Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные исследования взаимодействий ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактерий с промоторами

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Северинов, Константин Викторович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи СЕВЬРИНОВ Константин Викторович

.руюурно-функциональные исследовании взаимодеиствий ДНК-зависимей РНК-пол имеразы бактерий с промоторами

ОЗ.вв.26- Молекулярная кнетика

ДИССЕРТАЦИЯ ■ форме научного локла.|» на соискание ученой степени доктора биологических н»\к

Москва 2006

'f

Работа выполнена в отделе Молекулярных основ генетики клеюк Института

молекулярной генетики РАН и в лаборатории Молекулярных механизмов

транскрипции прокариот Института Ваксмана, Университет Ратгерс, США

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

академик П.Г. Георгиев

доктер биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН А.Б. Четверин

доктор биологических наук М.С. Гельфанд

Ведущая организация: Институт молекулярной би«л*гии

им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «21» декабря 2006 т. в 10 часов на заседании

> биологии гена РАН ив адресу:

ке Института молекулярной 1,[. Москва, ул. Вавилова д.

j Л^1^або»ская

Актуальность темы. Инициация транскрипции является наиболее сложно регулируемой частью транскрипционного цикла и оказывает непосредственное влияние на уровень генной экспрессии. Инициация остается наименее изученным этапом транскрипции. Более полное понимание процесса инициации транскрипции имеет как чисто научный, так и практический интерес. Понимание механизма инициации транскрипции и его регуляции позволит управлять экспрессией отдельных генов, а также откроет путь к разработке антибиотиков, специфичных к данному виду бактерий или влияющих на экспрессию лишь узкой группы или даже одного конкретного гена. Известно, что для узнавания консервативных элементов промотора и плавления ДНК в области старта транскрипции у бактерий необходима о-субъединица РНК-полимеразы. Однако, так как в структуре промоторного комплекса различные домены и структурные элементы кор-фермента РНК-полимеразы находятся поблизости или вступают в непосредственный контакт с промоторной ДНК, о-субъединица является единственной детерминантой узнавания промоторной ДНК и стабильности промоторного комплекса, образуемого голоферментом РНК-полимеразы. Выяснение роли таких контактов позволило бы гораздо полнее представить* картину взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами, что, в свою очередь, позволило бы гораздо лучше понять причины дифференциальной утилизации

ь силу промоторов

КНИГА ИМЕЕТ

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлась всеобъемлющая характеристика взаимодействий и контактов между ДНК-зависимой РНК-полимеразой бактерий и ДНК промоторов, выяснение функциональной значимости этих взаимодействий и контактов, а также возможности регуляции силы промоторов за счет изменения этих взаимодействий и контактов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения работы впервые охарактеризовано несколько доменов кор-фермента РНК-полимеразы, которые могут оказывать сильное влияние на утилизацию бактериальных промоторов. Так как описанные домены РНК-полимеразы высоко консервативны в эволюции, с большой вероятностью можно утверждать, что похожие взаимодействия играют важную роль и при узнавании промоторов РНК-полимеразами эукариот. В ряде случаев показано, как регуляция активности промоторов осуществляется за счет белок-белковых взаимодействий между регуляторами транскрипции и доменами кор-фермента РНК-полимеразы.

Конкретные результаты работы могут быть суммированы следующим образом. Показано, что взаимодействие aCTD с UP-элементами промоторов является мишенью АДФ-рибозилирования бактериофагом Т4. АДФ-рибозилирование бактериофагом Т4 aCTD таким образом является «антиактивационным» регулированием транскрипции. Охарактеризована роль подвижной заслонки (3-субъединицы РНК-полимеразы в узнавании промоторов и предложен молекулярный механизм, обьясняющий изменение промоторной специфичности голофермснта РНК-полимеразы бактерий за счет изменения

конформации подвижной заслонки. Показано, что транскрипционный фактор AsiA регулирует утилизацию промоторов нарушая взаимодействие подвижной заслонки с четвертым районом сг7(1-субьединицы. Охарактеризован дополнительный базальный элемент бактериальных промоторов, который находится между транскрипционным стартом и -10 элементом и узнается консервативным районом 1.2 а-субьединицы. Показана роль р'-молнии в узнавании промоторного спейссра между -10 и -35 элементами промоторов. Показана роль нижней челюсти Р'-субъединицы во взаимодействии с двуцепочечной ДНК ниже точки транскрипционного старта. Определен молекулярный механизм изменения промоторной специфичности голофермента РНК-полимеразы Е. coli при связывании белка gp2 бактериофага Т7. Определена первичная структура генов гро Thermus aquaticus. Определена третичная структура кор-фермента РНК-полимеразы Т. aquaticus. Создана генетическая система, позволяющая проводить функциональные и структурные исследования рекомбинантной РНК-полимеразы Т. aquaticus и ее мутантных производных. Определен молекулярный механизм узнавания участка начала репликации минус цепи бактериофага М13. Показано, что это узнавание является независимым от а70-субъединицы и осуществляется кор-ферментом РНК-полимеразы за счет взаимодействия с каналом кор-фермента, ответственным за связывание переднего дуплекса ДНК. Кор-фермент способен специфически инициировать абортивный синтез на участке начала репликации М13, а для образования более длинных транскриптов необходим район 3.2 ст70-субъединицы.

Полученные результаты существенно расширили современные представления о механизмах инициации клеточной транскрипции. В частности показано, что в определенных случаях or-субьединица РНК-полимеразы необходима для синтеза полноразмерной РНК и не играет роли в специфическом узнавании точки начала инициации, которое осуществляется кор-ферментом РНК-полимеразы. Новые представления, возникшие в результате проделанной работы, могут быть использованы в биотехнологии для создания новых поколений промоторов для эффективной экспрессии рекомбинантных генов, а также для разработки антибиотиков, которые ингибируют транскрипцию бактерий, связываясь с доменами РНК-полимеразы, изученными в данной работе. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на межведомственном межинститутском семинаре «Хромосома» при Институте биологии гена РАН (2006), на международных Энгельгардтовских конференциях по молекулярной биологии (2004, 2006), 35-ой отчетной конференции Института белка (2002), международных конференциях FASEB по Инициации транскрипции у прокариот (Сакстонс Ривер, Вермонт, США в 1995 1997, 1999, 2001, 2003 и 2005 годах), международных конференциях лаборатории Колд Спринг Харбор (США) по фагам и молекулярной генетике 1996,1997, 1999, 2000, 2002, 2002, 2003 и 2004 годах, международных конференциях Американского общества микробиологов (ASM в 1999, 2001 и 2003 годах) и междунарадного союза микробиологических обществ (IUMS) в 2005 году, на 16-ом съезде французского биофизического общества в 2001 году, на международной конференции Пост-инициационные активности РНК-полимеразы (Моунтайн Лэйк, Вирджиния, США) в 1994, 1996,

1998, 2000, 2005, 2003 и 2005 годах и на многочисленных приглашенных научных семинарах в различных научно-исследовательских учреждениях в России, США и европейских стран.

Публикации по теме работы. По материалам диссертации опубликовано более 110 печатных работ за 1993-2006 гт.

Личный вклад автора. Во всех работах, проведенных в подразделении автора, автору принадлежит ведущая роль в выборе экспериментальной стратегии проведенных исследований и разработке подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении, интерпретации и обобщении полученных данных и написании публикаций. Обсуждаемые в работе результаты из лаборатории авогра были либо получены лично автором, либо руководимыми ими студентами, аспирантами и научными сотрудниками. В работах, выполненных в сотрудничестве с другими лабораториами, личный вклад автора заключался в непосредственном участии в проведении экспериментов, в обсуждении их результатов и написании публикаций.

Результаты и их обсуждение

РНК во всех клеточных организмах синтезируется многосубьединичным ферментом - ДНК-зависимой РНК-полимеразой (РНКП). Функциональный цикл РНКП, т. н., транскрипционный цикл, можно разделить на три основных стадии: инициации, элонгации и терминации транскрипции. В ходе инициации РНК-полимераза должна распознать последовательность промоторной ДНК среди очень большого избытка непромоторных последовательностей, экспонировать матричную цепь ДНК в районе транскрипционного старта за счет ограниченного плавления (открывания) цепей ДНК промотора и инициировать синтез РНК. Инициация транскрипции у прокариот осуществляется холоферментом РНК-полимеразы, состоящим из кор-фермента и инициаторной субъединицы о. Кор-фермент представляет собой комплекс из пяти полипептидов (агРР'со) с общей массой около 360 кДа. Последовательность каждой субъединицы кор-фермента имеет существенные гомологии с субьединицами эукариотических и архебактериальной полимераз. о-субъединицы РНКП специфичны для бактерий: археи и эукариоты используют в инициации белки и белковые комплексы, не гомологичные бактериальным.

Кор-фермент способен осуществлять синтез РНК на стадии элонгации транскрипции, а также терминировать транскрипцию на терминаторах, однако, он не способен инициировать транскрипцию с промоторов, а-субъединицы также неспособны самостоятельно узнавать промоторы, однако, в составе холофермента они специфически связываются с консервативными последовательностями промотора, находящимися в положениях -35 и -10 относительно точки начала

транскрипции (+1), с образованием закрытого промоторного комплекса, о-субъединицы также участвуют в плавлении промоторной ДНК, которое необходимо для образования открытого промоторного комплекса. В открытом комплексе холоферменг не может сразу перейти к процессивному синтезу РНК и, оставаясь связанным с промотором, синтезирует большое количество коротких, так называемых, абортивных РНК. При удлинении абортивной РНК до определенной длины происходит потеря сг-субъединицы, контакты РНКП с промотором нарушаются, и образуется элонгационный комплекс, который может двигаться по ДНК и осуществлять процессивный синтез РНК длиной в тысячи нуклеотидов без диссоциации с матрицы.

а-субъединица играет центральную роль в инициации, будучи прямо вовлеченной в узнавание промотора и плавление ДНК. Е. соЧ содержит семь различных о-факторов, каждый из которых обеспечивает узнавание промоторов с определенными последовательностями. В экспоненциальной фазе роста более 90% молекул холофермента в клетке содержит субъединицу о70. При смене окружающих условий процент о70-холофермента уменьшается за счет образования холоферментов, содержащих другие а-субъединицы. Так, 0s ответственна за транскрипцию генов, специфичных для стационарной фазы роста, а'2 и 0е узнают промоторы генов ответа на тепловой шок и т. д.

Множественные выравнивания последовательностей белков о70-семейства выявляют четыре эволюционно консервативных района, которые могут быть поделены на субрайоны. Структурные данные выявляют в белках о70-семейства по крайней мере три отдельных домена, соединенных гибкими линкерами.

Эволюционно консервативные районы а приблизительно совпадают со структурными доменами. Такая структурная организация определяет существование множества конформаций молекул осубъединиц. Различные биохимические свойства свободной а-субъединицы и о-субъединицы в составе холофермента обусловлены скорее различием в относительном положении структурных доменов, нежели изменениями в самих доменах.

I Р<А-Н wh) -aaaawtttttwaaaaawtttwaaaaa

Рис. 1. Структура бактериального промотора, узнаваемого о70-холоферментом РНКП Е. coli. Показаны удлиненный -10 элемент, -35 элемент и UP-элемент. Точка начала транскрипции обозначена как «а». Наиболее консервативные положения обозначены заглавными буквами.

Промотором называют участок ДНК, находящийся перед началом транскрипционной единицы и ответственный за связывание и правильное позиционирование голофермента РНКП относительно точки начала транскрипции. Сравнение большого количества промоторов, узнаваемых о70 холоферментом, дало возможность выявить консервативные последовательности, необходимые для их функционирования (Рис. 1). Назальными элементами промотора называются последовательности длиной 6 нп, расположенные в районе положений -10 и -35 относительно точки начала транскрипции. В случае и70-субъединицы оптимальная (консенсусная) последовательность -10 элемента (по нематричной цепи) - это ТАТААТ, а -35 элемента - TTGACA. Хотя оптимальные последовательности -10 и -35 элементов различны для разных о-факторов, их расположение по отношению к старту транскрипции консервативно. Сила промотора в большинстве случаев

-ю

-TTGnca-

-tg-TAtaaT------а-

коррелирует со степенью сходства -10 и -35 элементов промотора с консенсусными последовательностями. Последовательности базальных элементов у подавляющего большинства промоторов отличаются от консенсусных последовательностей, что позволяет клетке регулировать их активность.

Узнавание -10 и -35 элементов промотора происходит за счет ДНК-белковых взаимодействий с эволюционно консервативными районами о субъединицы. Структурные и биохимические исследования свидетельствуют о том, что консервативный район 2.4 узнает промоторный элемент -10 (Рис. 2). Свободные о-субъединицы или фрагменты ст, содержащие район 2, способны лишь к очень слабому и малоспецифичному взаимодействию с двуцепочечной ДНК, последовательность которой имеет в себе -10 элемент. Однако в составе холофермента узнавание одноцепочечной нематричной цепи -10 элемента происходит с высокой специфичностью, что указывает на возможную роль района 2 в плавлении промотора.

Генетические, биохимические и структурные данные показывают, что консервативный район 4.2 о-субъединицы узнает -35 элемент промотора (Рис. 2). Район 4.2 необходим для формирования промоторных комплексов на большинстве промоторов, и некоторые бактериальные факторы регулируют эффективность инициации, взаимодействуя с районом 4.2 и усиливая (активаторы), или ослабляя (репрессоры) его взаимодействие с-35 элементом.

Взаимное расположение -10 и -35 элементов также влияет на силу промотора. Оптимальная длина спейсера, который разделяет-10 и -35 элементы -

4 ■ ■ 1

* ■-ИИв-1 {"Г й ■

В Ш^' г г . V- г f

Рас. 2. Структура о-субъеднниц РНКП (no Borukhov и Severmov, 2002). (А) Схема первичной последовательности о-субъединицы. Консервативные районы пронумерованы и обозначены разными цветами. (В) Третичная структура сЛ-субьединицы из холофермента РНКП Т. thermophUus. Цвета соответствуют цветам, использованным в панели А Показан ион Mg2+ каталитического центра РНКП (красный шарик) и coiled-coil домен (белый) Э'-субъединицы.

17-18 пар оснований; изменение длины спейсера как в сторону уменьшения, так и в

сторону увеличения ведет к резкому ослаблению промотора

В отличие от -10 элемента, -35 элемент не является абсолютно необходимым для активности промотора. Так, промотор ga/Pl является сильным промотором, но тем не менее не содержит функционального -35 элемента. В данном случае роль второго базального элемента промотора берет на себя дополнительный мотив TGn (где п - любое основание), непосредственно прилегающий к -10 элементу. Такие промоторы были названы промоторами «удлиненного -10 класса». То, что moihb TGn в составе удлиненного -10 элемента являетех независимым промоторньгм элементом подтверждается тем, что в его узнавании принимает участие отдельный район о70 - эволюционно консервативный район 2.5 (Рис. 2).

Несмотря на то, что о-субъединица безусловно ответственна за узнавание промотора холоферментом РНКП, она не способна связывать промоторную ДНК в свободном состоянии. Причина этого заключается в том, что, во-первых, каждый из трех потенциальных ДНК-связывающих модулей а-субъединицы способен лишь к очень слабым взаимодействиям со своими ДНК-мишенями, и ни одно из этих взаимодействий в отдельности не достаточно для формирования промоторного комплекса. Более того, внутри самой а-субъединицы имеются взаимодействия, которые приводят к автоингибированию узнавания промотора свободной а. Это автоингибирование снимается при образовании холофермента. Основное взаимодействие кор-фермента и а-субъединицы происходит между районами 2.1 и 2.2 и эволюционно консервативным coiled-coil элементом Р'-субъединицы (Рис. 2) (Sharp ct al., 1999). Отдельно взятый coiled-coil домен р' индуцирует узнавание одноцепочечного -10 элемента о70-субъединицей или ее фрагментами, содержащими ра