Специфичность узнавания генов-мишеней транскрипционными факторами семейства NF-kB

Британова, Людмила Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Специфичность узнавания генов-мишеней транскрипционными факторами семейства NF-kB
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Специфичность узнавания генов-мишеней транскрипционными факторами семейства NF-kB"

на правах рукописи

БРИТАНОВА ЛЮДМИЛА ВАЛЕРЬЕВНА

СПЕЦИФИЧНОСТЬ УЗНАВАНИЯ ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ ТРАНСКРИПЦИОННЫМИ ФАКТОРАМИ СЕМЕЙСТВА №-кВ

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 ДЕН 2009

Москва - 2009

003486875

Работа выполнена в группе "Онкоиммунология" Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Д.В. Купраш

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, проф. С.Г. Георгиева Кандидат биологических наук М.А. Лагарькова

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

'&1//1? 2009 г. в -У^ Часов

Защита диссертации состоится

заседании диссертационного совета Д 002.23*5.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан

46 нл

2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

А.М. Крицын

Актуальность проблемы

Индуцируемые транскрипционные факторы ответственны за изменение профиля экспрессии генов, приводящее к оптимальному по силе и продолжительности клеточному ответу. Одним из ключевых факторов такого рода является ОТ-кВ, участвующий в регуляции множества физиологических реакций. Сложная роль факторов №'-кВ в иммунитете часто описывается в рамках двух сигнальных путей, т.н. классического и альтернативного, в которые вовлечены димеры ИБ-кВ различного субъединичного состава и которые активируют различные наборы генов. Классический (или канонический) сигнальный путь активируется разнообразными рецепторами врожденного и адаптивного иммунитета, включая То11-подобные рецепторы, антигенные рецепторы лимфоцитов и рецепторы провоспалительных цитокинов, и ведет к транскрипционной активации и продукции цитокинов, хемокинов, адгезионных молекул и ряда ферментов, участвующих в воспалительных реакциях. Альтернативный ОТ-кВ путь, прежде всего, активируется рецепторами, принадлежащими суперсемейству ЮТИ. Лиганды к ряду рецепторов ЮТЮ семейства способны активировать оба сигнальных каскада, однако именно альтернативный ОТ-кВ путь в первую очередь отвечает за развитие и поддержание структуры лимфоидных органов и за ответ приобретенного иммунитета. Трудно переоценить важность получения научных знаний в данной области для медицины, так как система ОТ-кВ задействована абсолютно во всех процессах, связанных с активацией иммунитета (как врожденного, так и приобретенного). Кроме того, ИР-кВ является важнейшим антиапоптотическим фактором клеток млекопитающих, что обусловливает интенсивное изучение системы ОТ-кВ в онкологическом контексте. Альтернативный ОТ-кВ путь был открыт недавно и еще не изучен подробно, в частности, на данный момент не известно, что определяет специфичность его действия, т.е. активацию определенного набора генов, отличающегося от такового, характерного для активации классического пути. Простым и изящным объяснением такого рода специфичности могло бы стать дифференциальное связывание различных ДНК-последовательностей димерами ОТ-кВ разного субъединичного состава. Ключевыми исполнительными транскрипционными факторами в классическом и альтернативном сигнальных ОТ-к В каскадах являются гетеродимерные комплексы Яе1А/р50 и Ые1В/р52, соответственно, причем для

последнего не описан консенсус сайта связывания. Поэтому актуально определение консенсусной последовательности связывания транскрипционного фактора RelB/p52 и ее сравнение с таковой для комплекса RelA/p50. Кроме того, гены-мишени альтернативного NF-kB пути выявлены в основном исходя из анализа генетических моделей, и молекулярные аспекты регуляции их транскрипции практически не известны. Поэтому актуально изучение структуры регуляторных областей таких генов, в частности, гена хемокина CXCL13 (также известного как BLC).

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение таких аспектов транскрипционной регуляции через альтернативный NF-kB путь, как вклад узнавания ДНК гетеродимерами NF-kB различного состава в определение специфичности действия альтернативного NF-kB пути по сравнению с классическим, и потенциальные кофакторы и/или белки-партнеры, участвующие в регуляции генов-мишеней альтернативного NF-kB пути. Были поставлены следующие задачи:

1) Разработать систему получения функциональных комплексов полноразмерных зрелых белков группы NF-kB с возможными модификациями, свойственными эукариотическим клеткам.

2) Провести отбор последовательностей, специфически связывающих RelB/p52 in vitro, из пула случайных последовательностей (Random Site Selection). Использовать полученные последовательности для определения консенсуса связывания гетеродимерного фактора ReIB/p52.

3) Оценить способность комплексов RelB/p52 и RelA/p50 к дифференциальному узнаванию последовательностей, полученных при выполнении предыдущей задачи.

4) Методом последовательного дробления перекрывающихся фрагментов ДНК и тестирования данных фрагментов на способность к связыванию белковых факторов in vitro локализовать потенциальные регуляторные области в проксимальной области промотора гена схс113. Оценить функциональную активность обнаруженных потенциальных регуляторных элементов in vivo (в системе с геном-репортером).

Научная новизна

Подобраны условия получения функциональных комплексов полноразмерных зрелых белков семейства NF-kB путем гиперэкспрессии в эукариотических клетках. Полученные данным способом гетеродимерные функциональные комплексы белков были использованы для отбора из пула случайных последовательностей молекул ДНК, связывающих с высокой аффинностью транскрипционный фактор RelB/p52, который является «исполнительным» фактором при активации альтернативного NF-kB пути. Это позволило впервые установить консенсус связывания RelB/p52 in vitro. Консенсусная последовательность 5'-GGGRVWTTYY (где R = А или G; Y = С или Т; W = Т или А; V = А, С или G) оказалась близка к классическому консенсусу Rel/NF-kB, и в наибольшей степени схожа с известным консенсусом связывания гомодимерного фактора RelA/RelA. Кроме того, все последовательности, отобранные по своей способности связывать комплекс RelB/p52, со сравнимой аффинностью узнавали также RelA/p50. Таким образом, впервые установлено, что гетеродимерные комплексы RelA/p50 и RelB/p52 in vitro не демонстрируют значимых различий в предпочтениях к последовательности ДНК в участке связывания. При исследовании структуры проксимальной области промотора гена-мишени альтернативного NF-kB пути хемокина CXCL13 мыши обнаружены два новых потенциальных регуляторных сайта: сайт связывания факторов группы NF-kB и Spl. Впервые показано, что в регуляции базальной транскрипции гена хемокина CXCL13 может принимать участие транскрипционный фактор Spl.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на 7-й Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии, Суздаль, 31 ноября - 2 декабря 2004 г.; на конференции Keystone Symposia, "NF-kappaB: 20 Years on the Road from Biochemistry to Pathology" (D3) Fairmont Banff Springs, Banff, Alberta, March 23-28, 2006; на конференции "11* internetional TNF conference", May 13-16, 2007, Asilomar, CA, USA. Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах группы «Онкоиммунология» ИМБ РАН.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано три статьи и три тезиса конференций. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 176 источников. Работа изложена на 87 страницах машинописного текста, содержит 11 рисунков и 4 таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия полноразмерных гетеродимерных факторов RelB/p52 и RelA/p50 в эукариотических клетках

Транскрипционные комплексы RelB/p52 и RelA/p50 играют ключевую роль в двух различных молекулярных путях генной активации (альтернативном и классическом NF-kB каскадах, соответственно). Ранее для изучения способности белков группы Rel/NF-kB связывать ДНК-последовательности in vitro использовались рекомбинантные укороченные факторы, экспрессированные в бактериях. Мы же применили систему гиперэкспрессии полноразмерных транскрипционных факторов в эукариотических клетках, так как для адекватного исследования ДНК-связывающей способности гетеродимерных факторов RelB/p52 и RelA/p50 необходим источник рекомбинантных белков с оптимальной комбинацией таких характеристик, как высокая концентрация, нативная конформация и возможные пост-трансляционные модификации. С этой целью использовались суммарные клеточные лизаты клеток 293 НЕК, ко-трансфецированных рекомбинантными векторами, несущими требуемые компоненты гетеродимерных комплексов. Оказалось, что оптимальным соотношением плазмид, кодирующих нужные белки, является 1:1, как для получения гетеродимерного комплекса RelB/p52 (Рис. 1), так и для RelA/p50 (данные не показаны).

Правильность состава гетеродимерных комплексов была подтверждена методом гель-ретардации, в том числе с использованием антител, специфично узнающих индивидуальные субъединицы комплексов (Рисунок 1). ДНК-связывающая активность проверялась путем анализа связывания двуцепочечных синтетических олигонуклеотидов с известными NF-kB-связывающими характеристиками (Рис.1, дорожки 6-8, и данные не показаны). В присутствии соответствующего количества неспецифического ДНК-конкурента оба RelB/p52- и RelA/p50- содержащие лизаты клеток, ко-трансфецированных соответствующими экспрессионными конструктами в соотношении 1:1, демонстрировали сильное специфичное связывание классического сайта кВ из промотора гена M-CSF и не демонстрировали детектируемого связывания с мутантным кВ сайтом. Следовательно, наша система

гиперэкспрессии №-кВ белков позволяет получить рекомбинантные белки, обладающие требуемыми характеристиками.

Пробе:

Re&p&Z соотношение

R<NB/p52 несп.

H-CSFkS M-CSF k8 ап6-*е

M-CSf k8

Антияекл: супершмфг «Ц

Рисунок 1. Эффективная экспрессия гетеродимерного комплекса Ке1В/р52 в клетках 293 НЕК. А. Связывание с положительной (М-С8Р кВ, содержит сайт ОООАСТТТСС из гена М-СБР) и отрицательной (апП-кВ, содержит мутантный сайт ТСОАСТТТСС) контрольными кВ последовательностями при различном соотношении экспрессионных векторов в ко-трансфекции. Оптимальное связывание (что отражает оптимальное формирование требуемого гетеродимерного комплекса) наблюдается при соотношении 1:1. Б. Правильность субъединичного состава гетеродимерного комплекса подтверждается узнаванием специфическими антителами анти-р52 (к субъединице р52) и анти-ЛеШ (к субъединице ЯеШ).

Установление оптимального консенсуса связывания фактора ReIB/p52 in vitro

Функциональные гетеродимерные комплексы полноразмерных транскрипционных фактров, экспрессированных в эукариотических клетках, могут быть использованы для отбора последовательностей, специфически связывающих RelB/p52 in vitro, из библиотеки случайных последовательностей (Random Site Selection). Этот метод, но с использованием белков, экспрессированных в бактериях, ранее применялся для определения предпочтительных сайтов связывания гомодимерных комплексов NF-кВ состава р50/р50, RelA/RelA и cRel/cRel (Kunsch etal., 1992). В качестве исходного набора последовательностей использовалась библиотека двуцепочечных фрагментов ДНК, которые содержали последовательность из 10 случайных нуклеотидов ("ядро") с известными фланками. Эта библиотека обогащалась RelB/p52-CBfl3bmaiouniMH последовательностями путем проведения нескольких циклов, включающих радиоактивное мечение ДНК-проб, разделение нуклеопротеидных комплексов в не денатурирующем полиакриламидном геле (гель-ретардация), элюцию ДНК из зоны

геля, содержащей комплекс с Яе1В/р52, и амплификацию полученного материала методом ПЦР. Полученная библиотека фрагментов была клонирована в вектор рОЬЗЬаэю; индивидуальные клоны выделены и секвенированы. В двух независимых экспериментах было проанализировано более 200 клонов. Среди проанализированных последовательностей из полученных библиотек только 25 не демонстрировали детектируемого связывания ни с гетеродимером 11е1В/р52, ни с Яе1А/р50. Также следует отметить, что все они были представлены в библиотеке уникальными клонами, что говорит в пользу случайности их наличия в конечной выборке. Оставшиеся клоны образуют 40 кластеров, каждый из которых представляет уникальное 10-нуклеотидное ядро, и 16 кластеров клонов с 11-нуклеотидными ядрами, большинство из которых представлены уникальными клонами (см. Таблица 1, №№41-56). Некоторые из кластеров с 10-нуклеотидным ядром содержат по одному клону, тогда как другие представлены большим числом, вплоть до 26 клонов с прямой или обратной ориентацией последовательности ядра (Таблица 1).

Таблица 1. Пуклеотидная последовательность сайтов связывания гетеродимерного комплекса 1{е1В/р52, отобранных из пула случайных последовательностей (по результатам двух независимых экспериментов).

# последовательность1 количество клонов ¡те геу Яе1А/р50 аффинность2 Яе1В/р52 аффинность'

1 ООТАСТТТСС 8 . +++ +++

2 ООООАТТТСС 16 7 ++++ ++++

3 ООСОААТТСС 7 12 ++++ ++++

4 ООООСТТТСС3 7 2 ++++ +++

5 ОООООТТТСС 19 7 ++++ ++++

6 ОООАСТТТСС4 11 4 ++++ ++++

7 ОООООАТТТС 1 2 ++ ++

8 ООООААСТСС - 3 ++++ ++

9 ооосттттсс 4 3 ++++ ++

10 ООТОСТТТСС 2 - +++ +++

11 ООООААТТСТ 1 - + +

12 СТШАООТШ 1 - + +

13 ОАССАТОСОС 1 - ++ +

14 ооооотптг 5 3 ++ ++

15 оооооттссс 2 - +++ +++

16 АСОООААТТТ 3 1 + ++

17 ООСОАТТАСС 2 2 ++ +++

18 СООАСТПТС 1 1 + ++

19 ОСОООАТТСС 1 - +++ ++++

20 ОООООТТТАС 1 3 ++ ++

21 GGGACTTTTT 1 - + ++

22 GAGGGGAATT - 1 ++ +++

23 GGGGAATTTT 1 2 + ++

24 GGGGTTTCCC 1 - ++ ++

25 TGGGGGTTTT 1 + +

26 AGGGGGTTTT - ++ ++

27 GGGATTTTCC 1 ++ ++

28 GGTACTTTAC 1 - + +

29 GGGGATTCCC 1 2 +++ ++++

30 GGGGCTTTTT 1 - ++ ++

31 AGGGGATTTT 2 ++ ++

32 GGGGAAAACC 1 - ++ +++

33 GGAAACTACC 1 - ++ +

34 GGGGAATTTG . 2 + +

35 GGGTAATTCC - 1 ++ +

36 GGGGAATACC - 3 ++ +++

37 GGGAAGTACC . 1 ++ ++

38 GGGGGGTTTT 1 - ++ ++

39 GGGACTTTAC 1 - ++ ++

40 GGGGATTTAC 1 - ++ ++

41 GGGCCTTTCCA 1 _ + +

42 GGGGGCTTTCT 1 - + ++

43 GGGGAATCCCC 1 - ++++ ++++

44 GGGGACTTCCC5 1 - ++++ ++++

45 GGGGTTTCCCC 1 - ++++ ++++

46 GGGGAGTTTCC6 1 ++++ ++++

47 GGGTGGTTTCC 1 - +++ +++

48 GGGGAAGTCCC5 1 - +++ ++++

49 GGGTlTirCCC 1 - ++ +++

50 GGGGGTTTTAC 1 - ++ ++

51 GGGAAACTCCC 1 - ++++ +++

52 GGGGAATTCCG 1 - +++ +++

53 GGGAAAACACC 2 - ++++ +++

54 GGGTACTTTCC 2 - +++ ++

55 GGGGGGTTTCC 1 - ++++ +++

56 GAGGGGAATTC - 1 ++ ++

1 В каждом ряду под одним номером представлен кластер клонов с одинаковой последовательностью между фланками в прямой (fw) и обратной (rev) ориентации, Кластеры №№ 41-56 содержат 11-нуклеотидный кор. Количество клонов в прямой (fw) и обратной (rev) ориентациях указано в колонках 3 и 4, соответственно.

2 Относительная аффинность связывания комплексов RelA/p50 и RelB/p52 с пробами, полученными амплификацией с одного из клонов в каждом кластере. Значение относительной аффинности получено номализацией по отношению к пробе, содержащей кВ сайт из промотора M-CSF (проба №6 в прямой ориентации). Для кластеров, для которых была определена аффинность обеих проб (и в прямой, и в обратной ориентации), приведено среднее по двум значениям. Градация относительной аффинности связывания: ++++, более 75% относительно силы связывания с M-CSF кВ; +++, между 50% и 75%; ++, между 25% и 50%; +, менее 25%.

3 6 Пробы содержат известные кВ сайты из промоторов генов 3JunB, 4M-CSF, 51Р-10 и

6RANTES, соответственно

Мы наблюдали значительную корреляцию между такими параметрами, как относительная аффинность связывания и репрезентативность кластеров (т.е. количество клонов в одном кластере относительно суммарного числа клонов): большинство высокоаффинных кластеров содержит от 3 до 26 индивидуальных клонов (например, №№ 1-6, Таблица 1), тогда как большинство сайтов с умеренной аффинностью представлены 1-2 клонами (Таблица 1, №№ 37-40). Интересно, что 10 из 16 кластеров с 11-нуклеотидными ядрами ( Таблица 1, №№ 41-56) демонстрировали очень сильное связывание с гетеродимерами Яе1В/р52 и Яе1А/р50. Объяснением данного феномена может служить тот факт, что участок контакта гетеродимера ОТ-кВ с ДНК содержит 10 частично вырожденных нуклеотидных позиций, следовательно, 11-нуклеотидное ядро потенциально содержит два перекрывающихся сайта связывания ОТ-кВ.

1 г 1 4 5 S 7 8 9 10

т 1 i 11 1 9 121 1S1 153 32 25

с 1 0 а 1 38 1 3 7 132 144

ч 162 is» и» 1S9 57 7 2 0 1 г

А S 2 1 31 «а 43 в 12 7 0

Т И I

S' " 3'

Рисунок 2. Графическое представление консенсуса оптимальных сайтов связывания, отобранных для ReIB/p52 из пула случайных последовательностей.

Последовательность "logo" была получена с помощью программного обеспечения Weblogo (Crooks et al., 2004), доступного онлайн по адресу http://weblogo.berkelev.edu/logo.cgi. В таблице над графиком приведена частота каждого нуклеотида в каждой из 10 позиций сайта связывания.

На основе полученных последовательностей с 10-нуклеотидным ядром был определен консенсус предпочтительного сайта связывания RelB/p52 in vitro (Рисунок 2), который может быть представлен в упрощенном виде как 5-GGGRVWTTYY (где R = А или G; Y = С или Т; W = Т или А; V = А, С или G). Обнаруженный консенсус в наибольшей степени схож с консенсусом, определенным для гомодимерного комплекса RelA/RelA (Kunsch et al., 1992), но также очень схож с классическим

консенсусом для гетеродимера RelA/p50 5-GGGRNYYYCC-3' (Chen et al., 1998; Chen and Ghosh, 1999).

Отобранные из пула случайных последовательностей сайты связывания фактора RelB/p52 узнают комплексы RelB/p52 и RelA/p50 со сравнимой аффинностью

Маш эксперимент по установлению предпочтительного мотива связывания для комплекса RelB/p52 не выявил ни однго ядра, специфически связывающего Яе1В/р52 либо с Яе1А/р50: все отобранные последовательности или связывают оба комплекса RelB/p52 и RelA/p50 со сравнимой аффинностью, или не связывают ОТ-кВ вообще (Рис. 3, Таблица 1 и данные не показаны). Несколько проб продемонстрировали некоторое предпочтение по отношению к одному из использованных в опыте гетеродимерных комплексов ОТ-кВ перед другим (например, №№ 4, 8, 9, 13 для RelA/p50, №№ 16-20, 22, 23, 29, 32, 36 для Ке1В/р52, см. Таблицу 1), однако, подобные эффекты были весьма умеренными, разница в относительной аффинности связывания оказывалась не более чем 2-3 -кратной.

1 2 7-tvr 4 Snr €~к g~& ё—Я. вП Г~Х

В А ВАВАВАВАВА ST5

BS-----—-------

. В А

13 14 В А § А §~~А

д. "ЯЯШВ'

Гв

МП*

28 30 31rev 33 3<lrev 6

Л-В Х-Е ¿Г~В А В А~В

Рисунок 3. Отобранные из пула случайных последовательностей участки связывания RelB/p52 узнают гетеродимеры RelA/p50 и RelB/p52 со сравнимой аффинностью. А.

Пример полноразмерного геля, на котором оценивалась активность связывания анализируемых последовательностей с гетеродимерными комплексами RelB/p52 ("В") и RelA/p50 ("А"). Пробы, узнающие NF-kB со значимой аффинностью, пронумерованы в соответствии с номерами кластеров, содержащих клоны с данной вставкой. Проба №6 содержит кВ сайт из промотора гена M-CSF. В. Гель-ретардация с пробами, содержащими последовательности из библиотеки, обогащенной сайтам узнавания RelB/p52. Нумерация с расширением "rev" соответствует последовательности с указанным номером, но в обратной ориентации. Последовательности, не продемонстрировавшие значительного по силе связывания, не пронумерованы.

Таким образом, мы не обнаружили высокоаффинных NFkB-связывающих последовательностей ДНК, специфических для RelB/p52. Учитывая достаточную представительность нашей выборки, можно предположить, что таких последовательностей не существует в природе.

Опубликованный сайт BLC-kB из промотора гена схс113 мыши не связывает полноразмерные гетеродимерные комплексы NF-kB

Единственной опубликованной последовательностью ДНК, для которой было показано значимо различное сродство к гетеродимерным комплексам RelB/p52 и RelA/p50, и которая потенциально обладает способностью к дискриминации классического и альтернативного NF-kB путей на уровне связывания ДНК, является BLC-kB (Bonizzi et al., 2004). Bonizzi и соавторы использовали комплексы укороченных белков RelA/p50 и RelB/p52, экспрессированных в бактериях. Мы исследовали, сохраняется ли та же дифференциальность связывания с сайтом BLC-kB гетеродимеров полноразмерных Rel/NF-kB, экспрессированных в эукариотических клетках. К нашему удивлению, ни RelA/p50-, ни RelB/p52-содержащие лизаты клеток 293 НЕК не обнаружили детектируемого связывания с BLC-kB (Рис.4Б). Таким образом, мы показали, что гетеродимерный комплекс RelB/p52, образованный in vitro с использованием укороченных белков, экспрессированных в бактериях, не способен воспроизвести ДНК-связывающие свойства полноразмерных факторов из эукариотических клеток. Можно предположить, что отсутствующие в укороченных рекомбинантных белках домены и/или посттрансляционные модификации, специфические для эукариотических клеток, ответственны за формирование правильных гетеродимерных комплексов либо за образование необходимых ДНК-белковых взаимодействий. В то же время мы показали слабое, но заметное связывание Rel/NF-kB комплексов с последовательностью hBLC-kB из промотора гена хемокина CXCL13 человека, которая соответствует позициям, гомологичным таковым в участке BLC-kB мыши (Рисунок 4А, В). Предпочтительности в связывании с комплексом RelB/p52 либо ReA/p50 последовательность hBLC-kB не обнаруживает (Рисунок 4В). Кроме того, эта последовательность не является консервативной (Рисунок 4А), в то время как многие известные кВ сайты абсолютно консервативны между человеком и мышью

(Leung et al., 2004), как и большинство компонентов сигнальных путей, активирующих белки группы NF-kB. В частности, не было выявлено функциональных различий между RelB и его человеческим гомологом I-Rel (Bours et al., 1994). Поэтому способность последовательности hBLC-kB узнавать белки Rel/NF-kB in vitro вовсе не обязательно играет какую-то роль in vivo.

mBIiC CAAGACGAATTTCTTCTTCTGTAAAGGCAAGCTCAGCAATATTTTGGGÄGÄTITGAAAAC hBLC CAAGA-GAAGTTT------TAAAAAAGCAAGCTCAGCAATATTT-GGGGGCTTTTAAAGC

rBLC CAAGATGAATTTCTTTTCCTGCAAAGGCAAGCTCAGCAATATTT-GGGAGATTTGAAAAC ***** *** ** * *** ****************** *** * *** *** *

==BLC-kB==

MS/p52 R»lA/p50

ßpotfa:

M-CSFkB BLC-kB

Рисунок 4. Комплекс полноразмерных белков RelB/p52 не связывает сайт BLC-kB мыши. А. Выравнивание промоторной области гена хемокина BLC мыши (mBLCprm, верхний ряд), содержащей сайт BLC-kB (Bonizzi et al., 2004) с гомологичными областями промоторов в геноме человека (hBLCprm, средний ряд) и крысы (rBLCprm, нижний ряд). Звездочками обозначены позиции консервативных нуклеотидов. Б. Комплекс RelB/p52 связывает M-CSF кВ сайт, но не связывает мышиный BLC-kB сайт. Оптимальное связывание последовательности M-CSF кВ имеет место при соотношении 1:1 плазмид, кодирующих RelB и р52, использованных в ко-трансфекции. В. Сайт кВ в промоторе BLC человека узнает RelA/p50 и RelB/p52 с низкой аффинностью. Звездочками обозначены ДНК-белковые комплексы более высокой подвижности, образованные продуктами частичного протеолиза в данном эксперименте получения гетеродимеров RelA/p50.

Участок BLC-kB еще раз исследовался в недавней работе Fusco и соавторов (Fusco et al., 2009), где методом измерения анизотропии флуоресценции в растворе показано сравнимое связывание этого сайта BLC-kB с комплексами RelB/p52 и ReA/p50, восстановленными in vitro с использованием субъединиц, экспрессированных в бактериях (Fusco et al., 2008, 2009). В то же время авторы подтверждают наши данные об отсутствии детектируемого комплекса белок-ДНК в нуклеопротеиновом

геле. Причина столь разительных отличий в результатах, полученных разными методами, пока остается неизвестной. Однако в любом случае не наблюдается дифференциальное™ в связывании участка сайта BLC-kB димерами состава RelA/p50 и RelB/p52 (что согласуется с нашими выводами). К сожалению, характеристики комплекса RelB/p52/flHK, описанные в данной работе, неоднозначны, поскольку большая часть ключевых экспериментов выполнена с использованием белков, которые экспрессированы в бактериях и не являются полноразмерными (у RelB удален уникальный среди белков семейства Rel/NF-kB и при этом консервативный N-концевой участок, содержащий домен лейциновой молнии), а последовательность сайта BLC-kB, приведенная в статье, не соответствует таковой в геноме мыши.

В то же время, наши данные указывают на то, что in vitro RelB/p52 демонстрирует такие ДНК-связывающие свойства, которые не могут полностью объяснить селективность действия этого транскрипционного фактора in vivo. Возможно, существенную роль in vivo играют низкоаффинные RelB/p52-cпeцифичныe участки связывания, выявление которых требует дальнейших исследований, так как наши эксперименты были нацелены в основном на отбор высокоаффинных участков связывания. Также возможно, что кВ последовательности, которые связывают RelB/p52 и RelA/p50 со сравнимой аффинностью т vitro, могут проявлять селективность в контексте нативных промоторов в клетках и тканях, где наблюдается эндогенная экспрессия соответствующих генов-мишеней (Hoffmann et al., 2003; Saccani etal, 2003).

Потенциальные регуляторные цис-элементы в промоторе гена хемокина CXCL13 - мишени альтернативного NF-kB пути

Ассоциация RelB-содержащих NF-kB комплексов со специфическим набором генов-мишеней, в частности, с геном схс113, была показана в нескольких независимых исследованиях с использованием иммунопреципитации хроматина (Bonizzi et al., 2004; Croxton et al., 2006). Наличие у этого связывания важной биологической роли подтверждается анализом фенотипов мышей, мутантных по генам альтернативного пути активации NFkB (Banks et al., 1995; Burkly et al., 1995; Yilmaz et al., 2003; Siebenlist et al., 2005). Наличие RelB/p52-cпeцифичнoгo участка связывания в

промоторе гена-мишени было бы наиболее простым и прямым объяснением данного явления, однако, как было показано выше, специфичность единственной опубликованной последовательности с такими свойствами (BLC-kB) вызывает сомнения. Поэтому мы продолжили анализ проксимальной области промотора гена CXCL13 в поисках дополнительных регуляторных цис-элементов, содержащих участки связывания как известных регуляторов экспрессии этого гена, так и других транскрипционных факторов, указывающих на другие возможные пути передачи сигнала.

Промотор гена хемокина CXCL13 содержит два потенциальных NF-kB-зависимых цис-элемента

Для функционального анализа последовательность проксимальной области промотора хемокина CXCL13 (от -810 до +183 относительно начала транскрипции) была разбита на более короткие перекрывающиеся участки. На рис. 5А,Б приведена наиболее консервативная и наиболее интересная, по данным наших экспериментов, область промотора от -255 до +183. Радиоактивно меченные перекрывающиеся фрагменты промотора (Рис. 5Б) были синтезированы при помощи ПЦР и использовались как пробы для анализа ДНК-связывающих белков из суммарных лизатов клеток линии НЕК 293, трансфецированных конструктами, кодирующими различные гетеродимеры процессированных форм белков Rel/NF-kB (Рис. 6А). Следует отметить, что во всей исследованной области мы не обнаружили дифференциального связывания RelB/p52 по сравнению с RelA/p50 (Рис. 6А и данные не показаны). Если говорить о факторах Rel/NF-kB, данное наблюдение согласуется с ранее полученными результатами об отсутствии сильных специфических участков связывания in vitro для комплекса RelB/p52 по отношению к RelA/p50 (см. выше).

Положение потенциальных регуляторных цис-элементов в проксимальной области промотора гена хемокина CXCL13 приведено на Рис.5Б,В. Сильное связывание с лизатами из клеток НЕК 293 продемонстрировала проба 075 и ее более короткие фрагменты 075-2 и 075-3 (Рис. 6А), которые содержат потенциальные, предсказанные in silica, kB сайты h4 и тЗ, соответственно. Проба 075-1, не демонстрирующая сильного связывания в нашей системе, содержит сайт BLC-kB (Bonizzi et al., 2004), не имеющий значимого сродства к полноразмерным гетеродимерам NF-kB, как было показано ранее.

mBLC —TCTCCTCTTTTTTATTCACCCTCAAATCTCCACAGCATC—CCTGACATTTTTAATCT

hBLC —TCTCCCC----------ACCCTCAGATTTCTCCAGTGTCT—CTGGCACTTATAGTCC

rBLC ATTCTCCTCCTATTT—TCACCCTCGAATCTCTGCAGCATCTCCCTAACACTGGTAGTCT

mBLC GCATTTTTAAGAAGTGTTTGGTTATACTAACAGTGCTCCAAGGAAGATTCATAAATTTTG

hBLC ATGTTTGCAAGAAATATTTTATTATA------GTGCTCTGAAACAAATTTATAAAGTTTG

rBLC GCATTTTCA---AATGTTTGGTTATACAAACAGTGCTCTAAGGAAGGTTCGTAAATTTTG

mBLC CAAGACGAATTTCTTCTTCTGTAAAGGCAAGCTCAGCAATATTTTGGGAGArrrGAAAAC

hBLC CAAGA- GAAGTTT------TAAAAAAGCAAGCTCAGCAATATTT-GGGGGCTTTTAAAGC

rBLC CAAGATGAATTTCTTTTCCTGCAAAGGCAAGCTCAGCAATATTT-GGGAGATTTGAAAAC

= BLC-kB ==

mBLC TGACATTGCAGCTGACCTAAGAAAGAGAGGGTCAGTGGGAGGGCCCTGGCTGG-TATAAA hBLC TGATGATGCAGCTGACCTACTGGAGACAAAGGCAGTGGGAGGGCCCTTACTGG-TATAAA rBLC TGACATCGCAGCTGACCTACGGAAGACAGA—CAGTGGGAGGGCCCTCGCTGGGTATAAA

=- h4 —,

mBLC TAAATAGGAGTCT—GGAGCTGGGAATGCAC-GCACAGACTCCGAGCTAAAGGTTGAACT hBLC TAAATAGGAGTCTCTGGTACTGCAAACCCACAGCCTGGACTCAGAGCTCAAGTCTGAACT rBLC TAAATAGGAGTCT—GGAGCTGGAAACACAT-GCCTAGACTGAGAGCTGAAGGGTGAACT

== m3 ==

mBLC CCACCTCCAGGCAGAATG hBLC CTACCTCCAGACAGAATG rBLC CCACCTCCAGGCAGAATG

Рисунок 5. Структура проксимальной области промотора гена схс113 и первичный анализ связывания in vitro. А — Экзон-интронная структура гена хемокина CXCL13. Незакрашенные прямоугольники соответствуют нетранслируемым участкам кДНК. Б — Схема проксимальной области (-255 до +183) и ДНК-пробы, использованные в анализе связывания in vitro. В — Сравнительный анализ наиболее консервативного проксимального участка (-265 до +35). Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена мыши, человека и крысы выполнено с помощью программы ClustalW. Поиск потенциальных регуляторных элементов выполнен с помощью программ AIibaba2 и Match 1.0. Подчеркнуты последовательности сайтов: тЗ, h4 -предсказанные in silico kB-сайты, BLC-kB (Bonizzi et а!., 2004).

293 В А 293 В А 293 В

075-1 075 2 075-3

В А 293 В А 293 В А 293

Проба: 076-3

ihi \irri: 293 А

RelA/p50H

Проба: M-CSF кВ

Лизам: 293 В

Антитепа: / Супершифт •>- г > А ReB/p52^ ЩЩ

гпЗ 293 В

/$>оба: 075-2

Лизат: 293 А

h4 293 А

Проба: M-CSF кВ Лизат: 293 В

J' ^

Супершифт ф- , I

ReBip52 -»- ЩИ

Рисунок 6. Связывание сайта тЗ обеспечивается факторами семейства NF-kB, в то время как сайт h4 специфически связывает другие белки. А — Анализ связывания указанных проб (см. схему на Рис. 5Б) in vitro методом задержки ДНК в нуклеопротеиновом геле. 293 — суммарный лизат из нетрансфицированных клеток; А — лизат из клеток НЕК293, ко-трансфецированных конструкциями, несущими RelA и р50; В

— лизат из клеток, ко-трансфицерованных конструкциями, кодирующими RelB и р52. Б,В

— Анализ специфичности связывания проб 075-2 и 075-3, содержащих предсказанные сайты шЗ (Б) и h4 (В). "Конкурент" — немеченый двухцепочечный олигонуклеотид-конкурент. "Супершифт" - ДНК-белковые комплексы со специфическими антителами. M-CSF кВ - каноническая последовательность из гена M-CSF, связывающая белки Rel/NF-kB; anti-kB - нуклеотидная последовательность, не узнающаяся белками семейства Rel/NF-kB; "Анти-RelB" — антитела, специфически узнающие фактор RelB.

Мы подтвердили специфичность образования ДНК-белковых комплексов с участием фрагментов 075-2 и 075-3. Для участка тЗ, расположенного в пробе 075-3, доказано специфическое формирование ДНК-белкового комплекса при участии факторов кВ (Рис. 6Б). Что касается комплекса, образующегося при участии пробы 075-2,

содержащей сайт h4, мы показали, что этот специфический комплекс появляется в ответ на трансфекцию клеток, но не зависит от экспрессии активных факторов NF-кВ (данные не показаны), и сами белки семейства NF-kB не участвуют в его формировании (Рис. 6В).

Таким образом, анализ образования ДНК-белковых комплексов in vitro выявил в промоторе гена CXCL13 два дискретных участка узнавания ДНК-связывающих белков, которые могут представлять собой искомые регуляторные цис-элементы.

Сайт h4 распознается транскрипционным фактором Spl

Анализируя нуклеотидную последовательность сайта h4 (от -63 до -54, рис. 5В), и учитывая литературные данные о кооперативной регуляции факторами Spl и NF-kB генов, активируемых через классический NF-kB путь, мы предположили, что с этим участком могут связываться белки семейства Spl. Это предположение было подтверждено методом задержки ДНК в нуклеопротеиновом геле с помощью специфических антител к фактору Spl (Рис. 7А).

Пробк Аятатяк

Сумршмфт-«. Spl-*

Рисунок 7. Нуклеотидная последовательность h4 узнается фактором Spl. В клетках НЕК 293, трансфецированных экспрессионными конструктами, кодирующими факторы NF-kB (А) и суммарном лизате стромы селезенки мышей С57/В16 (Б) присутствуют белки, узнающие сайт h4. Анти-spl — антитела, специфичные к фактору Spl, sp-1 -- проба содержит классический GC-бокс, узнающий фактор Spl, использовалась в качестве положительного контроля (Dynan et al., 1983; Shi et al., 2001). Стрелками показано положение специфических ДНК-белковых комплексов.

Кроме того, мы показали, что не только в клетках НЕК 293, но и в нативной строме селезенки мышей (где хемокин CXCL13 экспрессируется на высоком уровне)

присутствуют белки, способные к специфическому связыванию с участком h4 и узнаваемые антителами к Spl (Рис. 7Б).

Потенциальные регуляторные цис-элементы шЗ и h4 активны в контексте промотора in vivo

Мы проанализировали функциональность сайтов тЗ и М в контексте промотора in vivo. Для этого проксимальная область промотора гена CXCL13 (-796 +12) была клонирована в вектор с геном-репортером pGL3 -Enhancer. Методом ПЦР-мутагенеза были получены конструкции, где сайты шЗ и h4 в промоторной области были заменены на мутантный кВ сайт "anti-kB". Последовательность anti-kB, ранее уже использованная в качестве отрицательного контроля, не связывается ни с белками Rel/NF-kB, ни с другими ДНК-связывающими белками, как в формате короткого олигонуклеотидного дуплекса (Рис. 8А), так и в контексте промотора в составе более длинного фрагмента (Рис. 8Б).

Активность репортерных конструктов изучалась в клетках НЕК 293. Помимо способности исследуемого промоторного участка к активации базовой транскрипции гена-репортера, анализировалась его способность к индуцируемой инициации транскрипции. Для этого одновременно с анализируемыми конструктами проводилась ко-трансфекция плазмидами, кодирующими Rel/NF-kB факторы. Согласно результатам люциферазного теста (Рис. 8В), сайт h4 абсолютно необходим для базальной транскрипции гена-репортера в клетках НЕК 293, так как его мутация (конструкт mut4) полностью нарушает экспрессию гена-репортера. Мутация же сайта шЗ снижает индуцируемую экспрессию (по сравнению с конструкцией, содержащей последовательность дикого типа).

Полученные данные позволяют предположить, что охарактеризованные нами последовательности шЗ и h4 участвуют в регуляции экспрессии хемокина CXCL13, причем тЗ, скорее всего, необходим для индуцируемой транскрипции гена CXCL13, регулируемой RelB/p52, а h4 необходим для базальной транскрипционной активности гена.

Рисунок 8. Сайты шЗ и h4 активны в контексте промотора in vivo. А, Б — Связывание природного (h4) и мутантного (Mut4) сайтов лизатами из клеток НЕК293, трансфицированных RelA/p50 (А) и RelB/p52 (В). Проба Mut4 представляет собой последовательность anti-kB, замещающую h4 в контексте природного промотора схсПЗ. Пробы 075-2 и 075-2-Mut получены ПЦР-амплификацией фрагмента 075-2 с двух вариантов промотора схсПЗ: дикого типа и содержащего мутацию Mut4. В — Люциферазный тест в клетках НЕК 293. pGL3EnhK- (он же pGL3-Enhancer), pGL3Control — нормирующие контрольные конструкции, векторы фирмы "Promega"; blc-796 — конструкция на основе pGL3-Enhancer, содержащая нативный промотор (-796 ... +12) гена схсПЗ мыши; mut3, mut4, mut3mut4 - конструкции на основе pGL3-Enhancer, содержащие ту же промоторную область (-796 ... +12), в которой сайты гаЗ, h4 по отдельности и одновременно заменены мутантной последовательностью "anti-kB". RelA/p50, RelB/p52 — клетки дополнительно ко-трансфицировали плазмидами, кодирующими факторы NF-kB.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Понимание молекулярных основ транскрипционной специфичности таких регуляторных факторов, как белки группы Ке1/ЫР-кВ, не только является основой фундаментальных знаний о клеточной физиологии, но и предоставляет теоретическую базу для разработки фармакологических препаратов. Альтернативный ОТ-кВ путь представляет собой сигнальный каскад, незаменимый для полноценного ответа адаптивного иммунитета. Так как открыт он был относительно недавно, немного известно об условиях, обеспечивающих специфичность его действия относительно классического ОТ-кВ пути. В данной работе мы показали, что эта специфичность не объясняется собственным свойством гетеродимерного комплекса Кс1В/р52 узнавать консенсусный участок связывания, отличный от такового для Ле1А/р50. Кроме того, так как наши результаты, полученные в экспериментах с использованием полноразмерных белков, экспрессированных в эукариотических клетках, противоречат ранее полученным данным по свойствам укороченных белков, экспрессированных в бактериях, то эта работа еще раз подчеркивает важность выбора адекватной системы для изучения того или иного биологического объекта.

Проведенный нами анализ проксимальной области промотора гена хемокина СХСЫЗ, являющегося мишенью альтернативного ОТ-кВ пути, позволил локализовать два потенциальных регуляторных элемента, содержащих участки связывания транскрипционных факторов ЯеШР-кВ и ЭрК Кроме того, мы показали, что гетеродимеры Яе1А/р50 и Яе1В/р52 не проявляют различий в способности к связыванию с промотором гена хемокина СХСЫЗ и индукции транскрипции с этого промотора в системе с геном-репортером. Этот факт согласуется с полученными ранее данными о сходстве консенсусных последовательностей сайтов связывания комплексов Яе1А/р50 и Яе1В/р52.

Таким образом, результаты данной работы указывают направление дальнейших исследований факторов и условий, определяющих специфичность действия альтернативного ОТ-кВ пути, в частности, специфичность эффективного привлечения комплекса 11е1В/р52 к промоторам генов-мишеней.

выводы

1. При помощи гиперэкспрессии в эукариотических клетках получены функциональные гетеродимерные комплексы полноразмерных зрелых белков семейства NF-kB.

2. С помощью аффинной селекции из пула олигонуклеотидов со случайной последовательностью ДНК впервые проклонирован репрезентативный набор участков связывания гетеродимерного транскрипционного фактора RelB/p52. На основании этой выборки определена консенсусная последовательность участка связывания RelB/p52 in vitro.

3. Впервые установлено, что полноразмерные гетеродимерные комплексы RelB/p52 и RelA/p50 при связывании с ДНК in vitro демонстрируют сходные предпочтения к последовательности ДНК в участке связывания. Таким образом, различие в биологических эффектах между RelB/p52 и RelA/p50 не определяется на уровне ДНК-белкового узнавания.

4. В промоторной области гена хемокина CXCL13 мыши обнаружены два новых потенциальных регуляторных участка, связывающих транскрипционные факторы семейств NF-kB и Spl.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Britanova L.V., Makeev V.J., Kuprash D. V. 2008. In vitro selection of optimal RelB/p52 DNA-binding motifs. Biochem Biophys Res Commun. 365, 583-588.

2. JI.B. Британова, Д.В. Купраш. 2009. Новые потенциальные регуляторные цис-элементы в промоторной области гена хемокина CXCL13, находящегося под контролем альтернативного NF-kB пути. Молекулярная биология 43,657-665.

3. JI.B. Британова, Д.В. Купраш. 2009. Контроль активации и специфичности NFkB: фенотипический анализ мышей с нокаутами по компонентам этой системы. Российский Иммунологический Журнал 3(12), 209-226.

Тезисы докладов

1. JI.B. Британова, Е.А. Сурова, Е.К. Кольцова, С.А. Недоспасов, Д.В. Купраш, Роль альтернативного пути в транскрипционной регуляции генов хемокинов. 7-я Международная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии, ноябрь 2004, Суздаль, Россия.

2. L.V.Britanova, K.B.Majorov, E.A.Sourova, S.A.Nedospasov, A.S.Apt, D.V.Kuprash Transcriptional regulation and genetic polymorphism of B-lymphocyte chemoattractant (BLC) gene. Keystone Symposia, "NF-kappaB: 20 Years on the Road from Biochemistry to Pathology" (D3) Fairmont Banff Springs, Banff, Alberta, March 23-28,2006

3. D.V. Kuprash, L.V.Britanova, D.J. Liepinsh, S.I. Grivennikov, S.A. Nedospasov LT signaling and the alternative NFkB pathway: downstream effects. lllh internetional TNF conference, May 13-16, 2007, Asilomar, CA, USA

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, д.37А Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Британова, Людмила Валерьевна

Введение.

Обзор литературы. Классический и альтернативный NF-kB пути: роль в иммунитете и факторы, определяющие специфичность действия

1. Структурные особенности NFkB и IkB белков.

2. Функциональная роль белков NFkB семейства.

3. Сигнальные каскады, ведущие к активации NFkB.

3.1. Классический NFkB путь и его роль во врожденном иммунитете.

3.2. Стнмул-зависимая индукция кнназной активности комплекса IKK.

3.3. Альтернативный NFkB путь и его роль в адаптивном иммунитете.

3.4. Стимулы, активирующие альтернативный NFkB путь.

4. Специфичность действия факторов NFkB семейства.

4.1. Временной контроль активности NFkB.

4.2. Контроль на уровне первичной последовательности сайта связывания.

4.3. Ко-факторы транскрипции.

4.4. Ковалентные пост-трансляционные модификации факторов семейства NFkB.

4.5. Структура хроматина как фактор, модулирующий активность NFkB.

Материалы и методы исследования

Клеточные культуры, трансфекция и получение суммарных лизатов.

Плазмиды.

Гель-ретардация.

Люциферазный тест.

Отбор высокоаффинных сайтов связывания из библиотеки случайных последовательностей (Random Site Selection).

Результаты и обсуждение

1. Экспрессия полноразмерных гетеродимерных факторов

RelB/p52 и RelA/p50 в эукариотических клетках.

2. Установление оптимального консенсуса связывания фактора RelB/p52 in vitro.

2.1. Статистический анализ результатов двух независимых экспериментов.

2.2. Консенсус сайта связывания фактора RelB/p52 по суммарным данным двух независимых экспериментов.

3. Сравнимая аффинность узавания сайтов связывания фактора RelB/p52 комплексами RelB/p52 и RelA/p

4. Отсутствие связывания полноразмерных гетеродимерных комплексов NF-kB с опубликованным сайтом BLC-kB из промотора гена cxcl 13 мыши.

5. Потенциальные регуляторные цис-элементы в промоторе гена хемокина CXCL13 - мишени альтернативного NFkB пути.

5.1. Два потенциальных NF-kB-зависимых цис-элемента в промоторе гена хемокина CXCL13.

5.2. Распознавание сайта h4 транскрипционным фактором Spl

6. Активность потенциальных регуляторных цис-элементов тЗ и h4 в контексте промотора in vivo.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Специфичность узнавания генов-мишеней транскрипционными факторами семейства NF-kB"

Индуцируемые транскрипционные факторы ответственны за изменение профиля экспрессии генов, приводящее к оптимальному по силе и продолжительности клеточному ответу. Одним из ключевых факторов такого рода является NF-kB, участвующий в регуляции множества физиологических реакций. Сложная роль факторов NF-kB в иммунитете часто описывается в рамках двух сигнальных путей, т.н. классического и альтернативного, в которые вовлечены димеры NF-kB различного субъединичного состава и которые активируют различные наборы генов. Классический (или канонический) сигнальный путь активируется разнообразными рецепторами врожденного и адаптивного иммунитета, включая То11-подобные рецепторы, антигенные рецепторы лимфоцитов и рецепторы провоспалительных цитокинов, и ведет к транскрипционной активации и продукции цитокинов, хемокинов, адгезионных молекул и ряда ферментов, участвующих в воспалительных реакциях. Альтернативный NF-kB путь, прежде всего, активируется рецепторами, принадлежащими суперсемейству TNFR. Лиганды к ряду рецепторов TNFR1 семейства способны активировать оба сигнальных каскада, однако именно альтернативный NF-kB путь в первую очередь отвечает за развитие и поддержание структуры лимфоидных органов и за ответ приобретенного иммунитета. Трудно переоценить важность получения научных знаний в данной области для медицины, так как система NF-kB задействована абсолютно во всех процессах, связанных с активацией иммунитета (как врожденного, так и приобретенного). Кроме того, NF-kB является важнейшим антиапоптотическим фактором клеток млекопитающих, что обуславливает интенсивное изучение системы NF-kB в онкологическом контексте.

Альтернативный NF-kB путь был открыт недавно и еще не изучен подробно, в частности, на данный момент не известно, что определяет специфичность его действия, т.е. активацию определенного набора генов, отличающегося от такового, характерного для активации классического пути. Простым и изящным объяснением такого рода специфичности могло бы стать дифференциальное связывание различных ДНК-последовательностей димерами NF-kB разного субъединичного состава.

Ключевыми исполнительными транскрипционными факторами в классическом и альтернативном сигнальных NF-kB каскадах являются гетеродимерные комплексы RelA/p50 и RelB/p52, соответственно, причем для последнего не описан консенсус сайта связывания. Поэтому актуально определение консенсусной последовательности связывания транскрипционного фактора RelB/p52 и ее сравнение с таковой для комплекса RelA/p50. Кроме того, гены-мишени альтернативного NF-kB пути выявлены в основном исходя из анализа генетических моделей, и молекулярные аспекты регуляции их транскрипции практически не известны. Следовательно, необходимо изучение структуры регуляторных областей таких генов, в частности, гена хемокина CXCL13 (также известного как BLC).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Британова, Людмила Валерьевна

выводы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Понимание молекулярных основ транскрипционной специфичности таких регуляторных факторов, как белки группы Rel/NF-kB, не только является основой наших фундаментальных знаний о клеточной физиологии, но и предоставляет теоретическую базу для разработки фармакологических препаратов. Альтернативный NF-kB путь представляет собой сигнальный каскад, незаменимый для полноценного ответа адаптивного иммунитета. Так как открыт он был относительно недавно, немного известно об условиях, обеспечивающих специфичность его действия относительно классического NF-kB пути. В данной работе мы показали, что эта специфичность не объясняется собственным свойством гетеродимерного комплекса RelB/p52 узнавать консенсусный участок связывания, отличный от такового для RelA/p50. Кроме того, так как наши результаты, полученные в экспериментах с использованием полноразмерных белков, экспрессированных в эукариотических клетках, противоречат ранее полученным данным по свойствам укороченных белков, экспрессированных в бактериях, то эта работа еще раз подчеркивает важность выбора адекватной системы для изучения того или иного биологического объекта.

Анализ проксимальной области промотора гена-мишени альтернативного NF-kB пути схс113 позволил локализовать два потенциальных регуляторных элемента, содержащих участки связывания транскрипционных факторов Rel/NF-kB и Spl. Кроме того, мы показали, что гетеродимеры RelA/p50 и RelB/p52 не проявляют различий в способности к связыванию с промотором гена хемокина CXCL13 и индукции транскрипции с этого промотора в системе с геном-репортером. Этот факт согласуется с данными о сходстве консенсусных сайтов связывания комплексов RelA/p50 и RelB/p52.

Таким образом, результаты данной работы указывают направление дальнейших исследований факторов и условий, определяющих специфичность действия альтернативного NF-kB пути, в частности, специфичность эффективного привлечения комплекса RelB/p52 к промоторам генов-мишеней.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Британова, Людмила Валерьевна, Москва

1. Ghosh S., May M.J., Корр Е.В. 1998. NF-kappa В and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Annu Rev Immunol. 16, 225-260.

2. Hayden M.S., Ghosh S. 2008. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132, 344362.

3. Zhong H., May M.J., Jimi E., Ghosh S. 2002. The phosphorylation status of nuclear NF-kappa В determines its association with CBP/p300 or HDAC-1. Mol Cell 9, 625-636.

4. Cramer P., Muller C.W. 1999. A firm hand on NFkappaB: structures of the IkappaBalpha-NFkappaB complex. Structure. 7, Rl-6.

5. Escalante C.R., Shen L„ Thanos D., Aggarwal A.K. 2002. Structure of NF-kappaB p50/p65 heterodimer bound to the PRDIIDNA element from the interferon-beta promoter. Structure. 10,383-391.

6. Berkowitz В., Huang D.B., Chen-Park F.E., Sigler P.B., Ghosh G. 2002. The x-ray crystal structure of the NF-kappa В p50.p65 heterodimer bound to the interferon beta -kappa В site. J Biol Chem. 277,24694-24700.

7. Fusco A.J., Huang D.B., Miller D., Wang V.Y., Vu D., Ghosh G. 2009. NF-kappaB p52:RelB heterodimer recognizes two classes of kappaB sites with two distinct modes. EMBORep.lQ, 152-159.

8. Huang D.B., Vu D., Ghosh G. 2005. NF-kappaB RelB forms an intertwined homodimer. Structure. 13, 1365-1373.

9. Fusco A.J., Savinova O.V., Talwar R., Kearns J.D., Hoffmann A., Ghosh G. 2008. Stabilization of RelB requires multidomain interactions with pl00/p52. J Biol Chem. 283, 12324-12332.

10. Lee S.H., Hannink M. 2002. Characterization of the nuclear import and export functions of Ikappa B(epsilon). J Biol Chem. 277,23358-23366.

11. Palmer S., Chen Y.H. 2008. Bcl-З, a multifaceted modulator ofNF-kappaB-mediated gene transcription Immunol Res. 42, 210-218.

12. Gerondakis S., Grumont R., Gugasyan R., Wong L., Isomura I., Ho W., Banerjee A. 2006. Unravelling the complexities of the NF-kappaB signalling pathway using mouse knockout and transgenic models. Oncogene. 25, 6781-6799.

13. Pasparakis M., Luedde Т., Schmidt-Supprian M. 2006. Dissection of the NF-kappaB signalling cascade in transgenic and knockout mice. Cell Death Differ. 13, 861-872.

14. Beg A.A., Sha W.C., Bronson R.T., Ghosh S., Baltimore D. 1995. Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the RelA component of NF-kappa B. Nature. 376,167170.

15. Beg A.A., Baltimore D. 1996. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alpha-induced cell death. Science. 274, 782-784.

16. Prendes M., Zheng Y., Beg A. A. 2003. Regulation of developing В cell survival by RelA-containing NF-kappa В complexes. J Immunol. 171, 3963-3969.

17. Senftleben U., Li Z.W., Baud V., Karin M. 2001. IKKbeta is essential for protecting T cells from TNFalpha-induced apoptosis. Immunity. 14, 217-230.

18. Li M., Shillinglaw W., Henzel W .J., Beg A. A. 2001. The Rela(p65) subunit of NF-kappaB is essential for inhibiting double-stranded RNA-induced cytotoxicity. J Biol Chem. 276, 1185-1194.

19. Meffert M.K., Baltimore D. 2005. Physiological functions for brain NF-kappaB. Trends Neurosci. 28,37-43.

20. Zhang J. Y., Green C.L., Tao SKhavari P.A. 2004. NF-kappaB RelA opposes epidermal proliferation driven by TNFR1 and JNK. Genes Dev. 18, 17-22.

21. Burkly L., Hession C., Ogata L., Reilly C., Marconi L.A., Olson D., Tizard R., Cate R., Lo D. 1995. Expression of relB is required for the development of thymic medulla and dendritic cells. Nature. 373, 531-536.

22. Weih D.S., Yilmaz Z.B., Weih F. 2001. Essential role of RelB in germinal center and marginal zone formation and proper expression of homing chemokines. J Immunol. 167, 1909-1919.

23. Yilmaz Z.B., Weih D.S., Sivakumar V., Weih F. 2003. RelB is required for Peyer's patch development: differential regulation of p52-RelB by lymphotoxin and TNF. Embo J. 22, 121-130.

24. Corn R.A., Hunter C., Liou H.C., Siebenlist U., Boothby M.R. 2005. Opposing roles for RelB and Bcl-3 in regulation of T-box expressed in T cells, GATA-3, and Th effector differentiation J Immunol. 175, 2102-2110.

25. Kontgen F., Grumont R.J., Strasser A., Metcalf D., Li R., Tarlinton D., Gerondakis S. 1995. Mice lacking the c-rel proto-oncogene exhibit defects in lymphocyte proliferation, humoral immunity, and interleukin-2 expression Genes Dev. 9, 1965-1977.

26. Mintern J.D., Belz G., Gerondakis S., Carbone F.R., Heath W.R. 2002. The cross-priming APC requires a Rel-dependent signal to induce CTL. J Immunol. 168,3283-3287.

27. Sha W.C., Liou H.C., Tuomanen E.I., Baltimore D. 1995. Targeted disruption of the p50 subunit of NF-kappa В leads to multifocal defects in immune responses. Cell. 80, 321-330.

28. Cariappa A., Liou H.C., Horwitz B.H., Pillai S. 2000. Nuclear factor kappa В is required for the development of marginal zone В lymphocytes. J Exp Med. 192,1175-1182.

29. Artis D., Kane C.M., Fiore J., Zaph C., Shapira S., Joyce K., Macdonald A., Hunter C., Scott P., Pearce E.J. 2005. Dendritic cell-intrinsic expression of NF-kappa B1 is required to promote optimal Th2 cell differentiation. J Immunol. 174, 7154-7159.

30. Caamano J.H., Rizzo C.A., Durham S.K., Barton D.S., Raventos-Suarez C., Snapper C.M., Bravo R. 1998. Nuclear factor (NF)-kappa B2 (pl00/p52) is required for normal splenic microarchitecture and В cell-mediated immune responses. J Exp Med. 187, 185-196.

31. Carragher D., Johal R., Button A., White A., Eliopoulos A., Jenkinson E., Anderson G., Caamano J. 2004. A stroma-derived defect in NF-kappaB2-/- mice causes impaired lymph node development and lymphocyte recruitment J Immunol. 173, 2271-2279.

32. Carmody R.J., Ruan Q., Palmer S., Hilliard В., Chen Y.H. 2007. Negative regulation of tolllike receptor signaling by NF-kappaB p50 ubiquitination blockade. Science. 317, 675-678.

33. Massoumi R., Chmielarska K., Hennecke K., Pfeifer A., Fassler R. 2006. Cyld inhibits tumor cell proliferation by blocking Bcl-3-dependent NF-kappaB signaling. Cell. 125,665677.

34. Hoffmann A., Leung Т.Н., Baltimore D. 2003. Genetic analysis of NF-kappaB/Rel transcription factors defines functional specificities. Embo J. 22, 5530-5539.

35. Bonizzi G., Karin M. 2004. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25,280-288.

36. Dejardin E. 2006. The alternative NF-kappaB pathway йот biochemistry to biology: pitfalls and promises for future drug development Biochem Pharmacol. 72, 1161-1179.

37. Scheidereit C. 2006. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25, 6685-6705.

38. Chen Z J. 2005. Ubiquitin signalling in the NF-kappaB pathway. Nat Cell Biol. 7, 758-765.

39. Wu С., Ghosh S. 2003. Differential phosphorylation of the signal-responsive domain of I kappa В alpha and I kappa В beta by I kappa В kinases. J Biol Chem. 278, 31980-31987.

40. Hoffmann A., Levchenko A., Scott M.L., Baltimore D. 2002. The IkappaB-NF-kappaB signaling module: temporal control and selective gene activation. Science. 298,1241-1245.

41. Beg A. A., Sha W.C., Bronson R.T., Baltimore D. 1995. Constitutive NF-kappa В activation, enhanced granulopoiesis, and neonatal lethality in I kappa В alpha-deficient mice. Genes Dev. 9, 2736-2746.

42. Cheng J.D., Ryseck R.P., Attar R.M., Dambach D., Bravo R. 1998. Functional redundancy of the nuclear factor kappa В inhibitors I kappa В alpha and I kappa В beta. J Exp Med. 188, 1055-1062.

43. Delhase M., Hayakawa M., Chen Y., Karin M. 1999. Positive and negative regulation of IkappaB kinase activity through IKKbeta subunit phosphorylatioa Science. 284, 309-313.

44. Senftleben U., Cao Y., Xiao G., Greten F.R., Krahn G., Bonizzi G., Chen Y„ Hu Y., Fong A., Sun S.C., Karin M. 2001. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa В signaling pathway. Science. 293,1495-1499.

45. May MJ., D'Acquisto F., Madge L.A., Glockner J., Pober J.S., Ghosh S. 2000. Selective inhibition of NF-kappaB activation by a peptide that blocks the interaction of NEMO with the IkappaB kinase complex. Science. 289, 1550-1554.

46. Poyet J.L., Srinivasula S.M., Lin J.H., Fernandes-Alnemri Т., Yamaoka S., Tsichlis P.N., Alnemri E.S. 2000. Activation of the Ikappa В kinases by RIP via IKKgamma /NEMO-mediated oligomerization. J Biol Chem. 275,37966-37977.

47. Hu Y., Baud V., Delhase M., Zhang P., Deerinck Т., Ellisman M., Johnson R., Karin M. 1999. Abnormal morphogenesis but intact IKK activation in mice lacking the IKKalpha subunit of IkappaB kinase. Science. 284, 316-320.

48. Li Q., Lu Q., Hwang J.Y., Buscher D., Lee K.F., Izpisua-Belmonte J.C., Verma I.M. 1999. IKK 1-deficient mice exhibit abnormal development of skin and skeletoa Genes Dev. 13, 1322-1328.

49. Ни Y., Baud V., Oga Т., Kim K.I., Yoshida K., Karin M. 2001. IKKalpha controls formation of the epidermis independently of NF-kappaB. Nature. 410, 710-714.

50. Cao Y., Bonizzi G., Seagroves T.N., Greten F.R., Johnson R., Schmidt E.V., Karin M. 2001. IKKalpha provides an essential link between RANK signaling and cyclin D1 expression during mammary gland development Cell. 107, 763-775.

51. Maeda S., Chang L., Li Z.W., Luo J.L., Leffert H., Karin M. 2003. IKKbeta is required for prevention of apoptosis mediated by cell-bound but not by circulating TNFalpha Immunity. 19, 725-737.

52. Maeda S., Kamata H., Luo J.L., Leffert H., Karin M. 2005. IKKbeta couples hepatocyte death to cytokine-driven compensatory proliferation that promotes chemical hepatocarcinogenesis. Cell. 121,977-990.

53. Grossmann M., O'Reilly L.A., Gugasyan R., Strasser A., Adams J.M., Gerondakis S. 2000. The anti-apoptotic activities of Rel and RelA required during B-cell maturation involve the regulation ofBcl-2 expression. EmboJ. 19, 6351-6360.

54. Chen L.W., Egan L., Li Z.W., Greten F.R., Kagnoff M.F., Karin M. 2003. The two faces of IKK and NF-kappaB inhibition: prevention of systemic inflammation but increased local injury following intestinal ischemia-reperfusion. Nat Med. 9, 575-581.

55. Park J.M., Greten F.R., Wong A., Westrick R.J., Arthur J.S., Otsu K., Hoffmann A., Montminy M., Karin M. 2005. Signaling pathways and genes that inhibit pathogen-induced macrophage apoptosis—CREB and NF-kappaB as key regulators. Immunity. 23, 319-329.

56. Lawrence Т., Bebien M., Liu G.Y., Nizet V., Karin M. 2005. IKKalpha limits macrophage NF-kappaB activation and contributes to the resolution of inflammation. Nature. 434, 11381143.

57. Li Z.W., Omori S.A., Labuda Т., Karin M., Rickert R.C. 2003. IKK beta is required for peripheral В cell survival and proliferatioa J Immunol. 170, 4630-4637.

58. Pasparakis M., Schmidt-Supprian M., Rajewsky K. 2002. IkappaB kinase signaling is essential for maintenance of mature В cells. J Exp Med. 196, 743-752.

59. Rudolph D., Yeh W.C., Wakeham A., Rudolph В., Nallainathan D., Potter J., Elia A .J., Мак T.W. 2000. Severe liver degeneration and lack of NF-kappaB activation in NEMO/IKKgamma-deficient mice. Genes Dev. 14, 854-862.

60. Courtois G., Gilmore T.D. 2006. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25, 6831-6843.

61. Kim S., La Motte-Mohs R.N., Rudolph D., Zuniga-Pflucker J.C., Мак T.W. 2003. The role of nuclear factor-kappaB essential modulator (NEMO) in В cell development and survival. Proc Natl Acad Sci USA. 100,1203-1208.

62. Schmidt-Supprian M., Courtois G., Tian J., Coyle A.J., Israel A., Rajewsky K., Pasparakis M. 2003. Mature T cells depend on signaling through the IKK complex. Immunity. 19, 377389.

63. Takada H., Chen N.J., Mirtsos C., Suzuki S„ Suzuki N., Wakeham A., Мак T.W., Yeh W.C. 2003. Role of SODD in regulation of tumor necrosis factor responses. Mol Cell Biol. 23,4026-4033.

64. Endres R., Hacker G., Brosch I., Pfeffer K. 2003. Apparently normal tumor necrosis factor receptor 1 signaling in the absence of the silencer of death domains. Mol Cell Biol. 23, 6609-6617.

65. Zhang S.Q., Kovalenko A., Cantarella G., Wallach D. 2000. Recruitment of the IKK signalosome to the p55 TNF receptor: RIP and A20 bind to NEMO (IKKgamma) upon receptor stimulation. Immunity. 12,301-311.

66. Ea C.K., Deng L., Xia Z.P., Pineda G., Chen Z.J. 2006. Activation of IKK by TNFalpha requires site-specific ubiquitination of RIP 1 and polyubiquitin binding by NEMO. Mol Cell. 22,245-257.

67. Kopp E., Medzhitov R. 2003. Recognition of microbial infection by Toll-like receptors. Curr Opin Immunol. 15,396-401.

68. Windheim M., Stafford M., Peggie M., Cohen P. 2008. Interleukin-1 (IL-1) induces the Lys63-linkedpolyubiquitinationofIL-l receptor-associated kinase 1 to facilitate NEMO binding and the activation of IkappaBalpha kinase. Mol Cell Biol. 28, 1783-1791.

69. Sun L., Deng L., Ea C.K., Xia Z.P., Chen Z.J. 2004. The TRAF6 ubiquitin ligase and TAK1 kinase mediate IKK activation by BCL10 and MALT1 in T lymphocytes. Mol Cell. 14,289301.

70. Hayden M.S., West A.P., Ghosh S. 2006. SnapShot: NF-kappaB signaling pathways. Cell. 127, 1286-1287.

71. Thome M. 2004. CARMA1, BCL-10 and MALT1 in lymphocyte development and activation. Nat Rev Immunol. 4, 348-359.

72. Su H., Bidere N., Zheng L., Cubre A., Sakai K., Dale J., Salmena L., Hakem R., Straus S., Lenardo M. 2005. Requirement for caspase-8 in NF-kappaB activation by antigen receptor. Science. 307,1465-1468.

73. Lee K.Y., D'Acquisto F., Hayden M.S., Shim J.H., Ghosh S. 2005. PDK1 nucleates T cell receptor-induced signaling complex for NF-kappaB activation. Science. 308,114-118.

74. Brenner D., Golks A., Kiefer F., Krammer P.H., Arnold R. 2005. Activation or suppression of NFkappaB by HPK1 determines sensitivity to activation-induced cell death. Embo J. 24, 4279-4290.

75. Basak S., Kim H., Kearns J.D., Tergaonkar V., O'Dea E., Werner S.L., Benedict C.A., Ware C.F., Ghosh G., Verma I.M., Hoffmann A. 2007. A fourth IkappaB protein within the NF-kappaB signaling module. Cell. 128, 369-381.

76. Coope H.J., Atkinson P.G., Huhse В., Belich M., Janzen J., Holman M.J., Klaus G.G., Johnston L.H., Ley S.C. 2002. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 plOO to p52. Embo J. 21, 5375-5385.

77. Dejardin E., Droin N.M., Delhase M., Haas E., Cao Y., Makris C., Li Z.W., Karin M., Ware C.F., Green D.R. 2002. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17, 525-535.

78. Novack D.V., Yin L., Hagen-Stapleton A., Schreiber R.D., Goeddel D.V., Ross F.P., Teitelbaum S.L. 2003. The IkappaB function of NF-kappaB2 pi00 controls stimulated osteoclastogenesis. J Exp Med. 198, 771-781.

79. He J.Q., Zarnegar В., Oganesyan G., Saha S.K., Yamazaki S., Doyle S.E., Dempsey P.W., Cheng G. 2006. Rescue of TRAF3-null mice by pi 00 NF-kappa В deficiency. J Exp Med. 203,2413-2418.

80. P.L. 2007. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma Cancer Cell. 12, 131-144.

81. Qu Z., Qing G., Rabson A., Xiao G. 2004. Tax deregulation of NF-kappaB2 plOO processing involves both beta-TrCP-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 279,44563-44572.

82. Matta H., Chaudhary P.M. 2004. Activation of alternative NF-kappa В pathway by human herpes virus 8-encoded Fas-associated death domain-like IL-1 beta-converting enzyme inhibitory protein (vFLIP). Proc Natl Acad Sci USA. 101, 9399-9404.

83. Ohmae Т., Hirata Y., Maeda S., Shibata W., Yanai A., Ogura K., Yoshida H., Kawabe Т., Omata M. 2005. Helicobacter pylori activates NF-kappaB via the alternative pathway in В lymphocytes. J Immunol. 175, 7162-7169.

84. Boehm Т., Scheu S., Pfeffer K., Bleul C.C. 2003. Thymic medullary epithelial cell differentiation, thymocyte emigration, and the control of autoimmunity require lympho-epithelial cross talk via LTbetaR. J Exp Med. 198, 757-769.

85. Kinoshita D., Hirota F., Kaisho Т., Kasai M., Izumi K., Bando Y., Mouri Y., Matsushima

86. A., Niki S., Han H., Oshikawa K., Kuroda N., Maegawa M., Irahara M., Takeda K., Akira S., Matsumoto M. 2006. Essential role of IkappaB kinase alpha in thymic organogenesis required for the establishment of self-tolerance. J Immunol. 176,3995-4002.

87. Zhang X., Wang H., Claudio E., Brown K., Siebenlist U. 2007. A role for the IkappaB family member Bcl-3 in the control of central immunologic tolerance. Immunity. 27,438452.

88. Kim D., Mebius R.E., MacMicking J.D., Jung S., Cupedo Т., Castellanos Y., Rho J., Wong

89. B.R., Josien R., Kim N., Rennert P.D., Choi Y. 2000. Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE. J Exp Med. 192, 1467-1478.

90. Futterer A., Mink K., Luz A., Kosco-Vilbois M.H., Pfeffer К. 1998. The lymphotoxin beta receptor controls organogenesis and affinity maturation in peripheral lymphoid tissues. Immunity. 9, 59-70.

91. Shinkura R., Kitada K., Matsuda F., Tashiro K., Ikuta K., Suzuki M., Kogishi K., Serikawa Т., Honjo T. 1999. Alymphoplasia is caused by a point mutation in the mouse gene encoding Nf-kappa b-inducing kinase. Nat Genet. 22, 74-77.

92. Muller J.R., Siebenlist U. 2003. Lymphotoxin beta receptor induces sequential activation of distinct NF-kappa В factors via separate signaling pathways. J Biol Chem. 278, 1200612012.

93. Mebius R.E. 2003. Organogenesis of lymphoid tissues. Nat Rev Immunol. 3,292-303.

94. Alcamo E., Hacohen N., Schulte L.C., Rennert P.D., Hynes R.O., Baltimore D. 2002. Requirement for the NF-kappaB family member RelA in the development of secondary lymphoid organs. J Exp Med. 195,233-244.

95. Yin L., Wu L., Wesche H., Arthur C.D., White J.M., Goeddel D.V., Schreiber R.D. 2001. Defective lymphotoxin-beta receptor-induced NF-kappaB transcriptional activity in NIK-deficient mice. Science. 291,2162-2165.

96. Basak S., Shih V.F., Hoffmann A. 2008. Generation and activation of multiple dimeric transcription factors within the NF-kappaB signaling system. Mol Cell Biol. 28, 3139-3150.

97. Siebenlist U., Brown K., Claudio E. 2005. Control of lymphocyte development by nuclear factor-kappaB. Nat Rev Immunol. 5,435-445.

98. Claudio E„ Brown K., Park S., Wang H., Siebenlist U. 2002. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing В cells. Nat Immunol. 3,958-965.

99. Hsu B.L., Harless S.M., Lindsley R.C., Hilbert D.M., Cancro M.P. 2002. Cutting edge: BLyS enables survival of transitional and mature В cells through distinct mediators. J Immunol. 168, 5993-5996.

100. Marinari В., Costanzo A., Marzano V., Piccolella E., Tuosto L. 2004. CD28 delivers a unique signal leading to the selective recruitment of RelA and p52 NF-kappaB subunits on IL-8 and Bcl-xL gene promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 101,6098-6103.

101. Yang C.H., Murti A., Pfeffer L.M. 2005. Interferon induces NF-kappa B-inducing kinase/tumor necrosis factor receptor-associated factor-dependent NF-kappa В activation to promote cell survival. J Biol Chem. 280, 31530-31536.

102. Weih F., Caamano J. 2003. Regulation of secondary lymphoid organ development by the nuclear factor-kappaB signal transduction pathway. Immunol Rev. 195, 91-105.

103. Lomada D., Liu В., Coghlan L., Hu Y., Richie E.R. 2007. Thymus medulla formation and central tolerance are restored in IKKalpha-/- mice that express an IKKalpha transgene in keratin 5+ thymic epithelial cells. J Immunol. 178, 829-837.

104. Zhang В., Wang Z., Ding J., Peterson P., Gunning W.T., Ding H.F. 2006. NF-kappaB2 is required for the control of autoimmunity by regulating the development of medullary thymic epithelial cells. J Biol Chem. 281, 38617-38624.

105. Akiyama Т., Maeda S., Yamane S., Ogino K., Kasai M., Kajiura F., Matsumoto M., Inoue J. 2005. Dependence of self-tolerance on TRAF6-directed development of thymic stroma Science. 308,248-251.

106. Natoli G., De Santa F. 2006. Shaping alternative NF-kappaB-dependent gene expression programs: new clues to specificity. Cell Death Differ. 13,693-696.

107. Werner S.L., Barken D., Hoffmann A. 2005. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309,1857-1861.

108. Huang D.B., Chen Y.Q., Ruetsche M., Phelps C.B., Ghosh G. 2001. X-ray crystal structure of proto-oncogene product c-Rel bound to the CD28 response element of IL-2. Structure. 9, 669-678.

109. Britanova L.V., Makeev V. J., Kuprash D.V. 2008. In vitro selection of optimal RelB/p52 DNA-binding motifs. Biochem Biophys Res Commun. 365, 583-588.

110. Leung Т.Н., Hoffmann A., Baltimore D. 2004. One nucleotide in a kappaB site can determine cofactor specificity for NF-kappaB dimers. Cell. 118,453-464.

111. Chen-Park F.E., Huang D.B., Noro В., Thanos D., Ghosh G. 2002. The kappa В DNA sequence from the HIV long terminal repeat functions as an allosteric regulator of HIV transcription. J Biol Chem. 277,24701-24708.

112. Perkins N.D. 2006. Post-translational modifications regulating the activity and function of the nuclear factor kappa В pathway. Oncogene. 25, 6717-6730.

113. Chew J., Biswas S., Shreeram S., Humaidi M., Wong E.T., Dhillion M.K., Teo H., Hazra A., Fang C.C., Lopez-Collazo E., Bulavin D.V., Tergaonkar V. 2009. WIP1 phosphatase is a negative regulator of NF-kappaB signalling. Nat Cell Biol. 11, 659-666.

114. Chen L.F., Williams S.A., Mu Y., Nakano H., Duerr J.M., Buckbinder L., Greene W.C. 2005. NF-kappaB RelA phosphorylation regulates RelA acetylation. Mol Cell Biol. 25, 7966-7975.

115. Hoberg J.E., Yeung F., Mayo M.W. 2004. SMRT derepression by the IkappaB kinase alpha: a prerequisite to NF-kappaB transcription and survival. Mol Cell. 16,245-255.

116. Dong J., Jimi E., Zhong H., Hayden M.S., Ghosh S. 2008. Repression of gene expression by unphosphorylated NF-kappaB p65 through epigenetic mechanisms. Genes Dev. 22,11591173.

117. Natoli G., Saccani S., Bosisio D., Marazzi I. 2005. Interactions of NF-kappaB with chromatin: the art of being at the right place at the right time. Nat Immunol. 6,439-445.

118. Hargreaves D.C., Horng Т., Medzhitov R. 2009. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138, 129-145.

119. Kunsch C., Ruben S.M., Rosen C.A. 1992. Selection of optimal kappa B/Rel DNA-binding motifs: interaction of both subunits of NF-kappa В with DNA is required for transcriptional activation. Mol Cell Biol. 12, 4412-4421.

120. Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.M., Brenner S.E. 2004. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190.

121. Berg O.G., von Hippel P.H. 1987. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. J Mol Biol. 193, 723-750.

122. Papatsenko D.A., Makeev V.J., Lifanov A.P., Regnier M., Nazina A.G., Desplan C. 2002. Extraction of functional binding sites from unique regulatory regions: the Drosophila early developmental enhancers. Genome Res. 12, 470-481.

123. Boeva V., Clement J., Regnier M., Roytberg M.A., Makeev V.J. 2007. Exact p-value calculation for heterotypic clusters of regulatory motifs and its application in computational annotation of cis-regulatory modules. Algorithms Mol Biol. 2, 13.

124. Chen F.E., Ghosh G. 1999. Regulation of DNA binding by Rel/NF-kappaB transcription factors: structural views. Oncogene. 18, 6845-6852.

125. Chen F.E., Huang D.B., Chen Y.Q., Ghosh G. 1998. Crystal structure of p50/p65 heterodimer of transcription factor NF-kappaB bound to DNA Nature. 391,410-413.

126. Bours V., Azarenko V., Dejardin E., Siebenlist U. 1994. Human RelB (I-Rel) functions as a kappa В site-dependent transactivating member of the family of Rel-related proteins. Oncogene. 9, 1699-1702.

127. Saccani S., Pantano S., Natoli G. 2003. Modulation of NF-kappaB activity by exchange of dimers. Mol Cell. 11, 1563-1574.

128. Ansel K.M., Ngo V.N., Hyman P.L., Luther S.A., Forster R., Sedgwick J.D., Browning J.L., Lipp M., Cyster J.G. 2000. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406, 309-314.

129. Finke D„ Acha-Orbea H., Mattis A., Lipp M., Kraehenbuhl J. 2002. CD4+CD3- cells induce Peyer's patch development: role of alpha4betal integrin activation by CXCR5. Immunity. 17, 363-373.

130. Forster R., Mattis A.E., Kremmer E., Wolf E., Brem G., Lipp M. 1996. A putative chemokine receptor, BLR1, directs В cell migration to defined lymphoid organs and specific anatomic compartments of the spleen. Cell. 87,1037-1047.

131. Luther S.A., Ansel K.M., Cyster J.G. 2003. Overlapping roles of CXCL13, interleukin 7 receptor alpha, and CCR7 ligands in lymph node development J Exp Med. 197, 1191-1198.

132. Croxton R., Puto L.A., de Belle I., Thomas M., Torii S., Hanaii F., Cuddy M., Reed J.C. 2006. Daxx represses expression of a subset of antiapoptotic genes regulated by nuclear factor-kappaB. Cancer Res. 66, 9026-9035.

133. Dynan W.S., Tjian R. 1983. The promoter-specific transcription factor Spl binds to upstream sequences in the SV40 early promoter. Cell. 35, 79-87.

134. Marin M., Karis A., Visser P., Grosveld F., Philipsen S. 1997. Transcription factor Spl is essential for early embryonic development but dispensable for cell growth and differentiation. Cell. 89, 619-628.

135. Bouwman P., Philipsen S. 2002. Regulation of the activity of Spl-related transcription factors. Mol Cell Endocrinol. 195, 27-38.

136. Suske G., Bruford E., Philipsen S. 2005. Mammalian SP/KLF transcription factors: bring in the family. Genomics. 85, 551-556.

137. Zhao C., Meng A. 2005. Spl-like transcription factors are regulators of embryonic development in vertebrates. Dev Growth Differ. 47,201-211.

138. Yao P.L., Lin Y.C., Sawhney P., Richburg J.H. 2007. Transcriptional regulation of FasL expression and participation of sTNF-alpha in response to Sertoli cell injury. J Biol Chem. 282, 5420-5431.

139. Zhu N.L., Li C., Huang H.H., Sebald M., Londhe V.A., Heisterkamp N., Warburton D., Bellusci S., Minoo P. 2007. TNF-alpha represses transcription of human Bone Morphogenetic Protein-4 in lung epithelial cells. Gene. 393, 70-80.

140. Yan Y., Dalmasso G., Sitaraman S., Merlin D. 2007. Characterization of the human intestinal CD98 promoter and its regulation by interferon-gamma Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G535-545.

141. Baetu T.M., Kwon H., Sharma S., Grandvaux N., Hiscott J. 2001. Disruption of NF-kappaB signaling reveals a novel role for NF-kappaB in the regulation of TNF-related apoptosis-inducing ligand expressioa J Immunol. 167, 3164-3173.

142. Xu J., Zhou J.Y., Wu G.S. 2006. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand is required for tumor necrosis factor alpha-mediated sensitization of human breast cancer cells to chemotherapy. Cancer Res. 66, 10092-10099.

143. Xu Y., Fang F., Dhar S.K., St Clair W.H., Kasarskis E.J., St Clair D.K. 2007. The role of a single-stranded nucleotide loop in transcriptional regulation of the human sod2 gene. J Biol Chem. 282, 15981-15994.1. Благодарно сти

Информация о работе

Британова, Людмила Валерьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Специфичность узнавания генов-мишеней транскрипционными факторами семейства NF-kB - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы