Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

К метаболизму белков и пептидов при хранении донорской крови

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "К метаболизму белков и пептидов при хранении донорской крови"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ БССР

МИНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

БЫЧНО Галина Николаевич

УДК 615.387+612.015.348

ЕС МЕТАБОЛИЗМУ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ ПРИ ХРАНЕНИИ ДОНОРСКОЙ КРОВИ

( 03.00.04-БИОХИМИЯ )

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

МИНСК 1989

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гематас и переливания крова МЗ БССР

Научный руководитель:

доктор мелиштоких наук КИКОЛАЙЧИК Б .В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор КША В.К.

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник ПЕТРОСЯН М.Т.

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. Ы .В .Ломоносова

Защита состоится " & "^^¿^¿^¿-¿УхЭЭО г> в /^часов на заседании специализированного Совета К 077.01.02 по задите кандодатских диссертаций ери Минском государственном медицкнг ком институтз (220738, г .Минск, проспект Правда, 13).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Минского государственного медицинского института

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного' Совета, кандидат медицинских наук, доцент

Г.И.РЕЛХ

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАКШ

Актуальность работы. Помещение любых клеток р экстремальные условия ви?ывает типовые изменения метаболизма (Александров:ISB5), дая которых предложен термин - нескецифяческий адаптационный синдром клеточной системы (Брэун и др., 1907). Есть все основания рассматривать процессы, происходящие в хранимой крови, с точки зрения указанного синдрома. Вопрос, о важности изучения метаболизма ьнутри-, клеточных ¿елкоЕ к путей их денатурации не знзквает дискуссий, од- . нако не меньшую важность имеет исследование метаболизма болков алазмы крови или,вернее, одной его стороны - катаболизма, поскольку в плазме отсутствуют системы синтеза белка. Еыясненио молекушр-но-массового гомеостаза лелково-пептидных веществ гложет явится одним из путей, приближающих нас к пониманию ключевых изменений, происходящих не только в плазме, но и в клетках хранимой крови. Кровь является основной гуморальной средой, з которой осуществляются многие регуляторные функции организма. К регуляторным системам крови относятся к процессы ограниченного прстеолиза, являющиеся особой формой биологкчеокого контроля, характеризующегося однонаправленностью биологического действия (Ореховэт, .1584; Локиияа, 1979,19CS). Протеолиз как форма биологического контроля осуществляется двумя путями. Первый путь - это реакции полной деградации оелдов, опредо-лявдие скорость распада белкоэ, регуляцию их метаболизма, удаление из организма "аномальных" белков, образующихся в результате мутацти или ошибок биосинтеза. Второй путь - это реакции ограниченного нро-геолкза, приводящие к гидролизу специфических участков б молекулах белков и имеющие решающее значение дая регуляции.

Нарушение или выключение каких-либо этапов ограниченного про-теолиза, либо неконтролируемая активация протейная монет сопровождаться как дефицитом, так и избыточным накоплением физиологически активных соединений, а тагаге веществ, сходных по своему строению и проявлениям биологической активности с извее-шла: пептидньв/з биорегуляторами либо о их активными фрагментами. К этим соединениям можно отнести также грушу веществ, получивших название пептидов группы "средних молекул". Считают, что с накоплением этих соедияе-нкй обусловлены универсальные мадоспецифическис'проявления заболевший (по сути тот же адаптационной или дисстресо-синдром), а их происхождение также связывают с активацией протсолитичзск;к еиатеи организма (Нкколайчик, 1934; Беляков, IS85).

Присутствие в крови моднчх протеолититеекпх систем (тромбино-

воя, нлазминсвья, систем комплимента), а также ьоявленке в плазме клеточных иротааньз (тромбоцитарных, лейкоцитарных) при разрувении меток и активация юс при последующем хранении может сопровождаться деградацией белков плазмы и появлением активных пептидных продуктов (¿ЯП), кесаецяфичесхи изменяющих многие биохимические реакции как в плазме, так в в метках крови. Сочетание расчлененности и избирав талькой чувствительности» а также целостности является источником существования специфичных и неоцецифичшх реакций клетки, ткани организма (Александров, 1985), эта реакции отчетливо проявляются при действии повр«кдаших агентов, к каковым могут быть отнесены условна, воэкикакцие при хранении крови. Хранимая кровь представляет собой орган, находящиеся в состоянии парабиоза, во лпеешшй деток-сикадиокшх систем, в частности, этапа экскреции.

Выяснение особенностей появления АЛЛ в процессе функционирования биологических систем крайне актуально для суждения о регулятор-Hoii роли метаболизма белков ь оргшшзме, ткани, клетке; практических вопросов фракционирования белков крови, их стабилизации в составе трансфузионных препаратов. Этим обусловлена необходимость фундаментальных исследований характеристик АПП и процессов их образования.

Цель работы. Изучение дощаники образования и накопления АШ, поиск плазменных белкоЕ-првдиествещщхоь, связь втих процессов о активацией протеолитичооких систем донорской крови при хранении, а такде разработка приемов и методов, направленных на устранение нежелательных эффектов действия АШ.

1. Изучить накопление АЛЛ в донорской плазме человека и животных при хранении и сопоставить с уровнем пептидов группы "средних молекул", выявляемом а организме при патологических состояниях,

2. Выяснить роль и классы протеиназ, ответственных га образование и накоплензз АЛЛ, а также их белки-предшественники.

3. Исследовать биологическое действие АЛЛ из плазмы крови на м<ягбранн животных и растительных клеток.

4. Исследовать возможность предотвращения нежелательного действам »Ф$екта образования и накопления АЛЛ путем использования инги-(íitTopoa зротесизпа, введешь моыбранопротекторов, применения оорб-цаоккой обработки. . '

Научная новизна работы. В работе впервые изучена взаимосвязь активации эндогенного протесютза с молекулярко-массовкм гомзостг-зом белков и пептидов плазмы донорской крови при хранении. Установлены классы активирующихся протеиказ, ответственные за образование и накопление АЛЛ; с помощью ингибиторов протеилаз выявлена возможность предупреждения появления гтах оовдинзний из плагкея-isrc белков-прздшественников. Исследовано действие А1Ы из различных источников на мембраны яивотних клэток - эритроциты и растительных клеток Nitella flei13is , показана возможность протек-тивного действия фармакологического средства "Мклдроиат" при хранении донорской.крови.

Практическая ценность. Разработана тесты ао определении доноров с вксским фибринолитЕческим потенциалом плазмы крови, что позволяет заранее рационально решить судьбу заготовленной крови и избегать использования в клинике трудно храличых серий. Разработана приемы ссрбционаой обработки длительно хранимой крови с помощью сорбептзв, что позволяет улучпить аЧ мерфо-функдгонапышо свойства, повысить выход белков при последущем фракционировании. С применением сорбцаонной технологий получены препараты альбумина из донорской крови (A.c. Л I253CÜ3. полепйтельное решение на выдачу aavcp-ского свидетельства » 4288221/^8-14/121509 от 30.08.88), обладающие высокой степенью частота и стабильности при хранении.

Реализация результатов работы. Результаты исследования внедрены в используются в работе 9-й клинической больницы и областного родильного дома г.Минска, Гродненской, Витебской, Минской областных клинических больниц. Оригинальные способа получения препаратов шазмь кревд с применением методов сорбциснной о<шсткя и биотехнология внедрены на Витебской областной станции переливания кроси.

Основныо положения, выносимые на зааиту.

1. Днскоордивация протесянза •• один из механизмов поврездаше-го действия на клетки и является элементом неспец*фического адаптационного синдрома клеточной системы.

2. Инактивация наиболее мощных протеиназ, способных активироваться при хранении крови, ингибиторами-широкого и узкого спектра действия обеспечивает более продолжительное сохранение компонентов консервированной крови и лечебны:: препаратов, цолучае.\тас на её основе. Епоспецифическая сорбция - эффективный мчтод удалена! из донорской крови активированных протеиназ, обеопочизаятай надежность цельной крови как грансфузиогжой среды» а такие аоэпо-

лящгсЧ увеличить выход балксдах препаратов высокой степени чистоты и стабильности.

3. Пептида, образующиеся в процессе протеолиза белков плазмы хра-:шмой кревк,являвтсд физиологически активными соединениями, действие их обусловлено появлением в их составе ме!Д5ранотропных компонентов; накоплением пептидов, модифицирующих белки; образованием в аномально высоких количествах пептвдов, близких в структурном отношении к известным пептидным биорегуляторам.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: J. ко.чференции молодых ученых - гематологов и трансфузиологов учреждений службы крови страны (Могилев, 1978), УШ съезде хирургов и Ш съезде гематологов и трансфузиологов БССР (Минск, 1979), Республиканской научно-практической конференции патофизиологов BCCF (Гродно, i960), научной конференции патофизиологов Прибалтийских ССР а БССР (Каунас, 1981), Республиканском съезда врачей паборантов (Минск IS8I), 1Д и 1У Всесоюзной конференции по физико-химической биологии (Тбилиси, 1932, 1984), I Республиканской конференции по сорбционяым методам дётоксикащш в клинике (Минск, 1983), У1 Всесоюзном симпозиуме по химия белков и пептидов (Рига, 1933), П Всесоюзной конференции по сорбциошшм методам детоксикацкп и иммунокоррекции в медицине (Ташкет-, 1984), УП Республиканском съезде терапевтов БССР (Минск, 1984), 1У съезде гематологов и трансфузиологов БССР (Минск, 1908), У Республиканском съезде адестезиологоэ-реаншалологоа (Ворошиловград, 1988), I международном конгресе по терапии аминокислотами и I« аналогами (Вена, 1989).

Публикации. Основные результаты опубликованы в 20 печатных работах, в том числе I авторском свидетельстве и 2 положительных решениях на ввдачу авторских свидетельств.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страшщах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Работа иллюстрирована 17 таблицами я 38 рисунками. Библиография включает 168 источников (93 - отечественной и 75 - зарубежной литературы).

С0ДЕШ1МЕ РАБОТЫ

Мате риалы и методы исследования. Основным материален для проведенной работы дослужила донорская кровь людей и животных, свеже-заготовленная и при хранении. Для детализации гипотезы о решающей ршхи актлвеиди протеолиза как основного поврездалдего фактора wec-пецкфичзского адаптационного синдрома исследовали плазму больных с симптомами эндогенной интоксикация, фибринолизнуа кровь, а тькго плазму кивотныу. (собак) при моделировании критических состояний. Всего было исследовано 532 образца биологических жидкостей (483 -плазш и сысорстэт, 32 - иф, 12 - ликзора) и 51 образец ххдаоге-натоь тканей.

Заготовку крови от доноров осуществляла на станции яерзлпва-ния крова в стандартные флаконы. Отбор образцов дня анализа проводили в стерильных условиях в день взятия, йь 7, 14 и 21 сутки хранения. Для получения плазш или эритроцитарной массы кровь центрифугировали при 2500 об/миц в течениз 10 мин, плаз,чу отделяли от эритроцитарной масси и исследовали. Гшогенаты тканей полу чата рутинными методами.

Фракционирование биологических жидкостей методом гель-хрема-тигрэ&ж осуществляли по (Детерман, 1970) с использованием сефздек-са G-50 я 0-200 (Фармация, Ивехщя). Для .сравнительной оценки молекулярных масс (Щ) образующихся пептидов колонки предварительно калибровались белками (рльбумин, Ш 67 ООО), пептидами (ангиотеизян, Ш 1030 ; глшдач-феж*лаланш, ММ 222), аминокислотами (трилтефаи, Ш 204)..

Электрофорез в пеляакриламиднем геле проводам! в денатурирующих условиях с додещисуяьфатом натрия ( «еЪег et «о., 1969) и ч кислой системе в присутствии мочевины ( Раnym et al», 1969).

Для определения концентрации общего белка и аиьйумика лепелъ-зеваля реакции связывания красителей Понсо з( salo ot al., 1974) и брсг.сфэ?елового зеленого ( Еашпаз et al*, 1971). Содержание фибриногена -- по ферментативной реакция с тромбином (Балицер, 1Э83).

Определение протеолитической активности. Исследовали фибрино-лдтнчеекуа активность на фибриповых пластинах ( Wilson et al., 1978), лепользованче модифицированных процедур позволило изучить активность основных компонентов &той системы - свободного плазмл-на и ангкпл&адшоа, пла&мшмгена и его активаторов. Гкстоназяуи

активность изучала по разработанной нами методике, позволяющей выя-. бить также классы активирующихся в биологической жидкости лротеиназ. Суммарная эотеразкая активность оценивалась по гидролизу синтетических субстратов ЕАЗЗ, ЕАМЭ, НАЛА (Пасхина и др., 1977).

Для получения шгазшногена и плазмина применяли метода биоспецифической сорбции (Николайчпк и др., 1979) о лизин-соДержащим оор-бенгом. Препараты суммарных гистопов получая: из хроматина по методу ( Т5в Хапйс о^аг., 1571).

Исследование мекбранотропных эф|ектов. Определяли осмотическую устойчивость к гипотоническому гемолизу кнтактных и обработанных АЩ эритроцитов, проводились измерения электродаффузиошшх свойств мембран шлеПа Пех1Ио при контакте с АШ, эта часть работы выполнена в институте ботаники АН БССР (д.б.н. Б.М.Юрин).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ "

Динамика накопления АШ в биологических «вдкостей людей и животных в процессе хранения.

При гель-хроматографии биологических жидкостей наблодалась харак торная картина (рио.1):зсна выхода высокомолекулярных компонентов, составляющая почти 99. затем небольшой пик в промежуточной,средае-молекулярней зоне - до 0,5л (фракция активных продуктов протеолиза, АШ), пин в области низкомолекулярного предела фракционирования -0,3$ и менее. Б исследованных интахтных жидкостных средах (плазма, сыворотка,лимфа,ликвор человека и животных) Ш пика АШ соответствовала ~-1000 Д, а уровень АШ соответствовал показателям цельной крови или же был .несколько ниже, пик низкомолекулярякх соединений располагался в зоне Ш нике 150 Д. При гель-хроыатографии гомогена-тов тканей помимо пика АШ регистрировалось еще от 2 до 5 пиков.различающихся по Ш, т.е. более широкий набор продуктов протеолиза в-цитоплазме (рис Д). Исходный уровень АШ изученных образцов плазмы крови но зависел от способа стабилизации (цитратная или гепаринизи-роьаннея), при этом концентрация АШ в овежезаготовлепной крови колебалась в диапазоне от 0,2 до 1,30 г/л, однако по частотному расп-. ределеяш выявляется две группы доноров, К цервой группе (80$ об-слодозанлс: од; были отнесены доноры с концентрацией АЛЛ - 0,38+ 0,10 г/л, ко второй группе (20^ обследованных лиц) доноры с кон-цонтрадаоП АЛЛ - 0,98+0,11 г/л. Как видно из табл.2., содержание АЛЛ в первой :руш.о возрастает к ? днл в 1,9 раза, к 1.4 и 21 суткам - в 3,0 л 4,0 раза соответственно. Во второй груше допоров итог-

Рпс.1. Г<ш>-хро5ягтограмй.<ы биологических вддкоотеЯ и ггао-гокатов тканей человека и животных, сефадеко С-50. I - плазма, 2 - липвор, 3 - лимфа, 4,5,6 - гсмсге-наты лейпоцитоп, селезенки, печени соответственно.

ление АШ (пло более интенсивно а к 7 даю превышает исходный уровень в 4.0-5,0 раз, к 14 и 21 суткам в 5,5 и 7,0 раз оооувотствэшю.

9

Таблица I. Изменение белкового метаболизма в плазме при хранении крови доноров.

Дни хранения Общий белок, Альбумин, Фибриноген, А1Ш, г/л г/л г/л_ г/л

Первая группа, свеаззаготовленная кровь 75,4+4,60 38,7+1,54 2,еОчО,11 0,38+0,02

7 74,1^2,40 36,8+1,65 2,254р,12г| 0,72±0,04к

14 72,4+2,80 35.3+1,28* 1,84^0,10* 1,15+0,12*

21 70,176,10 29,9^1,23м 1,62+0,08* 1,52^0,20*

Вторая Х'рупла, ¿ве&езаготов-

ленная кровь 71,5^0,34 36,6^1,46 2,90^0,07 0,58+0,11**

7- 68,3+2,94 30,0+2,00^1,35+0,16^ 3,83+0,24**

14 62,5+2,64** 23,111,75^1,14^0,1^ 5, З&МО, 25**

21 56,1+1,30** 20,5+1,52^1,СО+р, Об*8 6,76^0,36®*

Примечание: и - достоверные различия к исходным значениям, Р<0,00] к» - достоверные различия между группами, Р<0,001. На гель-хроматограммах отмечалось кзменекье сишзтрии распределения высокомолекулярного пика, прогрессировало уаирсние зоны еп выхода, во второй группе доноров уровень АШ достигал величин, сопоставимых со значениями концентраций пептидов группы " средних молекул" , полученными при исследовании плазмы больных с тяжелой патологией ироническая почечная и печеночная недостаточность, перитонит, "синдром вздаяекия" и т.д.). Скорее всего вяо связано с общим механизмом образования - активацией различных классов протеиназ, что на исключает возможности присутствия как общих, так и характер' ных только для хранимой крови компонентов, - продуктов деградации.

В первой группе образцов донорской крови концентрация общего белка достоверно не снижалась до 21 дня хранения (Р>0,1), ко содержание альбумина уменьшилось к 14 суткам в 1,1 (?<0,05), а к 21 дню в 1,3 раза (Р<0,001). Более интенсивно происходил процесс разрушения фибриногена, так, ухе к 7 дню хранения его концентрация стлалась в 1,2 раза (Р<0,01), а к 14 к 21 суткам в 1,5 и 1,7 раз соответственно (Р<0,001). Во второй группе деградация белков была белое выраженной (табл.1.),

Исходя из данных по ентаенип концолтращ;^ ¿елкод илазкш, слз-

дует ожидать более высокого уровня АШ в плазме хранимой крови.Однако регистрируемый прирост АЛЛ в плазме хранимой крови не коррелирует с количеством белка, подвергшегося деградации ^-Указанное мож- ; но отнести за счет того, что большая часгь А1Ш взаимодействует с мембранами клеточных компонентов крови или образует комплексы с плазменным! белками (Николайчик, 1984).

Роль протеолиза в процессе образования и накопления АШ.

Осознание протеолиза как особой формы биологического контроля привлекло внимание к изучению как внутриклеточных, так а внеклеточных протеиназ. Среди регуляторных систем крови внеклеточным протэи-назам принадлежит ведущая роль, известны, по-видюшм}, далеко не вое биологические процессы, которые осуществляются при участии зтж: протеиназ (Локшина, 1979, 1386; Орехович к др., 1984).

В нашей работе мы пытались получить принципиальный ответ на вопрос, в какой мере картина гель-хроматографического распределения фракций б донорской плазме связана с действием протеиназ. С этой целью были использованы растворимые и шлмобилкгз ованкые препарата -плазмпна, трипсина, папаина и комплекс этих ферментов. Обработка плазмы протеалитичеекдми ферментами уже в низкой .концентрации приводила к отчетливому возрастанию уровня, АШ, в высокой концентрации отмечалось не только резкое возрастание уровня АШ, но и расширение зоны выхода высокомолекулярных пептидных продуктов. Таким образом. практически точно воспроизведена в экспериментальных условиях динамика гель-хроматографаческих изменений, наблюдающаяся при хранении крови и з плазме больных с симптомами интоксикации, а также у экспериментальных животных б критических состояниях.

Связь появления АШ с активацией протеолиза в плазме донорской крови при её хранении требует решения двух основных вопросов: I-*-.. за счет каких белков-предшественников происходит образование АШ ? и 2 - какие классы протеиназ ответственны за эти продессы ?

В качестве субстратов для моделирования протеслиза мы исполь-зозали белки - альбумин и фибриноген, концентрация которых з плазме велика, но снижается в процессе хранения. Немаловажным оказалось и то, что в аминокислотных последовательностях этих белке? встречаются фрагменты, имеющие нзкоторое структурное сходство с известными пептидными биорегуляторами (Галактионов и др., 1984),н?лриь!ер: в аминокислотной последовательности сывороточного алъбупша присутствует фрагмент, являющийся аналогом гафтсина; а молекуле фибрино-

И

гена, его $ -цепи, обнаружен участок, являющийся активным аналогом енкефалина (Леонова, 1985).

Длительный гидролиз альбумина шшзшшом, трипсином, папаином не приводил к существенному увеличению уровня АПП, однако электрофорез в денатурирующих условиях альбумина и трипсиновых продуктов протеолиза дает 6 полос, отмечается резкое ослабление мондаерной фракции, в неденатурирукщих условиях отмечается только 2 полосы, соответствующие зоне мономера и димера. Можно предположить, что при ограниченном дротеолизе альбумина происходит образование АПП, гидрофобных по своей природе и по. этой причине взаимодействующих с альбумином,, в силу чего их истинный уровень в условиях проведеш»ч гель-фильтрации определить не удается. Альбумин является почти обязательным компонентом биологических жидкостей, поэтому с протеолизом указанного белка следует считаться, кроме того целесообразен поиск физиологически активных пептидов, способных возникать при активации протеолиза и деградации альбумина. Далее, эти эксперименты частично позволили ответить на вопрос о причине дисбаланса меаду протеолизом белков и не столь резким возрастанием АПП, о чем упоминалось ранее.

Иная картина в динамике накопления и количественном содержании АПП отмечалась при исследовании гидролизатов фибриногена. Гидролиз фибриногена плазмином проводили.в течение 70 ч; через I ч инкубации уровень АПП превышал исходный в 1,8 раз, к 24 и 70 ч - в 4,0 и 13,0 раз соответственно; на фоне повышения АПП отмечается снижение концентрации фибриногена. Доказательством существенного вклада продуктов гидролиза фибриногена в пул АПП оказались результаты, получение в опытах по обработке интактной плазмы и сыворотки плазмином.. Оказалось, что и в том,и в другом случае уровень АПП нарастает, но динамика накопления АПП в плазме была более выраженной (к 18 ч инкубации уровень АПП в плазме увеличился в 9-10 раз), а в сыворотке к этому времени менее быстрой (5-6 раз) из-эа отсутствия в ней одного из основных,. быстрогидролиэуемых субстратов плазмина - фибриногена,

Таким образом выяснилось, что обработка чистых белков и цельной плазмы протбинаэами позволяет моделировать процесс образования АПП. Однако в донорской крови при хранении возможна активация ; самых раз,тачных классов протеиназ как плазменных, так и появляющихся в гтлаяме им разрушении клеток, которые гидролизуют саше различиям бедки, к как следствие образование широкого спектра пеп-1Г_

тидов* различающихся по ММ и по физиологическому действию. В этом отношении информативным оказался метод определения "гастоназнсй" активности, позволяющий по характеру гидролиза гистонов судить о классе активируицихся протеиназ (рис.2, 3). По этому показателю четко прослеживаются различия между двумя группами доноров. В первой группе доноров в свежезаготовленной плазме "гистоназная" активность отсутствовала, несколько возрастала к 7 суткам хранения, а к 21 суткам достигала максимума, что проявлялось в практически полном отсутствии гистонозых белков на' электрофореграммах (рис .2). Во второй группе доноров "гистоназная" активность регистрировалась уже в свеже заготовленной крори, достигала максимума к 14 суткам хранения (рис.3). В обоих грушах высокий ингибирущий эффект оказывает ди-изопропилфторфосфат - ингибитор сериновых протеиназ; во второй груше, помимо даизопропилфторфосфата,.- ингибирущий эффект оказывали метабисульфит натрия и п-парахлормеркурийбензоат - ингибиторы тиоловых протеиназ.

Наиболее мощной сериновой протеиназой, ингибируемой диизспро-пилфторфосфатом, является плазмин, относящийся к фибринолнтической системе, В свежезаготсвленной крови доноров первой и второй групп регистрировалось присутствие основных компонентов фибриколитичес-кой системы, за исключением свободного плазмина, однако уровень этих компонентов у доноров второй группы достоверно отличался. Так, уровень плазминогена и активность активаторов оказались в 1,4 и 1,5 раза выше, чем в первой группе (Р<0,001), а. активность антиплазми-нов в 1,2 раза ниже (Р<0,05). В обоих группах к 14 дню хранения отмечалось появление в плазме свободного плазмина, увеличение акти-ваторной активности, снижение антиплазминов. К 21 дню хранения в плазме сохраняется в первой группе 50$, а во второй только 21% пнти-плазштовой активности. С истощением потенциала антиплазминов, воз' можно, связано появление в плазме доноров второй группы уже к 7 дню свободного плазмина и нарастание его активности при дальнейшем хранении. Прослеживается взаимосвязь мезаду активацией систем фибриноли-за и наработкой в плазме хранимой крови АПП.

Ясно, что основным путем накопления АПП может быть активация эндопротеиназ клеток и плазмы, в то время как энзопротеиназы, находящиеся внутри, главным образом, эритроцитов, не способны обеспечить окончательный гидролиз до аминокислот, поскольку пептиды - продукты деградации белков не обладают высокой проницаемостью черпз

151

•••и

Рис.2. Электрофореграммы определения "гистоназной" активности плазмы доноров первой группы при хранении крови. 1,2 -свезсезаготовленная плазма,проинкубированная с суммарными гистонами в течении I и 24 ч; 3,4,5. - 7,14 и 21 дни хранения; 6,7,8,9 - плазма 21 дня хранения с ингибиторами - ЭДТА, ДИ4Ф .БСН.ПХМБ соответственно; 10 - суммарные гистоны (контроль).

1|111 1вИ

3

•••••

Рис • 3.Электрофореграшы определения "гистоназной" активное-, ти пла&мы доноров второй группы при хранении крови, обозначения те же» что и на рис.2.

мембрану, а значит, субстрат и фермент пространственно разграничены* Ярким примером этому положению служит работа (Sldorowloa et al., 1984), в которой показано, что аминопезтидаза Р сохраняет свою активность в течение 21 дня хранения эритроцита. Кчтактиыс эритроциты способны разрушать связь Arg-Pro в брадикинине, однако скорость гидролиза этой связи у- гемолизатов выше в 2600 раз.

.Пространственное разграничение эндо- и экзопротеиназ, вероятно, не является единственной причиной стабильности АЛЛ, которая может быть связана тоже и о функциональной недостаточностью экзопротеиназ, и о их ию.'ибированием ( Boool et al. t 1981).

Предупреждение образования и действия АЛЛ в донорской крови.

. Устранение первичных цричин нарушения соотвеаствтвдих звеньев метаболизма белка является радикальным средством борьбы с нежелательными эффектами АЛГ1 и,мояет быть, одним из путей продления физиологической полноценности цельной крови при её хранении. С этой целью нами было использовано доа возможных подхода - введение ингибиторов лротекназ или мембранопротекторов и удаление из плазш АЛЛ или протеиназ путем сорбции.

В качестве ингибиторов протеолиза использовали эпсилона«шго-капроновую кислоту и её производные - пантетоиламинокапроновую кис-

АЛП, г/л

3,0 2,0 1,0

Рис.4

14 0 7 14 Д:и

хранена

Динамика изменения уровня АЛЛ в крови первой (А) и второй (Б) групп доноров при хранении с сигпбк-торам протеолиза.—-контрольная плазш и в среде, содержащей ЗАКК Г^ЮгЩ. — -НАКК Б.Иг-З«, - хРАСАМ 5»10~^М,—»— контр;шал 200 зд.А/ил.

1 1Ь

к трансгексамовую кислоты, а также контрикал. Введение в консервирующую среду этих соединений резко снижало или полностью блокировало процесс образования ЛПП при хранении крови (рис.4). До 14 суток хранения в опытных сериях, содержащих ингибиторы, уровень АПП сохранялся на значениях, получешшх для свежезаготовленной крови, и недостоверно (Р<0,5) возрастал только к 21 суткам хранения. Наиболее выраженным ингибирующпм действием среда производных эпсилон-аминокапронояой кислоты обладала трансгексамовая кислота, при использовании этого ингибитора в концентрации б^Ю"*4?«!, до конца срока хранения уровень ЛПП сохранялся на исходных значениях. При ис-пользоватш контрикшга в концентрации 200 ед.А/мл полностью инги-бировался протеолиз возможно в силу полифункциональности действия-этого ингибитора. Действие контрикала эффективнее в случаях, где накопление АПП было более выраженным, т.е. во второй группе.

Полное или частичное подавление протеолиза в хранимой крови какется оправданным в случае дальнейшего получения белковых препаратов из донорской крови, что в то же время при использовании цельной крови в клиника вряд ли целесообразно в силу угнетения ряда каскадных физиологических процессов. Достаточно просто,на наш взгляд, осуществимы сорбционные приемы регенерации хранимой крови, позволяющие либо удалять образовавшиеся АПП, либо сами протеиназы, вызывающие их накопление. С этой целью наш. был исследован ряд сорбентов - углеродсодержащие, металлоокисные и полимерные биоспецифические. Оказалось (рис.5), что однократная сорбционная обработка крови. 14-21 суток хранения углеродеодаржащими сорбентами (КАЗ СКН, СКТ) приводила к практически полному удалению фракций ЯШ. В то же время при перманентном хранении не удавалось существенно сни-

0П,

'230

0П230

150,0 100,0 50,0 О

\ VI

Л л л 1 \

/' // // 1 \ 1 \

// у/ л \ V 2

1,2 0,8 0,4

Рис.5.Гель-хроматогра мы плазмы хранимой крови (14 с; тки храпения) д (I) и после (2) сорбции через к лонку о сорбентом КАУ.

1.0

2,0 у\/0

зить теш накопления Ш1 - уже к 7 дню уровень МП возрастал .достигая величин, регистрируемых в контрольных пробах, что можно отнести за счет истощения сорбционной емкости сорбента или экранирования его белками.

Целесообразен поиск сорбентов, специфичных чо отношению к компонентам крови, которые ответственны за ключевые этапы протео-лиза. С этой целью были исоледонаны сорбенты "Овосорб" и "Злигель", назначение которых - удаление из крови и других биологических жидкостей протеолитических ферментов. При обработке свежезаготовлен-ной и хранимой крови сорбентом "Элигель" существенно (в 6-6 раз) снижался фибринолйтический потенциал плазмы крови за счет удаления плазминогена и/или плазшша. Применение "Овосорба" приводило к снижению суммарной эстеразной активности хранимой крови в 4-5 раз. Достоинством этих сорбентов является практически полное отсутствие неспецифической сорбции плазменных белков в отличие от углеродсодеряащих сорбентов, что позволяет рекомендовать эти сорбенты для доочистни белковых препаратов от загрязняющих их примесей протеиназ. Кроме того'отметим, что применение "Элигеля" позволяет получать новый троыболитически активный препарат - плазшь. ноген, а остающаяся после удаления фермента плазма пригодна душ дальнейшего фракционирования.

Таким образом,-на основании проведенных исследований модно заключить, что мероприятия, направленные на ингибирование протёск лиза или удаление продуктов его реакции, позволязт повысить выход б.елков плазмы и качество выпускаемых белковых препаратов. Вместе о тем эффективность и характер этих мероприятий дополнительно свидетельствует о пептидной природе и механизме образевания АЛЛ.

Мембранотропное действие пептидов группы АЛЛ и подбор мембранопротекторов..

Еоть все основания полагать, что песпещфгчооксв дейотвиз АШ! реализуется главным' образом посредством взаимодействия с мембранными структурами; предполагают, что пептида АЛЛ, встраиваясь в мембрану эритроцитов,модифицируют её (Галактионов и др., 1984), Действительно, измерение ионных потоков в суспензии яйт&ктгок эритроцитов, обработанных АЛЛ, указывало ш йзманелие ношмх потоков через мембрану эритроцитов (табл.Я.), примерно й 4,0 ранА снижался коэффициент проницаемости Мембран по отждазппю к йснйм «1.

не обнаруживалось изменений калиевой проницаемости и показателей "К- Ка-помпы".

Таблица 2.

Изменение Р №1, Р^, <1 мембран эритроцитов под действием АШ.полученных из разных источников.

Источник АЛЛ Р^ЮЭсм.с-1 Р^ОЭсм.о"1 <1 Юасм-с~1

. Контроль 1,0 М 3,5

Фракцгл АЛЛ из гидролизата фибриногена 3,7 1,0 5,4

йракция АШ1 из плазмы крови,21 день хранения 2,4 0,9 8,4

Как показали исследования, выполненные нами на клетках К1Ле11а £1вхШз (рис.6), в процессе хранения в плазме крови накапливаются соединения, способные изменять величину потенциала покоя и электрическое сопротивление клеточной мембраны. С большей долей уверенности можно полагать, что на клеточной мембране юДеИе л.ехШв нет специфических рецепторов пептидных продуктов, полученных из плсзмн крови человека, так что вызываемые АЛЛ сдзиги скорее всего связаны о неспоцифичеокой модификацией мембранных структур. На наш взгляд, такое действие пептидных продуктов может явится одним из звеньев синдрома неспецифической адаптации клеточной системы. .

В последнее время ведутся интенсивные поиски соединений - возможных мембранопро^екторов, однако в отношении консервированной крови такие попытки почти не предпринимались. Для оценки перспективности этого направления нами исследовано несколько препаратов, обладающих протективным действием на мембраны, - Милдрснат - синтетический аналог % -бутеробетаипа, разрешенный к клиническому применении; и ряд кремнийорганических соединений типа ИОС 755, 2464, 2271, 2717.

Било исследовано мембранопротзктивиое действие Милдроиата на клерки водоросли К1*эИа 11ах1И8 . Мздронат в интерзале концентраций 1'10~4~ но- вызывал достоверных сдаигов электрических характеристик мс:лбргл^ ли;ь11а 11ех111в , в то время как обра-богча '¡латок АЛЛ сопровождалась падением величины разности электри-

электрические характеристики мембраны

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ КДЫЕЯА

награди

Потони»' покои (¥) ■ зяэктрыческое соппогиивкме^Я,} •У.иВ- ' Д.й«/^

•53

100

50

> л А —■

V.

*

__

О 50 100 150

50 100 150 МИЧ

БЛОК РЕГИСТРАЦИИ

Рис.5. Зависимость сдвигов потенциала покол и электрического сопротивления ) кленах ЫМеИа ПззеШз аод действием АПП, введешда: в инкубационную среду (I - АШ из хранимой крови с 2 - гяцролизатоь фибриногена), стрелками указано введение С ф ) и отмыв ( ф ) клеток. Представлена схема экспериментальной камзры, позволяющей внутриклеточно исоледо-вать электрические характеристики Шее11а ПехЕНа.

чеспого потенциала при практически неизменных стационарных величинах электрического сопротивления клеточной мембраны. Введение Мшг-дро:;ата в среду после обработки АЛЛ нз снимало действие последних, тогда как преинкубация нпе11а гихШа в присутствии Ыилдроната в значительной мере ослабляло действие АШ и восстанавливало величины yiJ4.Ro контрольных значений. Следовательно, Мкддронат об-ладаэт выраженным протектиьным действием. Действительно, его введение в консервирующий раствор в концентрации 5.1СГ4- ЫСГ3},! и последующее хранение крови сопровождалось стабилизацией такого интегрального показателя,как гематокрит, повышением, осмотической устойчивости эритроцитов, замедлением темпа накопления АШ в ранние сроки хранения, т.е. именно в период, когда наблюдается интенсивное разрушение лейкоцитов и тромбоцитов.

Наилучшим протектмвным действием среди изученных кремнийорга-кических соединений обладали ИОС 755 и 2271 в концентрации б'НГ^И. Однако, с 14 суток отмечалось некоторое увеличение уровня АШ и по-вишелпе протеолитической активности плазмы, мембранопротективное действие этих соединений, судя по кривым осмотического гемолиза,было меньшим, чем Миадроната.

В сьете получении:: данных представляется перспективным ¡экспериментальный отбор препаратов подобного рода не только с целью продления сроков хранения донорской крови, но и для предупреждения неспецифического повреждения мембран при критических состояниях.

Присущая как АШ, так и синтетическим пептидам мзмбранопов-■ реждастцая активность имеет важное значение для химиков и фармакологов, занимающихся созданием новых пептидных препаратор, а именно, необходимость учитывать неопецифичэские маскирующие мембранные эффекты при испытании биологической активности. В этой связи при использовании экспериментальных тест-систем в первую очередь необходимо выяснить, с чем связано, фармакологическое действие сое-дгаенлй, - со спещфическнм рецепторшм взаимодействием либо с леспецдфическш мембрапотрошнш действием.

В и В О Д и

I. В исследоЕамаых бчолох'ячееких екдкостдх (кровь, лимфа, лкк-вор) и гсслогегетз:: ткш;сй человека л гшвотных в но/яле методом Гйл1~с[глъ?рацкп устинодлепо соотношение трех основных фракций: зы~ еекг.мол'куллрлая (белки), орзддемолекулярная (пептидные продукты) к н::зкомсле::улярпея (конечные продукты белкового метаболизма). При-

сутствие пептидных продуктов в исходных образцах биологических жидкостей незначительно (до 0,55? относительно содертанга белка) и существенно отличается от состава фракци.1 гомогенатов тканой.

2. Хранение донорской крови сопровождается повыселием иротоолл-тической активностч плаз-ли. Следствием этой активации является повышение концентрации активных пептидных продуктов в 4-6 раз к 21 суткам хранения по сравнению с исходной, свекезаготовленной кровью и сникение концентрации плазменных белков (главным образом за счет альбумина и фибриногена).

3. Выявлены дао группы доноров с низким (исходной - 0,38+0,01 г/л, к концу срока хранения возрастает до 4 раз) и высоким - 0,Э8т 0,11 г/л, к концу срока хранения возрастает до 6 раз) уровнем и темпом нарастания содержания пептидных продуктов при хранении крови. В последнем случае уровень АПП сопоставим с величинами, полученными для плазмы больных з критических состояниях.

4. Установлены классы протеиназ, преимущественна ответственные за деградации плазменнъпс белков прк хранении крови, - дья первой группы доноров - сериновые протеиназы и, в первую очередь,плазмин; док второй группы - сериновые и тиоловыэ протеиназы.

5. Определены соединения - ингибиторы протеиназ, препятствующие активзцич протеолиза при хранении крови: для первой группы доноров (о низким темпом нарастания АПП) - элоилонаминокапроповая кислота или ей производные, для второй группы (с высоким темпом нарастания АПП) более эффективным оказался белковый ингибитор - контринал.

6. В составе АПП, выделенных из плазмы хранимой крови, гздроли-затов фибриногена, плазмы больных, присутствуют соединения, обладающие неспецифическим мембранотрош ым действием на клеточный мембраны: снижающие осмотическую устойчивость эритроцитов к гипотоническому гемолизу, изменяющие ионные потоки и электродлЗЬфузионние характеристики Н.Не11а ПехШв.

7. Впервые изучено защгтное действие мембранспротекторов на мембраны эритроцитов фармакологического средства Милдролат и новых перспективных кремнийорганических соединений, доказана возможность их использования (!10С 755, 2271) в концентрации 5'10-4М для хранения донорской крови.

8. Для улучшения параметров хранимой донорской крози и получаемых па её оонсво белковых препаратов показана цолэсообразность использования углеоорЗционкых методов обработки с 1.'е.тао удаления ЛГШ

и биоспецифических сорбентов, способных избирательно удалять ин--диьидуальные компоненты плазмы крови, в частности, протеазы, не затрагивая основного белкового спектра.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Орлов М.М., Бычко Г.Н. К вопросу о целесообразности использования фибринолизной крови для получения естественных препаратов тромболпткческого действия//Сб.трудов молодых ученых по гематологии и трансфузиологии. - М. - 1976. - C.I4.

2. Савченко К.}?., Остапенко В.А., Николайчик В.В., Пилотович B.C., Мазур Л.Vi., Бычко Г.Н. Исследование белков и олигопептидов плазмы больных с печеночной и почечной недостаточностью при леч&-нии с помэцьй экстракорпоральной гсмосорбции//Тез.дскл.УП съезда хирургов и lü съезда гематологов БССР. - Минск, 1979. - С.288-289.

3. Николайчлк В.В., Остапенко В.А., Кирковский В.В., Бычко Г.Н. Возможные механизш образования физиологически активных пептидов при синдроме эндогенной интокснкацик//Тез.научн.конф.патофизиологов Лрибалтийсдих ССР и БССР. - Каунас, 1981. - С.138.

4. Николайчик В.В., Бычко Г.Н. Определение протеолитической активности плазш крови и т;саневых экстрактов с помощью электрофореза в П0лиакрила1лиде/А£атериалы U респ.съезда врачей-лаборантов. - Минск, 1981. - С.83.

5. Николайчик В.В., Пилотович B.C., Федулов A.C., Бычко Г.Н. к др., Влияние пептидов на осмотическую устойчивость эритроцитов //Труда Ш Всесоюзи.конф. - Тбилиси, 1982. - C.3S4-3G5.

6. Николайчик В.В., Пилотович B.C., Тукай Н.И., Бычко Г.Н. и др. Оценка терапевтического эффекта эпешюнаминокапроповой кислого и горчокса у болышх с Ш1 по уровню ясптил.се плазмы крози//Дсп, во В1ИИЖ га 3X934 (ред.».Здравоохранение Белоруссии).

7. Бычко Г.Н. Фракционирование СМ плазш на различных носителях//! Рэсп.кокф. Сорбцнонные метода детокепкацта б клинике. --Шщск, 1933. - С. 13.

8. Галакттюнсв С.Г., Юрии В.М., Николайчик В.В., Прохорчик Е.В., Коркепа I.A., гАгхнива Л./.:., Цейтиг В.М., Еычко Г.Н. Песпзцифнчсо-кко ыпмбринотрс-гогие эффекты ол'/гоцептидов//У1 Всссолзн.сто.-ло^иум по хтаи болкоэ ■/< пептидов. - Рига, 1Э83. -- С.232.

9. Нжелсйчкк В.В., i 1аз а г,оь Ю.Л., Б^'жо Г.Н. Акт.чвность эцдо-¡¡сотеллаз плазш при рсг/лшгчдаскх бо.г.езклх//УП ?ссп.съезд тера-пеетоп СССР. - !,hu:c;t, 1984. - С.5Э.

10. Галактионов С.Г., Николайчик В.В., Махнеза 1.М., Цейтин З.М., Леонова В.И., Brno Г.Н. Пептиды группы "средних молекул" - возможные аналоги известных пептидных биорегуляторов/Д1атериалы Л Воесоюэн.конф. - Ташкент, 1984. - С.49-50.

11. Галактионоа С.Г., Михнева Л.1Л., Николайчик В.В., Еиргер B.C., Цейтин В.М., Леонова В.И., Бычко Г.Н, К вопросу о неспецифическсм действии "средних молекул" на аппарат клеточного иммунитета/Димия

и биология иммунорегуляторов. - Рига:3инатне. - 1985. - С.253-264.

12. Бычко Г.Н. Деградация белков плазмы крови при хранении// Тез.дскл.респ.объед.научн.конф. патофизиологов, врачей спортивной мэдчцкны и ЛФК. - 'Линек, 1984. - С. 18-12.

13. ЕЬчко Г.К., Осповат Я.М., Оедулов A.C., Николайчик В.В. и др. Исследование накопления пептидов в биологических жидкостях// Труда ТУ Зсесолзи.межуЕивер.конф. - Тбилиси,1985. - С.122-124.

14.Николайчик В.В., Новиков Ю.И., Основа? Я.М., Бычко Г.Н. и др. Способ получения альбумина. - Авторское свидетельство СССР В 1253003.

15. Забелин H.H., Николайчик В.В., Бычко Г.Н. Изучение антьфиб-ринолиткческой активности никотином- £ -агтнокапроновой кислоты// Тез.докл.1У съезда гематологов и трансфузисыогов БССР. - Минск, 1988. - 0.83-81.

16. Николайчик В.В., Плата H.A., Ахрем A.A., Русанов В.М., Еычко Г.Н. и др. Способ получения альбумина. -» Положительное решение на выдачу эвторокого свидетельства Ä428822I/28-I4/I2I509 от 30.08.88.

17. Пяатэ H.A., Чупов В.В., Николайчик В.В., Валуев Л.И., Маэур Л.И., Кацнельсон Л.А., Никольская В.В., Бычко Г,Н. и др. Способ получения адсорбента для выделения профибринолизича из плазмы крови, - Положительное решение на выдачу авторского свидетельства №4298131/31-05/020543 от 06.09.88.

18. Гришин И.Р., Николайчик В.В., Илвкевич Г.В., Мазур Л.И., Подгайский В.Н., Бычко Г.Н. Ркстракорпоральная гемосорбция - патогенетически обоснованный метод лечения "синдрома включения" после реплантации круглых сегмзктов конечностей с длительными срокали ишемии/Д Ресгт.съезд инеетеэиадогов-реангаатологов. -Зорешиловград. - 1988. - С.352.

2J

19. Бычко Г.Н. Пептида - продукты деградации белков хранимой крови - как .возможные модификаторы трансфузионных свойств//Сб. трудов Клинические и теоретические аспекты трансфузиологш. -Минск, 1989. - С.28-35.

2С. Kikolaiohik V.V.^ Bytehko O.K., 81but T.V., Иаеиг L.I., Pilotovlch T.8. BpeilOD-aminooapronio aold in therapy of protein oataboliem dleoriae//lot Intern. Congr.Therapy with tuaiao&olds and Analogs. - Vienna, 1989. - 7.261-262.

Подписано к печати 7.12.89. AT 13507. Формат 64x84 I/I6. Бумага офсетная. Уч.-изд.л. 1,0. Усл. пвч.л. 1,2. Тираж 150 экз. Заказ 925. Бесплатно

Ротапринт HIIT0 "Гелотройпвука" Госстроя БССР 2Р.0С23, SiHrfCR, Саароборчсорский трект, 15