Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Способы повышени приживляемости эмбрионов крупногорогатого скота при трансплантации

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Способы повышени приживляемости эмбрионов крупногорогатого скота при трансплантации"

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА

ОД

На_ правах рукопису

ТИХОНА ГАЛИНА СЕРГІЇВНА

УДК 636.22/.28.082.4-089.843

СПОСОБИ ПІДВИЩЕННЯ ПРИЖИВЛЕННЯ ЕМБРІОНІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ

03, СЄ,

Спеціальність: 06.00.27. - біотехнологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

Харків - 1996

Дисертацією е рукопис

Робота виконана в відділ біотехнології відтворення нових генотипів сільськогосподарських тварин інституту тваринництва УААН

Науковий керівник: професор, доктор біологічних наук ~ Бугров Олексій Дмитрович

Офіційні опоненти: академік УААН, доктор ветеринарних наук Фукс Поліна Павлівна кандидат ветеринарних наук Бєліков Анатолій Андрійович

Провідна організація: Харківський зооветеринарний інститут

Захист дисертації відбудеться йМч/рЛДй/ 1996 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої Ради І Д02.30.01 при інституті тваринництва УААН, 312120, к. Харків, п/в Кулиничі

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці інституту тваринництва УААН, 312120, м. Харків, п/в Кулиничі

Автореферат розісланий 2г?V' 1996 року

Вчений секретар спеціалізованої Ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ. Актуальність теми. Трансплантація ембріонів займає достойне місце у розведенні сільськогосподарських тварин, перш за все молочної худоби, оскільки дозволяє найбільш досконало використовувати генетичний потенціал високопродуктивних тварин. У той же час, багато питань ще не вирішено. Це стосується як отримання ембріонів від корів-донорів, так і приживлення їх після пересадки реципієнтам. "

Відомо, що при штучному заплідненні сільськогосподарських тварин відбувається зниження запліднення самиць, якщо в 1 мл сперми бугая міститься понад 500 тисяч мікробних тіл . Такий же негативний вплив може завдати мікрофлора на трасплантовані ембріони. Хоч деякі дослідники вважають, що ембріони з інтактною зоною пеллюцида надійно захищені від мікрофлори (Е. Singh et. al., 1982; R.Bowen et al., 1983; D.Stringfellow et al., 1984; Z.Mallek et al., 1984; W.Hare et al.,1985), інші вчені відмічають, що деякі віруси проникають повз прозору оболонку або прилітають до неї та переносяться у матку реципієнта (R.Gwatkin, 1967; Е.Singh et al., 1982; L.Laurman et al., 1985; А.І.Сергієнко та інші, 1988).

Як відомо, здобуття та пересадка ембріонів здійснюється в лю-теальну фазу, коли чутливість матки корови до інфекції збільшена (LRowson, 1953), тому підвищення ефективності трансплантації великої рогатої худоби знаходиться у безпосередній залежності від асептичних умов одержання ембріонів та застосування сануючих препаратів. -

Необхідність дослідження питань, пов’язаних з приживленням ембріонів, випливала з особливостей роботи пунктів трансплантації на Україні. Багато з них побудовані не за типовим проектом і не мають достатні умови для асептичного одержання ембріонів. Тому

з

разробка і впровадження в практику засобів, що забезпечують зчн ження контамінації ембріонів є важливою актуальною проблемою.

Мета та завдання досліджень. Метою нашої роботи бул розробка методів профілактики та санітарного контролю техно логічних процесів при трансплантації ембріонів у великої рогато худоби. Задля досягнення цісї мсти нами було поставлено на вп рішення такі завдання:

1. Вивчити бактеріальну контамінацію статевих шляхів телиць реципієнтів у фолікулярну та лютеальну фази статевого циклу.

2. Вивчити вплив антибактеріальних препаратів на мікрофлор; статевих шляхів при їх санації безпосередньо перед вимиванням ; донорів та перед пересадкою ембріонів реципієнтам.

3. Провести порівняльну оцінку антибактеріальних препараті] для санації статевих шляхів.

4. Випробувати антибіотики для санації промивних буфернк середовищ та розчинів для відмивання ембріонів. _

5. Вивчити рівень впливу випробовуваних антибактеріальнії: препаратів на життєздатність та приживлення ембріонів.

Теоретична та практична цінність дослідження. Проведені комплексні дослідження для з'ясування факторів, що впливають н приживлення ембріонів. Із статевих шляхів телиць виділено асо ціації мікроорганізмів і визначено вплив окремих з них на прижив лення ембріонів. Встановлено, що до 3-го дня фолікулярної фазі відбувається звільнення матки і статевих шляхів телиць-рецнпіенті) від умовнопатогенної мікрофлори, а до 7-го дня лютеальної фазі зростання її досягає максимуму і кількість відповідає 1-му дш фолікулярної фази. Уперше для санації статевих шляхів корів донорів Л телиць-рециніентів було використано розчин Люголя, для санації промивних буферних середовищ та ембріонів комбіна

- ^ 4 ' -

цію антибіотиків (гентамщин-ампіцилін 12 мкг/мл і 100 ОД/мл).

Встановлено можливість попередження ендометритів у корів-донорів шляхом додавання вшценаведеного комплексу антибіотиків до промивних буферних середовищ. Зовнішня поверхня промислових шприц-катетерів вітчизняного виробництва грубошорохувата з багатьма рисками та гострими виступами. Вона високотравматична для тканин і утримує в нішах велику кількість мікробів. Для по-кращеня якості зовнішньої поверхні катетерів для пересадки ембріонів та її деконтамінації нами проведена додаткова механічна обробка (шліфування та полірування).

Впровадження наукових розробок. На підставі результатів досліджень і теоретичних Положень, сформульованих в дисертації, розроблено і запропоновано виробництву асептичну технологію трансплантації ембріонів великої рогатої худоби. Запровадження цієї технології підвищує приживлення ембріонів на 15-20 %. Вона містить в собі:

- методичні вказівки з використання розчину Люголя для . санації статевих шляхів корів-донорів і телиць-реципієнтів;

- методику використання комбінації антибіотиків (гентаміцин-ампіцилін 12 мкг/мл і 100 ОД/мл) для санації промивних буферних середовшц та ембріонів;.

- методику вимивання ембріонів у модернізований приймач;

- методичні вказівки з додаткового шліфуванням та полірування зовнішньої поверхні катетерів для пересадки ембріонів.

Апробація роботи. Основні результати досліджень доповідалися і були обговорені на республіканській науково-практичній конференції (Львів, 1987 ); на 2-гій республіканській науково-ирактичшй конференції (Львів, 1988 ); на республіканській науково-практичній конференції (Харків, 1988 ); на Всесоюзній науково-

5 с

технічній конференції (Ленінград, 1988 ); на Всесоюзній нараді з

трансплантації ембріонів сільськогосподарських тварин (Ллма-Ата,

1989 ): . • .

Розробки за матеріалі дисертаційної роботи експонувалися на

- ВДНГ СРСР та України. '

Головні положення дисертації викладено в 14 друкованих працях.

Наукоеї результати, що виносяться на захн.ст.

1.Порівняння бактеріальної контамінації статевих шляхів те-лиць-рецітієнтів у фолікулярну та лютеальну фазу статевого циклу.

2. Використання саную’пїх препаратів з кетою зниження бак-

іс-]>1;.лз,ного габрудксшія статевих шлаків корів-донорів і тєлііць-реципієнтів при ембріотрансплантацп. * *

3. Вплив мікробного фактору на приживлення ембріонів. .

4. Використання антибактеріальних препаратів для санації промивних буферних середовшц та відмивання ембріонів,-

5. Можливість зниження мікробної контамінації при додатковій обробці зовнішньої поверхні катетерів для пересадки ембріонів.

Особистий внесок пошукувача. Дисертант виконав переважну часшну роботи самостійно. Методологія та схема досліджень були відпрацьовані разом з науковим керівником, дослідна робота проводилася пощукувачем самостійно. Із спільних наукових дослідів і публікацій дисертант використав для оформлення роботи тільки свою частину результатів. *

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 140 сторінках машинописного тексту, включає 18 таблиць, 8 малюнків. Список літератури складається з 207 джерел, у тому числі 85 на іноземних мовах. - -

ОБ'ЄКТ ТА МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ. _

Робота проводилась з 1986 по 1990 рік у лабораторії трансплантації та культивування ембріонів сільськогосподарських тварин . Інституту тваринництва УААН і на пунктах, трансплантації ембріонів при дослідних господарствах.. Предметом дослідження були корови та телиці та одержані від них ембріони. У експериментах було використано 250 корів-донорів і 600 телиць-рецішіентів. Для стимулювання суперовуляції застосовували препарати ФСГ (50 мг) або ~ фоллітропін (5000 Од). Синхронізацію .статевого циклу донорів та реципієнтів здійснювали ін’єкцією естрофану на 12-14 день статевого циклу у дозі 500 мкг. Штучне запліднення корів-донорів проводили двічі подвійною дозою заморожено-відтанутої сперми.

Вимивання та пересадку ембріонів здійснювали на пунктах трансплантації ембріонів. Ембріони добували з рогів матки донорів на 7-мий день після осіменіння. Промивне середовище з рогів збирали до флаконів, закритих пробкою нашої конструкції. Після добування ембріони відмивали, оцінювали і зберігали до часу пересадки при температурі 37,5°С. Для вимивання і зберігання ембріонів використовували середовище Дюльбекко з додаванням фетальної сироватки великої рогатої худоби, або північного оленя (1%). Ембріони оцінювали-за загальноприйнятою методикою. Для-пересадки використовували ембріони- тільки відмінної та доброї _ якості. Пересадка ембріонів проводилась трансцервікально в ріг матки іпсілатеральний до жовтого тіла.- Добування і пересадка ембріонів проводилась одними й тими ж спеціалістами. Для бактеріологічних досліджень використовували загальноприйняті методики.

Для визначення бактеріального фону статевих шляхів у телиць-реципіентів відбирали проби слизу зі слизових оболонок шийки матки, медіальної та краніальної частин піхви в 1-й, 2-й, 3-й та 7-й”

7 ' ■

день статевого циклу за допомогою пристрою, який нами модернізовано. Посіви на середовища робили не пізніше, ніж. за одну годину після їх отримання від самиць. Для зниження бактеріальної контамінації статевих шляхів' у корів-донорів і телиць-реципіентів перед трансплантацією ембріонів проводили санацію препаратами: “Септонекс” і розчином Люголя з експозицією 5, 15 та_20 хв., які уприскували через розкрите піхвове дзеркало. Промивні буферні середовища та середовища для вимивання ембріонів санували антибіотиками гентаміцин 12 мкг/мл та ампіцилін 100 Од/мл, пеніцилін 100 ОД/мл та стрептоміцин 50 Од/мл. Поверхні промислових катетерів для пересадки ембріонів грубошерсткі з багатьма рисками та виступами. З метою покращення якості їх поверхні проводили додаткове шліфування та полірування до 8 класу

. і

чистоти. • .

Результати дослідів обробляли статистично за допомогою критерію Ст’юдента ( Г.Ф.Лакін, 1990 ). ‘ _

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Визначення бактеріальної контамінації статевих шляхів у те-лнць'реципіентів в .фолікулярну та лютеальну фазу статевого циклу. ' Результати досліджень показали, що у більшості телиць (6/10) в змивах зі слизової оболонки шийки матки, а також в змивах" зі. слизових оболонок статевих шляхів (9/10) були присутні асоціації мікроорганізмів як в лютеальній, так і фолікулярній фазі статевого циклу (таблиця 1).

Якісний аналіз проб слизу показав, що мікроорганізми належали до групи коменсалів, які переважно зустрічаються в кишечнику та на шкіряній поверхні. Це були мікроби з груп колі, стафілококів та стрептококів. При ідентифікації мікроорганізмів була встановлена їх видова належність. Частіше всього зустрічалися асоціації

' Таблиця 1 і

Бактеріальна контамінація статевих шляхів телиць злучного віку у фолікулярній та і'______________люгеальнійфазі статевого циклу (п=10) (Р>0,05) ____________

День статевого циклу і Місце . одержання проб слизу ' Ріст мікрофлори на живильних середовищах зі змивів статевих шляхів телиць-■ ' і . • *

МПБ МПА Середовище Буліра 1 Пласпшча-тий агар

< 1 К-кісгь % К-кість % К-кість % Кількість м.т./мл змиву

1-ііЙ день Шийка матки Медіальна час • 6 60*15,48 4 ' 40115,48 0 0 ' 483,51267,5

пша піхвн Каудальна час* 9 90±9,48 6 60115,48 . 1 1019,48 1 4658,512723,2 ..

тин а піхви 10 100 9 ! 90±9,48 2 20±12,64 5668,012702,2

2-ий день Шийка матки Медіальна час 8 , 80112,64 7 70±14,49 0 0 390,5191,10

і тшіа піхви Каудальна час- 9 90±9,48 8 і 80112,64 2 20±12,64 1154,51320,5^

тина піхви 10 100 10 100 . 2 •20112,64 1601,51316,40

3-ий день Шийка матки Медіальна час- 6 60±15,48 6 60±15,48 0 0 221,5166,6

1 , 1 тина піхви Каудальна час- 10 100 7 . 70114,49 2 20±12,64 1788,01794,2

тина піхви 10 100 8 80112,С4 2 20±12,64 3246,511003,0

7-ий день Шийка матки Медіальна час- 9 , 90±9,48 7 і 70±14,49 0 0 495,0185,3 , •

тина піхви Каудальна час+ 10 , і 1 1 ‘ 100 10 1 100 2 20112,64 1 2145,01767,2

1 тин а піхви . 10 100 10 100 • 3 30114,49 3830,01929; 3

мікроорганізмів, які належали до ацгеш, Е. соїі, Ре. аеги^поза,

Вас. эиЬШЬ. . ‘ •

Крім цього нами встановлено, що мінімальна кількість мікробних тіл в 1 мл змиву зі слизової оболонки шийки матки була на 3-й день статевого циклу-221,5 м.т./мл, а зі слизових оболонок статевих шляхів на 2-й день статевого циклу: з медіальної та каудальної частини піхви становило-1154,5 та 1601,5, відповідно.

На 7-й день статевого циклу відбувалося збільшення росту мікрофлори до 495,0 м.т./мл; 2145,0; 3830,0. Вірогідна відмінність (Р<0.05) була отримана нами між кількістю мікроорганізмів з проб, відібраних з слизових оболонок різних ділянок статевих шляхів телиць в 1-й, 3-й та 7-й день статевого циклу. •

Кількість мікроорганізмів, яка змінювалась в змивах, отриманих з одних і тих ділянок статевих шляхів в залежности від дня циклу, відмінно не відрізнялася, хоч відбувалося значне зменшення до закінчення тічки та охоти. На 7-й день статевого циклу, тобто часу здійснення пересадки ембріонів, кількість мікроорганізмів збільшувалась, що в наступних дослідженнях було нами враховано.

Таким чином, нами підтвердженно результати А.КгісЬпа (1974) про наявність бактерій в період статевої охоти в пробах слизу з шийки матки, які потенційно патогенні і створюють несприятливі умови для імплантації ембріона. Також встановлена динаміка звільнення .статевих шляхів від мікрофлори під час еструсу. Припущення про те, що на 7-й день статевого циклу, тобто, коли проводять ембріотрансплантацію, кількість мікрофлори в статевих шляхах (а можливо і в матці) збільшується, в наших дослідженнях підтвердилося. Наявність мікрофлори в матці або статевих шляхах може привести до інокуляції пересаджених ембріонів або створити несприятливі умови в матці для їх імплантації.

■ - 10 Виходячи з викладеного, можна зробити висновок, що для

якісної імплантації ембріонів”в матці необхідно створити асептичні

умови та підготовити стерильний пересадочний матеріал.

_ Вплив мікробного фактору на приживлення ембріонів.

Таблиця 2.

Вплив мікробного фактору на приживлення емб ріонів.

Пересадочний матеріал (ембріони) Пересаджено (пгг.) 3 них прижилося т

Ембріони, імокуліровакі Stahp. aureus (дослід) 10 _ 0

Ембріони, їнокуліроваш Е. соіі (дослід) 10 0

Ембріони без додавання мікроорганізмів (контроль) 20 50±11Д8

Результати досліджень по інокуліруванню ембріонів чистими культурами мікроорганізмів Е.соїі та 5і:.аигеш в розведенні 1:10е показали, що досліджена мікрофлора негативно впливає на приживлення ембріонів: жоден з них не прижився, а в той час у контролі приживлення ембріонів становило 50% (таблиця 2).

Наші припущення про негативну дію мікрофлори^ яка часто зустрічається в статевих шляхах телиць, а також у промивних буферних середовищах у корів-донорів, на приживлення ембріонів, підтвердилися (Р<0,001).

Виходячи з викладеного, можна зробити висновок, що для імплантації зиготи необхідно створити асептичні "умови в матці та підготовити стерильний пересадочний матеріал.

Зниження бактеріальної контамінації статевих шляхів у корів-донорів і телиць-реципієптів при ембріотрансплантації.

Результати досліджень, які подані в таблиці 3, показали, що використання сануючих препаратів при добуванні ембріонів значно знижує -ріст мікрофлори в статевих ліляхах корів-донорів. Кращі результати були отримані після санації статевих шляхів корів-донорів препаратом “Септонекс” та розчином Лгоголя з експозицією

• ' 11 . .

15 хв. Так, при обробці статевих шлірів " Септонексом” відбувається зниження кількості мікрофлори в пробах, відібраних зі слизової, оболонки її гайки маттш в 5,38 ради, а зі слизової оболонки пе-редвір’я піхви в 2,07 рази. При обробці статевих шляхів корів-донорів розчином Ліоголя відбувалося зниження кількості мікрофлори в 41,3 і 6,6 рази в пробах, відібраних зі слизової оболонки шийки матки та передвір’я піхви, відповідно (Р<0,001).В подальших дослідженнях для обробці статевих шляхів телиць-рецишєнтів . використовували розчин Люголя. Результати дослідження відображено на мал.1. . '

Бактеріальна контамінація- в середньому зменшувалась у пробах, відібраних зі слизових оболонок: шийки матки від 72.63 до 10.16, медіальної частини піхви від 95.75 до 13.92 та каудальної " частини піхви від 425.20 до 86.30 м.т./мл змиву. ' - - -

Количество микробных тел в 1 мл смыва (ед)

Шийка Медіальна Каудальна - _

матки частина частина

піхви піхви '

Мал 1. Бактеріальна контамінація статевих шляхів телиць до та після санації розчином Люголі

1 Таблиця З

Бактеріальна контамінація статевих шляхів корів-донорів до і після обробки їх

сануючими препаратами ,

Сануючий препарат 1 Частина органу Кіль- кість проб Ріст мікрофлори на пластинчатому агарі (кількість мікробних тіл/мл) ’

До обробки статевих ш;іяхів сануючими препаратами Після обробки статевих шляхів сануючими препаратами (з експозицією /хвнл./) Розведення 1:10

5 15 20

Септонекс Шийка матки 28 208,92±74,23а 150,21±57,42 38,82±16,01і 122,0^±58,98

Септонекс Каудальна частина піхви 28 865,32±209,09с 698,14±252,98 418,10±143,21д 534,32±214,80

Розчиц Люголя Шийка матки 28 86,81±37,82' 4,56±1,33 2,07±1,12* 2,96±1,83

Розчин Люголя Каудальна частина піхви 28 532,23±191,298 103,73±52,71 80,13±42,23ь 371,80*198,80

Примітка: різні суперскрипти означають значення, які вірогідно різняться між собою (Р<0,05).

- • 13 .

. Звідси походить, що санація статевих шляхів жорів-донорів і

телиць-рецшгієнтів розчином" Люголя з експозицією 15 хвилин перед вимиванням та пересадкою ембріонів е ефективним антимікробним засобом, який дозволяє запобігти проникненню інфекції в матку реципієнта. '

Використання антимікробних препаратів для санації промивних буферних середовищ та середовищ для відпиваная ембріонів. Бактеріологічні дослідження показали, що мікрофлора, яка найбільш часто зустрічається в статевих шляхах корів та" телиць, виявлена нами та іншими дослідниками також у промивних буферних середовищах. Для зниження мікробної контамінації нами було випробувано три комбінації антибіотиків: генгаміцин-аміщщлш, гентамщин-пенщилін, пенщшгін-стрептоміцйн.'

Результати модельних бактеріологічних досліджень показали, що для санації промивних буферних середовищ та вимивання ембріонів кращим антимікробним засобом є комплекс антибіотиків гентаміцин у концентрації 12 мкг/мл з ампіциліном 100 Од/мл, а також гентаміцин з пеніциліном (12 мкг/мл та 100 Од/мл), до яких всі дослідні штами мікроорганізмів виявилися абсолютно чутливі (відсутність росту) (таблиця 4).Концентрація гентаміцину 4,6,10 мкг/мл в комбінації з ампіциліном (100 ОД/мл) хоч і пригнічувала ріст синегнійної палички, але повної бактеріцидної активності не спостерігалося. Комбінація антибіотиків пеніциліну _ зі стрептоміцином в рекомендованих інструкцією концентраціях виявилася не ефективного проти синегнійної палички та досліджуємого штаму, кишечної палички. Враховуючи вищеподане, вважаємо

' Таблиця 4.

Порівняльна активність комбінацій антибіотиків на

антибіотиків у всіх пробах спостерігали ріст вищевказаних культур мікроорганізмів.

доцільним використовувати для санації промивних буферних середовищ комплекс антибіотиків генгаміцин-пенщилін або гентамщин^ ампіцилін у вищезазначених концентраціях.

Результати санації промивних буферних середовищ відображені в таблиці 5, з якої видно, що з 147 санованих змивів 116 -

чисті культури мікроорганізмів.

" Концентрація антибіотиків (мкг/мл та ОД/мл) KyJIbTypH MiKpO-0prajri3MiB Кількість проб Ріст мікроорганізмів на живильний середовищах

МПАу' чашках (кіл-ть колоній) МПБ Середо- вище Булїра

Гентаміцин 4 . B.subtilis 4 - -

Пенщнлін 100 Ps. aeruginosa 4 132-327 + - -

St. aureus 4 ' ' - -

E.' coli - 4 г - -

Гентаміцин 4 - B.subtilis 4 - -

Ампіцилін 100 Ps. aeruginosa 4 9-72 + •

St. aureus 4 - -

E. coli 4 - - ■ -

Гентаміцин 6 B.sabtilis S - -

Ампіцилін 100 Ps. aeruginosa s- од. + .

St. aureus 5 • - -

E. coli . " 5 - - -

Гентанщкн 10 . B.subtilis 2 - -

Ампщалік 100 Ps. aeruginosa • 2 од. - '

St. aureus 2 - -

E. coli 2 - - - -

Гентаміцин 12 B.sabtilis 4 ■ — -

Пеніцилін 100 Ps. aeruginosa 6 - - “

- St. aureus 4 - - • -

E. coli 5 - - -

Гентаміцин 12 B.subtilis 4 - . -

Ампщклін 100 Ps. aeruginosa 4 - -

St. aureus 4 - -

E. coli 4 - -

Пеніцилін 100 B.subtilis 5 - +

Стрептоміцин 50 Ps. aeruginosa 5 спл. ріст + -

- St. aureus . 5 - + _

E. coli 5 сил. ріст + +

Примітка: (+) наявність росту, (-) - відсутність росту. В контролі~бет

15 .

вільні від мікрофлори (78,9%). В контрольних змивах без додавання антибіотиків з 144 змивів тільки 65 - вільні від мікроорганізмів (45,2 % ) ( РС0.001).

Таблиця 5.

Дія комплексу антибіотиків гентаміцин+ампщилш -_______на мікрофлору промивних середовищ_________

Середовище для вимивання ембріонів Всього досліджено змивів Відсутність росту мікроорганізмів на живильних середовищах (МПА, МПБ)

Кількість %

Геитаміцин + ампіцилін (12 мкг/мл іа 100 Од/мл) (дослід) 147 116 78,9±3,37

Без антибіотиків (контроль) 144 65 45,2±4,15

З поданого походить, що санація промивних буферних сере-

довшц дає велику ймовірність отримання деконтамінованих ембріонів, що є важливим моментом в комплексі профілактичних заходів мікробної контамінації при трансплантації ембріонів. Санація промивних буферних середовищ може бути засобом профілактики захворювання матки у корів-донорів (ендометрітів).

Ембріони з промивного буферного середовища надалі, згідно з інструкцією по трансплантації, повинні проходити ще одну обробку - багаторазове відмивання стерильним буферним середовищем. Наші мікробіологічні дослідження показали, що п’ятиразове відмивання ембріонів в стерильгаїх буферних середовищах не завжди дає позитивний антимікробний ефект (таблиця 6).

~ Таблиця 6

Порівняльна оцінка багаторазового відмивання ембріонів . середовищами з додаванням антибіотиків та без них_________________

Середовище для відмивання ' ембріонів Всього досліджено середовищ Ріст мікрофлор середо (МПА, Кількість И на ятдпипте МПБ) %

Г сптаїчц-ікп + оншірілш (12 мкг/мл та 100 Од/мл) (дослід) 25 - 0 - 0

Без антибіотиків (контроль) _ 25 3 12,0±6,49

З 25 проб у трьох спостерігався ріст мікрофлори, а їгрп відмиванні ембріонів середовищами з доданням антибіотиків гента-мідин-ампіцилін (12 мкг/мл і 100 Од/мл) всі проби були стерильними (Р>0,05).

Комлекс антибіотиків гетамігдан-ампіцилін має широкий' спектр антимікробної дії. Крім цього, він не шкодить розвитку ембріонів при культивуванні in vitro (таблиця 7).

. В досліді, де були використані середовища з додаванням комплексу антибіотиків гентамщин'амшцшгін- (12 мкг/мл і 100 Од/мл), в контролі- середовище з антибіотиками пеніцилін-стреп-томіцкн (100 і 50 Од/мл), в другому контролі- середовище без додавання антибіотиків: 5 з 7 (71.4%), 5 з 9 (55.5%) та 3 з 6 ( 50%) ембріонів розвинулися зі стадії морули пізньої (МП) в бластоцисту ранню (БР); 5 з 5 (100%), 2 з 5 (40%) ембріонів розвинулися зі стадії бластоцисти ранньої (БР) в бластоцисту пізню (БП), 5 з 7 (71.4%), 5 з 7 (71.4%) та 3 з 4 ембріонів - зі стадії бластоцисти пізньої (БП) в стадію бластоцисти експандованої (БЕ), відповідно.

Маніпуляції з ембріонами здійснювалися біля 2-х годин. Наявність антибіотиків контролює розвиток мікроорганізмів, який підвищує приживлення ембріонів (таблиця 8). На нашу думку, це відбувається за рахунок того, що в матку реципієнта разом з пересадочним матеріалом (ембріонами) вводили невелику кількість середовища Дюльбекко з антибіотиками, які створювали оптимальні умови для імплантації^ -

Вплив антибіотиків на розвиток ембріонів

№ п/п 1 Середовище для культивування ембріонів 1 1 Стадія розвитку ембріонів перед культивуван- ням Всього ембріонів, шт. Стадія розвитку ембріонів через 24 години і Кількість ембріонів, що розвинулися

МП БР БП БР % БП % БЕ % шт. %

1 Без антибіотиків (контроль) 6 5 4 15 1 3 50,0 2 40,0 3 75,0 8 53,3±12,88

2 1 3 комплексом 1 антибіотиків: гентаміцин+ ампіцилін (12 мкг/мл и 100 Од/мл) 7 5 7 19 5 71,4 5 100, 0 5 71,4 15 78,9±9,33

3 3 комплексом антибіотиків: ПЄНІЦИЛІН+ стрептоміцин (100 и 50 Од/мл) 9 5 7 21 5 55,5 5 100, 0 5 71,4 15 71,4±9,86

І

. 18

. Дані таблиці 8 підтверджують, що з 38 реципієнтів, яким були пересаджені ембріони, відмиті середовищами з комплексом антибіотиків гентаміцші-амшцилін (12 мкг/мл та 100 ОД/мл) тільними стали 28 голів, що складає 73.6%. В контролі - з 36 реципієнтів тільки 18 голів виявилися тільними, що складає 50% ( Р<0.05 ).

Таблиця 8.

Виляв антибіотиків на приживлення ембріонів

Середовище для відмивки ем, брІОШБ Всього досліджено реципієнтів 3 них тільних

Кількість %

Гентамщин+ампіцнлін (12 мкг/мл та 100 Од/мл) (дослід) 38 28 73,6±7,14

Без антибіотиків (контроль) 36 18 50,0±8,33

. З вшцевикладеного походить, що запропонований нами комплекс антибіотиків гентаміцин-амтцилін (12 мкг/мл та 100 ОД/мл) являє собою добрий антимікробний засіб і позитивно впливає на приживлення ембріонів.

Вплив на мікробну контамінацію додаткового шліфування та полірування поверхні інструментів для пересадки ембріонів.

Мікроскопічний аналіз показав, що зовнішня поверхня промислових шприц-катетерів вітчизняного виробництва грубошершаві з багатьма рисками, гострими виступами, які сумірні з клітинами епітелію, з розміром мікроЬрганізмів, а часто перебільшуют 5-6 мкм-0.4 мм. Середня висота нерівностей відповідає першому класу чистоти поверхні. -

Поверхні з такими нерівностями високотравматачні для тканин та можуть привести до травматичного або мікробного запалення. В зв’язку з цим нами проведено додаткове шліфування та полірування зовнішньої поверхні шприц-катетерів до 8-го класу

- . 19 -

чистоти та досліджено вплив такої обробки на мікробну контамінацію. “ ; '

• Результати модельних досліджень показали, що дворазове відмивання стерильним фізіологічним розчином катетерів для пересадки ембріонів, інокульованих чистими культурами Staph, aureus і Pseudomonas а. 'не приводить до повної деконтамінації поверхні як

- . . Таблиця 9

Бактеріальна контамінація шпркц-кахетерів після дворазового відмн-вадня їх від внесених культур мікроорганізмів._________________________

Вид мікроорганізм» Розведення Кратність відмивання катетерів Ріст мікроорганізмів на пластинчатому агарі (м.тіл/мл)

Змив з шліфова,-ного катетера. (п=10) Змив з неппгїфо-ваного катетера (п=10)

Staph, auretts 1:250 . 1 2 1410,0±177,58 188,50±24,51 96S,0±170,50 212,0±29,59

Pseudomonas aeruginosa. 1:2500 ►1 ' 2 ' 163,50±37,08 34,50±9,23 210,7S±29,10 72,25±8,35

полірованих, так і неполірованих виробів, хоч і приводить ~до знач--ного зниження росту мікроорганізмів (таблиця 9). З цих даних видно, що відмивання катетерів стерильним фізіологічним розчином значно знижує ріст мікроорганізмів, цри цьому, з зовнішньої поверхні полірованих катетерів кількість мікроорганізмів вимивається більше, ніж з неполірованих: Staph.aureus зменшується в 7.5 разів і 4.6 рази, a Pseudomonas а. в 4.4 рази та 2.7 разів, відповідно. Після збільшення кількості відмивань зовнішньої поверхні катетерів стерильними фізіологічними розчинами до трьох разів має місце аналогічний напрям процесу зниження мікробної контамінації, але і це не приводить до повної деконтамінації зовнішньої поверхні як полірованих, так і неполірованих катетерів. Частина мікроорганізмів залишається на поверхні катетерів в нішах за рахунок адгезії (таблиця 10). Аналізуючи отримані дані прийшли до висновку,

що иа зовнішній поверхні додатково оброблених катетерів зали-■ її*' • • шаеться набагато менша кількість мікробних тіл в 1 [мл змиву обох • . І . • . видів мікроорганізмів в порівнянні з необробленими катетерами.

Таким чином, додаткова обробка промислрвих металевих катетерів для пересадки ембріонів являє собцю засіб профілактики механічного подразнення та пошкодження епітеліального шару ший-

Таблиця 10

. Бактеріальна контамінація шириц-катетєрів. після трьохразового відмн-

Вид* мпсроор- гашзма i Розведен НЯ Експозиція (години) Ріст мікроорганізмів иа пластинчатому агарі (мліл/мл) .

Змив зі шліфованого катетера (п=10) Змив зі нешліфо-ваного катетера 1 (п=10)

Staph, aureus 1:250 4 702,50±81,90* 2500,0±465,4Ь

.Staph, aureus 1:250 6 2000,0±285,96‘ 4000,0±650,0'1

Pseudomonas a. 1:2500 4 У.Оіі.О* 200,0±28,5f

Pseudomonas a. 1:2500 б 40,0±10,2* 1600,Q±240,lh

ки та рогів матки, • а також профілактуе мікробне обсіменіння їх за рахунок зниження контамінації зовнішньої поверхні. Такі катетери можна багаторазово використовувати без спеціальної стерилізації (автоклавування) під час масових пересадок. Використання оброблених катетерів підвищує приживленні ембріонів до, 20%.

Таким чином, результати наших досліджень переконливо доводять, що наявність мікрофлори негативно впливає на приживлення ембріонів. Мікрофлора промивних середовищ в більшості випадків виявляє стійкість до-пеніциліну в комплексі зі стрептоміцином і більш чутлива до гентаміцину в сполученні с ампіциліном. Розроблений та випробований в лабораторних та виробничих умовах засіб деконтамінації ембріонів з додаванням гентаміцину і ампіциліну не приводить до несприятливої дії на ембріони. Комбінація антибіотиків гентамщин-ампіцилін (12 мкг/мл та 100 Од/мл) залишає ембріони від мікробів, що подалі сприяє їх кращому приживленню. Для профілактики мікробної контамінації нами розроб

лено елементи технології вимивання та пересадки ембріонів, а саме: " ' ‘ '

’• 1. Санація статевих шляхів корів.-донорів і телиць-реципієнтів

з експозицією 15 хв. перед ембріотрансплантацією.

2. Введення у промивні буферні середовшца комплексу анти-

біотіків гентамідин з ампіциліном в концентраціях 12 мкг/мл та 100 Од/мл з метою профілактики негативного впливу микроорганізмів на ембріони. - .

3. Вимивання ембіріонів середовищем Дюльбекко з додаванням антибіотиків (гентаміїхин-амшцилін 12 мкг/мл та 100 Од/мл ).

4. Додаткова механічна обробка промислових катетерів для пересадки ембріонів.

. 5. Ізоляція ембріонів від зовнішнього середовища в модер-

■ нізованому приймачі для вимивної рідини. .

ВИСНОВКИ

1. Бактеріальна контамінація статевих шляхів телиць-реципіен-тів знижується у фолікулярну фазу та підвищується у лютеальну фазу статевого циклу у період, що приємний для пересадки ембріонів.

2.Мікрофлора статевих шляхів (Staph, aureus та Е.соїі) у кон-

центрації 850 тис.м.т./мл і більш негативно впливає на приживлення ембріонів після трансплантації їх телицям-реципієнтам. -

З.Обробка слизових оболонок статевих шляхів телиць-реципіентів розчином Люголя з експозицією 15 хвилин імовірно знижує їх" мікробну забрудненість. __

4. Приймач змивів з рогів матки з зігнутою посеред єні трубкою діаметром 5 мм забезпечує збирання їх у повному об’ємі без утворення піни та втрати ембріонів.

5.Додавання у промивні буферні середовшца комплексу антибіотиків (гентаміціпі 12 мкг/мл з ампіциліном" 100 Од/мл) знижує мікробну контамінацію ембріонів,. попереджує, занесення мікроорганізмів у матку та роги реципієнта, а також захворювання матки корів-донорів ендометрітамн.

6. Багаторазове відмивання ембріонів середовищем Дюльбекко з додаванням комплексу антибіотиків (гентаміцин з ампіциліном у концентрації 12 мкг/мл та 100 Од/мл в відповідно) забезпечує повну дсконтамшацію ембріонів та підвищує їх приживлення на 23.6%.

7.ШліфуБ2ішя та полірування зовнішньої поверхні металевих

катетера для пересадки ембріонів до 8 класу знижує мікробну забрудненість інструмента, що подалі сприяє підвищенню приживлення ембріонів. . .

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ.

1.М.етод санації статевих шляхів телиць-реципієнтів розчином Люголя з експозицією 15 хв. пропонується для попередження заносу інфекції у матку під час пересадки ембріонів.

2. Комбінацію антибіотиків гентаміцин 12 мкг/мл з ампіциліном 100 Од/мл пропонується додавати у промивні буферні середовища для вимивання та відмивання ембріонів.

3. Більш якісне шліфування та подальше полірування зовнішньої поверхні металевих інструментів для пересадки ембріонів до 8го класу чистоти пропонується підприємствам-внготовачам.

4. Бактеріологічній контроль змивів з матки та рогів рекомен-

дується проводити один раз у рік у кожного донора з метою визначення загальної бактеріальної забрудненості при вимиванні ембріонів на пунктах трансплантації. - -

' 23 -

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Бугров А.Д., Величко И.М., Зверева Г.С. Санация половых

путей у коров-доноров// Тез. докл. республ. науч.-лрактич конф.-Львов.-1987.- с. 14- 15. .

2.Бугров А. Д., Карташов В.Ф., Передера К.Б., Величко И.М., Коркин В.А., Хмельков В.Н., Шеховцов С.Ю., Невинный Н.А., Зверева Г.С., Шеховцова Е.Ю., Масс А.А. Техническое оснащение украинской технологии трансплантации эмбрионов// Тез. докл. II республ. науч.- произв. конф.- Львов.-1988.- с.13.

3.Величко И.М., Зверева Г.С. Влияние антибиотиков на при-живляемость эмбрионов при их трансплантации //Тез.докл.респ науч. конф.- Харьков.- 1988.- с.59.

4.3верева Г.С., Величко И.М. Санация половых путей у телок-реципиентов/ / Там же.- с.68.

5.3верева Г.С., Величко И.М. Предотвращение микробной контаминации при трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота// Тез. докл. Всесоюзн.научн.-техн. конф.- Ленинград.- 1988.-с. 44.

б.Зверева Г.С. Влияние микробного фактора на приживляемость эмбрионов//Тез. докл..Всесоюзн. совещ. по трансплантации эмбрионов с.х. жив.-^Алма-Ата.- 1989.- с. 15.

7.Карташов В.Ф., Теличка Т.А., Зверева Г.С. Частота случаев дробления ретардированных эмбрионов крупного рогатого скота при их культивировании с различными антибиотиками// Тез. докл. научн.- методич. совещ.- Минск.- 1989.-с.24.

8.3верева Г.С., Величко И.М., Теличка Т.А. Меры предупреждения и профилактика микробной загрязненности вымывных сред и эмбрионов крупного рогатого скота при их трансплантации// Там же.- с.26.

24 '

9.Бугров О.Д., Хмельков В.М., Коркін В.А., Карташов В.Ф.,

Масс А.Л., Шеховцов С.Ю., Невиний Н.О., Зверева Г.С., Шехов-цова О.Ю. Результати використання української технології трансплантації ембріонів великої рогатої худоби племзаводів, плем-прнємств ( УТТЕПП )//Тези доповідей І республіканської наукової конференції,- Львів.- 1990.- с.48.

ІО.Зверева Г.С. Деконтаминацня эмбрионов крупного рогатого скота при их трансплантации// Научно-технический бюллетень №56,- Харьков.- 1990.- с.3-8.

И.Бугров А.Д., Хмельков В.Н., Коркин В.А., Карташов В.Ф., Зверева Г.С., Шеховцова Е.Ю., Мусульбас М.С. Применение трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в племзаводах Украины//Научно-производственная конференция.- Киев.- 1991.-с.61.

12.Бугров А.Д., -Зверева_Г.С., Мусульбас М.С., Хмельков В.Н. Усовершенствование инструментов для пересадки эмбприонов крупного рогатого скота// Научно-технический бюллетень >£>57.-Харьков.- 1991.- с.55-59.

13.Бугров А. Д., Тихона Г.С. Влияние микробного фактора на при-живляемость эмбрионов у коров и телок// Материалы научнопрактической конференции,- посвященной 110-летию со дня рождения Потемкина Николая-Дмитриевича.- Харьков.- 1995. - с.65

14.Бугров А.Д., Тихона Г.С. Деконтаминация эмбрионов крутого рогатого скота// Там же.- с.65

Тихона Г.С. Способы повышения приживляемости эмбрионов крупного рогатого скота при трансплантации. Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специаль- -ности 06.00.27 - биотехнология. Институт животноводства УААН, Харьков, 1996.

В работе изучен видовой состав микроорганизмов половых путей коров и телок. Установлено, что условнопатогенная микрофлора (Staph.aureus и E.coli) отрицательно влияет на приживляемость эмбрионов. Предложены способы предупреждения микробной контаминации на этапах извлечения и пересадки эмбрионов крупного рогатого скота, повышающие их приживляемость.

Tikhona G.S. Methods for increasing pregnancy rate at bovine embryo transfer.

- Thesis on the scientific degree competition of candidate _ of agricultural sciences in the speciality 06.00.27 - biothechnology. Institute of Animal Science of UAAS, Kharkov, 1996.

Species composition of microorganisms in reproductive tracts of cows and heifers was studied in the research. Negative influence of conditional pathogenic microflora on pregnancy rate at embryo transfer was" established. Methods for microbial decontamination at ^bovine embryo recovering and transfer were proposed to increase pregnancy rate.

Ключові слова: велика рогата худоба, мікроорганізм, ембріон, приживлення, трансплантація.

Підписано, до друку 20,05.96.

Обсяг І, О д.а. Замовлення 50 Тираж 100 екз.

Ділянка оперативного руку Інституту тваринництва УААН 312120, м.Харків, п/в Кулинічі. '