Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная физико-химическая характеристика альбумина крови здоровых доноров и больных с печеночной и почечной недостаточностью

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная физико-химическая характеристика альбумина крови здоровых доноров и больных с печеночной и почечной недостаточностью"

академия наук беларуси 0 д институт фотобиолЬгии

1 7 ОНТ Ю96

УДК 535.33:547.963

ИВАНОВ Андрей Иванович

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЬБУМИНА КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ С ПЕЧЕНОЧНОЙ И ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1996

Работа выполнена в лаборатории биоорганической химии Института биоорганической химии АН Беларуси и отделе искусственных органов и медицинской биотехнологии Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. P.E. Кавецкого HAH Украины.

Научные руководители: доктор биологических наук Голубович В.П.

доктор медицинских наук, профессор Николаев В.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Черницкий Е.А.

кандидат биологических наук Степуро И.И.

Оппонирующая организация: Белорусский государственный университет.

Защита состоится "27" сентября 1996 г. в 14М часов на заседании Совета по защите диссертаций (шифр Совета Д 01.37.01) в Институте фотобиологии АН Беларуси по адресу: г. Минск, ул. Ф. Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АН Беларуси.

Автореферат разослан " " августа 1996 г.

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации

Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) осуществляет функции внеклеточного депонирования и транспорта многих эндогенных лигандов: жирных и желчных кислот, аминокислот, порфиринов, - а также катионов металлов (Zn2+, Со2+, Сим) и различных ксенобиотиков - лекарственных средств и ядов (Peters, 1975; Kragh-Hatisen, 1981, 1990; Herve et aJ, 1994). Универсальность связывающих свойств альбумина обусловлена наличием нескольких гидрофобных карманов (Carter & Но, 1994), а также высокой конфор-мационной лабильностью молекулы ЧСА, позволяющей подстраивать конформацию аффинных центров к структуре лиганда (Honore, 1990). Для печеночной и почечной недостаточности характерно снижение связывающей способности ЧСА (Sjoholm et al, 1976; Ландау, 1985; Viani et al, 1992; Миллер, 1993), что способствует развитию синдрома эндогенной интоксикации и снижает эффективность применяемых лекарственных препаратов. В настоящее время обсуждаются два основных механизма дисфункции ЧСА при патологии - блокирование аффинных центров эндогенными метаболитами и структурные изменения молекул альбумина. Ряд ингибиторов транспортной функции ЧСА при почечной недостаточности удалось идентифицировать (Mabushi & NaJcahashi, 1988; Nîwa et al, 1988), тогда как данные о модификации структуры альбумина при заболеваниях фрагментарны и противоречивы - от отсутствия конформационных изменений белка (Sjoholm et al, 1976; Kober et al, 1978) до обнаружения частично денатурированного альбумина (Троицкий с соавт., 1986, 1991).

Таким образом, комплексное физико-химическое исследование структуры альбумина при печеночной и почечной недостаточности, направленное на выяснение молекулярных механизмов дисфункции ЧСА при данных заболеваниях, является актуальной задачей современной биофизики и позволит использовать структурно-функциональное состояние молекулы альбумина для оценки степени развития эндогенной интоксикации в организме.

Связь работы с крупными научными программами, темами

Диссертационная работа выполнена в рамках плановой темы Института биоорганической химии АНБ "Разработка моделей детоксикации организма при патологиях, связанных с нарушениями белкового метаболизма".

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования явился сравнительный анализ структуры и связывающей способности ЧСА здоровых доноров и больных с хронической почечной и печеночной недостаточностью - заболеваний, при которых показано нарушение транспортной функции альбумина. Поставленная цель включала решение следующих задач:

- выбор метода выделения балла, сохраняющего нативнуго структуру и состав прочно-связанных лигандов альбумина в норме и при заболеваниях;

- сравнительный анализ вторичной структуры и особенностей глобулярной упаковки альбумина в норме и при заболеваниях, а также оценка конформациошшй лабильности молекулы ЧСА при изменении рН среды и температуры;

- сопоставление связывающей способности основных аффинных центров альбумина здоровых доноров и пациентов;

- оценка обратимости модификации структуры и связывающей способности альбуминг при заболеваниях;

- оценка роли ддинноцепочечных жирных кислот - неспецифического стрессовогс фактора - в конформационных изменениях альбумина при заболеваниях.

Научная новизна полученных результатов

Впервые проведен комплексный сравнительный анализ вторичной, третичной струк туры, гидратации и связывающей способности сывороточного альбумнна больных I хронической печеночной и почечной недостаточностью.

Показано, что различные методы выделения ЧСА в разной степени модифицирую" его нативную структуру и литандирование. Наиболее адекватным методом выделени; альбумнна в норме и при патологии признано полиэтиленгликольное фракционировани плазмы крови.

Установлено, что степень спирализации молекул альбумина в растворе не изменяете при хронической почечной и печеночной недостаточности. В лиофилизованном состоя нии образцы ЧСА печеночных больных характеризуются аномально высоким содержг нием Р-структуры. В растворах альбумина больных с печеночной недостаточность! обнаружено увеличение количества и времени корреляции связанной воды.

Показано увеличение термостабильности "патологических" альбуминов, снижени их способности к индуцированным рН конформационным переходам в диапазоне рН ( 10, а также снижение сродства к лигандам четырех основных аффинных центров молею лы альбумина, более выраженное при печеночной недостаточности.

Продемонстрировано, что ряд спектральных и термодинамические особенное« "патологических" альбуминов не устраняются после деяигандирования белка и 1 являются следствием нагрузки ЧСА Длинноцепочечными жирными кислотами.

Выявлена зависимость структурно-функциональных свойств ЧСА больных хрон! ческим пиелонефритом от длительности жизни пациентов па программном гемодиализ!

Практическая и экономическая значимость полученных результатов

Данные о снижении связывающей способности различных аффинных центров ЧСА при печеночной и почечной недостаточности могут быть использованы для коррекции

дозировки лекарственных средств. Сведения об обратимости модификации структуры и транспортной функции альбумина при патологии могут служить основой для выбора сорбционной либо трансфуэионной стратегии детоксикационной терапии. Представленные результаты также могут быть использованы для прогноза выживаемости уремических пациентоп на программном хроническом гемодиализе.

Основные положенно диссертант!, выносимые на защиту

- метод выделения ЧСЛ, основанный на полиэтиленгяикольном фракционировании плазмы крови, сохраняет нативную структуру и лигандную нагрузку бедка и наиболее адекватен для изучения структуры и функции альбумина в норме и при патологии;

- альбумин больных с хронической печеночной и почечной недостаточностью характеризуется увеличением термостабильности, снижением хонформационной лабильности при рН-ипдуцированном N-8 переходе и уменьшением сродства к маркерным лигандам основных связывающих центров ЧСА;

- ЧСА больных с хронической печеночной недостаточностью отличается от альбумина здоровых доноров и больных с хронической почечной недостаточностью увеличением количества и времени вращательной корреляции связанной воды, аномально высоким содержанием (3-структуры в лиофилизировапных образцах беяка и более выраженным снижением сродства центров связывания додецилсульфата и салицилата;

- физико-химические особенности ЧСА больных с хронической печеночной недостаточностью не обусловлены комппексированмем с длипноцепочечными жирными кислотами и не устраняются при делигандировании альбумина.

Личный вклад соискателя

Экспериментальный материал получен при решающем участии автора. Выбор условий эксперимента, анализ полученных данных и интерпретация результатов проведены автором самостоятельно.

Апробация результатов диссертации

Результаты диссертационной работы были представлены на IV Международном Конгрессе Всемирной Ассоциации по Аферезу (Саппоро, Япония, 3-6 августа 1992), IX Всемирном Конгрессе по Искусственным Органам (Амстердам, Нидерланды, 5-8 июля 1993), II Международной Конференции по уремической токсичности (Гент, Бельгия, 3-6 сентября 1994), VI Европейской Конференции по Спектроскопии Биологических Молекул (Вилленью д'Эск, Франция, 3-8 сентября 1995), X Всемирном Конгрессе по Искусственным Органам (Таипей, Тайвань, 14-18 ноября 1995).

Опублнкованяость результатов

По теме диссертации опубликовано 7 статей и тезисы 7 докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литера туры, главы "Материалы и методы", четырех глав экспериментальных исследований заключения, выводов и списка цитируемой литературы (242 источника). Работ: изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 31 рисунок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

В работе использованы образцы плазмы и сыворотки крови здоровых доноров i пациентов с печеночной и почечной недостаточностью. ЧСА выделяли полиэтиленгли кольным осаждением с последующей анионообменной хроматографией (Vasileva et al 1981), аффинной хроматографией на Голубой агарозе (Saint-Blancard et al, 1982) и upe паративным электрофорезом в полиакриламидном геяе (Маурер, 1972) (далее в текст ЧСА больных с печеночной и почечной недостаточностью называются "цирротическк ми" и "уремическими" альбуминами). Обезжиривание проводили активированным угла (Chen, 1967). Концентрацию альбумина определяли по методу (Doumas et al, 1971' концентрацию неэстерифицированных жирных кислот - по методу (Duncombe, 1963).

Спектры кругового дихроизма (КД) регистрировали на спектрополяриметрах Jascc 20 и Jasco С-500. Инфракрасные (ИК) спектры записывали на спектрометре Jasco IR-81 после запрессовки белка в матрицу КВг; деконволюцию спектров проводили методо (Kauppinen et al, 1981) с помощью компьютерной программы, созданной в Инстигуз физики АНБ. Рамановские спектры регистрировали на Фурье-спектрометре Bruker IFÍ 88 с длиной волны возбуждающего лазера 1064 нм. Времена протонной магнитно релаксации воды в растворах ЧСА измеряли на спектрометре-релаксометре фирм "Сувар". Флуоресцентные исследования альбумина проводили на лабораторной усг: новке, детально описанной в работах Бурштейна с соавт. (Burshtein et al, 1973). TepMi граммы плавления сыворотки крови и ЧСА регистрировали на дифференциальном ск; ннрующем калориметре ДАСМ-4, тепловые эффекты комплексообразования измеряв на проточном микрокалориметре 2277 Thermal Activity Monitor (Nikolaev et al, 1992 Экспериментальные даные обрабатывались статистически (Рокицкий, 1973).

Основные результаты я их обсуждение

Влияние методов выделения на лигамную нагрузку и структуру альбумина

Ключевое значение для данного исследования имеет выбор метода выделения 4C¡ максимально сохраняющего его нативную структуру и состав прочносвязанных лига дов. Рис. 1 иллюстрирует влияние различных методов выделения на термодинамичесю свойства альбумина здорового донора. Альбумин, полученный подиэтиленгликольнь

осаждением (ПЭГ-ЧСА), имеет унимодальную термограмму плавления с максимумом тегогопоглощения при 62-63°С, но форме и положению практически совпадающую с эндотермой ЧСА в дельной плазме крови. Термограммы альбуминов, выделенных аффинной хроматографией (АХ-ЧСА) и препаративным электрофорезом (ЭФ-ЧСА), бимодальны с дополнительным высокотемпературным пиком при 77°С.

40 50 60 70 80 э0 °с

Причиной трансформации кривых плавления АХ-ЧСА является высокий уровень белоксвязанных НЭЖК (1,0-1,5 моля лиганда на моль белка против 0,2-0,5 моль/моль в образцах ПЭГ-ЧСА, ЭФ-ЧСА и исходной сыворотке крови). По-видимому, хроматография на Голубой агарозе избирательно извлекает из сыворотки молекулы ЧСА, несущие жирные кислоты. Бимодальность термограмм ЭФ-ЧСА здоровых доноров вызвана структурными изменениями белка. В ИК-спектрах ЭФ-ЧСА наблюдается уменьшение интенсивности поглощения в интервале частот 1644-1638 см-> полосы Амид I и при 1225 см-1 в полосе Амид III я появление новой компоненты при 1296 см-' в полосе \мид III (Рис. 2). Основываясь на литературных отнесениях компонент ИК-спектров различных балков (Byler & Susi, 1986; Arrondo, 1993; Dong et al, 1995), спектральные >собашости ЭФ-ЧСА можно обьяснить изменениями в а-спиральных (компонента при 1296 см') и ß-структурных участках молекулы альбумина.

Термограммы АХ-ЧСА и ЭФ-ЧСА различных здоровых доноров варьируют по ¡горме и положению на температурной оси вследствие слабой воспроизводимости 'словий выделения альбумина. Указанная вариабельность не характерна для кривых [давления ПЭГ-ЧСА и цельной сыворотки. Кривые плавления "патологических" ЧСА видетеяьствуют, что препаративный электрофорез приводит к термосгабилизации льбумина различных больных, тогда как аффинная хроматография вызывает частичное

Р

з

2

1

Рис. I Термограммы плавления сывороточного альбумина, полученного из плазмы здорового донора полиэтиленгликольным фракционированием (1), аффинной хроматографией (2) и препаративным электрофорезом (3).

делигандирование ЧСА пациентов с печеночной недостаточностью.Таким образов ПЭГ-метод в наибольшей степени сохраняет термодинамические свойства, присущи нативному альбумину в норме и при заболеваниях.

Вторичная структура альбумина в норме и при заболеваниях

Для изучения особенностей вторичной структуры альбумина больных печеночной j почечной недостаточностью нами проанализированы спектры КД растворов, а такж ИК- и Рамановские спектры яиофилизованных образцов ЧСА. По данным КД, содержа ние а-спиралей альбумина в растворе при печеночной и почечной недостаточносп (50,1±1,3 и 51,1+1,2%, соответственно) достоверно не отличается от ЧСА здоровы: доноров (49,9±1,2%).

Анализ полос Амид I и Амид III ИК и Рамановских спектров ЧСА, где проявляются валентные и деформационные колебания групп, участвующих в образовании пептидно! связи (Беллами, 1963; Arrondo et al, 1993), подтвердил неизменность вторично! структуры альбумина при хронической уремии. В то же время, ИК и Рамановские спек тры образцов ЧСА при печеночной недостаточности имеют значительные отличия о-нормы: в полосе Амид I ИК-спектров отмечается увеличение относительной интенсив ности компоненты при 1645 смл, а в аналогичной полосе Рамановских спектров расте-по интенсивности линия при 1617 см1 (рис. 3). В полосе Амид III ИК-спектров увеличи ваются интенсивности составляющих при 1286 и 1225 см-1, а в Рамановских спектра; растет по интенсивности компонента полосы при 1268 см-1 (рис. 3). Перечисленньк компоненты ИК и Рамановских спектров обусловлены в белках колебаниями Р-споев J Р-поворотов (Кэрри, 1985; Anderle & Mendelsohn, 1987; Jakobsen & Wasacz, 1990; Dong e

Рис. 2 Деконволюция ИК-спектров в полосах Амид I (а)

и Амид III (б) препаратов альбумина, полученных различными методами из плазмы крови здорового донора: 1 -ПЭГ-ЧСА, 2 -АХ-ЧСА, 3 - ЭФ-ЧСА .

1750 1700 1650 1600 1350 1300 12S0 1200 у, см

а], 1995). Следовательно, лиофилизованные образцы альбумина больных с печеночной недостаточностью характеризуются увеличением доли ¡1-структуры.

Рис. 3 Рамановские спектры сывороточного альбумина здорового донора (1) и больных с хронической почечной (2) и печеночной (3) недостаточностью.

а 1 500 ,В()И

Волновое число, см"1

Известно, что высушивание белков вызывает их частичную деспирапизацию с увеличением доли Р-структуры и неупорядоченного клубка (Ок^ашто е( а], 1995; СпеЬепо\у ^ а1, 1995). Поэтому обнаруженные особенности вторичной структуры альбумина печеночных больных могут быть следствием дегидратации белка. ИК и Рамановские спектры комплексов альбумина с 5 молекулами пальмитиновой кислоты свидетельствуют, что юдобный структурный ответ на дегидратацию не моделируется высоким. уровнем шьбуминсвязанных жирных кислот. Кроме того, делигандирование ЧСА печеночных юльных не приводит к нормализации их колебательных спектров.

1араметры гидратации альбумина в растворе

Драматические изменения вторичной структуры ЧСА больных с печеночной недос-аточностью при лиофилизации могут быть обусловлены особенностями гидратной »болочки белка в растворе. Для проверки данного предположения мы изучили гидрата-1ИЮ альбумина здоровых доноров и различных больных методом протонной магнитной •елаксации. В табл. 2 приведены времена спин-решеточной (Т1) и спин-спиновой (Т2) «таксации протонов воды в растворах ЧСА, а также вычисленные с их помощью коли-ество и время корреляции связанной с беяхом воды. Как следует из таблицы, парамет-ы гидратации альбумина здоровых доноров и больных с хронической почечной недо-гаточностью (ХПН) достоверно не различаются, тогда как в растворах "цирротичес-их" ЧСА время Тг уменьшено вдвое, что указывает на увеличение количества связанной

о

воды и возрастание времени ее вращательной и трансляционной корреляции. 11 величине тКОИ1 можно сделать вывод, что молекулы воды связаны с поверхностью беяк двумя водородными связями и локализуется вблизи полярных групп (Koenig at al, 1993; Снижение Т2 обнаружено нами и в растворах ЧСА больных с острой почечной недо статочностью (ОПН) (табл. 1).

Нагрузка альбумина 5 молями стеариновой, пальмитиновой, миристиновой ил) линолсвой кислот не влияет на гидратацию белка, тогда как 5 молей олеата на мол ЧСА снижают Ti с 2,14 до 1,58 сек, не изменяя величины Тг. Следовательно, увегшчени количества альбуминсвязашшх жирных кислот lie объясняет усиления гидратации ЧСУ при патологии.

Таблица

Параметры гидратации ЧСА здоровых доноров и больных с печеночной и почечной

недостаточностью в растворе

Источник ЧСА Ti, сек Тг, сек ТкорхЮ9, сек (HlO)au3, г/г ЧСА

Здоровые доноры (п-10) 2,14+0,18 1,58±0,16 4,2±0,4 0,011 ±0,002

ХПН (п=16) 2,08+0,12 1,55+0,14 3,4+0,3 0,012±0,002

ОПН (п=6) 1,94±0,09 0,98±0,11 * 9,4+1,2* 0,018i0,003*

Цирроз печени (п-10) 2,00±0,10 0,60±0,21* 11,5±3,9+ 0,021±0,005* |

Примечание: * р < 0,01 в сравнении с ЧСА здоровых доноров.

Изучение температурной и рН-чувствительности альбумина

Способность к структурной адаптации ЧСА важна при связывании лигандо! (Honore, 1990), а также для облегченной диссоциации комплексов альбумин-лиганд нг мембранах клеток-мишеней (Reed & Burrington, 1989). Методом водород-дейтериевогс обмена показано, что конформациоиная подвижность ЧСА выше, чем у других белков не обладающих ферментативной активностью (Willumsen, 1971). Поскольку конформациоиная лабильность белков коррелирует с температурной и рН-чувствительностью ил структуры (Мажуль с соавт, 1970; Черницкий, 1972), мы сопоставили воздействие данных факторов на структуру альбумина в норме и при патологии.

Изучение термоденатурации ЧСА

Термограммы плавления "цирротических" и "уремических" ЧСА сходны по форме и сдвинуты в область более высоких температур (рис. 4) в сравнении с кривыми плавления донорских альбуминов (кривая 1 на рис. 1). Кривые плавления "патологических" ЧСА можно разделить на два типа. Тип I - бимодальные термограммы с низкотемпературным максимумом в интервале 65-69 °С и высокотемпературным - при 75-77 °С, тип II - унимо-

дальные термограммы с максимумом теплопоглощения при 78-81 °С (рис. 4). Термограммы второго тина имеют увеличенную энтальпию плавления и характерны для образцов ЧСА с высоким уровнем жирных кислот (>3 моль/моль). Бимодальные термограммы первого типа могут быть обусловлены как присутствием альбуминсвязанных лигандов (Shrake & Ross, 1988, 1990), так и конформационными изменениями белка (Казицина и Сочава, 1990; Yamasaki et al, 1990). Для "патологических" ЧСА, вероятно, справедливы оба механизма, поскольку делигандирование белка частично нормализует термограммы, но не ликвидирует их бимодальностн.

Рис. 4 Термограммы плавления Рис. 5 Температурные зависимости соотно-

ЧСА больных циррозом печени шения интенсивностей на склонах спектра

(I, II - типы термограмм). триптофановой флуоресценции ЧСА здоро-

вого донора (1) и уремического больного (2).

Возрастание термостабильности ЧСА больных с печеночной и почечной недостаточностью демонстрируется не только их кривыми плавления, но и температурными зависимостями триптофановой флуоресценции. Единственный триптофановый остаток ЧСА расположен на интерфейсе между вторым и третьим доменами. Параметры его флуоресценции изменяются при изменении междоменных взаимодействий факторами среды и связанными лигандами (Нямаа с соавт:, 1984, 1985). На рис. 5 представлены температурные зависимости отношения интенсивностей флуоресценции (Рз55/Рз25) на нисходящем и восходящем крыльях триптофанового спектра ЧСА. Спектр флуоресценции альбумина здорового донора претерпевает два коротковолновых сдвига (уменьшение отношения Кз55/Рз25). Слабо выраженный сдвиг в интервале температур 30-40 °С, вероятно, сопровождает частичную деспирализацию С-концевого домена ЧСА, резко

выраженное коротковолновое смещение полосы флуоресценции после 60 °С вызвано, плавлением межсубдоменных участков белка (Takeda et al, 1989). Спектры триптофано-вой флуоресценции ЧСА больных с печеночной и почечной недостаточностью сходны и смещены в коротковолновую область при комнатной температуре (см. рис. 5), что может быть обусловлено как конформационными изменениями во втором домене, так и изменением междоменных взаимодействий. Первый коротковолновый сдвиг у них слабо выражен или отсутствует, а термоденатурационное смещение полосы флуоресценции уменьшено по амплитуде. В денатурированном состоянии белка триптофанил "уремического" ЧСА находится в более полярном окружении, чем у нормального альбумина. Полученные данные свидетельствуют об увеличении термостабильности межсубдоменных соединительных фрагментов альбумина при патологии.

Калориметрическое исследование N-B перехода альбумина

Молекулы ЧСА способны претерпевать обратимый конформационный переход в интервале рН 6-8 - так называемый N-B переход (Foster, 1977). При этом существенно трансформирутся кривые плавления и спектры флуоресценции альбумина. Наибольшую термостабильность альбумин здоровых доноров имеет при рН 6. Защелачивание среды в интервале рН 6-8 сдвигает максимум теплопоглощения ЧСА с 69 до 61 "С, уменьшает калориметрическую энтальпию денатурации с 230 до 92 ккал/моль и индуцирует выраженную бимодальность термограммы.

Термограммы плавления "патологических" альбуминов второго типа не изменяются в интервале рН 6-8. Кривые плавления "патологических" ЧСА первого типа при рН 6 унимодальны подобно эндотермам донорского ЧСА. Защелачивание среды до рН 7 индуцирует их бимодальность с максимумами теплопоглощения при 67-68 и 77-78 °С. При рН 8-9 вклад высокотемпературного пика в кривую плавления заметно увеличивается. Энтальпия денатурации при этом лишь незначительно уменьшается. Следовательно, В-форма "патологических" ЧСА более термостабильна, чем у альбумина здоровых доноров.

Анализ рН-зависимосгей триптофановой флуоресценции выявляет стадийный характер N-B перехода ЧСА здоровых доноров: длинноволновое смещение полосы флуоресценции в интервале рН 6-7,4 и обратный коротковолновый сдвиг при дальнейшем повышении рН (рис. 6). Спектры флуоресценции "уремических" и "цирротических" ЧСА неизменны при рН 6-7,4 и демонстрируют слабо выраженный коротковолновый сдвиг в интервале рН 7,4-10. Подавление флуоресцентных изменений при N-B переход« также происходит при нагрузке альбумина жирными кислотами (рис. 6).

Комплексообразование ЧСА с маркерными лигандами

Сниженная информационная чувствительность ЧСА больных с печеночной и почечной недостаточностью к изменению рН и температуры, вероятно, обусловлена возрастанием жесткости молекулы альбумина при этих заболеваниях. Уменьшение конформационной лабильности ЧСА при почечной и печеночной недостаточности сопровождается снижением связывающей способности, оцениваемой по энтальпии образования эквимолярных комплексов белка с маркерными лигандами различных связывающих центров (табл. 2).

Рис. 6 рН-завнсимости соотношения интенсивностей на склонах спектра триптофановой флуоресценции ЧСА в норме (]), при хронической уремии (2), и нагруженного 5 молями пальмитиновой кислоты (3).

Р

355 325 1.2

1,1

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

23456789 10

РН

Таблица 2

Молярные энтальпии комплексообразования (-АН*, кДж/моль) ЧСА с маркерными лигандами основных связывающих центров.

Лигаид Донорские ЧСА (п=15) "Уремические" ЧСА(п=17) "Цирротические" ЧСА (п=15)

Октаноат натрия 17,72±0,48 10,38+0,49* 9,95+0,93*

% к контролю 100+3 59±3 56±6

Салициловая кислота 26,88±0,62 21,73±0,48* 16,41+0,47**

% к контролю Ю0±3 81±2 61+2

Феноловый красный 6,8 ¡±0,23 3,67±0,23* 3,39±0,20*

% к контролю 100±4 54±4 50±3

Додецилсуфат натрия 67,15±0,93 54,79^0,79* 38,34±1,7**

% к контролю 100+2 82+2 57+3

Примечания: * р< 0,001 в сравнении со здоровыми донорами, + р< 0,001 в сравнении с уремическими больными.

Абсолютные значения энтальпий комплексообразования "уремических" и "цирроти чсских" альбуминов со всеми тест-лигавдами ниже, чем у белка здоровых доноров Поскольку тепловые эффекты реакций пропорциональны количеству образующих« комплексов (Соа^о1о ег а), 1978; Акл & УататоШ, 1994), снижение величины -ДН, свидетельствует об уменьшении сродства "патологических" альбуминов. Энтальпш комплексообразования "уремических" и "цирротических" ЧСА в одинаковой мерЕ снижены при связывании октаноата и Фенолового красного, тогда как сродство альбумина больных с печеночной недостаточностью к салициловой кислоте и додецилсуль-фату ниже, чем у ЧСА уремических больных. Процедура деяигандирования полностьк нормализует связывающую способность четырех аффинных центров "уремического" ЧСА. Обезжиривание "цирротическото" альбумина незначительно увеличивает сродство к Феноловому красному, не изменяет связывание с додецилсульфагом и салициловой кислотой и снижает сродство к октаноату (табл. 3). Деяигандировани« "патологических" альбуминов позволяет сделать вывод о том, что при хронической уремии транспортная функция альбумина угнетена прочно-связашшми ингибиторами, тогда как при печеночной недостаточности дисфункця ЧСА в значительной степени обусловлена ковалентной модификацией белка.

Таблица 3

Энтальпии комплексообразования (-АНК, кДж/моль) ЧСА, выделенного из интактных и делигандированных по Чену сывороток крови больных с почечной и печеночной

недостаточностью

Лиганд "Уремический" ЧСА "Цирротический" ЧСА

Интактный Делигандир. Интактный Делигандир.

Каприлат натрия 9,6±0,6 19,2±0,5* 4,8±0,4 3,5±0,2*

Салициловая к-та №,6±0,5 27,510,7* 15,010,4 16,7±0,5

Феноловый красный 4,7±0,2 7,3±0,3* 2,34.0,2 3,7±0,2*

Додецилсульфат 55,5+0,9 68,2+1,2* 29,0+1,1 31,2±1,5

Примечание: * р< 0,05 в сравнении с интактным ЧСА

Сравнительная характеристика физико-химических свойств ЧСА уремических больных с различными сроками гемодиализа

В последние годы появились данные о том, что низкая концентрация ЧСА в плазме крови коррелирует с увеличением риска смерти у больных с ХПН (Lowrie & Lew, 1990; Rocco et al, 1993). Однако нормальное функционирование альбумина определяется не столько его общей, сколько "эффективной" концентрацией, т.е. долей молекул белка с ненарушенными структурой и связывающей способностью (Добрецов, 1994). Для изуче-

ния зависимости структурно-функционального статуса уремических ЧСА от выраженности эндотоксического стресса мы провели сравнительный калориметрический и спектроскопический анализ альбумина больных хроническим пиелонефритом, различное время находившихся на программном гемодиализе. Пациенты были разбиты на 3 группы: I - до 1 года, II - от 1 до 5 лет и III - свыше 5 лет диализа. На рис. 7а представлены термограммы плавления образцов сывороток крови здоровых доноров и уремических больных по группам. Термограммм уремических сывороток характеризуются сдвигом в высокотемпературную область и уменьшением вклада низкотемпературного максимума, обусловленного плавлением слабо-лигандированного альбумина. Трансформация кривых плавления уремических сывороток достигает максимума у больных второй группы а у пациентов, проживших более пяти лет на диализе, отмечается частичная нормализация термограмм. Аналогичная динамика характерна для кривых плавления изолированных образцов "уремических" альбуминов (рис. 7Ь). Наибольшие высокотемпературный сдвиг и бимодалыюсть присущи кривым плавления "уремических" альбуминов в период от 1 до 5 лет гемодиализа, тогда как у ЧСА больных третьей группы отмечается частичная нормализация термограмм. Изменения кривых плавления указывают на максимальную загрузку ЧСА уремическими токсинами в период от I до 5 лет диализа.

'не. 7 Термограммы плавления сыворотки крови (а) и ЧСА (Ь) здорового донора (1) и ремических больных со сроками диализа до 1 года (2), 1-5 лет (3) и более 5 лет (4).

Усиление лигандной нагрузки сопровождается модификацией структуры белка. Уремические" альбумины второй группы имеют коротковолновую триптофановую луоресценцию при комнатной температуре и сниженную амплитуду термоденатура-

ционного перехода. В третьей группе амплитуда смещения полосы флуоресценции при плавлении белка возвращается к норме.

Абсолютные значения энтальпий комплексообразования "уремических" ЧСА с маркерными лигандами снижены в сравнении с донорским альбумином. Значения -ДН* для связывания октаноата натрия, Фенолового красного и салициловой кислоты уменьшаются в ряду: донорский ЧСА - "уремический" ЧСА до 1 года гемодиализа -"уремический" ЧСА от 1 до 5 лет гемодиализа и вновь возрастают у альбумина больных третьей группы (табл. 4).

Таблица 4

Энтальпии комгшексообразования (-АН*, кДж/моль) маркерных лигандов с ЧСА

здоровых доноров и уремических больных по группам

Образец Лиганд

Октаноат натрия Салициловая кислота Феноловый красный Додецил-сульфат

Донорский ЧСА 19,1 ±0,9 27,4±1,1 5,5±0,3 66,6+1,7

"Уремические" ЧСА

I группа 9,8±0,5* 18,9±0,6* 3,9+0,1* 53,3+1,0*

II группа 6,4±0,5*+ 14,1±0,9*+ 1,9±0,3*+ 52,3±1,8*

III группа П,9±1,0*+ 21,0+0,8*+ 3,6±0,1*+ 54,6±2,1*

Примечания'. * р < 0,05 по сравнению с ЧСА здоровых доноров;

+ р < 0,05 по сравнению с "уремическим" ЧСА предыдущей группы.

Частичная нормализация лигандирования, конформации и связывающей способности альбумина уремических больных, более 5 лет находившихся на хроническом гемодиализе, вероятно обусловлена преимущественным выживанием пациентов, альбумин которых в большей степени сохраняет структуру и связывающую способность.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что полиэтиленгликольное фракционирование плазмы крови человека в сочетании с хроматографией на <2АЕ-Сефадексе сохраняет нативную структуру сывороточного альбумина и состав его прочносвязанных лигандов. Этот метод выделения наиболее адекватен для изучения структуры и функции альбумина в норме и при заболеваниях.

2. Степень спирализации альбумина в растворе не различается для здоровых доноров и больных с печеночной и почечной недостаточностью. Лиофилизованные образцы альбумина больных с печеночной недостаточностью, в отличие от здоровых доноров и уремических больных, имеют аномально высокое содержание р-структуры.

3. Установлено, что альбумин больных с хронической печеночной недостаточностью в растворе характеризуется увеличением количества и времени вращательной корреляции белок-связанной воды в сравнении со здоровыми донорами и пациентами с хронической уремией.

4. Для больных с хронической почечной и печеночной недостаточностью, по сравнению со здоровыми донорами, показано повышение термостабильности альбумина, снижение способности к рН-индуцированным структурным переходам в диапазоне рН 6-10 и уменьшение сродства к маркерным лигандам: октаноату, салицилату, Феноловому красному и додецилсульфату. При печеночной недостаточности угнетение связывания альбумином салицилата и додецилсульфата сильнее, чем при уремии.

5. Обнаружено, что делигандироваиие активированным углем частично нормализует термограммы плавления и восстанавливает связывающие свойства "уремического" альбумина, но не нормализует структуру и связывающую способность "цирротического" альбумина. Физико-химические особенности альбумина больных с печеночной недостаточностью не обусловлены связыванием длинноцепочечных жирных кислот.

6. Модификация структуры и связывающей способности альбумина больных хроническим пиелонефритом наиболее выражена в период от одного до пяти лет жизни на программном гемодиализе. Пациенты с более длительными сроками диализа по структурно-функциональным характеристикам альбумина приближены к здоровым донорам.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Иванов А.И., Иванов А.А., Голубович В.П., Королик Е.В., Лещенко В.Г., Жбанхов Р.Г. Исследование структуры сывороточного альбумина при патологии методом ИК-спектроскопии//Ж. лрикя. спектроск. - 1991. -Т.54. - С.445-448.

2. Rotellar Е., Nikolaev V., Sarnatskaya V., Ivanov A. Theoretical background of extra-corporal correction of a transport function of sérum albumin in patients with ESRD // 4th International Congres of the World Apheresis Association: Abstracts.- Sapporo, Japan, June 3-5.- 1992.- P.169 (O-12-l).

3. Иванов А.И., Короленко E.A., Королик E.B., Сарнацкая В.В., Мепещенко Л.А., Николаев В.Г., Жбанков Р.Г., фон Аппен К. Исследование методом ИК-спектроско-пии структуры альбумина крови здоровых доноров и больных с хронической почечной недостаточностью // Биополимеры и клетка. - 1993. - Т.9.- С.35-40.

4. Nikolaev V., Sarnatskaya V., Rotellar Е., Ivanov A., von Appen K., Haspar M., Klinkmann H. Functional states of HSA over différent periods of dialysis (Abstract) // Artificiel Organs. - 1993. - Vol. 17. - P.463.

1b

5. Nikolaev V., von Appen K., Sarnatskaya V., Ivanov A., Klinkrnann H., Rotellar E., Haspar M. The possibility for the recovery of HSA functional characteristics in uremic patients (Abstract) // Artificial Organs. - 1993. - Vol.17. - P.464.

6. Sarnatskaya V.V., Nikolaev V.G., Osipova L.A., Ivanov A.I., Maslenny V.N., Ivanyuk A.A., Yushko L.A. Peritoneal dialysis for the removal of protein-bound markers of hepatic insufficiency//Artificial Organs. - 1993. - Vo}.17. - P. 828-836.

7. Иванов А.И., Жбанков Р.Г., Короленко E.A., Королик Е.В., Мелещенко Л.А., Мархевка М., Ратайчак X. Исследования методами ИК и КР спектроскопии структуры сывороточного альбумина человека в условиях различных лигандных нагрузок // Ж. прикл. спектроск. - 1994. - Т.60. - С.399-405.

8. Бабушкина Т.А., Иванов А.И., Сарнацкая В.В., Николаев В.Г. Сравнительное изучение протонной релаксации воды в растворах. сывороточного альбумина здоровых доноров и больных с почечной и печеночной недостаточностью // Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / Ред. Ю.А. Грызунов, Г.Е. Добрецов - Москва: Ириус, 1994.-С.154-161.

9. Ivanov A., Sarnatskaya У., Nikolaev V., Korolenko Е., Korolik Е., Zhbankov R. Uremic albumin: secondary or tertiary structure modification? И 2nd International Symp. on Uremic Toxicity: Abstracts. - Gent, Belgium, September 22-24, 1994. - P.25.

10. Sarnatskaya V., Nikolaev V., Ivanov A. Conformation and transport function of uremic serum albumin after different types of adsorptive treatment // 2nd International Symp. on Uremic Toxicity Abstracts. - Gent, Belgium, September 22-24, 1994. - P.25.

11. Ivanov A., Zhbankov R., Korolenko E., Korolik E., Marchewka M., Ratajczak H., Meleshchenko L. Infrared and Raman spectroscopic study of serum albumin of healthy donors and patients with liver cirrhosis // 6th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules: Abstracts. - Villeneuve d'Ascq, France, September 3-8, 1995. - P.495-496.

12. Nikolaev V., Ivanov A., Sarnatskaya V., Maslenny V. Analytical aspects of albumin-bound substances removal (Abstract)//Artificial Organs. - 1995. - Vol.19. - P. 1054.

13. Nikolaev V., Sarnatskaya V., von Appen K., Ivanov A., Rotellar E., Haspar M., Klinkrnann H. Biophysical studies on the correction of uremic HSA binding defects by in vitro charcoal adsorption treatment.// Artificial Organs. - 1996. - Vol.20. - P.16-22.

14. Иванов А.И., Сарнацкая B.B., Короленко E.A., Королик Е.В., Мелещенко J1.A., Николаев В.Г., Николайчик В.В., Юшко JI.A., Жбанков Р.Г. Модификация лигандной нагрузки и структуры сывороточного альбумина человека при различных методах выделения // Биохимия. - 1996. - Т.61. - С.903-911.

РЭЗЮМЭ

1ваиоу Андрэ11яаиавп

Парауиадьная фЬико-пшчиаз зшрактарысп.пса алъбум'ша крым здаровых донорау 1 хворых на пячоначную 1 иыркавяю недчстатховясць

Ключавыя славы: аиьбумш, шфрачырвоная ды Раманауская спектраск-ашя, пратоннзя рэлаксащля, дыферанцыйная скашруючая ды праточная каларыметрыя, цэнтры звязвання, канфармацыя.

Праведзены комплексны параунальны аналп другакаснай ды трагцчнай структуры, пдратацьн а таксама звязвагочай здольнасц! чалавечасхага сываратачнага альбумша (ЧСА) здаровых донарау ды хворых па храшчную пячоначную а таксама ныркаваю не-дастатковасць. Паказана нязменнасць узроуню сшрал1зацьн "паталапчных" ЧСА у растворы; у лкфЫзаваных абразцах ЧСА хворых на пячоначную недастатковасць знойдзена анамальна вялпсае утрыманне Р-сгруктуры. У растворах альбумша хворых на пячоначную недаст атковасць знойдзена павешчэнне колькасщ звязанай вады ды памяньшэнне яе спрытнасщ. 3 дапамогай дыферанцыйнай скашруючай каларыметрьц а таксама бялко-вай флуарэсцэнцьн вызиачана павел!чэнне гэрмастабшьпасщ "паталапчных" ЧСА ды зшжэине IX здольнасц! да ¡ндуцыраваных рН канфармацыйных пераходау у непральнай ды шчалачной вобласщ. Метадам праточнай м1кракаларыметры1 зафжсавана зшжэнне срадства чатырох асноуных афшных цэцтрау альбумша больщ выразнае дня пячоначнай недастатковасць Прадэманстрапапа, што спектральныя ды тэрмадынам1чныя асабл!пас-ц[ альбумша пячоначных хворых не прымаюцца пры дагагандыраванш 1 не зьяуляюцца вышкам утрымання ЧСА доугаланцуговым! тлусным! юслотамь Знойдзена залежнасць структуры ды функцыянальнай якасщ альбумша хворых на храшчны теланэфрыт ад працягласц! жыцця пыцыентау на праграмным гемадыял1зе. Атрыманыя рэзультаты могуць выкарыстоувацца дзепя карэкцьп доз лекавых сродкау, прагнозу развщця эндагеннай ттаксткацьн а таксама выбара стратэгн дэтакякацыйнай тэрапн.

РЕЗЮМЕ

Иванов Андрей Иванович

Сравнительная физико-химическая характеристика альбумина крови здоровых доноров и больных с печеночной и почечной недостаточностью

Ключевые слова: альбумин, инфракрасная и Рамановская спектроскопия, протонная релаксация, дифференциальная сканирующая и проточная калориметрия, центры связывания, конформация.

та

Проведен комплексный сравнительный анализ вторичной, третичной структур гидратации и связывающей способности человеческого сывороточного альбуми) (ЧСА) здоровых доноров и больных с хронической печеночной и почечной недостато ностью. Показана неизменность степени спирализации "патологических" ЧСА растворе; в лиофшшзованных образцах ЧСА больных с печеночной недостаточность найдено аномально высокое содержание Р-структуры. В растворах альбумина больных печеночной недостаточностью выявлено увеличение количества- связанной воды уменьшение ее подвижности. С помощью дифференциальной сканирующей калориме рии и белковой флуоресценции показано увеличение термостабильности "пагологиче ких" ЧСА, снижение их способности к индуцированным рН конформационны переходам в нейтральной и щелочкой области, методом проточной микрокалориметри зафиксировано снижение сродства к лигандам четырех основных аффинных центре альбумина, более выраженное для печеночной недостаточности. Продемонстрироваш что спектральные и термодинамические особенности альбумина печеночных больных и устраняются при деяигандировании и не являются следствием нагрузки ЧСА длиннс цепочечными жирными кислотами. Выявлена зависимость структурных и функционал! ных свойств альбумина больных с хроническим пиелонефритом от длительности жизн пациентов на программном гемодиализе. Полученные данные могут использоваться дл коррекции доз лекарственных препаратов, прогнозирования развития эндогенно] интоксикации и выбора стратегии детоксикационной терапии.

SUMMARY

Ivanov Andrei Jvanovich

Comparative physico-chemical characterisation of blood albumin of healthy donors and patient with liver and renal failure

Key words-, albumin, infrared and Raman spectroscopy, proton relaxation, differentia scanning and flow calorimetry, binding sites, conformation.

A versatile comparative analysis of the secondary and tertiary structure, hydration anc binding capacity was carried out for serum albumin (HSA) of healthy donors and patients with liver and renal failure. Unchanged spiralization has been shown for "pathological" HSA in solution. Abnormally high content of p-structure was observed in lyophilised samples oi patients with liver deficiency. A rise in the amount and decrease in the mobility of bound water was found in solution of albumin of patients with liver deficiency. Increased thermostability of "pathological" albumins and their lowered ability to undergo pH-induced conformational transitions in neutral and alkaline regions were discovered using differential

scanning calorimetry and protein fluorescence; decreased ligand affinity of four major albumin binding sites was shown by flow microcalorimetry techniques, the latter effect being more pronounced in liver failure. It was demonstrated that the spectral and thermodynamic peculiarities of albumins of liver patients are not eliminated upon deliganding HSA and are not caused by its loading with long chain fatty acids. In patients with chronic pielonephritis a correlation has been revealed between structural and functional properties of albumin and term of programmed hemodialysis. The data obtained in the work can be applied for correction of drug dosages, prognosis of the development of endogenous intoxication and choice of the strategy of detoxifying therapy.

Иванов Андрей Иванович

Сравнительная физико-химическая характеристика альбумина крови здоровых доноров и больных с печеночной и почечной недостаточностью

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано к печати 9.08. 1996 г.

формат 60 x 90 1/16. Бумага типогр. Офсетная печать.

Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ

Отпечатано на резографе Института физики им. Б. И, Степанова АН Беларуси. 220072, Минск, пр. Скорины 70. Лицензия ЛВ № 685 от 23. 12.1993 г.