Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A

Альтшулер, Михаил Львович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A"

На правах рукописи

АЛЬТШУЛЕР МИХАИЛ ЛЬВОВИЧ

Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита А

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2005

Работа выполнена в Государственном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН

и в Государственном учреждении здравоохранения г. Москвы «Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии» Департамента здравоохранения г.Москвы

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук Блинкова Л.П.

доктор биологических наук Глухов А.И.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук

профессор Быков А.С.

доктор биологических наук Романова Ю. М.

ВЕДУЩЕЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Российское Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования «Российский Государственный Медицинский Университет» Федерального Агенства по Здравоохранению и Социальному Развитию

Защита диссертации состоится 21?. СвНТЯПрЯ. 2005г. в /¿оочасов на заседании диссертационного совет^ Д 001.35.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д.5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан__2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук_

И.В. Яковлева

Z006~ч

953!

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность проблемы.

Важнейшим элементом диагностики инфекционных болезней, бактерионосительства, санитарного контроля, экологического мониторинга окружающей среды является детекция инфекционного агента. Среди способов определения возбудителей главенствуют классический микробиологический и иммуноферментный методы. В последнее время в диагностике микрорганизмов применяют выявление специфического фрагмента нуклеотидной последовательности возбудителя, который можно идентифицировать, используя как индикатор его наличия, способность к воспроизведению in vitro в присутствии ДНК-полимеразы, праймеров и дезоксирибонуклеотидов. Этот процесс, подобный процессу естественной репликации хромосом и отличающийся от него исключительно быстрым экспоненциальным накоплением короткого фрагмента ДНК, называется полимеразной цепной реакцией (ПЦР) [Mullis К. and FaloonaF., 1987].

По чувствительности, быстроте, простоте и дешевизне ПЦР сопоставима с иммуноферментным анализом или даже превосходит его. В некоторых, случаях ПЦР оказывается предпочтительным или единственно возможным методом детекции возбудителя.

Актуальность представленной диссертационной работы обусловлена необходимостью повышения достоверности, чувствительности и скорости выявления возбудителей. Вариант метода ПЦР, называемый nested или гнездовой ПЦР, нацелен на исключение ошибочных реультатов и обладает повышенной чувствительностью. Суть гнездовой ПЦР заключается в проведениии двух последовательных реакций, при которых исходным материалом для второй реакции является продукт (ампликон) первой [Whelen A.C. et al., 1995]. Так обеспечивается двойной контроль результата анализа, практически исключающий вероятность ошибки. Кроме этого, гнездовая ПЦР обладает дополнительным преимуществом. Оно состоит в том, что при использовании аллель-специфических праймеров во время второй реакции гнездовой ПЦР, благодаря структурной простоте матрицы, становится возможным определение мутаций, удаленных от 3'-конца праймера [Патрушев Л.И. с соавт.,1998].

Создание новых методов тестирования, на наш взгляд, прежде всего необходимо для возбудителей пяти особо опасных или социально значимых инфекций - чумы, холеры, гепатита А, простого герпеса I и II типа (HSVI и HSVII), а также устойчивого к рифампицину Mycobacterium tuberculosis

Например, выявление с помощью гнездовой ПЦР возбудителя чумы в тестируемом материале позволит своевременно применить экстренные меры профилактики и терапии [Lederberg J. et al., 1992].

Трудоемкость, длительность и относительно высокий риск ошибок при использовании на практике традиционного двухэтапного подхода, применяемого для обнаружения вирулентных штаммов Vibrio cholerae у больных, вибрионосителей, в объектах окружающей среды также делает гнездовую ПЦР предпочтительным методом анализа [Binszstein N. et al ,2004]. В данном случае ПЦР позволяет идентифицировать возбудителя непосредственно в клиническом материале, прошедшем бактерицидную обработку, минуя стадию подращивания и клонирования этого опасного микроорганизма.

Нужно отметить, что для Mycobacterium tuberculosis характерен медленный рост на питательных средах. Это не позволяет своевременно выявить у пациентов лекарственноустойчивые штаммы, в частности, штаммы, устойчивые к рифампицину - одному из ведущих противотуберкулезных препаратов [Williams D.L. et al.,1994]. Возможной альтернативой остается определение мутаций, вызывающих устойчивость к лекарству. [Стент Г. и Кэлиндер Р.,1981; Hunt J.M. et al.,1994; Telenti A. et al.,1993] Для определения таких мутаций необходим быстрый, недорогой и нетрудоемкий метод. В этом случае также может быть применена гнездовая ПЦР с использованием аллель-специфических праймеров, перекрывающих несколько мутантных сайтов, дополненная методом информационного полиморфизма ДНК (single-strand conformation polymorphism, SSCP).

Герпетическая инфекция человека - болезнь, дающая серьезные осложнения. При этом, патологические состояния, вызванные HSV I и HSV II, неодинаковы по своим проявлениям и последствиям [Бочаров А.Ф с соавт., 1982]. ПЦР позволяет проводить дифференциальную диагностику HSV I и HSV II, а ее гнездовой вариант - исключить ошибки при анализах.

Результаты, полученные при детекции вируса гепатита А в крови пациентов с помощью ИФА, требуют подтверждающего теста, который также может быть выполнен методом ПЦР.

Цель работы. Разработка и испытание методов гнездовой ПЦР и конформационного полиморфизма ДНК (SSCP) как инструментов детекции генов, специфичных для пяти возбудителей инфекционных болезней человека: чумы, холеры, туберкулеза, герпеса и вирусного гепатита А. Задачи исследования.

1. Определить спектр мутаций устойчивости к рифампицину у штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих в России, и разработать упрощенный метод определения данных мутаций на основе сочетания аллель-специфической амплификации и SSCP.

2. Разработать чувствительный и специфичный метод комбинированной гнездовой ПЦР и обратной транскрипции для детекции РНК вируса гепатита А. Сопоставить результаты, полученные методами ИФА и гнездовой ПЦР при анализе форменных элементов крови и сывороток у больных гепатитом А или смешанными формами гепатита.

3. Создать метод гнездовой ПЦР для дифференциальной диагностики вируса простого герпеса I и II типа и проверить его чувствительность и специфичность. Получить данные о распределении I и II типа вируса между различными клиническими группами больных и между различными типами материала, полученного от больных и носителей.

4. Разработать гнездовую ПЦР, направленную на непосредственную идентификацию гена, кодирующего фактор вирулентности (энтеротоксин) V. cholerae, у больных, вибрионосителей и в окружающей среде.

5. Разработать метод гнездовой ПЦР для определения Y. pestis, не дающего перекрестных реакций с У. enterocolitica и К pseudotuberculosis.

Научная новизна. Научно обоснованы методы гнездовой ПЦР с коллекционными штаммами Yersinia pestis, Vibrio cholerae, рифампицин-резистентного Mycobacterium tuberculosis, HSVI и HSVII и вируса гепатита A, a также с образцами материала, инфицированного этими микроорганизмами.

Впервые определен спектр мутаций устойчивости к рифампицину в российских штаммах М. tuberculosis. При этом было зарегистрировано необычно высокое относительное количество мутаций в кодоне 516 гена гроВ и была открыта новая, не описанная в литературе двойная мутация.

Показано, что при идентификации точечных мутаций с помощью аллель-специфического праймера возможно определение единичных нуклеотидных замен, удаленных от 3'-конца праймера.

Создан оригинальный метод комбинированной аллель-специфической амплификации и SSCP, при котором единственный аллель-специфический праймер в одном эксперименте способен выявлять любую из шести мутаций, а в едином опыте SSCP можно выявлять любую из пяти других мутаций. Аналогичные подходы могут найти применение на других моделях.

Методом гнездовой ПЦР с обратной транскрипцией получены экспериментальные данные, касающиеся ассоциации вируса гепатита А с мононуклеарными клетками крови, что расширяет возможности выявления этого вируса у человека в случае отрицательного результата при анализе сыворотки пациента.

Выявлена более высокая способность HSVI проникать в различные органы и ткани сравнительно с HSVII.

Практическая значимость работы. Разработка быстрого, экономичного метода определения устойчивости к рифампицину в культурах М. tuberculosis, выделенных от больных, позволяет применять адекватные подходы к лечению больных. Метод обеспечивает значительное сокращение срока анализа, если в качестве исходного материала используют чистые культуры возбудителя, выращенные на питательной среде, поскольку отпадает необходимость пересева этих культур на среду, содержащую рифампицин, и последующего ожидания результата в течение нескольких недель или месяцев.

Созданные методы гнездовой ПЦР позволяют повысить достоверность и чувствительность выявления Y. pestis, V. cholerae, HSVI и HSVII, вируса гепатита А в инфицированном материале различного происхождения. Этот метод позволяет проводить анализы с инактивировапными возбудителями, не представляющими угрозы для здоровья человека, что очень важно при работе с возбудителями особо опасных инфекций. При этом сокращаются сроки выполнения анализов.

В случае V. cholerae выбор непосредственного фактора вирулентности как мишени для амплификации выгодно отличает разработанный нами подход от применяемых в настоящее время иммуноферментных и микробиологических тестов, имеющих косвенный характер.

Обнаружено, что, в отличие от мазков из урогенитального тракта и клеточного материала мочи, соскобы из урогенитального тракта дают наиболее полную и объективную информацию о совместном присутствии вирусов HSV I и HSV II у больных с диагнозом «герпетическая инфекция».

Высокая чувствительность метода гнездовой ПЦР позволяет проводить поиск возможной аккумуляции вируса гепатита А во фракции мононуклеарных клеток крови при отсутствии возбудителя в сыворотках.

В случае гепатита А и герпеса практическая ценность разработанных методов, в значительной мере, заключается в возможности использовать их как дополнительный тест, подтверждающий результаты ИФА.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработан оригинальный метод детекции мутаций устойчивости к рифампицину у Mycobacterium tuberculosis с применением подходов, не предполагающих секвенирования ДНК.

2. Созданы методы гнездовой ПЦР, имеющие преимущества сравнительно с одноступенчатой ПЦР, для тестирования возбудителей простого герпеса I и II типа, холеры, чумы и гепатита А

3. Гнездовая ПЦР может быть использована при лабораторной диагностике для обнаружения в клиническом материале РНК вируса гепатита А, ДНК вирусов герпеса и возбудителя холеры.

Апробация работы. Результаты работы доложены на 223 Всероссийской конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» (20-22 января 1998г., Москва) и на научно-практической конференции и школе-семинаре для молодых ученых с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (2004г., Астрахань-Москва). Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, июнь, 2005г.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их

обсуждение, выводы, список литературы, включающий 180 источников. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 13 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Бактериальные и вирусные штаммы, питательные среды, клинические образцы.

В качестве материала для исследования использовали ДНК 130 штаммов М. tuberculosis, изолированных из мокроты больных с диагнозом туберкулез легких и предоставленных лабораториями лечебных учреждений. Штаммы М. tuberculosis были предварительно оттестированы на чувствительность к рифампицину на среде Левенштейна-Йенсена.

В работе была использована ДНК 25 штаммов Y. pestis, полученная в противочумных институтах, а также ДНК нескольких коллекционных штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

Материалом для исследований по холере служили фекалии. Использовали также ДНК 18 вирулентных и 7 авирулентных штаммов V.cholerae, полученных из окружающей среды. Очищенные препараты HSVI и HSVII, а также штамма НМ175 вируса гепатита А были предоставлены Институтом вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Клинический материал, содержащий вирус герпеса, был получен из Московского герпетического центра и Центрального кожно-венерологического института МЗ РФ. Клинические образцы от пациентов с диагнозом "гепатит А" и другими формами гепатитов были получены из отделения гепатитов 1-ой инфекционной больницы г. Москвы.

Выделение ДНК и РНК

Выделение ДНК из инфекционного и потенциально опасного материала проводили по предложенной нами методике и под нашим контролем на базе вышеуказанных учреждений, имеющих право на проведение подобных работ, в соответствии с МУ1.3 1794-03 «Организация работ при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности». ДНК из культур М tuberculosis выделяли, применяя порошкообразный SiOi в виде диатомовой земли или SILICA и гуанидинтиоцианат [Boom R. et al., 1990]. ДНК из препаратов вируса герпеса, культур V.cholerae, Y.pestis, а также из клинических образцов выделяли, следуя вариантам классического метода,

включающего экстракцию фенол/хлороформом и осаждение спиртом. РНК вируса гепатита А получали методом экстракции фенол/хлороформом в присутствии гуанидинтиоцианата в кислой среде с последующим осаждением спиртом [Chomszynski P. and Sacchi N., 1987].

Праймеры для ПЦР

Праймеры были рассчитаны при помощи программ Primer3 (http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi, Loghead Institute, Boston, США) или Oligo (Molecular Biology Insights, West Cascade, CILIA) и синтезированы стандартным фосфороамидатным методом. Возможность частичного соответствия их нуклеотидной последовательности повторам человеческой ДНК, которая может присутствовать в клинических образцах, и попадания участков отжига на полиморфные сайты, была исключена путем скрининга относительно соответствующих баз данных.

Проведение ПЦР, а также реакции совмещенной обратной транскрипции и ПЦР.

Все реакции, предназначенные для идентификации возбудителей чумы, холеры, герпеса и гепатита А были построены по гнездовому принципу, сущность которого заключается в том, что полученный ПЦР-продукт разводится и используется как исходный материал во второй ПЦР-реакции, дающей более короткий фрагмент ДНК.

Реакционная смесь для ПЦР во всех случаях готовилась на основе стандартного аммонийного ПЦР-буфера, содержащего общепринятые или эмпирически подобранные концентрации других необходимых компонентов. Программы амплификации были оптимизированы в соответствии с общепринятыми принципами.

При работе над возбудителем гепатита А была сконструирована смесь, совмещающая все ингредиенты, необходимые для обратной транскрипции и ПЦР. После обратной транскрипции с применением обратной транскриптазы MMLV без промежуточных процедур в той же пробирке проводили первую стадию ПЦР. Реакционная смесь для этих реакций конечным объемом 100 мкл содержала 67mM TrisHCl (рН8.8), 16.6 тМ (NH4)2S04, 0.01% Tween-20, 20тМ DTT, О.ЗЗтМ каждого dNTP, 2.5тМ MgCl2, 5ед. обратной транскриптазы MMLV, 2.5ед. BIOTAQ полимеразы, по 50 пмоль каждого из праймеров.

Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,5% или 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.

Секвенирование гена rpoB Mycobacterium tuberculosis

Нуклеотидную последовательность ПЦР-фрагментов, заключающих в себе участок, связанный с резистентностью к рифампицину, определяли по методу Сенгера [Sanger F. et al., 1977] с использованием набора для термоциклического секвенирования «finol DNA Sequencing System» (Promega, США). Секвенирование ПЦР фрагментов гена гроВ проводили с применением праймеров, меченных по 5' концу изотопом фосфора 32Р. Секвенирование каждого фрагмента проводилось по обеим комплементарным цепям ДНК.

Аллель-специфическая амплификация

При аллель-специфической амплификации применяли двухступенчатый гнездовой подход. ПЦР-продукт, включающий сайты искомых мутаций устойчивости к рифампицину, разводили в 20-80 раз, в зависимости от его концентрации, и использовали как материал для второй реакции. На второй ступени один праймер был внутренним и аллель-специфическим, а в качестве второго использовали один из праймеров, применявшихся на первой ступени. Реакции ставили в аппарате "Терцик МС2" (ДНК-технология, Протвино, Московская область). Реакционная смесь и программа амплификации при работе с аллель-специфическими праймерами не имела особенностей, заслуживающих упоминания, однако, количество циклов методом подбора было сокращено до 12±2. Эксперименты с аллель-специфическими праймерами в качестве положительного контроля включали ПЦР-фрагмент, вносимый в количестве, в два раза меньшем количества определяемых образцов, и отрицательный контрольный образец, вносимый в концентрации, в два раза превышающей таковую испытуемых образцов. Это должно было исключать возможность ложных результатов, связанных с неравным содержанием в пробах исходной ДНК.

Анализ конформационного полиморфизма (SSCP)

Условия электрофореза Продукт амплификации денатурировали в формамиде, и вносили в ячейки полиакриламидного геля, содержащего глицерин в концентрации 8,3%. Электрофоретическое разделение денатурированной ДНК проводили в аппарате «Mini-Protean II» (Bio-Rad, США), погруженном в емкость

с охлаждаемой водой (10-18°С). Электрофорез проводили в течение 12-15 часов при 150V.

Окрашивание геля. Гель инкубировали 12-15 минут при комнатной температуре в растворе, содержавшем 10% этанола (о/о), 0.1% уксусной кислоты (о/о) и 0.2% AgNCb (в/о), затем отмывали от несвязавшегося с ДНК нитрата серебра путем погружения в дистиллированную воду и помещали на 15-20 минут в раствор, содержавший 3% NaOH и 1% формалина.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Определение устойчивости к рифампицину у Mycobacterium tuberculosis. Разработка упрощенной методики определения мутаций устойчивости к рифампицину на основе конформационного полиморфизма и аллель-специфической амплификации.

Согласно литературным данным, мутации устойчивости к рифампицину у

M.tuberculosis находятся между 498 и 540 кодоном гена rpoB [Varma-Basil М. et

al.,2004; Karahan Z.C. et al.,2004; Arnold C. et al.,2005]. Методом секвенирования

было проанализировано 52 устойчивых и 48 чувствительных к рифампицину

штаммов. Мутации были обнаружены в 51 устойчивом штамме (табл.1).

Таблица 1. Соотношение различных типов мутаций устойчивости к рифампицину в гене rpoB М. tuberculosis

Кодон Тип мутации Количество штаммов

абс. %

533 ctg (L) ctg-ccc (L-P) 1 2

531 teg (S) tcg-ttg(S-L) 23 46

tcg-tgg(S-W) 1

526 сас (Н) cac-gac (H-D) 5

cac-tac (H-Y) 3 23

cac-ctc (H-L) 2

cac-cgc (H-R) 2

516gac(D) gac-gtc (D-V) 9 23

gac-tac (D-Y) 2

gac-ggc (D-G) 1

Двойная мутация: 514 ttc (F) 515 atg (М) ttc-ttg (F-L) atg (М)-делеция 1 2

Вставка между Вставка-ttc (F)

513 саа (L) и 514 1 2

ttc(F)

Не обнаружено

мутаций 1 2

В целом, анализ гена гроВ в исследованной выборке клинических штаммов М tuberculosis показал достаточно стандартное распределение известных мутаций, за исключением относительно большого процента мутаций в кодоне 516 и не охарактеризованной ранее делении.

Секвенирование является весьма дорогостоящим и трудоемким методом, что затрудняет его применение в рутинной диагностике. Нами была рассмотрена возможность использования для детекции мутаций в гене гроВ простого и нетрудоемкого в исполнении метода аллель-специфичной амплификации. Анализ распределения мутаций рифампицин-устойчивости в штаммах М. tuberculosis показывает, что наиболее часто мутации встречаются в 531, 526 и 516 кодонах гроВ гена. Доля штаммов, имеющих такие мутации, может достигать 80% от общего числа резистентных штаммов. Предлагаемая нами процедура определения резистентности адаптирована, в первую очередь, для выявления штаммов, несущих такие мутации, методом аллель-специфичной амплификации. Последующий анализ оставшейся части штаммов проводится методом конформационного полиморфизма (single strand conformation polymorphism - SSCP). Последовательность действий включает 4 основные этапа и схематически представлена на рис. 1.

На первом этапе проводили амплификацию фрагмента гена гроВ, имеющего длину 157 нуклеотидных пар и включающего область, которая детерминирует устойчивость к рифампицину. Продукт амплификации разводили и использовали в качестве матрицы для аллель-специфичной амплификации с праймерами spl и rpoS (рис.1, этап 2).

Праймер spl, за исключением третьего нуклеотида от З'-конца, идентичен последовательности чувствительных к рифампицину штаммов в районе 526 и 531 кодонов гроВ гена (рис.2). При наличии мутаций в кодоне 526 или 531 амплификация не происходит, тогда как в варианте с ДНК из чувствительных штаммов, происходит амплификация с образованием продукта длиной 80 нуклеотидных пар (рис.3).

гро8

- 1. Амплификация

гро9 фрагмента гена гроВ

гро8

2. Определение мутаций в 526 и 531 кодоне с применением аллель-специфического \ праймера эр1

м 3. Определение замены А-Т

фо9 в 516 кодоне с применением

аллель-специфического праймера эр2

88СР 4. Определение других

мутаций устойчивости с применением ЭЭСР

Рис.1. Очередность отдельных операций при определении устойчивости к рифампицину.

526 531

acccacaagcgccgactctc 3' ccaactgggtgttcgcggctgacagocg 5' TAC TTG

CTC TGG

CGC cag

GAC tgt

cag ttt

AAC

ccc

CAA ggc

Рис.2. Структура праймера spl. Сверху приведена последовательность праймера spl. Некомплементарный нуклеотид в 3evi положении от 3' конца, введенный для повышения специфичности праймера, подчеркнут Ниже показан фрагмент последовательности гена гроВ, комплементарной праймеру. Жирным шрифтом выделены кодоны 526 и 531. Снизу показаны известные мутации в 526 и 531 кодонах. Те из них, которые были обнаружены в исследованной выборке, выделены.

Рис.3. Результат амплификации с аллель-специфическим праймером spl.

Дорожка 1 - чувствительный контроль; дорожки 2-6 - устойчивые мутанты, несущие следующие нуклеотидные замены: 2 -А—» Т во второй позиции 526 кодона, 3 -А-» G во второй позиции 526 кодона, 4 -С —> Т в первой позиции 526 кодона, 5 -С—» G в первой позиции 526 кодона, 6 -С—► Т во второй позиции 531 кодона. Дорожка 7 - стандарты молекулярной массы, имеющие длину 108 и 52. пар нуклеотидов.

На следующем этапе пробы, в которых не было выявлено мутаций в 531 или 526 кодоне, амплифицировали с праймерами spl и гро9 (рис.1, этап 3). Этот праймер комплементарен последовательности часто встречающегося мутанта, несущего замену А —» Т во второй позиции 516 кодона. При наличии такой мутации в исследуемом образце амплифицируется продукт длиной 71 пара нуклеотидов.

На последнем этапе пробы, в которых не было обнаружено мутаций в 516, 526 и 531 кодонах, анализировали методом SSCP. Методом эмпирического поиска были подобраны условия, позволяющие в едином эксперименте определять пять разных мутаций.

Таким образом, приведенная схема детекции мутаций предполагает определение значительной части резистентных штаммов на первых этапах анализа, сокращая число проб для более трудоемкого анализа посредством SSCP. Для оценки эффективности предложенной комбинации методов было проанализировано 122 клинических изолята М. tuberculosis (44 чувствительных и 78 устойчивых). Данные, полученные в ходе аллель-специфической амплификации и SSCP, в «слепом» эксперименте сравнивали с результатами секвенирования гроВ гена тех же проб и с результатами микробиологического анализа резистентности. Результаты оценивали при допущении, что секвенирование при его совпадении с результатом микробиологического определения обладает абсолютной достоверностью. Было обнаружено три несоответствия с результатами секвенирования (2,5%). Два из них оказались одинаковьми и были расценены как ошибки при определении замены С —> Т (G—> А в комплементарной цепи) во втором нуклеотиде 531 кодона с помощью праймера sp\; третье несоответствие было зафиксировано на стадии SSCP. Можно сделать вывод, что разработанная нами стратегия определения устойчивости к рифампицину не полностью свободна от ошибок, хотя их количество невелико сравнительно с другими методами, основанными на ПЦР.

Следует отметить необыкновенные возможности праймера spl. Секвенирование резистентных штаммов, определенных в данном эксперименте показало, что этот праймер корректно определяет, по крайней мере, 5 различных типов мутантов, из которых 4 было локализовано в 526 кодоне. Столь высокая специфичность праймера, имеющего длину 20 нуклеотидов, явилась

неожиданным открытием, так как обычно праймеры «не замечают» единичных некомплементарностей, удаленных от их 3' конца. Удивительно то, что две из этих некомплементарностей принадлежат к типу пурин-пиримидин (обе С:А), где энергия связи между нуклеотидами не столь сильно отличается от энергии связи в правильных комплементарных парах. Аналогичное наблюдение независимо было сделано Л.И. Патрушевым с соавт. [1998].

2. Разработка метода определения РНК вируса гепатита А и анализ его информативности при диагностике гепатита А.

Вирус гепатита А содержит РНК и, благодаря консервативности своих эпитопов и отсутствию перекрестных иммунологических реакций, является сравнительно удачным объектом для детекции посредством иммуноферментного анализа. Гнездовая ПЦР, разработанная нами, предполагает использование в качестве матрицы комплементарной ДНК, полученной в реакции обратной транскрипции, проводимой перед ПНР. Поскольку метод был рассчитан на широкое и массовое применение, одна из главных задач, которая решалась при его разработке -сделать его максимально простым и удобным. Нами были найдены условия, при которых после обратной транскрипции без промежуточных процедур и в той же пробирке проводили ПЦР с внешними праймерами. Высокая чувствительность метода (15 копий генома) была установлена на модели чистого препарата вируса, а его исключительная специфичность - при использовании большого количества образцов посторонней ДНК или РНК, выделенной из разнообразных организмов, включая человека.

Было охарактеризовано 59 образцов крови, полученных от пациентов с диагнозом "гепатит А". Все пациенты были серопозитивны на содержание антител к вирусу гепатита А. Данные ПЦР совпали с результатами иммуноферментного анализа в 46 случаях (78%). Неполное совпадение данных иммуноферментного анализа и ПЦР вероятно объясняется персистенцией антител в крови пациента после того, как вирус, при развитии этой болезни, исчез из кровяного русла и сконцентрировался в печени.

В медицинской практике нередко встречаются случаи смешанных инфекций, когда пациент поражен одновременно несколькими формами вирусного гепатита. В таких ситуациях симптомы часто маскируют друг друга, и

диагностика в большей степени полагается на данные лабораторных исследований, чем на клинические признаки. Мы обследовали отдельную выборку из 33 больных, имеющих признаки и несущих маркеры других форм гепатита. У 16 пациентов данной группы (49%) была обнаружена РНК вируса гепатита А. Анализ сыворотки методом ИФА показал, что 9 пациентов имеют суммарные антитела к этому вирусу (27%). Совпадение с результатами ИФА наблюдалось в 6 случаях.

Обнаружено также, что данный вирус может присутствовать не только в сыворотке, но и в мононуклеарных клетках крови. Зарегистрированы случаи, когда он выявлялся только в мононуклеарных клетках. В выборке больных, имеющих только гепатит А, таких случаев было сравнительно немного (11% от числа пациентов, у которых методом ПЦР был обнаружен вирус гепатита А). Однако у пациентов со смешанной инфекцией РНК гепатита А была обнаружена только в мононуклеарных клетках крови у большей части пациентов (11 человек из 16 или 69%). Эти данные не согласуются с представлением, что вирионы гепатита А пребывают в крови в форме простой суспензии и инертны по отношению к клеткам крови.

Путем сравнения количеств получаемого ПЦР-продукта с активностью печеночных аминотрансфераз была предпринята попытка ответить на вопрос, пригоден ли данный метод для оценки степени поражения печени. Была проанализирована выборка из 7 человек. Один из них после ПЦР-анализа имел низкую концентрацию искомого фрагмента ДНК, определяемую по яркости свечения соответствующей полосы в агарозном геле. Активность печеночных аминотрансфераз у этого испытуемого оказалась в несколько десятков раз ниже, чем у остальных, имевших в результате ярко светящийся ПЦР-фрагмент. Подобный результат носит сугубо предварительный характер и требует масштабной проверки ввиду распространенного среди специалистов убеждения, что традиционная ПЦР непригодна для количественных измерений.

3. Специфичные ПЦР для дифференциальной диагностики HSV I и HSV II. Распространенность этих вирусов в различных органах. Выявление оптимального способа получения клинического материала из урогенитального тракта, объективно отражающего раздельное и совместное присутствие обоих типов вируса.

Разработанный нами метод гнездовой ПЦР позволяет различать два типа вируса простого герпеса. Как на первой, так и на второй ступени гнездовой ПЦР один из пары праймеров специфичен по отношению к I или П типу. Такая постановка метода обеспечивает двойной контроль достоверности полученного результата в отношении точности идентификации типа вируса и, следовательно, должна резко снижать возможность ошибок. Чувствительность метода составила приблизительно 10 копий вирусного генома. Специфичность этого метода по отношению к простому герпесу человека была показана в экспериментах, где в качестве матрицы использовалась чужеродная ДНК девяти различных вирусов, бактерий, и геномная ДНК человека.

Исключительно широкая распространенность носительства простого вируса герпеса человека является общеизвестным фактом. Благодаря доступности материала из различных тканей и секретов организма клинически здоровых людей, мы смогли определить по отдельности «область распространения» HSV I и HSV II внутри организма (табл.2).

Таблица 2. Определение HSV 1 и HSV 2 у здоровых доноров

Количество доноров Клинический материал HSV1 только HSV2 только HSV1 +HSV2 HSV1 % HSV2 % HSV1 +HSV2 % Общий %

56 слюна 2 0 0 4 0 0 4

50 слезная жидкость 3 0 0 6 0 0 6

65 мазок из урогенитального тракта 1 2 2 2 3 3 8

30 мононуклеарные клетки крови 1 0 1 3 0 3 7

45 клеточный материал мочи 0 3 0 0 7 0 7

22 сперма 0 0 1 0 0 5 5

Как и ожидалось, при этом обследовании были получены, главным образом, отрицательные результаты. Вирус I типа обнаружен во всех типах материала, за

исключением клеточного материала мочи. Вирус П типа преобладал в образцах, полученных из урогенитального тракта, но отсутствовал в слюне и слезной жидкости.

В выборке больных исследовали мазки урогенитального тракта, соскобы урогенитального тракта, клеточный материал мочи (табл.3). Присутствие вируса герпеса у больных было зафиксировано во всех случаях.

Таблица 3. Определение НБ\/1 и НБ\/2 у пациентов с диагнозом "герпетическая инфекция"

Количестве ионоров Вид и способ взятия клинического материала НАЛИЧИЕ ДНК ВИРУСА

ШУ1 ШУИ ШУ1+ШУП % ШУИ % ШУ1+ШУ2 %

15 соскобиз урогенитального тракта 2 9 4 13 (40) 60, (87) 27

28 мазки из урогенитального тракта 2 23 3 7 (18) 82 (93) 11

18 моча 1 17 0 6 (6) 94 (94) 0

* Цифры в скобках обозначают процент, рассчитанный с учетом смешанных инфекций. Например, для ШУ1 и соскобов (2+4)/15=0,4-100=40.

Считается, что вирус герпеса II типа является "генитальным", то есть преимущественно определяется в урогенитальном тракте. Это подтверждается также нашими результатами.

Из данных таблицы 3 видно, что успех или неудача при детекции вируса I или II типа могут зависеть от вида и способа извлечения клинического материала. Принимая в расчет случаи смешанных инфекций, частота обнаружения вируса I типа в моче-6%, а в соскобах-40%. Следовательно, разные виды и способы взятия клинического материала для анализа неравноценны по их информативности при выявлении вирусов герпеса I или II типа. Необходимо подчеркнуть еще один важный вывод из таблицы 3. Ее данные открывают принципиальную возможность подойти к ответу на вопрос, какую долю в действительности составляют лица, несущие оба типа вируса в урогенитальном тракте. Вирус герпеса I типа, реально присутствующий в урогенитальном тракте, но ускользающий от детекции при анализе клеточного

материала мочи, выявляется методом соскобов, хотя соскобы, возможно, в свою очередь, не позволяют в полной мере выявить вирус герпеса II типа. Напротив, моча выглядит как наиболее удачный объект для выявления вируса герпеса II типа. Таким образом, истинный процент смешанных инфекций вычисляется следующим образом: (а%+в%)-100%, где а-процент обнаружения вируса герпеса I типа в соскобах с учетом смешанных инфекций, равный 40; Ь- процент обнаружения вируса герпеса II типа в моче с учетом смешанных инфекций, равный 94. Процент смешанных инфекций, рассчитанный таким образом, оказывается равным 34 и весьма близким к экспериментальному значению равному 27, полученному при использовании соскобов. Делая общий вывод по таблице 3, можно утверждать, что наиболее объективную информацию можно получить при использовании метода соскобов.

Клинически обособленную группу составляют больные герпесом с генитальными язвами. Из 11 обследованных нами больных у 3 пациентов обнаружены оба типа вируса, 7 пациентов страдали генитальным герпесом, вызваным вирусом II типа, и только в одном случае причиной генитальных язв был вирус I типа.

Отдельная линия исследований была направлена на выяснение возможных преимуществ гнездового метода определения вирусов простого герпеса в клиническом материале сравнительно с одностадийными реакциями на «общий герпес», разработанными и применяемыми двумя крупными диагностическими фирмами В одном случае анализировали выборку из 79 пациентов с диагнозом «герпетическая инфекция», поставленным на основе совокупности клинических данных и лабораторных исследований, исключающих ПЦР. Этот диагноз служил критерием для сравнения. Результаты, полученные при использовании набора одной из упомянутых фирм, имели 19% ошибок. Методом гнездовой ПЦР правильный результат был получен в 100% случаев. Применительно ко второй фирме, исследовали 108 пациентов с «подозрением на герпетическую инфекцию». Результаты анализов, проведенных этой фирмой, не поддавались однозначному истолкованию и поэтому не позволяли ответить на вопрос, присутствует ли в организме пациента вирус герпеса. Разработанным нами методом удалось обнаружить этот вирус у 29 больных.

4. Создание гнездовой системы для детекции Vibrio cholerae и анализ вирулентности вибрионов

Применительно к холере, решающее значение при оценке метода ПЦР имеет его возможность избирательно выявлять вирулентные штаммы V. cholerae. Разработанный нами гнездовой метод детекции возбудителя холеры основывается на определении специфических последовательностей гена ctxA, кодирующего одну из субъединиц фактора вирулентности (холерного токсина). Чувствительность метода, проверенная на штамме М045 (серогруппа 0139), составила до 1 копии генома. При использовании разнообразных неспецифических ДНК-матриц, полученных из патогенных микроорганизмов и человека, образования специфических ПЦР-фрагментов ни в одном случае не наблюдали.

Метод испытан на трех больных с клиническим диагнозом «холера». В эксперимент был включен также один испытуемый, являющийся носителем холерного вибриона, вирулентность которого не была доказана. В качестве положительных контролей использовали коллекционный фекальный материал, содержащий вирулентные бактерии М045, и, дополнительно, штамм Е. coli с генами термолабильного энтеротоксина eltAB (термолабильный энтеротоксин Е. coli и холерный энтеротоксин имеют очень большую гомологию в аминокислотной и нуклеотидной последовательности, сходную структуру и механизм действия [Dallas et al., 1980]). В качестве отрицательных контролей использовали культуры двух нетоксигенных штаммов V. cholerae и культуру одного нетоксигенного штамма Е. coli. Результаты анализа в контролях подтвердили наличие или отсутствие энтеротоксина. Кроме этого, у всех трех больных с клиническим диагнозом «холера» ПЦР-анализ подтвердил присутствие гена субъединицы А холерного токсина, что эквивалентно подтверждению вирулентности штамма. В случае вибрионосителя был также получен положительный результат относительно гена вирулентности. Именно этот результат представляет особый интерес, так как концентрация бактерий холеры в исходном материале, как можно предполагать, была во много раз ниже, чем у больных холерой, и тем не менее, чувствительность метода гнездовой ПЦР и в этом случае оказалась достаточно высокой, чтобы уловить искомый ген токсина. В целом, подобные результаты свидетельствуют, что ПЦР позволяет определять вирулентность V. cholerae в фекалиях, минуя стадию культивирования.

Кроме этого, данный метод был применен для анализа изолятов V cholerae, полученных из окружающей среды (прудовой или речной воды, а также из воды канализационных стоков). Было обследовано 17 вирулентных и 7 авирулентных штаммов. Их вирулентность была установлена предварительно иммуноферментным методом или на основе заражения лабораторных животных в лабораториях противочумных институтов. Результаты ПЦР-анализа в 100% случаев совпали с ожидаемыми, то есть, специфические ПЦР-продукты наблюдали только в образцах ДНК вирулентных штаммов V. cholerae. В диагностике холеры традиционно применяется следующая стратегия: проводят анализ морфологических, физиологических и биохимических свойств изолированных бактерий с целью определения принадлежности к виду Vibrio cholerae, а также их серологическое тестирование с целью установления сероваров/серотипов, свойственных патогенным штаммам. Разработанный нами метод прост, не требует культивирования, применим как для санитарного мониторинга окружающей среды, так и в клинической практике для быстрого определения вирулентности V. cholerae, и направлен на непосредственное выявление фактора вирулентности.

5. Разработка оптимальных условий проведения ПЦР для детекции возбудителя чумы и испытание созданной тест-системы на коллекционных штаммах

Детекция возбудителя чумы, проводимая традиционными методами, предполагает серию трудоемких, весьма длительных и не вполне безопасных биохимических тестов, производимых, в основном, на живых культурах. Надежных иммуноферментных методов детекции возбудителя чумы пока не существует, либо они требуют применения дорогостоящих моноклональных антител. Разработанный нами метод идентификации Y.pestis, как и в остальных вышеописанных случаях, основан на гнездовой ПЦР. Он предполагает амплификацию участка плазмиды, специфичной для Y.pestis как вида и отсутствующей в близкородственных и также патогенных для человека Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis. Как исходный материал можно использовать убитые бактерии. Чувствительность метода составила до 1 копии генома. Для проверки специфичности реакции были поставлены с ДНК различных штаммов У. pseudotuberculosis, У. enterocolitica, М. tuberculosis, V. cholerae и с ДНК человека. Образования специфических ПНР-продуктов ни в одном случае не наблюдали.

Для дальнейшей проверки метода проанализирована ДНК 25 штаммов Y penis, выделенных из разнообразных источников в природных очагах чумы. Положительный результат был получен в 24 случаях. Таким образом, гнездовая ПЦР позволила обнаружить Y. pestis в 24 культурах из 25 (96%). Применение одноступенчатой ПЦР привело к менее удовлетворительному результату [только 21 из 25 штаммов показали положительный результат (84%)]. Следовательно, можно констатировать, что ПЦР, и в особенности ее гнездовой вариант, применима для определения культур У. pestis и является чувствительным и высокоспецифичным методом детекции этого микроорганизма.

Приносим глубокую благодарность всем сотрудникам лечебных учреждений за практическую помощь и консультации при выполнении диссертационной работы.

выводы

1. Определен спектр мутаций устойчивости к рифампицину в штаммах М tuberculosis, циркулирующих у больных в России. Разработан упрощенный вариант метода детекции мутаций устойчивости к рифампицину путем комбинированного применения аллель-специфичной амплификации и SSCP.

2. Показана возможность применения аллель-специфической амплификации для определения нуклеотидных замен, удаленных от 3'-конца праймера.

3. Продемонстрирована высокая чувствительность и специфичность гнездового метода ПЦР при детекции возбудителей простого герпеса человека I и II типа, холеры, чумы и гепатита А. Показаны его преимущества по сравнению с одноступенчатой ПЦР.

4. Показана эффективность применения гнездовой ПЦР для обнаружения ДНК вирусов герпеса и бактерий холеры, а также РНК вируса гепатита А в клиническом материале, что свидетельствует о целесообразности использования гнездовой ПЦР в лабораторной диагностике.

5. Установлена способность вируса гепатита А накапливаться во фракции мононуклеарных клеток крови, что позволяет расширить возможности его обнаружения в крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Генерозов Э.В., Альтшулер М.Л., Денисова Т.С., Владимирский М.А., Андросова М.Н., Черноусова Л.Н., Шашкина Е.Ф., Адамович Н.В., Говорун В.М. Выявление мутаций в гене гроВ, обуславливающих резистентность Mycobacterium tuberculosis к рифампицину. //Материалы 2— всероссийской конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний». - г. Москва. - 20-22 января 1998г., С.94-95.

2. Генерозов Э.В., Альтшулер М.Л., Говорун В.М., Лопухин Ю.М., Голышевская В.И., Черноусова Л.Н., Хоменко А.Г. Детекция и характеристика мутаций в гене гроВ резистентных к рифампицину клинических штаммов М. tuberculosis // Проблемы туберкулеза. - 1999. -N7. - С.39-42.

3. Альтшулер М.Л., Генерозов Э.В., Черноусова Л.Н., Голышевская В.И., Говорун В.М., Хоменко А.Г. Применение аллель-специфической амплификации и анализа конформационного полиморфизма для выявления устойчивости к рифампицину клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - 1999.-том 128.-N11.-C.555-559.

4. Альтшулер М.Л. Новое понимание феномена устойчивости к лекарствам на примере рифампицинрезистентности у Mycobacterium tuberculosis // Экспериментальна и клинична медицина - 1999 - N2. - С.24-26.

5. Глухов А.И., Гордеев С.А., Альтшулер М.Л., Северин С.Е. Применение метода гнездовой полимеразной цепной реакции для дифференциальной диагностики вируса простого герпеса человека // Клиническая лабораторная диагностика. - 2003. - N2. - С.45-49.

6. Глухов А.И., Гордеев С.А., Альтшулер М.Л., Зыкова И.Е., Северин С.Е Применение гнездовой ПЦР в детекции возбудителя чумы // Клиническая лабораторная диагностика. - 2003. -N7. - С.47-50.

7. Глухов А.И., Гордеев С.А., Альтшулер М.Л., Зыкова И.Е., Северин С.Е. Анализ вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae методом

гнездовой полимеразной цепной реакции // Клиническая лабораторная диагностика. -2004. -N1. - С.48-51.

8. Альтшулер M.JL, Олейникова T.JI., Гордеев С.А., Глухов А.И. Детекция РНК вируса гепатита А методом ПЦР. // Материалы научно-практической конференции и школы-семинара для молодых ученых с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Москва - июль, 2004г., Часть. 1-С.9-11.

9. Глухов А.И., Гордеев С.А., Альтшулер M.JL, Блинкова Л.П., Быченко А.Б., Тенцов Ю.Ю., Северин С.Е. Разработка и испытание ПЦР тест-системы для детекции РНК вируса гепатита А // Журн. микробиол. - 2004. - N4. -С.50-54.

10.Глухов А.И., Гордеев С.А., Альтшулер M.JI., Блинкова Л.П., Быченко А.Б., Тенцов Ю.Ю., Северин С.Е. Исследование эффективности и области применения метода гнездовой ПЦР при диагностике гепатита А // Журн. микробиол. - 2004. - N6. - С.88-91.

РНБ Русский фонд

2006-4 9531

Заказ №417. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Альтшулер, Михаил Львович

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ.

1.1.1. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПЦР.

1.1.1.1. Структура и совместимость праймеров.

1.1.1.2. Денатурация ДНК-матрицы.

1.1.1.3. Температура отжига праймеров.

1.1.1.4. Количество циклов амплификации.

1.1.2. ЗНАЧЕНИЕ ПЦР ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ МУТАЦИЙ И АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ.

1.1.2.1. Обзор методов детекции мутаций в ПЦР фрагментах.

1.1.2.1.1. Полный анализ нуклеотндной последовательности, проводимый с помощью ссквснированпн.

1.1.2.1.1.1. Определение нуклеотндной последовательности методом секвенирования по Сеигеру.

1.1.2.1.1.2. Секвеиироваиие, основанное на гибридизации.24 1.1.2.1.2. Методы, направленные на идентификацию огличий в нуклсотидпой последовательности или па определение избранных мутаций.

1.1.2.1.2.1. Конформационные методы.

1.1.2.1.2.1.1. Метод, основанный на локальном плавлениии ДНК.

1.1.2.1.2.1.2. Гетеродуплексный анализ.

1.1.2.1.2.1.3. Конформационно-чувствительньш электрофорез в агарозе.

1.1.2.1.2.1.4. Конформациопиый полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК.

1.1.2.1.2.2. Лигазная цепная реакция.

1.1.2.1.2.3. Гибридизация и микрочипы.

1.1.2.1.2.4. Использование рестрикции для детекции мутаций.

1.1.2.1.2.5. Микросиквенс.

1.1.2.1.2.6. Использование белков, узнающих иекомплемеитариости.

1.1.2.1.2.7. Химическое расщепление некомтемеитариостеи.

1.1.2.1.2.8. Метод "молекулярныхмаяков" (Molecular beacons).

1.1.2.1.2.9. Агчель-специфическая амплификация.

1.1.3. ПРЕИМУЩЕСТВА «ГНЕЗДОВОГО» МЕТОДА ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.

1.2. АНАЛИЗ ГЕНА RPOB КАК МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ У MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

1.3. ОПАСНОСТЬ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВИРУСОМ ГЕРПЕСА И ЗНАЧЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ В ЕГО ДИАГНОСТИКЕ.

1.4. ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ.

1.4.1. АКТУАЛЬНОСТЬ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ В УСЛОВИЯХ СОВРЕМЕННОГО ОБЩЕСТВА.

1.4.2. ВЫБОР ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МИШЕНИ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ YERSINIA PESTIS.

1.5. ХОЛЕРНЫЙ ЭНТЕРОТОКСИН КАК ФАКТОР ВИРУЛЕНТНОСТИ И МИШЕНЬ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ

1.6. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ГЕПАТИТА А И ЗНАЧЕНИЕ ПЦР В ЕГО ДИАГНОСТИКЕ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ И ВИРУСНЫЕ ШТАММЫ, ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, ИСТОЧНИКИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ.

2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК И РНК.

2.1.2.1. Выделение ДНК из м. tuberculosis.

2.1.2.2. Выделение РНК вируса гепатита А.

2.1.2.3. Выделение ДНК У. Pestis, V. choleraew вируса герпеса.

2.3. ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ПЦР.

2.4. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР И СОВМЕЩЕННЫХ РЕАКЦИЙ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ С ПЦР.

2.5. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНА RPOB MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

2.6. АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ.

2.7. АНАЛИЗ КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА (SSCP).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ У MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

3.1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРА МУТАЦИЙ, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ К РИФАМПИЦИНУ.

3.1.2. РАЗРАБОТКА УПРОЩЕННОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ НА ОСНОВЕ КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА И АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ.

3.1.3. ВЫЯВЛЕНИЕ ЗНАЧИМОСТИ РЕДКИХ МУТАЦИЙ.

3.1.4. ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ В ПЦР-ПРОДУКТАХ.

3.2. РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ И ИСПЫТАНИЕ СОЗДАННОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММАХ.

3.3. СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ГНЕЗДОВОЙ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ДНК VIBRIO CHOLERAE И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ АНАЛИЗА ВИРУЛЕНТНОСТИ ВИБРИОНОВ.

3.4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГНЕЗДОВОЙ ПЦР ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ЧЕЛОВЕКА I И II ТИПА (HSV И HSV2).

3.5. ИСПЫТАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА А. ВЫВОДЫ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Русскиа АТФ (англ. АТР) —аденозиптрифосфорная кислота ИФА иммуноферментный анализ МКК мопононуклеарные клетки крови ПЦР (англ. PCR)- полимеразная цепная реакция А иглийскис А аденин АТР аденозиптрифосфорная кислота BLAST Basic Local Alignment Search Tool (Базовый инструмент поиска сходства последовательностей, основанный на принципе локального сопоставления) bp пуклеотидпая пара-пара комплементарных пуклеотидов, находящихся напротив друг друга в двух цепях ДНК С цитозип CMV цитомегаловнрус ü АТР дезоксиаденозинтрнфосфорпая кислота üCTP дезокснцитиднитрнфосфориая кислота ÜGTP — дезоксигуанозннтрнфосфорная кислота ÜTTP дезокситнмндинтрнфосфорная кислота EBV вирус Эшитейпа-Барра G гуанин HAV вирус гепатита А HBV вирус гепатита В I1HV6 вирус герпеса типа VI HI V-1 — вирус иммунодефицита человека типа I HSV1 вирус простого герпеса человека I типа HSV2 вирус простого герпеса человека II типа HTLV-1 -Т-лимфотропный вирус человека типа I HZV вирус герпеса зостср NCBI National Center for Biotechnology Information (Государственный Центр Биотехнологической Информации, США) RT-PCR совмещенная реакция обратной транскрипции (ЯТ)и ПЦР (PCR) SDS додецплсульфат натрия SSCP single-strand conformation polymorphism (конформационный полиморфизм однонитевых фрагментов ДИК) Т-тимин

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A"

1. Актуальность проблемы.

По чувствительности, быстроте, простоте и дешевизне ПЦР сопоставима с иммуноферментным анализом или даже превосходит его. В некоторых, случаях ПЦР оказывается предпочтительным пли единственно возможным методом детекции возбудителя.

Актуальность представленной диссертационной работы обусловлена необходимостью повышения достоверности, чувствительности и скорости выявления возбудителей. Вариант метода ПЦР, называемый nested или гнездовой ПЦР, нацелен на исключение ошибочных реультатов и обладает повышенной чувствительностью. Суть гнездовой ПЦР заключается в проведениии двух последовательных реакций, при которых исходным материалом для второй реакции является продукт (ампликон) первой [166]. Так обеспечивается двойной контроль результата анализа, практически исключающий вероятность ошибки. Кроме этого, гнездовая ПЦР обладает дополнительным преимуществом. Оно состоит в том, что при использовании аплель-специфических праймеров во время второй реакции гнездовой ПЦР, благодаря структурной простоте матрицы,становится возможным определение мутаций, удаленных от З'-конца праймера [114].

Например, выявление с помощью гнездовой ПЦР возбудителя чумы в тестируемом материале позволит своевременно применить экстренные меры профилактики и терапии [90].

Трудоемкость, длительность и относительно высокий риск ошибок при использовании на практике традиционного двухэтапного подхода, применяемого для обнаружения вирулентных штаммов Vibrio cholerae у больных, вибрионосителей, в объектах окружающей среды также делает гнездовую ПЦР предпочтительным методом анализа. В данном случае ПЦР позволяет идентифицировать возбудителя непосредственно в клиническом материале, прошедшем бактерицидную обработку, минуя стадию подращивания и клонирования этого опасного микроорганизма.

Нужно отметить, что для Mycobacterium tuberculosis характерен медленный рост на питательных средах. Это не позволяет своевременно выявить у пациентов лекарственноустойчивые штаммы, в частности, штаммы, устойчивые к рифампицину - одному из ведущих противотуберкулезных препаратов [173]. Возможной альтернативой остается определение мутаций, вызывающих устойчивость к лекарству. [8, 70, 146] Для определения таких мутаций необходим быстрый, недорогой и нетрудоемкий метод. В этом случае также может быть применена гнездовая ПЦР с использованием аллель-специфических праймеров, перекрывающих несколько мутантпых сайтов, дополненная методом конформационного полиморфизма ДНК (single-strand conformation polymorphism, SSCP).

Герпетическая инфекция человека — болезнь, дающая серьезные осложнения. При этом, патологические состояния, вызванные HSV I иHSV И, неодинаковы по своим проявлениям и последствиям [2]. ПЦР позволяет проводить дифференциальную диагностику HSV I и IISV II, а ее гнездовой вариант - исключить ошибки при анализах.

Задачи исследования.

4. Разработать гнездовую ПЦР, направленную на непосредственную идентификацию гена, кодирующего факторвирулентности (энтеротоксин) V. cholerae, у больных, вибрионосителей и в окружающей среде.

5. Разработать метод гнездовой ПЦР для определения У. pestis, не дающий перекрестных реакций с У. enterocolitica и У. pseudotuberculosis.

Научная новизна. Научно обоснованы и апробированы методы гнездовой ПЦР с коллекционными штаммами yersinia pestis, Vibrio cholerae, рифампицин-резистентного Mycobacterium tuberculosis, IISV I и HSV II и вируса гепатита А, а также с образцами материала, инфицированного этими микроорганизмами.

Впервые определен спектр мутаций устойчивости к рифампицину в российских штаммах М tuberculosis. При этом было зарегистрировано необычно высокое относительное количество мутаций в кодоне 516 гена гроВ и была открыта новая, не описанная в литературе двойная мутация.

Создан оригинальный метод комбинированной аплель-специфической амплификации и SSCP, при котором единственный аллель-специфический праймер в одном эксперименте способен выявлять любую из шести мутаций, а в едином опыте SSCP можно выявлять любую из пяти других мутаций. Аналогичные подходы могут найти применение на других моделях.

Выявлена более высокая способность HSVI проникать в различные органы и ткани, сравнительно с HSVII.

Практическая значимость работы. Разработка быстрого,экономичного метода определения устойчивости к рифампицину в культурах M.tuberculosis, выделенных от больных, позволяет применять адекватные подходы к лечению больных. Метод обеспечивает значительное сокращение срока анализа, если в качестве исходного материала используют чистые культуры возбудителя, выращенные на питательной среде, поскольку отпадает необходимость пересева этих культур на среду, содержащую рифампицин, и последующего ожидания результата в течение нескольких недель или месяцев.

Созданные методы гнездовой ГТЦР позволяют повысить достоверность и чувствительность выявления Y. pestis, V. cholerae, HSV! и HSVII, вируса гепатита А в инфицированном материале различного происхождения. Этот метод позволяет проводить анализы с ипактивированпьиш возбудителями, не представляющими угрозы для здоровья человека, что очень важно при работе с возбудителями особо опасных инфекций. При этом сокращаются сроки выполнения анализов.

Положения, выносимые на защиту.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Альтшулер, Михаил Львович

ВЫВОДЫ

1. Определен спектр мутаций устойчивости к рпфамницину в штаммах Л/. tuberculosis, циркулирующих у больных в России. Разработан упрошенный вариант метода детекции мутаций устойчивости к рифампицину путем комбинированного применения аллель-специфичной амплификации и SSCP.

2. Показана возможность применения аллель-специфической амплификации для определения нуклеотидных замен, удаленных от З'-конца праймера.

4. Показана эффективность применения гнездовой ПЦР для обнаружения ДНК вирусов герпеса и бактерий холеры, а также PIIK вируса гепатита А в клиническом материале, что свидетельствует о целесообразности использования гнездовой ПЦР в лабораторной диагностике.

5. Установлена способность вируса гепатита А накапливаться во фракции монопуклеарных клеток крови, что позволяет расширить возможности его обнаружения в крови.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Альтшулер, Михаил Львович, Москва

1. Баринский И.Ф., Шубладзс А.К., Каспаров А.А., Гребешок В.Н. Герпес: этиология,диагностика, лечение// 1986, Медицина, Москва.

2. Бочаров А.Ф., Кицак В.Я., Бочаров Е.Ф., Трухачсв А.А. Вирус простого герпеса // 1982, Наука, Новосибирск.

3. Генерозов Э.В., Альтшулср М.Л., Говорун В.М., Лопухин Ю.М., Голышевская

4. B.И., Черноусова Л.Н., Хоменко А.Г. Детекция и характеристика мутаций в гене гроВ резистентных к рифампицину клинических штаммов М. tuberculosis // 1999, Проблемы туберкулеза, 7:39-42.

5. Лакина Е.И., Куш А.А. РНК вируса гепатита С у пациентов с диагнозом «вирусный гепатит С» // 2002, Вопросы вирусологии, 47:4-11.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование // 1984, Мир, Москва.

7. Покровский В.И., Поздеев O.K. (ред.). Медицинская микробиология // 1999, ГЭОТАР-МЕД, Москва.

8. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия // 2001, ГЭОТАР-МЕД, Москва.

9. Стент Г., Кэлиндер Р. Молекулярная генетика //1981, Мир, Москва.

10. Шаханнпа И.Л., Радуто О.И. Вирусные гепатиты в России: официальная статистика и экономические потерн//2001, Вакцинация. Новости вакцинопрофплактпкп, №6 (18):5-10.

11. Amor M, Parker KL, Globcrman H, New Ml, White PC. Mutation in the CYP21B gene (iIel72-to-asn) causes steroid 21-hydroxylase deficiency // 1988, PNAS, 85:1600-1604.

12. Applied Biosystems. 3730/3730x1 DNA analyzers//2004,http:/AvAvw.wtcrf.ed.ac./genetics/4331467b.pdf

13. Baklouti F, Giraud Y, Francina A, Richard G, Perier C, Geyssant A, Jaubert J, Brizard

14. C, Dclaunay J. Hemoglobin Grange-Blanche beta 27(B9) Ala—Val., a new variant with normal expression and increased affinity for oxygen // 1987, FEBS Lett, 223:5962.

15. Babon JJ, McKcnzie M, Cotton RG. The use of resolvascs T4 cndonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection // 2003, Mol Biotechnol, 23:73-81.

16. Barany F. The Ligase chain reaction in a PCR world //1991, PCR Methods and Applic, 1:5-16.

17. Barbosa GHTS, Santanal EM, Almeida AMP, Araujo AM, Fatibcllo-Filho O, Carvalho LB, Jr. The use of filter paper plasticized with polyvinyl alcohol-glutaraldchyde in ELISA II2000, Braz J Med Biol Res, 33: 823-827.

18. Bassam BJ, Caetano-Anolles G, GressholTPM. Fast and sensitive silver staining of DNA in Polyacrylamide gels//1991, Anal Biochem, 198:217-220.

19. Bi LJ, Zhou YF, Zhang XE, Deng JY, Zhang ZP, Xie B, Zhang CG. A MutS-based protein chip for detection of DNA mutations // 2003, Anal Chem, 75:4113-4119.

20. Blouquit Y, Bardakdjian J, Lena-Russo D, Arous N, Pcrrimond II, Orsini A, Rosa J, Galacteros F. HB Bruxellcs: beta-41 or 42(C7 or CDl)phe deleted // 1989, Hemoglobin, 13:465-474.

21. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wortheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // 1990, J Clin Microbiol, 28:495-503.

22. Bottaro M, Berti E, Biondi A, Migone N, Crosti L. Hctcroduplex analysis of T-ccll receptor y gene rearrangements for diagnosis and monitoring of cutaneous T-cell lymphomas // 1994, Blood, 83:3271-3278.

23. Bradley RD, Ilillis DM. Recombinant DNA sequences generated by PCR amplification //1997, Mol Biol Evol, 14:592-593.

24. Brcnnan SO, Williamson D, Symmans WA, Carrell RW. Two unstable hemoglobins in one individual: Hb Atlanta (beta 75 Leu leads to Pro) and Hb Coventry (beta 141 Leu deleted)// 1983, Hemoglobin, 7:303-312.

25. Bunce M, Young NT, Welsh KI. Molecular HLA typing the brave new world // 1997, Transplantation, 64:1505-1513.

26. Burke JF (ed.). PCR: Essential techniques // 1996, Wiley, New York-London-Amstcrdam-Sydney.

27. Butler T. Plague and other Yersinia infections // 1983, In "Current Topics in Infectious Diseases", W.B. Greenough and T.S. Mcrigan (eds), Plenum Press, New York.

28. Canetti G, Froman S, Grossctt A. Mycobacteria: Methods for testing drug sensitivity and resistance // 1963, J Bull Wld Health Org, 29:565-579.

29. Caugant DA, Sandven P, Eng J, Jeque JT, Tonjum T. Detection of rifampin resistance among isolates of Mycobacterium tuberculosis from Mozambique // 1995, Microb Drug Resist, 1:321-326.

30. Cha RS, Zarbi H, Keohavong P, Thilly WG. Mismatch amplification mutation assay (MAMA) // 1992, PCR methods applic, 2:14-20.

31. Chang HL, Zaroukian MH, Esselman WJ. T200 alternate exon use in murine lymphoid cells determined by reverse transcription-polymerase chain reaction // 1989, J Immunol, 143:315-321.

32. Chantcau S, Rahalison L, Ralafiarisoa L, Foulon J, Ratsitorahina M, Ratsifasoamanana L, Carniel E, Nato F. Development and testing of a rapid diagnostic test for bubonic and pneumonic plague// 2003, Lancet, 361:211-216.

33. Chiou S-H, Hu M-C, Chung B. A misscnse mutation at ilcl72-to-asn or arg356-to-trp causes steroid 21-hydroxylase deficiency // 1990, J Biol Chem, 265:3549-3552.

34. Chomszynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatc-phcnol-cloroform extraction// 1987, Anal Biochem, 162:156-159.

35. Chung H, Jaykus L-A, Sobsey MD. Detection of human enteric viruses in oysters by in vivo and in vitro amplification of nucleic acids // 1996, Appl Environment Microbiol, 62:3772-3778.

36. Cooksley G. Hepatitis disease management-integrating prevention, diagnostics and therapeutics // 2002, Proceedings of the 10th International Congress on Infectious Diseases, Singapore, CTp. 34.

37. Cooper KL, Gocring RV. Development of a universal probe for electronic microarray and its application in characterization of the Staphylococcus aureus polC gene // 2003, J Mol Diagn, 5:28-33.

38. Corso D, Cognata B, Ciaccio C, Piazza T, Dibcncdctto SP, Samperi P, Russo Mancuso G, Schiliro G. Hb Agenogi beta 90(F6)Glu—Lys. and beta zero-thalassemia in a Sicilian family // 1990, Hemoglobin, 14:549-553.

39. Costa-Mattioli M, Di Napoli A, Fcrre V, Billaudel S, Perez-BercolTR, Cristina J. Genetic variability of hepatitis A virus//2003, J Gen Virol, 84:3191-3201.

40. Cotton RG, Rodrigues NR, Campbell RD. Reactivity of cytosine and thymine in singlc-base-pair mismatches with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations // 1988, PNAS, 85:4397-4401.

41. Coyle PV, Jain S, Wyatt D, McCaughey C, O'Neill HJ. Description of a nonlcthal herpes simplex virus type 1 glycoprotein D deletion mutant affecting a site frequently used for PCR // 2000, Clin Diagn Lab Immunol, 7:322-324.

42. Covne VE, James MD, Reid SJ, Rybicki EP. Molecular Biology Tcchniqucs Manual (3T ed). Polymerase chain reaction //1998, http://www.mcb.uct.ac.za/manual/MolBiolManual.htm

43. Cuthbcrt JA. Hepatitis A: old and new//2001, Clinical Microbiol Rev, 14:38-58.

44. Dallas WS,, Falkow S. Amino acid sequence homology between cholera toxin and Escherichia coli heat-labile toxin // 1980, Nature, 288:499-501.

45. Di Pinto A, Fortev T, Tantillo GM, Terio V, Buonavoglia C. Detection of hepatitis A virus in shellfish (Mytilus galloprovincialis) with RT-PCR // 2003, Food Prot, 66:1681-1685.

46. Dutton C, Sommer SS. Simultaneous detection of multiple single-base alleles at a polymorphic site//1991, Biotechniques, 11:700-702.

47. Feodorova VA, Devdariani ZL. Development, characterisation and diagnostic application of monoclonal antibodies against Yersinia pestis fibrinolysin and coagulase // 2000, J Med Microbiol, 49:261-269.

48. Genes and Disease. Nutritional and metabolic diseases. Diabetes, type 1 // 2004,http://www.ncbi.nIm.nih.gov/books/

49. Gill P. Application of low copy number DNA profiling // 2001, Croat Med J, 42:22932.

50. Globerman II, Amor H, Parker KL, New MI, White PC. A nonsense mutation causing steroid 21-hydroxylase deficiency // 1988, J Clin Invest, 82:139-144.

51. Gurgey A, Sipahioglu M, Aksoy M. Compound heterozygosity for Hb E-Saskatoon or bcta22(B4)glu-to-lys and bcta-thalassemia type IVS-I-6 (T-to-C) // 1990, Hemoglobin, 14:449-451.

52. Helmberg A, Tusie-Luna MT, Tabarelli M, Koller R, White PC. R339H and P453S: CYP21 mutations associated with nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency that are not apparent gene conversions // 1992, Molec Endocr, 6:1318-1322.

53. Henegarin O. PCR and Multiplex PCR Guide//1997,http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/guide.html

54. Higashi Y, Tanae A, Inoue II, Fujii-Kuriyama Y. Evidence for frequent gene conversion in the steroid 21-hydroxylase P-450(C21) gene: implications for steroid 21-hydroxylase deficiency // 1988, Am J Hum Genet, 42:17-25.

55. Higashi Y, Tanac A, Inoue 11, Iliromasa T, Fujii-Kuriyama Y. Aberrant splicing and niissense mutations cause steroid 21-hydroxylase (P-450C21.) deficiency in humans: possible gene conversion products // 1988, PNAS, 85:7486-7490.

56. Higgins JA, Ezzell J, Hinnebusch BJ, Shipley M, Ilenchal EA, Ibrahim MS. 5' nuclease PCR assay to detect Yersinia pestis // 1998, J Clin Microbiol, 36:2284-2288.

57. Ho SK, Chan TM. An overview of assays for serum HBV DNA // 2000, Clin Lab, 46:609-614.

58. Hongyo T, Buzard GS, Calvert RJ, Weghorst CM. 'Cold SSCP': a simple, rapid and non-radioactive method for optimized single-strand conformation polymorphism analyses // 1993, Nucleic Acids Res, 21:3637-42.

59. Hopmeier P, Binder C, Gadner H, Fischer M. A case of the unstable Hb Genova (beta 28 Leu—Pro) in an Arab child associated with severe haemolytic anaemia and growth retardation // 1990, Acta Haematol, 83:39-41.

60. Hovig E, Smith-Sorensen B, Brogger A, Börresen A-L. Constant denaturant gel electrophoresis, a modificatuion of denaturing gel electrophoresis, in mutation detection //1991, Mutat Res, 262:63-71.

61. Hunt M. Real-time PCR// 2004, http://www.med.sc.edu:85/pcr/realtimc-homc.html.

62. Hunt JM, Roberts GD, Stockman L, Felmlee TA, Persing DH. Detection of a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens // 1994, Diagn Microbiol Infcct Dis, 18:219-227.

63. Igbal SS, Chambers JP, Goodc MT, Valdes JJ, Brubaker RR. Detection of Yersinia pestis by pesticin fluorogenic probe-couplcd PCR// 2000, Mol Cell Probes, 14:109114.

64. Inganas M, Byding S, Eckersten A, Eriksson S, Hultman T, Jorsback A, Lofman E, Sabounchi F, Kressner U, Lindmark G, Tooke N. Enzymatic mutation detection in the P53 gene // 2000, Clin Chem., 46:1562-1573.

65. Innogcnctics, Inno-Lipa Rif.TB // 2004,http://www.innogenetics.bc/site/diagnostics.html

66. Isolation of genomic DNA from bacteria// 1998, http://lyco-lycoming.edu/-newman

67. Jenkins FJ. Basic methods for the detection of PCR products // 1994, PCR Methods Applic, 3:S77-S82.

68. Judo MSB, Wedel AB, Wilson C. Stimulation and suppression of PCR-mediated recombination// 1998, Nucl Acids Res, 26:1819-1825.

69. Kahn SM, Jiang TA, Culbertson IB, Weistein GM, Tomita N, Ronai Z. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via "enriched" PCR amplification//1991, Oncogene, 6:1079-1083.

70. Kirby-Keyser L, Porter CC, Donohoue PA. E380D: a novel point mutation of CYP21 in an HLA-homozygous patient with salt-losing congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency// 1997, Hum Mutat, 9:181-182.

71. Kobayashi S, Nara T, Nakano Y, Fukazawa H, Kawamura G, Kitajima II, Sugita M, Joh K, Ohba Y, Hattori Y. Hemoglobin Burke: an unstable hemoglobin rarely associated with hemolytic episodes// 1986, Hemoglobin, 10:661-666.

72. Koos RD, Seidel RH. Detection of acidic fibroblast growth factor mRNA in the rat ovary using reverse transcription-polymerase chain reaction amplification // 1989, Biochem Biophys Res Commun, 165:82-88.

73. Kosaki R, Nakamura T, Higaki S, Yamamoto S, Inoue Y, Hayashi K, Shimomura Y, Tano Y. The use of competitive PCR for quantitation of HSV-1 DNA // 2003, Jpn J Ophthalmol, 47:240-245.

74. Kulichenko AN, Norkina OV, Gintsburg AL, Popov Iu.A, Ddrozdov IG. Improvement of a method for detecting of strains of the plague microbe using polymerase chain reaction // 1994, Genetica, 30:167-171.

75. Kuppuswamy MN, Hoffmann JW, Kasper CK, Spitzer SG, Groce SL, Bajaj SP. Single nucleotide primer extension to detect genetic diseases: Experimental application to hemophilia B (factor IX) and cystic fibrosis genes //1991, PNAS, 88:1143-1147.

76. Kwok S, Sheng-Yung C, Sninsky JJ, Wang A. A guide to the design and use of mismatched and degenerate primers //1994, PCR methods and applic, manual supplement, 3:S39-S47.

77. Lajic S, Clauin S, Robins T, Vcxiau P, Blanche H, Bcllanne-Chantelot C, Wedell A. Novel mutations in CYP21 detected in individuals with hyperandrogenism II2002, J Clin Endocr Metab, 87:2824-2829.

78. Landin B, Berglund S, Wallman K. Two different mutations in codon 97 of the bcta-globin gene cause Hb Malmo in Sweden // 1996, Am J Hematol, 51:32-36.

79. Lederberg J, Shope RE, Oaks SC, Jr. (eds). Emerging Infections // 1992, National Academy Press, Washington, D.C.

80. Lee HH. Ligase chain reaction // 1996, Biologicals, 24:197-199.

81. Maniatis A, Bousios T, Nagcl RL, Balazs T, Ucda Y, Bookchin RM, Maniatis GM. Hemoglobin Crete (beta 129 ala leads to pro): a new high-affinity variant interacting with beta o -and delta beta o -thalassemia // 1979, Blood, 54:54-63.

82. Maniatis T, Fritsch EE, Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual // 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

83. Marinucci M, Giuliani A, Maffi D, Massa A, Giampaolo A, Mavilio F, Zannotti M, Tentori L. Hemoglobin bologna (alpha 2 beta 2 61 (E5) lys replaced by met). An abnormal human hemoglobin with low oxygen affinity // 1981, Biochim Biophys Acta, 668:209-15.

84. Marras SA, Kramer FR, Tyagi S. Multiplex detection of single nucleotide variations using molecular beacons//1999, Genet Anal, 14:151-156.

85. Matsiota-Bemard P, Vrioni G, Marinis EJ. Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Greece // 1998, J Clin Microbiol, 36:20-23.

86. Mekalanos JJ. Cholera toxin: genetic analysis, regulation, and role in pathogenesis // 1985, Curr Top Microbiol Immunol, 118:97-118.

87. Melanitou E, Fain P, Eisenbarth GS. Genetics of type 1A (immune mediated) diabetes // 2003, J Autoimmun, 21:93-98.

88. Meyerhans A, Vartanian JP, Wain-Hobson S. DNA recombination during PCR // 1990, Nucleic Acids Res, 18:1687-1691.

89. Miller DR, Wilson JB, Kutlar A, Huisman TH. Hb Bicctre or alpha 2 beta(2)63(E7)His—Pro in a white male: clinical observations over a period of 25 years// 1986, Am J Hematol, 21:209-214.

90. Monteiro L, Bonnemaison D, Vekris A. Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces: Helycobacter pylori model // 1997, J Clin Microbiol, 35:995-998.

91. Mullis KB, Ferre F, Gibbs RA (eds). The Polymerase Chain Reaction // 1994, Birkhauser, Boston.

92. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction //1987, Methods Enzymol, 155:335-350.

93. Nachamkin I, Kang C, Weinstein MP. Detection of resistance to isoniazid, rifampin, and streptomycin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by molecular methods // 1997, Clin Infect Dis, 24:894-900.

94. Nash KA, Gaytan A, lnderlied CD. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis by use of a rapid, simple, and specific RNA/RNA mismatch assay // 1997, J Infect Dis, 176:533-536.

95. Negri Aijona S, Maldonado Eloy-Garcia J, Molchanova TP, Wilson JB, Gu L-H, Huisman THJ. Hb Brockton (beta-138 (HI6) ala-to-pro) observed in a Spanish girl // 1992, Hemoglobin, 16:511-514.

96. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) // 1989, Nucleic Acids Res, 17:2503-2516.

97. Ohlsson G, Muller J, Schwartz M. Gcnetic diagnosis of 21-hydroxylase deficiency: DGGE based mutation scanning of Cyp21 // 1999, Human Mutation, 13:385-389.

98. Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphism // 1989, PNAS, 86:2766-2770.

99. Owerbach D, Sherman L, Ballard A-L, Azziz R. Pro453-to-ser mutation in CYP21 is associated with nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency // 1992, Molec Endocr, 6:1211-1215.

100. Pastinen T, Partanen J, Syvanen AC. Multiplex, fluorescent, solid-phase minisequencing for efficient screening of DNA sequence variation// 1996, Clin Chem, 42:1391-1397.

101. Patrushev LI, Zykova ES, Kayushin AL, Korosteleva MD, Miroshnikov AI, Bokarew IN, Leont'ev SG, Koshkin VM, Severin ES. New DNA diagnostic system for detection of factor V Leiden // 1998, Thromb Res, 92:251-259.

102. Pease AC, Soles D, Sullivan EJ, Cronin MT, Holmes CP, Fodor SP. Lightgenerated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis // 1994, PNAS, 91:5022-5026.

103. Prctorius GS, Sirgel FA, Schaaf IIS, van Ilelden PD, Victor TC. Rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis — rapid detection and implications in chemotherapy// 1996, S Afr Med J, 86:50-55.

104. Prevention of Hepatitis A through Active or Passive Immunization // 1999, Morbidity and Mortality Weekly Report, Centers for Desease Control and Prevention, Atlanta, USA, 48:1-12.

105. Prezioso VR. General Notes on Primer Design in PCR // 2004,http://www.brinkmann.com/PCRapplprimer.asp

106. Rahalison L, Vololonirina E, Ratsitorahina M, Chanteau S. Diagnosis of bubonic plague by PCR in Madagascar under field conditions // 2000, J Clin Microbiol, 38:260-263.

107. Rahbar S, Feagler RJ, Beutler E. Hemoglobin Hammersmith (beta 42 (CD1) Phe replaced by Ser) associated with severe hemolytic anemia//1981, Hemoglobin, 5:97-105.

108. Rappuoli R, Pizza M, Douce G, Dougan G. Structure and mucosal adjuvanticity of cholera and Escherichia coli heat-labile enterotoxin // 1999, Immunol Today, 20:493-500.

109. Ridanpaa M, Burvall K, Zhang LH, Husgafvcl-Pursiaincn K, Onfclt A. Comparison of DGGE and CDGE in detecton of single base changes in the hamster hprt and human N-ras genes // 1995, Mutat Res, 334:357-364.

110. Rinder H, Dobner P, Fcldmann K, Rifai M, Bretzel G, Rusch-Gcrdes S, Löscher T. Disequilibria in the distribution of rpoB alleles in rifampicin-resistant M. tuberculosis isolates from Germany and Sierra Leone. // 1997, Microb Drug Resist, 3:195-7.

111. Romero C, Fernandez Fuertes I, Quintana A, Blanco L, Navarro JL, Wilson JB, Huisman TH. Hb G-Szuhu or alpha 2 beta 2(80)(EF4)Asn-—Lys, in combination with beta zero-thalassemia in a Spanish family // 1985, Hemoglobin, 9:535-539.

112. Safrin S, Shaw H, Bolan G, Cuan J, Chiang CS. Comparison of virus culture and the polymerase chain reaction for diagnosis of mucocutaneous herpes simplex virus infection // 1997, Sex Transm Dis, 24:176-80.

113. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplificatioon of ß-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia// 1985, Science, 230:1350-1354.

114. Sanger F, Nicklcn S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // 1977, PN AS, 74:5463-5467.

115. Sanguinetti CJ, Neto ED, Simpson AJG. Rapid silver stainining and recovery of PCR products separated on Polyacrylamide gels // 1994, Biotechniques, 17:915918.

116. Schachter J. DFA, E1A, PCR, LCR and other technologies: what tests should be used for diagnosis of chlamydia infections? // 1997, Immunol Invest, 26:157-161.

117. Schlör S, Riedl S, Blaß J, Reidl J. Genetic Rearrangements of the Regions Adjacent to Genes Encoding Heat-Labile Enterotoxins (eltAB) of Enterotoxigenic Escherichia coli Strains // 2000, Appl Environ Microbiol, 66:352-358.

118. Sheorey H, Waters MJ. Viral hepatitis? Which test should I order? // 2001, Aust Fam Physician, 30:433-437.

119. Sherman DR, Mdluli K, Hickey MJ. // 1996, Science, 272:1641-1643.

120. Speiser PW, New MI, White PC. Molecular genetic analysis of nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency associated with HLA-B14,DR1 // 1988, New Eng J Med, 319:19-23.

121. Stickney HL, Schmutz J, Woods IG, Holtzer CC, Dickson MC, Kelly PD, Myers RM, Talbot WS. Rapid mapping of zebrafish mutations w ith SNPs and oligonucleotide microarrays // 2002, Genome Res, 12:1929-1934.

122. Savov A, Angelicheva D, Jordanova A, Eigel A, Kalaydjieva L. High percentage acrylamide gels improve resolution in SSCP analysis // 1992, Nucleic Acids Res, 20:6741-6742.

123. Stamm WE, Handsfield IUI. The association between genital ulcer disesase and acquisition of HIV infection in homosexual men // 1988, JAMA, 260:1429-1433.

124. Su X, Röbelek R, Wu Y, Wang G, Knoll W. Detection of point mutation and insertion mutations in DNA using a quartz crystal microbalance and MutS, a mismatch binding protein // 2004, Anal Chem, 76:489-494.

125. Suzuki Y, Katsukawa C, Inoue K, Yin Y, Tasaka H, Ueba N, Makino M. Mutations in rpoB gene of rifampicin resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis in Japan // 1995, Kansenshogaku Zasshi, 69:413-419.

126. Tanaka Y, Yazawa K, Dabbs ER, Nishikawa K, Komaki H, Mikami Y, Miyaji M, Morisaki N, Ivvasaki S. Different rifampicin inactivation mechanisms in Nocardia and related taxa //1996, Microbiol Immunol, 40:1-4.

127. Taniguchi H, Aramaki H, Nikaido Y, Mizuguchi Y, Nakamura M, Koga T, Yoshida S. Rifampicin resistance and mutation of the rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis// 1996, FEMS Microbiol Lett, 144:103-108.

128. Taylor GR (ed.). Laboratory methods for the detection of mutations and polymorphisms in DNA // 1997, CRC Press, New-York London.

129. Tclenti A, Imboden P, Marchesi F, Lowrie D, Cole S, Colston MJ, Matter L, Schopfer K, Bodmer T. Detection of rifampicin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis// 1993, Lancet, 341:647-650.

130. Tiesman J, Rizzino A. Expression and developmental regulation of the k-FGF oncogene in human and murine embryonal carcinoma cells // 1989, In Vitro Cell Dev Biol, 25:1193-1198.

131. Trebesius K, Harmsen D, Rakin A, Schmelz J, Heesemann J. Development of rRNA-targeted PCR and in situ hybridization with fluorescently labelled oligonucleotides for detection of Yersinia species // 1998, J Clin Microbiol, 36:25572564.

132. Tusie-Luna M-T, Speiser PW, Dumic M, New MI, White PC. A mutation (pro30-to-leu) in CYP21 represents a potential nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency allele //1991, Molec Endocr, 5:685-692.

133. Tusie-Luna M-T, Traktman P, White PC. Determination of functional effects of mutations in the steroid 21-hydroxylase gene (CYP21) using recombinant vaccinia virus // 1990, J Biol Chem, 265:20916-20922.

134. UgozzoH L, Wallace RB. Allele-specific polymerase chain reaction //1991, Methods: A companion to methods in enzymol, 2:42-48.

135. Waldor MK, Mekalanos JJ. Lysogenic Conversion by a Filamentous Phage Encoding Cholera Toxin// 1996, Science, 272:1910-1914.

136. Walker L, McFarlanc A, Patterson M, Eng B, Wayc JS. Hb Castilla bcta-32(B14)leu-to-arg. caused by a de novo mutation // 2003, Hemoglobin, 27:253-256.

137. Walsh PS, Erlich HA, Iliguchi R. Preferential PCR amplification of alleles: Mechanisms and solutions // 1992, PCR Methods Applic, 1:241-250.

138. Wang NY, Liaw GJ, Weng LC, Chiu YY, Huang FY, Yang DL, Chiang CS. Rapid detection of herpes simplex virus by polymerase chain reaction // 1999, J Microbiol Immunol Infect, 32:99-104.

139. Wang LF, Rakela Y, Laskus T. Head-to-tail primer tandem repeats // 1997, Mol Cell Probes, 5:385-387.

140. Wawcr K, Ruggebcrg H, Meyer G, Muyzer G. A simple and rapid electrophoresis method to detect sequence variation in PCR-amplified DNA fragments // 1995, Nucleic Acids Res, 23:4928-4929.

141. Wedell A, Luthman H. Steroid 21-hydroxylase deficiency: two additional mutations in salt-wasting disease and rapid screening of disease-causing mutations // 1993, Hum Molec Genet, 2:499-504.

142. Wedell A, Ritzen EM, Haglund-Stengler B, Luthman II. Steroid 21-hydroxylase deficiency: three additional mutated alleles and establishment of phenotype-genotype relationships of common mutations // 1992, PNAS, 89:72327236.

143. Welkos SL, Friedlander AM, Davis KJ. Studies on the role of plasminogen activator in systemic infection by virulent Yersinia pestis strain C092 // 1997, Microb Pathog, 23:211-223.

144. Wells D, Sherlock JK. Strategies for preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders by DNA amplification //1998, Prcnat Diagn, 18:1389-1401.

145. Wen SY, Wang H, Sun OJ, Wang SQ. Rapid detection of the known SNPs of C YP2C9 using oligonucleotide microarray // 2003, World J Gastroenterol, 9:13421346.

146. Whiley DM, Mackay IM, Syrmis MW, Witt MJ, Sloots TP. Detection and differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by a duplex LightCycIer PCR that incorporates an internal control PCR reaction // 2004, J Clin Virol, 30:32-38.

147. White PC, Vitek A, Dupont B, New Ml. Characterization of frequent deletions causing steroid 21-hydroxylase deficiency// 1988, PNAS, 85:4436-4440.

148. World Health Organization:Hepatitis:Background information on hepatitis A // 2001, httpi/Awvw.vvho.int/vaccincs/cn/hcpatitisa.shtml.

149. Widjojoatmodjo MN, Fluit AC, Torenma R. The magnetic immuno polymerase chain reaction assay for direct detection of salmonellae in fecal samples // 1992, J Clin Microbiol, 30:3195-3199.

150. Wiedmann M, Wilson WJ, Czajka J, Luo J, Barany F, Batt CA. Ligase chain reaction (LCR)--overview and applications // 1994, PCR Methods Appl, 3:S51-S64.

151. Wilde J, Eiden J, Yolken R. Removal of inhibitory substances from human fecal specimens for detection of group A rotaviruses by reverse transcriptase and polymerase chain reactions // 1990, J Clin Microbiol, 28:1300-1307.

152. Williams DL, Waguespack C, Eisenach K, Crawford JT, Portacls F, Salfingcr M, Nolan CM, Abe C, Sticht-Groh V, Gillis TP. Characterization of rifampin-resistance in pathogenic mycobacteria // 1994, Antimicrob Agents Chemother, 38:2380-2386.

153. Williams DL, Wagnespack C, Eisenach K. WHO/IUATLD global project on anti-tubcrculosis drug resistance surveillance. Antituberculosis drug resistance in the world // 1997, World Hcalh Organization Publication WIIO/TB 97.229, Geneva.

154. Williamson D, Brennan SO, Carrell RW. Hb Brisbane (beta 68 (E12) Leu replaced by His) is unstable// 1983, Hemoglobin, 7:473-475.

155. Williamson D, Nutkins J, Rosthoj S, Brennan SO, Williams DH, Carrell RW. Characterization of Hb Aalborg, a new unstable hemoglobin variant, by fast atom bombardment mass spectrometry// 1990, Hemoglobin, 14:137-145.

156. Xie J, Wehner TC, Conkling MA. PCR-bascd single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis to clone nine aquaporin genes in cucumbcr // 2002, J Amer Soc Hort Sci, 127:925-930.

157. Yang YL, Wang G, Dorman K, Kaplan AI I. Long polymerase chain reaction amplification of heterogeneous HIV type 1 templates produces recombination at a relatively high frequency//1996, AIDS Res Hum Retroviruses, 12:303-306.

158. Yeager AM, Zinkham WH, Jue DL, Winslow RM, Johnson Mil, McGuffey JE, Moo-Penn WF. Hemoglobin Cheverly: an unstable hemoglobin associated with chronic mild anemia// 1983, Pediat Res, 17:503-507.

Информация о работе

Альтшулер, Михаил Львович
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы