Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение физико-химических свойств сывороточного альбумина человека при его взаимодействии с глюкозой

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение физико-химических свойств сывороточного альбумина человека при его взаимодействии с глюкозой"

шдашЕшевеш"

ШСИЙТЕ ЙОЮШОНОШИ

На нравах рукоансз

ЧШШЖМ, НАТАШ МТОНОША

Ш 577.112,8242577.114,3.

ИЗШШШ ШЖО-ЯШШШШ. свойств €ШШ»0ТОШОГО

шт&т ш.ошк при его бвжщшШгеш о гакозой

03.00.02 - СЗСфЗЕМ!

АВТОРЕФЕРАТ

дщессрг&щя es ссзсзанаэ уташ! егэвзяз каютдаза йлогога с^зж щр£

ШНСК - ISSO

Работа вннсишеяа в лайореторш бшофштя Msessffsa бшсшш М БССР

Научные руководвзбж ащеш М БССР, деетор ивдещинских

шуке шрофвсеор ОетрсезшШ ®оМ., кащвдде бжшоттаекш: наук,, зазодрщ аабораторадй басфйзшш Окещгро Holl.

. Офзщашше ошшневтш

довжор биолога® шхж наук Ърннцш! I.A. ■ доетор биажоштатх наук ^ренкевич 6.Н.

Бэдаая органЕзацЕШ - Инезагут биофизики АН СССР

Зазщга еогаежтсй "X," Ш&1. в /£?чаеов

на заседднш ешшащзярованнвго еовага Д 006.05.01. но заврзсе доеторошх дасеэргадай но ашташшеет "бйсфЕЗЕка" пра йдетаэухб фйтобасшогаш АН БСШ ( 22ШЗЗ, Мзшек, ул. Ф.Скоравн, 2? ).

С даееертгщшЁ мает© ознахсшгься в бжблзотэко Ннстазука фотобяшшнш Ш Б00Р.

Лвторефзраг разослал * ^ " CP^^jiJL 1990 г.

сакрзкарь стщадвшЕрованнэго ✓ _ /

совета, кшщвдаг бЕоеакгезшшж вцр: -^¿¿¿¿т—

ОБЩАЯ ЖХРШЕРШСШ ?ШШ

Актуальность Сыввротошна аягбугзн эдловока с внсокш сродством связывав« а грансиортпруэ? «акнв эздотешкз датаща, aas'бшшрубщ, жирные кнслотн« гормоны, a тзкда йирвдсаеадь«5Ц|©&-Фа^р некоторые .металлы, и цздый ряд экзогешшх ооэдшеиий. Наряду с традсяоргшш функция?.® белок низе» д другш свойства: обдадаз? эстеразододобкой энзшатнчэшсой активностью относптелшэ шхрзао-пзретов, широфзкатешшватов, вложат е высокой зффзжтнзяосгж хш-роаззовать эфяры жзграж кислот; а такт обладает Еврсксздазонедоб-ной активности) в отношении органических пэрзкпсвй и Е/З^.

Из всех белков плазмы еывороточиай альбумин ямэег ®аиув вн-секуа концентрацию { норядка 50 мг/мв ) а,благодаря свозй увйкаягг» яой структуре, обладаем высокой связававдзй емкостью дош тогжх соединений. В связи с этаи, альбумин ножег вступать в неевзжаачз-скез реакции с сагдда разнообразными лпгандши, в частности, а еа-харает. Такое взаимодействие белка с хдаксзой, происходящее des у частая ферментов, называется нефермэататавнвм гликозааярованкеи. Мояосажарвды с ацяклнчвской структурой молекулы реагирует со свободными аманогрушами-белков» образуя основали® Ша$$а, медленно из-роходящее в кетоаман, а в случае дсхаиззвусгаж вротеанов - в «сайг-ланнэ «удуоресцарующаэ' продукты баш® слезкой щззродНо

В усяошсс гааврмнаешш евскзшйшгасксй модаВшада вив-зоё подвергается ешнокзсяоты а саше •разяз'анэ <$едшк укшуяебза, альбуатш» коллаген» осгзакалнга, фйбравогоа, йзяаа xpyosasma глаза, а гавяэ засудив, шюпрогеввы, дуздэшжаэ азашя, бзувжя аорефярйческах нервоз я сгаяного поз га а гзюгзз друга»« JSssossjes-рованЕе белков эратроцптарнкх шабрен носят врззодать s екзпшзю Я2 sexy честя з нарушив» прошщазмостя.

Кроме щйрглиаскяи сугдостЕзтгоэ зяачжо а усзьгаяла гг$эр~ м?агагавного шздозмлггпсташш бояхов знегт ^вэлхтзнгг-з зсб-тоязрзгог j' _ "* 1->г ' i г б - ^тд т. '

, ,т г-— <>-•? T^rT"Ht*> i Г'* —5

*ч<" i - с t т сг i '-^fj, ' 1 ) 1

" i ! j f i' j * ''t1, '" " * ^tp'- - 4„

■> г - 1 ^

7 ( ^ 6 - • ->

захвачу ш альбушка, фибрина,, яаяопротецдов п теи саышд способствует ях отлозенню на стенках еозудев. ЕшкозшшроБаянэ фибряногена in vivo ксает цравести к накоплена© фжбржна в тканях, нанболзе чаето порававщкхся щш диабете. Все эта е гдэугне последствия eost-транымшонной шдафакащщ белков говорят о необходеяости глубокого лзучзння процессов глшгозшщрованкйр изманавня скех свойств белков, связанных с глкхозой» н исследования белок-белковых взашадаЕетвЕй» вдеднрудаш взешодайзтвЕз цротеанов о реден-торагш in vivo в HOpi© в в условиях гипергликемии»

Üps сахарком ддабэте в плазме крош появляется некоторые нехарактерные для нэа соединена*, а кондэЕтращш других веществ резко повышаются или сншгаотея. Так, у больных наблвдается возраста-те содераашия гехгсоззшна, шаяовой кислоты, фукозы» изменяется содерзшшз трнгашодрцдов, растет количество несвязанных: металжов-Cu, zn, ?е- накапливаются лекарства сулв|анилакядной природа до уровня, намного щювщавдаго обнчный. В связи с этим, определенный янтерее представляет изучение шнтров связывания глюкозы с белкаыа, которые является общэш а даш других штащов, а также изучение нарушим транспортных свойств белков.

Повышение уровня гликозидарованных белков сыворотка очонь хорошо soppejjspjes с Езгдэнашшш в концентрациях глюкозы а лапвдов, происходящими пра ослабленной толерантности к глюкоз© и диабете„ и болеэ выраээно, по даннкн некоторых авторов, чем повынзние глшозп-лцроваяного гемоглобина. Псэтощу, из всех белков крови, наибольшей интерес ддш изучения представляет модифицирование ишкозой белков сыворотки & ее основного белка - альбумина. Изучение свойств гдеко-зслсрованнаго альбушна таада является актуальной задачей для Фезе-ko-xe),sтаской биологш ж молекулярной бпофазвкло

Основной целка работы является нзучзвне физико-ххашташаг. свойств сывороточного альбушна пра ого взашодействиЕ с дшкозой и нссладованао локализавдЕ дшсозо-евязывагарах участков на мшдюио™ лзкулз.

<1сков;п'в аатета исал-елог-ания: - £зу\зн2з фазЕко-хая^саах характерЕсдас аканоглслот, белков пда-п альбумгца ирз их г.овалеенюг: взшзгодэйсгвая с некоЕорыгл

сшщдаш С глакоза, гтхрцдохсаль-З^осФат, адвт-

до^ояис [üczíijtfüüftrji кагозг-ь'лрокцагж ехзтгиакох о

буианом;

- определение тепловой стабильности гликозшшрованного альбумина я его способности к агрегации;

- исследование роли аминогрупп макромолекул в белок-белковых взаимодействиях;

- изучение локализации участков связывания глюкозы на молекуле альбумина;

- разработка оригинального флуоресцентного метода определения гля-козилированных белков;

- определение алтиоксздантных свойств неформентативяо гликозилироЕанного альбумина.

Научная новизна.. Установлено, что УФ-спектры поглощения шса-козилированного альбумина достаточно хорошо могут быть представлены суммой спектров поглощения исходного мономерного альбумина и гликозилированного лизина» Флуоресцентными исследованиями титрования раствора альбумина аминокислотами, связанными с моносахаридом, показало образование основания ВДда между белком и глакозилирован-ной ашнокислотоя. Взаимодействие гликозилированного альбумина со свободны/и аминокислотами приходит к образованию белок-дигандиых комплексов и усилению мзкрогетерогенности макромолекул.

С помощью методов УФ-слектроскошш, флуоресценции, кругового дихроизма показана возможность взаимодействия глюкозы с сывороточным альбумином по участкам, связывающим шридоксаль-б'-фосфат, билирубин. Даняь'э триптофановой флуоресценции, 311Р-спектроскопии, а также измерение степеш поляризации флуоресценции лиганда, коваяент-но связанного с альбумином, позволили установить, что моносахарид взаимодействует с бежал по Лиз-1 и Лпз-ЗШ.

Впервые показана роль аминогрупп остатков лизина альбумина в белок-белковых взаимодействиях. Изучена устойчивость протеина к агрегации яря нагревании в зависимости от рН и ионной силы. Установлено повышение устойчивости глнкозилированного и алкилированного альбумина % агрегации, Показано, что гликсзиларование белка приводи® к уузннмшш, а модификация его ацеталвдегидом и, в меньшей Степана,, ШфВДШсаль-5'-$ос5'атом к усиления иегшлокулярншс взаимодействуй. Установлено пзгяонокиэ антноксндантных свойств альбумина при гллкозадсровзяии.

Пр.чкт-чскчя тштоотъ работа. В ходе исследований разработан кзход определения глшсозшшроЕашшх белков плазиы с пю'ощл флуоре-

сцентной спектроскопии ( авторское свидетельство Jé 1465766 ), этим методом определены глжозилнрОЕакныа белки у 120 больных. Благодаря кзучзщш антиоксидантных свойств альбумина, предложен новый флуоресцентный способ (подана заявка на изобретение ), отлича»-щайся высокой специфичность® по сравнений с известными методами, определения эффективности проведенной гомосорбцал у больных с хро-ничзскоИ ивченочно-почечнок недостаточностью, сепсисом, сахарным диабетом. Эффективность проведенной гемосгрбцяи исследована у 48 большие. Оба метода внедрены з работу областного экдокринологичэ-ского диспансера и реанимационного отделения областной больницы г. фодно.

Результата исследований по уменьшению взаимодействия глекс-зилированного альбумина с пнредогссаль-йЦ'осиагс^, билирубином, лир-шйз кислотами, ионами мэди, а также данные об изменений транспорт' низе и (¿доико-химических свойств гликозилированиого альбумина могут асЕользоваться в медицинской фармакологии и экспериментальной биологии.

Апробация работа. Основные результаты исследований долашны м обсуадвнн на;

- 34 интернационально« конгрессе по алкоголизму, Канада, 1985 г;

- 8 обьоДо симпозиуме биохим. обвдетв CCCP-IJP, Рига, 1985 г;

- 5 Всесоюзна« биохимическом съезде, Москва, 1986 г;

- 8 Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов, Тбилиси, 1S37 г;

- 6 конференции по спектроскопии биополимеров, Харьков, 1S88 р;

-- интернациональном симпозиуме "Молекулярная организация биолога-ческих структур", Москва, 1989;

- заседаниях лабораторий Института биохимии АН БССР, Гродно, 1SS5, 193?» 1989 г.г.

Публикации. По тема диссертации опубликовано 5 статей, тезисы 7 докладов и получено авторское свидетельство на изобретение.

Рбгем работы. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и содержат 6 схем, 3 таблицу, 42 рисунка. -спесок да-хорагурн вжлшает 254 наименования, из них 21о на иностранных языкг

¡ЖЕРИШ И МЕТОдИ ИССЛЕДОВАНИЙ ß рабохо испояхзоЕалд препараты коммерческого сызороготлого тбумпна таяовека Фарш " fteanal " ( Вонгрн:; ') <. Об'гзгараьикг.о белка проводили по методу Чэка ( Caen , 193? ). Шкоизрауа фраздиз

— э -

альбушгаа подучалз. телт4шшгрангбй на ксложе с ТзКЧ1'»'/-=б5~геже:я.

Применяли реактивы: щрздоксаль-5Цюофаг фярглн ш НеапвХ " ( Венгрия ), билирубин - Signa я ( CEI )„ аминокислоты Сирии " Serva м { ФРГ ), остальные реактивы отечественного производства классификации " И " s " ОСЧ w.

Гликозилированный альбумин получали инкубацией бежа е 2 M глюкозой при 3?°С в течение 1-20 суток. Для предотвращения загрязнения белковых проб микрофлорой образцы пропускали через мамбраянш аальтры для задержания микрооргаиизмов л Сыниор-7 " { ЧССР ) и э эксперименте использовали стерильную посуду е притертая пробкаш. ГлихозилироБаннуп фракцию альбумина отделяла от яеглижозилзровашоЗ гелвфильтракиеи на колонке е КМ-й&ялшозой. Количество связанной глгаозы определяли колориметрическим методам с использованием яяо-барбитуровой кислоты С Guthrow , 1979 ) и флуоресцентным методом с использованием шрадоксашна.

Исследование белок-лигацдных и белок-белковых взаимодействий проводили g помощью методов; УФ-сшктрофотоштрии, флуоресценция» ЭПР-спектроскопии,, аминокислотного анализа, кругового дихроизма.

Спектры поглощения снимали на спектрофотометре я Specord M4Q" Í IIP ), спектры флуоресценции - па спемрофяуориметра " Ая.inco -вошап * ( США ) , поляризации флуоресцешш измеряли на сттарст-•гре ОдЛ-1 С СССР ). Аминокислотный анализ проводили на автоматическом анализаторе ■аманокдпло? Т-339 С TSGP ), используя шггзгратор Ci -100 С г£СР ) лял обсчета адаионннх пиков. Радкоатавяоехь проб определяли на счетчика Мапг-2 " í CULI ), используя дяокеановнй сцинтиллятор. ипектры кругового дихроизма записывали на спс-ктрсяо-ляриметре " Jasco -20 " { Япония }. Регистрация спектров ЭПР проводили на радиоспектрометра SPs-áaa ( ХДР ), работящему э Х-даапазо-не С 9,27 - 9,47 Год ). Для проведения электрофореза использовали аппарат для вертикального гель-электрофореза фирмы " Хлйу-Калур а ( СССР 5, оптические плотности белковнх полос прописывали с яеаго'дъэ денситометра ifc-lOO ( IUP ). Прогревание образцов бзлка в хеотара-турном градиенте от 30 до S0°C осуществляя о помощко хиввтадераа-теля с регулированием .'темяерагуры к снекгрофотоиэору " Specord ~ М40 скорость прогрева равнялась 2°оДшя.

рейульшн и их сбкздеиив

^азшсо-аЕшшасдке свойзтва'гликоз;штроваи?гнх аашожпйяоу. g

снвспототюго адьбтютка *ж?ловека»

Для изучения микроокружения связанной глюкозы на молекуле белка были проведены исследования гликозилирования аминокислот различных классов. Наиболее эффективно с глюкозой взаимодействуют аминокислоты с положительно заряженными а-группами: гистидин, лизин и несколько меньше аргинин, а тагае некоторые аминокислоты с незаряженными п-группами или разветвленной цепью: цистеин, щетин, изолей-шн, глуташн, валин. Практически не взаимодействуют с глюкозой при нейтральных значениях рН аланин а пролин. Взиоятно, для реакции гликозилирования, идущей в несколько стадий, на этапе внутримолекулярной перегруппировки Амддори имеет существенное значение наличие у ¿¿линокислоты п-группн, несущей при нейтральных значениях рН суммар-ыыи положительный заряд - это имдцазольяая, гуанидиноЕая и аминогруппа. Исходя из этого, было сделано предположение, что гликозили-роьанию в белках, в первую очередь, будут подвергаться те лизиновые остатки, которые соседствуют в паяйпептидной цепи с остатками гис-твдина, лизана, аргинина, цистина или сближены с этими остатками за счет особенностей третичной структуры макромолекулы.

Взаимодействие аминокислот с моносахаридами значительно зависит от рН среда инкубаши, полностью протонированнне аминокислоты практически не связываются с глюкозой. Б районе значений рН 6,0, когда начинается депротонирование нН^-группы, по данным аминокислотного анализа, наблюдается уменьшение свободных аминогрупп лизиновых остатков и возрастание числа модифицированных глюкозой аминогрупп, резко увеличивающееся в щелочной области.

Аминокислоты, ке обладателе способностью поглощать свет, после взаимодействия с глюкозой приобретают хромофорные ( рис. 1, В, кривая 2 ) и флуоресцентные свойства.

314ектиЕность взаимодействия глюкозы с альбумином зависит от концентраций белка и моносахарида, ионной силы и значения рН растворов, температуры и времени инкубации лигацда с белком. Истинная константа скорости формирования кетоамина, образовавшегося в резуль-таи протекания перегруппировки Амадори, равна 8,7-101 М~2 ч"1. Гликозилироьание протеина сопровождается ростом поглощения в районе ¿33-2^0 нм, а такие, в более дальней области - 320-3-10 нм ( рис. 1,А) Таквю спектральные измерения показали, что изменение одической плотности гликозидироваиного альбумина человека моано удовлетворительно представить простой суммой поглощения мономера альбушна и гликози-лированного лизина ( рис. 1, Б ).

fue. 1. А. Спектры поглощения глЕкоззшгровашого моксмера ачгбунина. Бремя инкубации белка о глюкозой: 1~ 0S 2- 3 сут, 3- 7 сут, 4- 15 сут, 5- 20 оут. Исходные концентрации: альбумина- 1Q"4 М, гдшозы-2 М. Б. Спектры поглощения мономера алвбушна в присутствии различных концентраций гликозшшрованного лизина, Исходные концентрации: лизи::-л- 5-Ю"2 М, гллкозы- 2 М, время инкубации оря 37°С- 7 сут. Хо-нечнке концентрация лизина: 1- 0, 2- 4,5-1С"4 М, 3- 1,33'КГ3 М, 4-

i,I, 5- 4,5'10~3 М. Концентрация альбумина- 2,1*10 '3 И. В. Спектры поглощения: 1- исходного «онсгжра белка, 2- глпкезплпро-ванного лизина, концентрацией 4,5' Ю-3 М, 3- сугала спектров 12 2, 4- спектр сеса альбумина и глшеозилированного лизина (2). 5- гхзо-заларовшшого белка, время инкубации с глюкозой - 23 сут.

Глшсозвдарованка сывороточного алъбушна сопровождает ел яушэ-нкем триптофаноЕСи флуоресценции я ростом флуоресценции в области 410-420 ш.! t рис. 2 ).

'злусросвдяезя е сбласта 410-420 ш сбуслоаэзга сбразсваязем

РиСо 2г. Спектры флуоресценции глЕксяшгароьашюго аль-бумзна,, А. '^ВОз(5 = 2SQ на.

^луорбсдирущих. продуктов взш-лодеиствая альбумина с глюкозой бола« слонноа химической структуры всладстаио протекатш меа- к вяутрямо-двкулярных перегруппировок. Тундняе триптоссанозой флуоресценции альбумина макет быть результатом образования основания Ша44'а меяду глюкоз оá и аминогруппой макромолекулы, так как алвдшинная связь oí ладает довольно высокой акцепторной способностью. Также тушение со; стьенной флуоресценции белка мскег быть шзьано миграцией. энергии < триптофана на образовавшаяся при гликозилвррвании хромофор, добавление боргидрзда натрия к гликозилированаому альбумину уменьшает tj шние собственной (флуоресценции в белке с высокой степенью гликози-лирования. При небольших сроках инкубации глюкозы с протеином i.'aüi, полностью снимает адаеят тушения триптофачовои флуоресценции. Необходимо также отметить, что сеой вклад в тушение вносит также и карбонильная группа кетоамианого продукта, способная восстанавливать^« наЕН^ до соответствующего амяноспирта»

Взаимодействие сывороточного альбумина с моносахаридом существенно зависит от рН среды инкубации. Aase в диапазоне нейтральны? значении увеличение рН на 0,2 приводит к усилению гликозилирования и быстрому изменению флуоресцентных свойств бзлка С рис. 3 ). Вероятно, щелочной сдвиг рК крови ln vivo в пределах 0,1-0,2 при некоторых патологиях, например, алкалозе, может привести к усилению неФерментативного гликозилирования белков.,

Рис. 3. Спектры флуоресценции гликозилированного альбумина, i лученные при различных рН средь инкубации. А. АЕОЗ(5 = 2SS шл. 1- негликозилированный белок, * 6- гликозинированный, рН: 2-6,3 3- 6,88 , 4- 8,30, 5- 9,03, 69,48. Б. \оз6ф « 330 ям. 1- не гликсзилироваышй белок, 2-11 -гликозилароваяный, рН: 2- 2,48, 3- 3,42, 4- 4,24 , 5- 4,85 , 6- 5,45 , 7- 6,15 , 8- 6,64 , 9- 6,88, 107,208 11- 7,57. Исходные концентрации: альбумина- 10*^, гдукгак-2Л.

Электрофорез, проведенный в полиакридашднш геле показал, ш лимвддрощцный газзхозой альбумин пркобрзтазт болыцуа ьлектрофорем чэезуЕ подашюегъ, что вероятнее всего свидетельствует об уваяичз-ísle общого отрицательного заряда. белка и приводи* к мшфогетероген-

юти макромолекул. Мри взаимодействия альбумина с глюкозой изменя-:сл значение из о э лек три чэ ск ой тост, Глшсозилировадаэ белка еопро-здается уменьшением тепловой стабильности к уменьшением энталь-ш денатурации. Калориметрические кривые плавленая лягаадзроваяного юкозой сывороточного альбумина» как обезжиренного„ так ж яеобез» фанного» схожи меяду собой и приближаются к кривой плавления обваренного исходного альбумина.

Возрастание кякрогзтео oraкностя глтсозядтюванного альбумина при его взаимодействии с аминокислотами. Взэжжвкйтшэ„гли= козилиоованншс амИНОКИСЛОТ с альбумином. Нефврментативно гликозилированяый альбумин взаимодействует с минокислотами с образованием стабильных комплексов, приводящих к озрастаншо микрогетерогенности бежа. Аминокислоты включаются в остав макромолекул пропорционально степени лигавдирования альбуми-:а глюкозой. После разделения протеина, предварительно проинкубиро-'энного с глюкозой, на связанный и нвсвязанннй с моносахаридом, бы-:о'показанос что аминокислота взаимодействует только с гликозилиро-(анньм альбушшом, образуя стабильные аддукты.

Электрофорез в полнакридашдном геле показал, что избыток, ама-[скчслоты, добавленный к гликозилированшэду альбумину и проанкубя-юванный s ним, вызывает увеличение электредорвтачесгсой пожЕнакоетк 1елка. Причем, сдвиг белковой полосы возрастает с увеличением отв-№ня гликозшшрования протеина ( рас. 4 ). Это свздатзльствуа« об 'ваизчении общего отрицательного заряда белковой молекулы за счет шзочэния в состав глщсозшагрованного альбушша аминокислота я уве-шчешш микрогетерогенности макромолекул.

Рас. 4. Оптические шютностз белковых полос,, полученных при аяэктрофорезе в пояиакрилаотдном геле? i- .исходного монет,'.оркого альбумина; 2- исходного альбумина, проинкубированного с аминокислотой; 3,4,4* - гликозилированно-го альбумяна ( время инкубации с глюкозой; 3- а сут, 4,4* - 11 сут ). К белконш пробам 2,3,4 был добавлен гз-бытс.ч аминокислоты л проинкубирован GS ч при 37°0. йслодлке концентрация: альбумина- 6'lQ"4 М, ггзхсозц- 2 1!, взлана- 6 •10~¿ М.

Í.0

tira«.)

Глнкозилщюванные аминокислота также взаямодейст^ют с натнв-ным альбумином с образованием обратимого основания Шиффа, что тоае может приводить к усилению белковой неоднородности. Факт образования таких комплексов был доказан по включению глшсозилированных аминокислот в состав белковой молекулы только после обработки проб RaBH^. Эти результаты были подтверадеда исследованиями по тушению триптофа-ноьо!' '¿луоресденции мономера альбушна гликозилированныш аминокис-лоташ ( рис. 5 ). Графики Штерна-Фольаера тушения флуоресценции белка имеют излом, а кажущаяся константа Штерна-Фольмера имеет два значения. Досле обработка гликозилированной аминокислоты боргадридом натрия, приводящей к восстановлению карбонильной группы, излом исчезает, а угол наклона пряшх уменьшается. Эти данные свидетельствуйте что тушение собственной флуоресценции белка .протекает как по динамическому, так и по статическому механизму. Статический механизм туиз-ния вдуоресшндаи триптофана, вероятно, обусловлен образованием основания Шифра между альбумином и гликозилированноь. аминокислотой. Из рис. 5 видно, что наиболее аффективно тушат ариптофановую флуоресценцию белка гликозшшрованные основные аминокислоты- лизин, гистидин и аргинин, вероятно, за счет присутствия в тушащей смеси большей концентрации кетоаминного продукта, способного связываться с альбумином.

-Рис. 5. Графики Штерна-Фольыера тушения флуоресценции альбушна глшсозилированнши аминокислотами: 1- алананом, 2- валино^, 3-глугаминси, 4- аршнияом, 5- лизином, 5- лизином + каШ4, 6-гиствдинси, 6- гастидином .

Исходные концентрации: аминокислот- 5'10~2 М, глшозн- 2 М, врат инкубации- 7 сут при 37°С, рН среды - 6,2 - 6,7.

При высоких значениях рН все аминокислоты эффективно гликозе-днрувтся независимо от принадлежности их к отделенному классу. Яо-этсцу добавление к сывороточному альбущну скзси, проинкубированной при различных значаниях рй и содерааЬэЙ глюкозу, аминокислоту и гле-козшщрованную аминокислоту, вазываат тушение собствешой флуоресценции бедка пропоршонаашо концентрации гликозилированной аминокислоты. При перзходо из нейтральной к сзлочной срзда инкубации доля

- il

гликозаяированных аминокислот в смеси увеличивается в яесколысо раз, что сопровождается возрастанием кажущихся констант Штерка-Фолшера тушения альбумина гликозилировашшш аминокислотами ( табл, 1 ).

Таблица 1.

Кажущиеся константы Щтерна-Фслшера тушенья мономера альбумина гликозилированными аминокислотами, полученными при различных значениях pH среды инкубации.

Г И С т и дин ВАЛ :ин Л S ЙЦ И H

ра ! К» М"1 S pH 1 к, гГ1 ? pH s к, м"^

2,00 ! 36 » 2,10 s 12 Î i,so ! 30

5,35 ! 90 ! 3,90 ! 25 ! 3,60 ! 155

7,00 ! 160 ! 6,21 ! 48 S 9,85 ! 350

8,62 ! 240 ! 8,30 » 150 i 11,22 ! 4000

10,79 ! 2300 ! 11Д1 ! 3500 ! - -

инкубации при 37°С - 3 суг.

Однако, это происходит ш разному для различных классов аминокислот и не всегда коррелирует с кривой депрот'оназавдв Л-Ш^-грушш аминокислот. Это также подтверждает вняв еде данный вывод о влиянии боковых групп аминокислот на скорость гагакозшшровання.

Факт снаавная уровня болышяства а»акомслот при нагрузко глюкозой и гяпергликемия ( March o.sîni , 1987; Wahren , 1976 5 мсгет быть обусловлен наряду с усилением выведения модифицированных шз-козок аминокислот { Brownie© » 1Э80 ) и другими факторами также затрудненным определением аминокислот с помощью шшгцдринового метода вследствие их гдакозшшровекяя и образования комплексов с белкаш. Кроме того, взаимодействие гликозиларованных белков с аыйнокясяотгми ми альбумина с гдикозалкрованными аминокислотами нсает быть одной из причин возрастания мнкрогетерогенностн белка при патологиях С Троицкий, 1S8S; Cárcel , 1SB7 ).

Локализация глшозо-связыватощих участков .на молекуле сывороточного альбумина человека.

Известно, что молекула сывороточного альбумина чздовека in vivo имеет множественные участки связывания гдкжсзн ( iberg , 1S86 ). Исследования, описанные ранее, показывают, что наиболее эффективно in vitro с игасозой взаимодействуют основные аминокислоты

и вдстин. Эти результаты подтверждают роль обобщенного кислотно-ос новкого катализа в реакциях неферментативного гликозшшрования.

Некоторые гдюкозо-связывавдие участки на молекуле альбумина бшш локализованы с помощью ряда биофизических методов и метода ко курвятных взаимоотношении моносахарида с лигандами, у которых уже известны места связывания в различных участках макромолекулы.

Данные по тушению триптофановои Флуоресценции гликозилирован ного альбумина позволяют предположить, что один из основных центро связывания глюкозы должен быть пространственно близок к триптофану А результаты уменьшения гликозилирования белка в присутствии Еита-мера и уменьшение взаимодействия с гликозилированным альбумина пиридоксаль-и-й'ос^'ата, имеющего два сильных центра связывания на б лке, позволяют сделать вывод, что это может быть Лиз-199 или Лиз-2 или оба остатка шесте.

Факт вытеснения длинноцепочечных жирных кислот с мест сбязыв ния на альбумине при гликозилироьании ( вшш , 1S81 ), а такае да ныв об уменьшении степени модификации белка глюкозой в присутствии жирных кислот» говорят об общности некоторых участков связывания, частности» Лиз-525.

Гликозиларованный альбумин обладает меньшим сродством к били рубину. Пигмент взаимодействует с исходным белком, как известно, и одному сильномуо а также по независимому центру с более низким сро, ством { Jacobsen , 1972-1976 г.г. >. В состав сильного центра свя зывания входит Лиз-240. В спектрах поглощения эквнмолярноп смеси и тивного альбумина с билирубином наблюдается, в основном, только по лоса поглощения, принадлежащая связанному с белком лигацду. В спек тре поглощения раствора билирубина с гликозилированным альбуминам регистрируется полоса поглощения билирубина, связанного протеином меньшим сродством. Эта полоса возрастает с увеличением количества глшозы, ковалентно связанной с белком. Эффективная константа сьяз: вания билирубина лигавдироъанным моносахаридом альбумином- 10® в то время как для нативного- 108 МВ спектрах кругового дихро изма смесь билирубина с исходным, немодифиыированныи альбумином об ладаат положительной полосой.. вращения при 452 нм и отрицательной п лосой с максимумом при 410 нм. Гликозилироваше альбумина приводи! к уменьшению интенсивности паюс вращения билирубина, вплоть до их исчезновения н смены знака вращения ( рис. 6 ).

Приведенные данные свидетельствуют о существенной наруиении

сильносвязывашего тантра билирубина на молекуле белка. Поскольку в состав билирубин-связывающего центра еходит Лнз-240, мояно предположить, что Диз-240 является одним из участков взаимодействия глюкозы на макромолекуле.

йшкозилирование альбумина приводит к уменьшении взаимодействия ионов Си(И) с белком, что легко фиксируется ЭПР-методом, Симметрия электронного поля окружения иона меда изменяется от ромбической до аксиальной в зависимости от времени инкубации белка с моносахаридом. Альбумин с высокой степенью гликозилнрования не взаимодействует с ионами меди, что можно наблюдать по уменьшению и полному исчезновению ^-составляющей ЭПР-спектра лигандированного белка в присутствии меди, и, одновременно, появляется сигнал, характерный для свободных ионов меди в воде ( рас. 7 ).

3030 зёо 5ш

Так как связывание коноз Си^" с альбумином осуществляется при участга первых аминокислотных остаожоз полшхептадной цепн, то, вероятно, можно говорить о нарушении центра СЕязнваная меди модификацией одной аз аминогрупп: либо аминогруппы аспарапшовой кислоты, либо е-аминогруппы Лаз-4, либо сбенх ашшогруш» Хрома того,, аз в« с: -

250 5о0 Ш Й5 И»!

?ис. 6. ад-спектры комплекса билирубина с исходным (1) и гликозилиро-ваннш С2,3) альбумином при рН 7,5. Время инкубация альбумина с глюкозой 4 (2) и 8 (3) сут. Концентрации; белка и билирубина в растворе равны 4-1СГ5 М.

но, что в присутствии ионов вдв усиливается связывание шридоксаль» 5'~фосфата с альбумином по Лиз-4 ( Степуро, 1985 ), а анализ спектров кругового дихроизма показал, что гликозилированный альбумин в присутствий эквшоляряых концентраций ионов меда и витамера Е^ с меньшим сродством взаимодействует с шридоксаль-5-Фосфатом. Близость к Лиз-4 положительно заряженного остатка ГИс-3 говорит о вероятно« сти йджезшшрования именно этого остатка лизина, а модификация глюкозой ¿-аминогруппы Асц-10 до данный литературы, считается доказанной,

Расстояние в молекуле тъйугет от Трп-214 до Лиз-4 было рассчитано по тушению триотофановоЁ фяуорасценади бедка, модифицированного пиридоксаль-э-фосфатом в присутствии ионов меди. Это расстояние Трп-214 - Лиз-4 оказалось равным 14 А. Такге' были измерены спектры поляризации флуоресценции шридсжсаль-э'-фосфата, связанного с белком по Лиз-4. Степень поляризации флуоресценции хромофора при этом была равна 0,048-0,050. Такое низкое значение степени поляризации флуоресценции хромофора, локализованного в самом начале полипеп-тэдной цеш, свидетельствует о высокой подвижности н-концевого участка белковой молекулы. Исходя из всех представленных данных по флуоресценции, можно предположить, что за эффективное тушение собственной флуоресценции белка при его взаимодействии с глюкозой может быть ответственно не только лигандировакие альбумина по ¿-аминогруппам Лиз-199 и Лиз-240, но и Лиз-4 или ¿-^-группе Асп-1.

Суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод об участии по крайней мере 5 аминогрупп в связывании глюкозы: Лиз-4, Лиз-199, Лиз-240„ Дез-525 в «¿-аминогруппы Асп-1.

Креме того» показано существенное уменьшение взаимодействия лигандированного глшозой альбумина с пиридоксаль-б'-фосфатда, жирными кислотами, билирубином, ионами меди, а также снижение степени гликозалирования белка в присутствии бикарбонат-ионов. Это может свидетельствовать о нарушении транспортных свойств гликозилирован-ного альбумина в отношении этих лигевдов.

Изменение антиоксядантннх свойств сывороточного альбумина поп |шкозаш?ова|НйД.

В последние годы возможность существования антиоксидантных свойств у адьбушяа об су вдается многими исследователями. Сывороточный аиьбушн способен активно разрушать органические перекиси и НзО^образовавшася в результате цеш реакций ( Р1г1в1по 9 1988 ). Кроме того, связывал сокы мзда, которые в свободном состояния в при-

сутствии пэрекйсных соединений являются инициаторами нерекисного окисления липвдоб в организме» белок предохраняет мембраны» белки а компоненты клеток от повреждающего действия свободных радикалов. ( Hailiweli , 1988 ). Известно, что разрушение белковой молекулы, вызванное совместным действием Си^ ж H^g» легко фиксируется по изменению спектров триптофановой флуоресценции протеина. С целью изучения антиоксидантных свойств белков плазмы были исследованы флуоресцентные характеристики плазмы здоровых доноровв больных сахарным диабетом, сепсисом и больных с хроническом печеночно-почечной. недостаточностью ( ХППН ). Флуоресцентные исследования показала, что при 800-1600-кратнык избытках перекиси Бодорода по отношению к белкам в присутствии 5-кратного избытка СизО^ существенной деструкции белков плазмы здоровых доноров не наблюдается. В экспериментах, проведенных с плазмой больных сахарным диабетом, сепсисом и ХППН при тех же избытках реагентов, бьшо зафиксировало существенное тушение гриптофановои флуоресценция и образование продуктов, флуоресцирующих в области 410-420 нм при Л^з _ s 330 нм ( рис. 8 ).

i>s.cl 8. Влияние совместного действия 20 ионов меди и на флуоресцентные

свойства белков плазмы. Спектры флуоресценции: исходной гаазш больного сепсисом (1) и здорового (2) доноров; плазмы после обработки 800- кратным избытком HgOg я 5-кратным избытком CuS04 и пояучасоЕой инкубации при 37° С 1- больного, 2- здорового ). Концентрация белков- 6,6'Ю-4 М, .XBO36>330hm

360 ~ 500 Ш Ж л.к*

Можно предположить, что альбумин, связывая по началу цепи, иола кода, становится подобным медь-содержащим пероксидазам и способ-зтвует эффективному разрушению перекиса водорода без образования звободных радикалов* Если же центр связывания меди нарушен иодифи-сацией его каким-либо лигандом, в частности глюкозой, то может наблюдаться уменьшение взаимодействия ионов меди с белком. Это, в сесю эчэредь, мокет привести к возрастанию количества свободных ионов меи. Действительно, некоторыми авторами было зафиксировано повышение юнцентрадии ионов меди и некоторых других металлов в крова больных сахарным диабетом ( SJorgen , 1985, Fayek , 1985 ).

Известно, что сывороточный альбумин человека полностью подав-

дяет гемолиз эритроцитов, вызванный совместиш действием ионов мзде и аскорбатагт { Lo vetad , 1S34 ). Евдкозидврованннй альбумин, в отличие от натжвного, оказывает значительно менее выраженный стабилизирующий эффект против разрушения эритродатарной мембраны. Причем , уменьшение антдокисщтельного действия альбумина прямо цропор-шонально степени лшгандаровашя белка глюкозой. Вероятно, нативнын альбумин, взаимодействуя с ионами меда, прерывает цепь радикальных реакций, ведущих в конечном итоге к гемолизу эритроцитов, а гликози-лирование белка сниЕает его антиокислитальную активность.

Факты образования флуоресцирующих продуктов после обработки цяазмы избытками CusO^ и H^Og у больннх сепсисом и сахарным диабетом, а также уменьшение етабмизжрувдего аффекта гликозшшрованиого альбумина против гемолиза эритроцитов, вызванного совместным действием ионов меда и аскорбата, говорят об изменении антЕОксидантных свойств альбумина.

Белок-белковые взаимодействия и устойчивость глгосозилирован-кого альбумина к агрегации при нагревании. Исследования процессов белковой агрегации показали, что в за-кискжюти от температуры.инкубации в растворе исходного нативного альбуыана возрастает доля белков с высоким молекулярным весом, а содерзание мономера снижается. Агрегация начинается лря температуре 6?-68°С, а прогревание протеина при 74-75°С приводит к существовали» а растворе только полимеризовавшегося белка ( рис. 9,кривая i ).

Рис. 9. Образование агрегированной Форш из ыономернок фракгта сывороточного альбумина (1) к гликозилдрованного альбушна, п = 2,1 (2), после прогревания в течение 30 мин при различных температурах. Концентрация белка- 6-10"4 tí.

5=1 60 70 ЙГ Т.Т

Образование агрегатов усаливается при увеличении ионной силы раствора ( рзс. 10 ) в добавлении спиртов а мочевины. УмонЬЕзние ионной салы ишеу балконных растворов, лзгандарованно альбушна альдегидами приводят к умоншлши белок-белковых взаимодействий а к повкшэшш усзкгёчагосм протеина к агрогашд пра аахравакси { рис. 10 ).

Стабильность сывороточного шабуюка к агрзгаанн лрк всарова-

fbe

м>

ют возрастав* посла ковалекгного вкдзченая гаккозя в состав белка.

Гас. 10. Изйзвоего опгапвской плотности альбумзпй прз ярогр&за-нни от 30 до 30°С в присутствия: натрий-фосфатного буфера, pH 6,9, концентрацией- 0,Со М (1), 0,014 (4), 0,0025 М (5), 0,25 М (5); гл-ридскса/гь-бЦьосфата (3). Прогревание гликогилироваяного альбуггл--на, .время инкубации белка с елзэков ой 7 сут (2). Концентрации в растворе: альбумина- Ю~%!> пиря-

30

5Ü

70

1ОГС

доксаль-о-фосфата- 2'10""%. Скорость прогрева 2°СЛан.

Ш

Так, альбумин, связавший не менее 2 молекул глюкозы, не образует агрегатов вплоть до 80^ ( рис. S ), а его кривая тегеюпоглощешя совпадает с кривой плавления мономорного белка. В раствора сывороточного альбумина с высоким содержанием пояшаеризованного белка црд длительно;;. инкубация с глюкозой, постепенно, пропорционально степени лагаддарованпя белка моносахаридом, уменьшается содержание асооцна-тов высокой молекулярной массы ( рис. 11 ). Содержание тршзра, ад-мера и мономера альбумина со временем возрастает, что свидетельствует об их участии в образовании высокомолеку.тарных ассоциатов,

Рис. 11. Влияние гллкознлксовшшя на бе-лск-белковыэ взаимодействия молекул альбумина. К исходному адьбумппу с больши колцчзстбом подшвра CD добавляли глюкозу (2-4) д лн?убипов&гпг при 37°С различное время, после те го наносили. на колонку с ?£К-№'.'-55-гедеа. Профглп элю~ rn&s 1- 2сходного белка; Я- исходного обезгЕранного алхбугдиа без полимерной 4рашшп; 2-1- гляссояляроволного белка. Врекя яняубгкви с янгаозой: 2- 5 сут; 3- 9 сут, 4- 33 сут. Исходяко коздентра-* ЦПи: альбумина- 6-10"%, гчшкозн- 2 И.

Ал'лляроЕашэ альбумина пирздсгссзль-б'-фссфаго'л такзе ензглааэ белковую агрэгггоги. Так, прокат, ссдергащиД 1 газлезулу асеалантпо

04

связанного с бежал лиганда, образует посла прогревания ассошаты меньшей молекулярной массы, чем исходный альбумин, дальнейшее увелз чение количества ковалентно связанного с макромолекулой лиганда npi водит к уменьшению доли агрегированного альбумина, а при 6-7 молях пиридоксаль-б'-фосфата на моль белка агрегаты не образуются.

Эффективно стабилизируют белок к нагреванию такse и жирные ю лоты, в частности пальмитиновая кислота. Так, обезжиренный альбуызщ проинкубированный с небольшими избытка/л палшятиновой кислоты, не образует агрегатов после прогрева при 75°С.

Известно, что в образование белковых даыеров, трнмеров и аса пиатов высокого молекулярного веса определенный вклад вносят SH-rp; шш макромолекул ( Aoki , 1983, Salto , 1987 ). Но из представле: ных данных видно, что агрегация альбушна уменниается или не проко ходит вовсе ври лигандировании белка глюкозой., пиридоксаль-5-4осфа том и пальмитиновой кислотой. Так как взаимодействие этих жгандов с альбумином происходит с участием аминогрупп белка, логично сдела вывод, что образование агрегатов протеина осуществляется с помощью Ê-îffig-rpynn лизлновых остатков макромолекул.

Вероятно, в механизм агрегации белка существенный вклад ehoc электростатические силы, возникающие мевду положительно заряженным аминогруппами лнзиновых остатков одной белковой молекулы и отряцат лыш заряженными остатками, например, карбоксильных групп другой, действительно,, результаты, полученные при прогревании сквороточног альбушна при различных значзннях рН, подтверждают это предположен ( рис. 12 ).

tí« W

05

Рис. 12. Влияние рН инкубационных рас . воров на устойчивость сывороточного е бумина к агрегацаЕ при нагревании. чения рН белковых растворов: 1- 3,С0; 2- 4,45; 3- 4,70; 4- 5,16; 5- 5,97; 6 6,8?; 7-7,70; 8- 9,83. Концентрация белка- 10"%. Изменение оптической ш тности регистрировали при .250 нм с ис

*t пользованием непрогреваемой кюветы ci внения, в которой находился альбуыан при той вэ концентрации. Скорость црс tP¡=f~- грева составила 2°С/мнн.

Дра значениях рН, близких к изозлентрической точке альбумина, Фиксируется наименьшая стабильность макромолекулы» По мере увеличения или уменьшения значения рН от азоэлектрической точки стабильность белка возрастает, и в крайних точках рН 3,0 и 9,33 молекула альбумина наиболее устойчива к нагреванию ( рис. 12 ).

Как уже отмечалось Еыше, лигандирование альбумина глшозой приводит к уменьшению белок-белковых взаимодействий. Напротив, модификация протеина кротоновым альдегидом или, в меньшей степени, па~ рилоксаль-б^-фосфатом сопровождается возрастанием межмолекулярных взаимодействии. Так, сывороточный альбумин человека, проинкубированный с высокими концентрациями ацетальдегида, подвергается лигандиро-ьанию не только уксусным, но и кротоновым альдегидом, образующимся из ааеталвдегида. Взаимодействие альбумина с кротоновым альдегидом легко Фиксируется спектральными методами: ростом полосы поглощения в районе 330-350 и 290 нм, а также сильным тушением триптофановой Флуоресценции белка и появлением а ростом интенсивности флуоресценции с максимумом на 420 нм (Л ^ = 365 ш ) ( рис. 13 ).

Рис. 13. Изменение спектральных характеристик сывороточного альбумина в зависимости от времени его инкубации с аде талвдегидом. Оптическую плотность регистрировали при: 1280 ем; 2- 330 нм„ Интенсивность флуоресценции регистрировали на максимуме при возбужденна: 3- 296 нм, 4- 365 нм. Исходные концентрата: альбумина- 6* «ПИ, ашталвдегида-6-10"%; температура инкубации 37°.

При этом лигандированае альбумина кротеновш альдегидом сопровождается межбелховыми сшивками с образованием ассоциатов большей молекулярной массы в сравнении с исходит белком С рис. 14 }. Меньшие избытка альдегидов такж могут способствовать образованию чеж-белкоЕых ставок а приводить к увеличению количества белков в растворе с большей молекулярной массой. Электрофорез, проведенный в поли-акрилэг.здном геле с добавлением додецалсульфата натрия, псказал, что белки плазмы, лигавдироЕаяныз ацеталвда гадом а кротонов,1Ч альдегидом, а таяаэ пиридоксалъ-бЦьосфатогд могут образовывать сшивка.

По-видимому, увеличение концентраций альдегидов может

сасц

5

СУЙ!*:!

привести к мегбеяковнц сшвкаа и увэлачешш молекулярной массы белков пжазмы, а такге к нарушения белок-белковых взаимодействий бел-

ков-переносчиков с рецепторами,

05

Рес. 14. Меамодекулярные взаимодействия сывороточного альбумина человека, дшгандарованного кротоновым альдеш-дш. К исходному .альбумину добавляли избыток ацеталвдегвда, инкубировали пря 37°С различные промежутки времен! а наноснли на колонку с тж-эт -55-гелем, регистрации вели при 280 нм. Ерзая ннкубаши белка с альдегидом: 1- 0? 2- 2,5 ч; 3- 7 ч; 4- 15 ч; 524 Чо Исходные концентрации: альбтал-на-6-10""%, аде тальдегида-6-10"%.

о т ■ 4га

освоит швоаы

1. §язеко-хши?зсш2и М9Т0Д21П доказано, что из всех аминокислот разлачных классов кетбоязе эффективно взаимодействуют с глюкозой основные аминокислоты.

2о Установлено, что гдакозилпрованные аминокислоты взаимодействует- с адьбушнои е образованием обратимых комплексов, в то вредш как гласозалироващщй альбукян образует с аминокислотами стабильные аддукты.

У. Локализованы новые участки взаимодействия глюкозы с альбумином, в состав которых входят Ляз-4 и Лиз-240. Гликозшшрование белка по этим участкам приводит к нарушению транспортных свойств ала буьана в отношении ионов меди, билирубина, п^ддоксаль-б'-фосфата.

4, Установлено, что образование белковых агрегатов сывороточного альбумина происходит с участием ё-аминохрупп остатков лизина.

5, Показано, что лагацдЕрование альбушна глюкозой, пиридок-саль-Ь-фосфатсм, здгрвхаа кислотами повышает его устойчивость к агрегации при натр звании. Глшсозылнроваше альбушна и белков плазмы приводит к уменьшению содержания агрегатов в растворе.

6, Сшшлшз сродства ионов коде к альбумину при его гликозеш-ровавдс приводит к участей нссвязспешс с белзои ионов металла в ге-норацгЕ сзебокак радикалов а црасутсшш эдо вызывает повро-здондс л кгоючзше структур.

7. Методами УФ-спектроскошк, флуороспоншг н гвяь-фяльграцяз показано ускорение образования кротоноього алщэгэда из ацегадьдб-гида в присутствии белков илв. афински слот; кротоновнЗ алздегзд вызи-вает меябелковыв сшивки макромолекул.

Сгщсок работ. опубликованные по. та'е ^ссерттвга:

1. Стецуро И.¡1.5 Ярошевнч H.A. Стабильные аддукты ти&чана а его производных с основанием Швффа, образованным акэтальдегадсм к аминокислотами,- В кн.: Проблемы современной биохимик и биотезаюло-гаи. 8-ой Обьед. сишозиуи баохжл.обществ CCCP-3&?, Para, 1985,с. 13?.

2. Солодунов A.A., Степутю И.И., Ярокзвич H.A. Уменьшение свя-зышшя билирубина с гдикозилированным сывороточнш альбумином человека.- В кн.: Актуальные вопросы разработки, изучваия и производств лзкарстЕенных средств, Каунас, 1935, с. 320.

3. Ostrovsky J.M., Sataiiovalcaja V.l., Stepuro I.I., Jaroehe-vlch К.A. CatabolisiE and inaetivaticn cf acetaldehyde iE thn animal or~o:nism. 34- th. International Congress Alcohol and Drug Dependent;?. C:.lr... -i, Alberta, Canada, 1985, V. 1, p. 52-53.

4. Степуро И.И., йаводннк И.Б., Матянск Н.В., Наумов 1.В., 11?.-лецкая Т.П., Солодунов A.A., Яропввач H.A. Комплекса глакозышрозан-ных белков крова с аминокислотами, лшщднкки а белковыаз кошог,битами мембран эритроцитов,- В кп.: Тезисы докладов У Всесоюзною бшо-хщтеского съезда, М., "Наука", 1386, т.З, с. 322.

5. Степуро ИЛ'.-, Гйлепкая Т.П., ЯроЕзкач H.A. Дддувян глнказя-ларованного сывороточного альбумина с аааясияолоздш. - Укр, бкохш». журнал, 1S86, í\ 58, JM, с. 9-14.

6. Степуро й.И., Солодунов A.A., Ярозавзэ H.A. В&аяяздейсгвзе билирубина с глшсозшгкрсвакнш снвороточнюд озтьбуйявсга. - Вопросы мед.пмин, 1SSS, т. 32, & 6, с. 46-43.

7. Мороз Л.F., Кондаков В.И., Степуро И.iL, Ярошвач H.A. Взаимодействие яарадоксаль-З-фоефата с сызсроточвш альбуггшсеа чблг века а панкреатической рпбопуказазоЗ. - Б'кшзлая, 193? с з. 52, В 4 с. 5с0-551.

8. Стоцуро К.И., Чгксоьскал H.A. Незазшаг&чзсгйв гяихозаладо-ьанаа белков крова. - В кп.: Тегясц докладов 3-ой Всессляной кспфз-ri3KXía.T.i до хлша к бпохзям углеводов, Москва, 1987» с. 71»

9. Сгепурэ U.S., йроковлл iLA.s Осгрокашй S.U. ünoccö ОЕреде-лзетя глтаозшпровошш: богзоз зрогд.- Дксш&оз сщетгзльст>» 1533, ,.'? 1';вэ'766.

10. Степуро И.И., иолодунов A.A., Иклецкая Т.Е., Ярошевкч Н.А Островский Ю.М. Распределение пирддоксаль-з'-фосфата между белками и шзксаюдекуляршли компонентами плазмы крови; влияние ацетальде-гвда. - Укр.биохш.журнал, 1988, т. 60, § 1, с. 34-41.

11» Стецуро Й.И., ЯрошзЕич я.к., ЯнчуреЕпч A.C. Роль £-амино-груш остатков лизина сывороточного альбумина человека в процессах тепловой денатурации белка. Повышение устойчивости гликозилирован-ного и адкшшрованного альбумина к агрегации при нагревании. -Молек.биол.» 1988, т. 22, & 2, с. 466-472.

12. Степуро Й.И., Чайковская H.A. Изменение мевдоыенных взаимодействий в тсакула сывороточного альбумина при связывании альдегидов а сгтртов. - В кн.: Тезисы докладов У1 конференции по снек-уроскоши биополимеров, Харьков,, 1988, с. 282-й3.

13. Stepuro I.I., LapBhina 2.A., Chajicovskaja H.A. Effect of ligand binding on domain interactions in the molecule of human serur elbundn. International Symposium "Jsolecular organization of biological structures", Moscow, 1989, V. 1, p. 158;