатазы в крови больных хроническим простатитом. Принятый нами уровень кислой фосфатазы Д5нг/мл/ превышает 6% больных хроническим простатитом.

' Аналогичные данные мы получили и по спермаспецифнческому ингибитору трипсина. При разделительном уровне 25 нг/мл выше него оказались 68% больных раком простаты, 22 1 больных аденомой предстательной железы и 8% больных хроническим простатитом.

Совместное определение кислой фосфатазы и спермаспе-цифического ингибитора трипсина .несколько увеличивает эффективность тестов, так как чувствительность выше у теста на спермаспецифический ингибитор трипсина, а специфичность выше у теста на кислую фосфатазу.

Динамика сывороточного уровня лактоферрина/скаферрина/ носит противоположный характер. При раке простаты концентрация лактоферрина падает почти вдвое в отличие от опухолей других локализаций/ рак мочевого пузыря, рак легкого, опухоли желудочно-кишечного тракта, лимфогрануломатоз, опухоли яичка/, при которых уровень лактоферрина растет. Это наблюдение в совокупности с анализом концентрации лактоферрина в ткани простаты в норме и при опухолях позволило нам предположить, что нормальный уровень лактоферрина в сыворотке крови отчасти образован лактоферрином, секрети-руемым предстательной железой.

Изложенное показывает, что кислая фосфатаза и сперма-специфический ингибитор трипсина могут быть использованы в дифференциальной диагностике опухолей предстательной железы от других урологических заболеваний, топической'диагностики рака из невыясненного очага, динамического наблюдения о целью выбора лечения.

Обязательная процедура пальцевого исследования при па' толэгии Ефостатн сопровождается выделением секрета пред-

Таблица 6. Белки семенной плазмы в простатическом соке

в норме при опухолевых и воспалительных заболеваниях предстательной железы/средняя концентрация мкг/мя /.

Кислая Спермаспе-фосфатаза цифический ингибитор трипсина

Простато-

с'пецифичес- Скафер-кий рин

кий

антиген

Норма /68/ ' 6900,0+1100 950,0+170,0 2850,0+650,0 50,5±15,0

Аденома предстательной железы

/172/ 1400,0+400,0 1620,0+300,0 2748,0+884,0.380,0+60,0

Рак предстательной железы 75,0+30,0 80,0+35,0 875,0+380,0 62,0+12,0

Иронический

простатит 3290,0^690,0 2022,0+370,0 2260,0+585,0 108,0+45,0 а^о^стрение

5/вне обострения /78/ 3510,0+775,0 2170,0+190,0 3628,0+850,0 56,0+14,5

зтательной железы. Иммунохимический анализ этого секрета на содержание белков семенной плазмы показал,что их уровень резко изменяется ,при опухолях простаты /табл.6/. При раке предстатель-нойжелезы концентрация кислой фосфатазы в простатическом соке падает в 86 раз, а спермаспецифического ингибитора трипсина в 12 раз. При аденома уровень спермаспецифяческого ингибитора трипсина растет, а уровень кислой фосфатазы снижается значительно меньше /менее чем в три раза/. Другие белки не показывают четкой динамики концентрации. На основании полученных нами данных разработан способ дифференциальной .диагностики аденомы и рака предстательной железы /Авг.свид.'ё П89212; авт.свид. 41828272/; основанный на определении суммарной концентрации

спермаспецифического ингибитора трипсина и кислой фосфатазы в секрете простата. Он оказался более чувствительным/9370/ и более специфичным /75%/ тестом, чем обнаружение этих маркеров в крови больных. Прямых аналогий нашим данным в литературе нет, но имеются многочисленные данные о снижении в ткани рака простаты уровня кислой фосфатазы /Еялик В... Пинчук B.,1977,chu T.n.et al, 1975, Loor R.et all 1981/ и резком снижении концентрации ингибиторов протеиназ/feélicr J. ,1991/..

В настоящее время лабораторный анализ спермы ограничен, как правило, цитологическим исследованием. Мы провели иммунохимичес-кий анализ уровня четырех антигенов семенной плазмы при различных нарушениях спермогенеза и обнаружили, что уровень всех этих белков /спермаспецифический ингибитор трипсина, простатоспецифичес-кий антиген, скаферрин, кислая фосфатаза/ связан с фертильностью эякулята. Причем уровень кислой фосфатазы обратно пропорционален числу сперматозоидов в эякуляте, а уровень остальных равномерно снижается по мере уменьшения числа и подвижности сперматозоидов /табл.7/р.'

Таблица 7. Уровень .антигенов семенной плазмы при нарушениях сперматогенеза/ средняя концентрация в мкг/wi /.

Кислая Спермаспеци- Простато-

<!юг<Ьатача фический специфичес- Скаферрин

ijjou^iaja ингибитор кий антиген

трипсине

НОРМОЗОО-

СПЕРШЯ/Т87/ 3423,0^160,0 2329,СМ02Г0 1 345,0+244,0 495,0+15.0 ОЛИГОЭОО-

СПЕРМЙЯ/Т74/ 4320,0^408,0 1376,0+730,0 1108,0+216.0 376,(&16.0

Л300С1ТЕР?»ИЯУ79/бТ44,0+9Г8.С7 1240,0+130.0 864,0+116,0 ЗТ6,0±Э6.9

Увеличение концентрации кислой фосфатазы по мере уменьшения числа сперматозоидов позволяет предположить, что физиологическое место действия кислой фосфатазн семенной плазмы- поверхность сперматозоидов и, естественно, при снижении числа сперматозоидов растет ее уровень в сперме»

Судебно-медицинская экспертиза следов спермы имеет большое значилив при расследовании половых преступлений, Единственно Доказательным способом определения спермы в составе пятен является микроскопическое обнаружение сперматозоидов в исследув- . • мых пятнах. Однако не всегда отсутствие сперматозоидов может-доказать отсутствие спермы в поставе пятен. Сперматозоиды могут быть разрушены различными физическими или химическими факторами, а также подозреваемые могут стоадать азооспермией или .олигозооспеомией.

Мы предприняли попытку использования иммунохимического 'теста на специфический белок семенной плазмы для определения ■наличия спермы в составе пятен. Был выбран спермаспецифичес-' кий ингибитор трипсина, обладающий достаточно устойчивой струк-. турой и содержащийся в семенной плазме в высокой концентрации. Исследовали 45 образцов из коллекции бюро судебпо-ыеди» ■ цинской экспертизы Астраханской области и 5(7 образцов спермы высушенных на кусочках ткани и хранившихся от 2 недель до 28 месяцев. Выявление исследуемого белка во Есех образцах . было Т00#-

/

Широкое тестирование большого количества образцов сыво-, ротки крови, "мочи, слюны, пота, слез, влагалищных выделений/ ' более ТООО образцов/ показало исключительную специфичность теста на спермаспецифический ингибитор трипсина для выявления спермы в составе пятен.

ж

• Простота выполнения, воспроизводимость, документируемость. отсутствие ■ артефактов наряду с чувствительностью, и специфичностью ставят иммунохимический тест на спермаспецифический ингибитор трипсина в предпочтительное положение к цитологическому анализу в судебно-медицинской экспертизе пятен спермы. В настоящее время более чем в 30 областных бюро судебно-медицинской экспертизы России успешно применяют предложенный нами способ. Зарубежных аналогов этому тесту нет.

ВЫВОДЫ

1„ Дана электрофоретическая, хроматографическая и иммтао-химическая характеристика белкового спект ра семенной плазмы человека. Три белка-спермаспецифический ингибитор трипсина, карбоксилэстераза и саливоспермальный антиген очищеш впервые. Дана физико-химическая характеристика очищенных препаратов, включая аминокислотный состав, концевые аминокислоты, моносаха-рвдннй состав углеводных компонентов.

2. Установлено преобладание галактозы и галактозамина

в углеводном компоненте 4 белков, что позволяет предполагать особую систему гликозилирования белков семенной плазмы с преимущественным включением галактозы и ее производных.

3. Выявлены возможные механизмы межмолекулярнцх взаимодействий белков семенной плазмы с полисахаридами, полиамино-кислотама, белками. Показана способность гепарина, декстран-судьфата, полилиэина и ангател к скафоррину вызывать сперма*—

гглятанацаю н подавлять подвижность сперматозоидов, что может служить моделью механизма спермагглэпшации при воспалительных заболевшшях муке кой репродуктивной системы»

Предложена схема» действия протеолптических ферментов

семенной плазмы, основным звеном которой является ингибирова-ние простатоспецяфического антигена /нейтральной протелнаэы/ спермаспецифическим ингибитором трипсина и дальнейшая диссоциация комплекса в присутствии полиионов.

5. С помощью иммуноферментных тест-систем выявлено повышение уровня специфической кислой фосфатазы в сыворотке коови у 67% больных раком простаты, у 17$ больных аденомой предстательной железы и 6% больных хроническим простатитом; уровень спермаспецифического ингибитора повышен у 68$ больных раком простаты, у 22$ больных аденомой простаты и 8$ больных хроническим простатитом. Уровень сывороточного лактоферрина при раке проотаты почти вдвое ниже нормального, а при аденоме и хроническом простатите в пределах нормы»

6. Разработан и внедрен способ диагностики рака предстательной желчен,- основанный на определении в секрете простаты специфических белков: кислой фосфатазы и спермаспецифического ингибитора трипсина^ Установлено, что в 93$ случаев рака простаты /стадии '1Г,Ш,ТУ/ суша концентраций этих белков ниже 400 мг/мл, а у 75$' больных- аденомой предстательной железы выше Т200 мг/мл.

7. Показано,что-.при нарушениях сперматогенеза уровнй спер-маспецифического ингибитора трипсина, простатоспецифического антигена, скаферрина снижаются по мере уменьшения числа сперматозоидов,. а уровень кислой фосфатазы обратно пропорционален числу сперматозоидов в эякуляте и на основе этого наблюдения предложен способ определения фертильноста эякулята/ коэффициент фертильности/,

8. Разработан и внедрен в производство способ определения спермы в составе пятен при судебно-медицинской экспертизе

вещественных доказательств, основанный на кммунохимкческом определении сперматоспецифического ингибитора трипсина.

ВНЕДРЕНИЕ НАУЧНЫХ РАЗРАБОТОК

. Результаты проведенных исследований внедрены и используются в виде методических рекомендаций "Иммунохимический тест для дифференциальной диагностики рака и аденомы предстаттель-ной железы", утвержденных Минздравом РСФСР г Т987 г. и "Методической инструкции по применению антиспермалъной диагностической сыворотки", утвержденной Ученым Советом ЦНИИ судебной -медицины в 1990' году, а также на основе авторских "свидетельств на 8 изобретений, апробированных на базе Астраханской Т областной клинической больницы, областного кожно-венерологаческого диспансера,■областного онкологического диспансера, областного бюро судебно-медицинской экспертизы.

Результаты исследования в настоящее время используются: - в научных исследованиях кафедры биохимии, ЦНИЛ и клинических кафедр Астраханского мединститута;

-в практической работе урологический отделений 1- областной клинической больницы и областного онкологического диспансера;

• - в практической работе более 30 областных бюро судебно-медицинской экспертизы Россия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ® ДИССЕРТАЦИИ t

sj авторские свидетельства на изобретения: Т» Николаев АЛ.» Ашакова Н.И., Мельман В.М..Способ диагностики опухолей предстательной железы// A.C. Уе 1169212 от 22.3 Л985.

2. Николаев А»А., Афанасьева А.В ..Фельдман Л.В., Сундуков В. А. Способ определения спермы при судебно-медицинской экспертизе// A.C. № 94S549 от Т..4Л982.

3. Николаев А.К., Аншакова Н.И- Способ определения фертильнос-ти эякулята// А.С, № Т409943 от Т5,ЗЛ988.

Николаев A.A. Способ получения бета-глобулина из предстательной железы //A.C. $ Т489017 от 22.2.Т989. 5* Николаев A.A., Ломовицкая Л.И. Способ определения наличия спермы в судебно-медицинском исследовании пятна// A.C. Ji Т68293Т от 8.6.Т99Т»

6, Николаев A.A. Способ выделения сперматозоидов// А.С»

№ Т796628 от 22.9.Т991. >

7, Николаев A.A. Способ получения лактоферрина // A.C. •. № Т7Т8946 от t5.1T.T99T.

8, Николаев 'Jf.А., Аншакова Н.И., Мельман В.М. Способ лабораторного определения раха< предстательной железы// A.C.

. ü Т828272 от T3.~g.T992.

б/ в журналах а сботаиках:

9, Николаев A.A.., Афанасьева А .В., Антонов Н.М. Острофазовые протеины в диагностике опухолей предстательной железы// •

; Лабораторное дело-Т98Т-М-с.230-233. ТО',Николаев A.A., Афанасьева А.В.Даьруллин Ю.Х. Органоспе- ' цифическрй глобулин предстательной железы в условиях опу-холеного роиста// Балл. экспер,бкол,-Т580- ;<"1 Г- с.583-585, 1 Т.Николаев A'.Ä. Способ выделения органоспецифического бета - • глобулина предстательной железы человека// Изобретательство и рационализация в медицине. Республиканский сборник. M»,T98tt-c,T44-T46.

со

12» Николаев A.A. Способ выделения гамма-эстеразы из предста-. тельной железы человека// Изобретательство и рационализация в медицине. Республиканский сборник.М., 1980-с.146-148.

ТЗ. Николаев A.A. Неспецифические,эстеразы в опухолевых тканях предстательной железы/Энзимология новообразований. Ред. A.M. Голубев.Саратов-1982-с»46-58.

Т4. Рассказов ff.И..Николаев A.A.; Аншакова К.И. Содержание

некоторых антигенов семенной плазмы при бесплодии у мужчин// _ Вестн»дермат»векер,-1383- ЖЗ- с.59-63.

15» Николаев A.A. Аншакова Н.И. Иммунохимическая и физико-химическая характеристика лактоферрина биологических жидкостей// Вопр.мед.химии-1985-53-с.128-132.

Т6. Николаев A.A. Способ идентификации пятен спермы//Иаобре-

тательство 'И рационализация в медицине. Республиканский сборник. М. ,-1987-с.19-21.

17,' Николаев A.A., Аншакова Н.И. Лактоферрин человека: физико-химические свойства и-способ очистки// Изобретательство и рационализация в медицине. Республиканский сборник. М., T987-C.70-72.

78. Николаев A.A., Сундуков В.А..Фельдман Л.В, Идентификация пятен спермы по специфическому белку семенной плазмы// Судебно-медицинская экспертиза-!988-^2-с.25-27.

ТЭ.Николаев A.A., Аншакова Н,И.,Мельман В.М., Иммунохимичес-кие исследования в диагностике опухолей предстательной железы^//Пролиферация и рак . Медико-биологические аспек-.

• ты, Саратоэ-1988-с.37-50.

20,Николаев A.A. Харакиер антигенной перестройки опухолей предстательной железы человека//Вопр.онкологии-т988-№9- ■;'

• C.TOS4-TOTO» ;

21.' Николаев А.А.ДншаковяН.И. Иммунохимический тест для дифференциальной диагностики рака и аденомы предстательной железы// Методические•пекомендации-1988-16с.

22. Сухарев А,Е», Николаев А.А, Иммунохимические исследования уровня лактоферрина'в биологических жидкостях// Деп.руко-пись-1988-1570 MPS раздел ХУШ-МО-публИ Т5?»

23. Николаев А.А, Изменение антигенного состава предстательной железы при маяигнизации// Гистохимические и иммтаохи-мические маркеры злокачественных опухолей. Саратов-Т988-С.22-29. - •

24. Сухарев А.Е.,Николаев A.A. Источники продукции лактофер-рина человека в норме и при патологии//Депон.рукопись-1989-Л9-16290-МРН ХХ1-КЗ-публ.495.

25.Николаев А.А.,Аншакова Н.й. .Ильков АД» Иммунохимические' и физикр-химические свойства простатического бета глобулина// Вопр.мед.химии-Т989- К5-с.1Т»17.

26.Николаев А.А.,Аншакова Н.И. Способ определения протеиназ-ной активности// Изобретательство и рационализация в медицине. Республиканский сборник.М,,-1989-0.4-6» '

27»Николаев A.A. Оценка фертильности эякулята//йзобретатель-ство и рационализация в медицине, ТРеспубжканский сборний, М..-Т980- С..Т58-Т59. .

28»Няколаев A»Ä.,Карасев »ѻ Выделение и свойства специфического ингибитора трипсина из семенной плазмы,человека// Еи0химпя-Т99С-№6-с»T065-T07T.

20»Сухарев А.Е»«.Николаев А„Е»»Васильев М.Ю» Уровень сывороточного лактоферрина з норме и при патологии// Вопр.мед. химии ?-T99CW*3-c »81-83»

30.Сухарев А.Е..Николаев A.A. Лактоферрин и лейкоциты крови

у онкологических больных//Лабораторное дело-1990- №8-с.ЗЗ-36.

31.Николаев A.A., Аншаков Н.И..Алтухов С.А. Образование интео-полимерннх комплексов белками семенной плазмы// Бопр.мед. химии-1990-№4-с.98-101.

32.Николаев A.A., Аяшакова Н.И. Иммунохимические тесты в диаг-,. костике заболеваний мужской репродуктивной системы//Уроло-

' гия и нефрология-199Т- Л5—с»134—140, в/ в тезисах:

33.Николаев A.A.,Голубев A.M. Изоферменты кислой фосфатазы в

опухолях предстательной железы//11-й Всесоюзный симпозиум «

"Структура и функция лизосом"Тезисы докладов. Новосибкрск-1980-с ..86-87.

34.Николаев.д»А. Сравнительный иммунохимический анализ секрета предстательной железы в норме и при хроническом простатите// Тезисы докладов 65 научной конференции медиков Астрахани.-

• Астрахань-1984- с.8э.

35.Николаев A.A. Фракционирование белков семенной плчзмы по-лиэтиленгликолем// Тезисы докладов 66 научной сессии медиков Астраханской области,Лстрахань-1985-е.36.

■Зб.Наколаев А.А.,Анаакова Н.И. Способ выделения лактоферрина человека//Аннотированный указатель рац.предложений сотрудников АГМИ,т.2-Астрахань-1985-с.64. i

•37,Николаев A.A. Способ дифференциальной диагностики опухолей предстательной железы// Аннотированный указатель рацпред-

• лохений сотрудников АГМИ,т.2-Астрахань-1985-с.66-67. ЗЗ.Николаев A.A. Способ иммунизации лабораторных животных//

Аннотированный указатель рац.предложений сотрудников АШИ. т.2-Астрахань-1985- с.65.

Николаев ÄJU Способ окраски иммуноэлектрофорегоамм// Аннотированный указатель рац.предложений сотрудников АГШ, т.2-Астрахань~1985- с.95-96.

Николаев A.A. Специфическая фосфатаза семенной плазмы человека// Тезисы 67-й назгено-практической конференции медиков АстоаханскоЙ областа-Астг)ахань-Т98б-с.68» Николаев A.A. Выделение простатоспецифического антигена.как згшт сочетания хроматографическихг,методов// Тезисы между-гародной конференции"Хроматография в биологии и медицине". L, Медицина-Т986-с.91-92.

Тиколаев A.A. Гетесогенность спермаспецифического ингибитора трипсина// Тезисы 68-й научно-практической конференции шдиков Астраханской области-Астрахань-Т987-с.7Э. Ги кола ев АД. Диагностика опухолей предстательной железы в •словиях поликлиники// Материалы Всесоюзной конфеоенции-'ОМСК-199Ö-C. Т87-188.

иколаев A.A.., Рассказов Н.И., Алтухов С.А. Возможный ме-. анйзм спермагглютинации при воспалительных заболеваниях узской репродуктивной системы// Актуальные вопросы бесплод-ого брака. Материалы конференции-Свердловск-1989-с.79-80'» ikolaev А., Afanasiova A.Va. Organospecific beta globulin a cancrr// Embrionic antigens in cancer. 8-th Heet. ISÖBM Iallinn-1980-p.113.

Ikolaev A. lamunochenical stadi of seniaal esterase i?oon-гшео in,sone tumors// Enbrioncc antigens in cancer. 8-th >ot. IS0BH-Tallinn-'i930-p.96.

.kolaev A. ,Ancbakova !J. Secretori proteins in cancer pros- ' ite diagnosis// Oncodevelopaetel proteins and clinical app-cations.-18-th Keet.ISOBM-Koscow-1990-p.140.

^Q.IIikolaev A. Structural and functional chrrsctoristics of prostatic bota globulin// Oncodevelopmentel proteina and clínica applic ations-18-th Meet. ISOBM-Mos'c ow-1990-p. É0 •

49. Wikolaev A. Ohemotaxic function of lactoferrin in inflaaa tion .//2 nfl animation, antireumatic, an algesics, immunomodul atore. 4-th Xntersoience World Conferenco~Geneva-/l991-p»09.