Создание стерически стабилизированной иммунолипосомальной системы на основе моноклональных антител с целью специфической доставки биологически активных веществ к клеткам-мишеням

Яглова, Наталья Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание стерически стабилизированной иммунолипосомальной системы на основе моноклональных антител с целью специфической доставки биологически активных веществ к клеткам-мишеням
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Создание стерически стабилизированной иммунолипосомальной системы на основе моноклональных антител с целью специфической доставки биологически активных веществ к клеткам-мишеням"

На правах рукописи

ЯГЛОВА Наталья Валентиновна

СОЗДАНИЕ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННОЙ ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С ЦЕЛЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ К КЛЕТКАМ-МИШЕНЯМ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре биологической химии медицинского факультета Российского университета дружбы народов.

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор

Березов Темирболат Темболатович

академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор

Чехонин Владимир Павлович

Официальные оппопенты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Козел ьцев Владислав Львович Трещалина Елена Михайловна

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится « 2005г. в часов на за-

седании диссертационного совета Д 213.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан « » (уЫ^О^С*^ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор фарм. наук, доцент Т.П. Лагуткина

Актуальность проблемы. Создание систем, способных осуществлять специфический направленный транспорт биологически активных веществ из системного кровотока к клеткам центральной нервной системы является одной из самых актуальных задач нейрофармакологии. Известно, что инкапсуляция препаратов в различные микроконтейнеры существенно улучшает их фармакокинетические параметры, снижает токсичность, позволяет уменьшать разовые и курсовые дозы На современном этапе доставка препаратов к клеткам мозга сводится к использованию конъюгатов лекарственных препаратов с векторными антителами, наночастиц и липо-сом. Наиболее перспективными системами для доставки различных лекарственных средств считаются стерически стабилизированные липосомы, обладающие свойством длительно циркулировать в системном кровотоке, будучи нераспознанными макрофагами ретикулоэндотелиальной системы [Allen Т.М., 1991]. Конъюгация их с различными векторными молекулами должна обеспечить нацеливание их на определенные клетки-мишени [Ga-bizon А., et al., 1990; Allen T.M., et al., 1994] Основным недостатком таких систем является неспособность преодолевать гематоэнцефалический барьер. Что касается направленного транспорта в опухоли мозга, то он в значительной степени облегчен благодаря нарушению целостности гемагоэнце-фалического барьера. За последнее десятилетие было создано несколько липосомальных транспортных систем для доставки противоопухолевых препаратов к клеткам злокачественных глиальных опухолей, которые по частоте занимают первое место среди первичных опухолей мозта [Кои-kourakis М., et al., 2000; Fabel К., et al., 2001; Haoki H., et al., 2004]. Для повышения эффективности их действия в качестве векторов использовались молекулы трансферрина, антитела к трансферрину, фолиевая кислота, так как опухолевые клетки экспрессируют рецепторы к этим веществам в больших количествах, нежели нормальные клетки [Huwiler J., et al., 1996, Huwiler J., et al., 1997; Shi G., et al., 2002; Saul J„ et al., 2003]. Это, с одной стороны, делало доставку препаратов в опухолевые клетки избирательной по отношению к нормальным клеткам мозга, а с другой стороны, приводило к накоплению препарата практически во всех органах и тканях, так как выбранные молекулярные мишени являлись неспецифичными. Решить такую проблему было бы возможно, если в качестве мишеней можно было использовать молекулы, экспрессируемые только опухолевой клеткой. Изучение молекулярного профиля злокачественных глиом на сегодняшний день не обнаружило присутствия постоянно экспрессируемых опухолевыми клетками специфических маркеров [Kondo Y., et al., 2004]. Исследования специфического маркера нормальных астроцитов — глиофибрилляр-ного кислого белка (GFAP), показали возможность использования его в качестве мишеней для направленного транспорта [Чехрнин В.П. с соавт., 2000; Чехонин В.П. с соавт,, 2003], а разработка методов получения моно-клональных антител к нейроспедифкческим белкам позволило вплотную подойти к решению проблемы [Чехонин В П с соавт , 2000, Турина О И., 2005]. Наличие данных о сохранении эксфвддонеджбМЯЭДй^крлевыми

БИБЛИОТЕКА !

СП О»

-----—» ф

клетками астроглиального происхождения [Коршунов А.Г., Сычева Р.В., 1995; N., е( а1., 1983] позволяет рассматривать его как потенциальную мишень для доставки биологически активных веществ к соответствующим клеткам с помощью микроконтейнеров, конъюгированных с моноклональ-ными анти-СРАР-антителами, создание которых и являлось целью данного исследования.

Цель исследования: Разработать способ получения ПЭГилирован-ных (покрытых полиэтиленгликолем) иммунолипосомальных контейнеров, способных направленно доставлять противоопухолевые препараты к клеткам астроглиальных опухолей и изучить ряд их физико-химических свойств.

Задачи исследования:

1. Разработать способ получения ПЭГилированных липосом.

2. Разработать способ конъюгирования моноклональных антител к глио-фибриллярному кислому белку (ОРАР) с ЛЭГилированными липосо-мами.

3. Изучить ряд физико-химических свойств иммунолипосом

4. Провести иммуноморфологическую оценку специфичности связывания ПЭГилированньгх иммунолипосом с эмбриональными астроцитами мозга крысы и клетками глиомы крыс.

5. Определить количественное содержание ОРАР в сыворотке крови больных глиомами мозга разной степени злокачественности.

Научная новизна:

Созданы стерически стабилизированные иммунолипосомы, содержащие доксорубицин, способные осуществлять адресную доставку препарата в клетки опухолей астроглиального происхождения.

Разработан способ практически 100%ной загрузки липосом доксору-бицином с использованием трансмембранных градиентов рН и сульфата аммония в присутствии малеимидного производного фосфатидилхолина.

Практическая значимость исследования:

Показана возможность направленного транспорта в клетки глиаль-ных опухолей с помощью иммунолипосом с использованием вРАР в качестве молекулярной мишени, что открывает очевидные перспективы для патогенетически обусловленного метода терапии глиом, обеспечивающего избирательное накопление препарата в клетках опухоли и позволяющего значительно повысить эффективность терапии при снижении побочного действия противоопухолевых препаратов.

Положения, выносимые на защиту: 1. Эмульсионно-экструзионная технология обработки липидной смеси, состоящей из лецитина, холестерина, малеимидного производного фосфа-тидилэтаноламина и дистеароилфосфатидилэтаноламина, конъюгирован-ного с ПЭГ-2000, в молярном соотношении 23:16:1:1,6. использование активной загрузки доксорубицина с помощью трансмембранных концентрационного и рН градиентов и малеимидного метода конъюгации анти-

GFAP-антител обеспечивают получение стерически стабилизированных иммунолипосом заданного размера.

2. Специфическое взаимодействие иммунолипосом с эмбриональными астроцитами мозга крысы и клетками глиомы С6 обусловлено иммунохи-мическим взаимодействием конъюгированных анти-GFAР-антител с антигеном, расположенным на поверхностной мембране клеток

3. Глиофибриллярный кислый белок может использоваться в качестве молекулярной мишени для адресной доставки биологически активных веществ в клетки опухолей астроглиапьного происхождения, поскольку его содержание в сыворотке крови больных глиальными опухолями мозга остается низким даже при больших объемах опухолей и не может препятствовать проникновению иммунолипосом в патологический очаг при их парентеральном введении

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены и обсуждены на V Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2004), Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию Самарского государственного медицинского университета «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины» (Самара, 2005) и на научных конференциях кафедры биохимии РУДН.

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы:

Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 19 рисунками Указатель литературы включает 245 источников, из них 8 отечественных, 237 зарубежных.

Автор выражает огромную признательность за поддержку и квалифицированную помощь сотрудникам лаборатории иммунохимии ГНЦ социальной и судебной психиатрии Росздрава д.м.н Гуриной О.И., к.х.н. Жиркова Ю.А., к.м.н. Семеновой A.B. и приносит слова искренней благодарности своим научным руководителям академику РАМН, д.м.н профессору Березову Темирболату Темболатовичу и академику РАМН, д.м.н. профессору Чехонину Владимиру Павловичу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для получения липосом использовали следующие липидные компоненты: лецитин из желтков куриных яиц; холестерин, DSPE-PEG — дис-теароилфосфатидилэтаноламин, конъюгированный с ПЭГ-2000 (полиэти-ленгликоль с молекулярной массой 2000); МРВ-РЕ — мапеимидо-4-(я-фенилбутирил)-фосфатидилэтаноламин, который служил для химического связывания с белком. Все эти вещества были получены от фирмы Avanti

Polar Lipids (США) в следующем виде: холестерин — твердая субстанция; лецитин, DSPE и МРВ-РЕ — растворы в хлороформе в концентрациях 10, 50 и 25 мг/мл соответственно. Все препараты липидов хранились в атмосфере аргона при -20°С. Прочие реактивы и вспомогательные материалы были получены из следующих источников: 2-иминотиолан, N-этилмалеимид, буфер HEPES (Ы-2-гидроксипиперазин-Ы'-2-этансуль-фокислота), безводный сульфат натрия, хлорид натрия, безводный гидрок-сид натрия, Сефадекс G-25 superfine, тиоцанат аммония, гексагидрат хлорида железа—от фирмы ICN; флуоресцентный индикатор Dil (1,Г-октадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат) и сефаро-за CL-4B — от фирмы Fluka; доксорубицин — ЗАО «Ферейн»; дигидраты одно- и двузамещенных фосфатов натрия и калия, тритон Х-100 — от фирмы Serva Feinbiochemica; хлороформ, метанол, толуол и циклогексан — от фирмы Aldrich; набор реактивов для определения белка ВСА Protein Assay Reagent Kit 23227 — от фирмы Pierce. Все реактивы были максимально возможной степени чистоты. Все манипуляции по приготовлению липосом проводились в атмосфере аргона высокой чистоты, поставляемого ОАО «Балашихинский кислородный завод».

Приготовление липосом производилось с помощью эмульсионно-экструзионного метода. Эмульгирование липидов проводили с помощью роторного испарителя Laborata 4000 с автоматическим насосом Rotavac Control (Heildolph Instruments, Германия). Затем липидную эмульсию обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора, предназначенном для приготовления липосом (G112SP1 Special Ultrasonic Desintegrator, Laboratory Supplies Company, США) и экструдировали через мембранные фильтры Nucleopore с размерами пор 400, 200, 100, 50 нм с помощью ручного миниэкструдера Avanti Polar Lipids (США).

В качестве инкапсулируемого противоопухолевого агента был выбран доксорубицин, так как на сегодняшний день его липосомальные формы являются одними из наиболее перспективных, благодаря значительному улучшению фармакокинетических, токсических и других параметров (Gabizon A. et al., 1994; Lundberg B.et al., 2000). Включение доксорубицина проводили по принципу активной загрузки при искусственно созданных трансмембранных градиентах pH и концентрации сульфата аммония Доксорубицин анализировался стандартными спектрофотометрическими методами после соответствующей экстракции (спектрофотометр Hitachi U-2800).

В качестве векторных антител использовали моноклональные антитела D4 к GFAP человека (лаборатория иммунохимии ГНЦ СиСП Росздра-ва). Конъюгация моноклональных антител с липосомами производилась малеимидным методом.

Оценка физико-химических свойств полученных иммунолипосом производилась по следующим критериям: количественное определение общих фосфолипидов липосом, количественное определение связавшегося белка (моноклональных антител) и определение размера липосом

Использованный в работе метод определения суммарных фосфоли-пидов основан на спектрофотометрической регистрации окрашенных комплексных соединений между молекулами липидов и тиоционатом (роданидом) трехвалентного железа. В работе использован 0,1 и раствор этой соли (27,03 г FeCl3x6H20 + 30.4 г NH4SCN в 1 л воды). Калибровочный график строили по результатам фотометрирования при длине волны 488 нм серии растворов лецитина с концентрациями от 0,005 до 0,05 мг/мл Фосфолипиды липосом были предварительно переведены в органическую фазу.

Количественное определение связавшегося белка проводили с помощью метода, основанного на известной реакции восстановления ионов Си2* до ионов Си+ под действием белка в щелочной среде (биуретовая реакция) и на высокочувствительной спектрофотометрической регистрации образующихся ионов одновалентной меди после их связывания в хелатные комплексы с бицинхониновой кислотой. Эти комплексы характеризуются высокой экстинкцией около 562 нм, которая линейно зависит от концентрации белка в широком рабочем диапазоне (от 20 до 2000 мкг/мл) Калибровочный график строился по результатам фотометрирования при длине волны 565 нм серии растворов бычьего сывороточного альбумина с концентрацией от 5 до 250 мкг/мл. Конъюгированный с липосомами белок был предварительно осажден и отделен от липидов.

Размер липосом определяли с помощью трансмиссионной электронной микроскопии в НИЦ вирусологии Министерства обороны РФ.

Для изучения векторных функций иммунолипосом использовали препараты культур эмбриональных астроцитов мозга крысы и клеток глиомы С6 (лаборатория иммунохимии ГНЦ СиСП Росздрава).

Предварительный анализ моноклональных анти-СРАР-антител в препаратах культур эмбриональных астроцитов мозга крысы и клеток глиомы С6 производили с помощью метода непрямой иммунофлюорес-ценцин (Weller Т., Coons А., 1954) в нашей модификации.

1. Клетки глиомы и астроциты, помещенные на покровные стекла, покрытые поли-Ь-лизином, фиксировали ледяным метанолом (по 2 мл на ячейку культурального планшета) без предварительной отмывки от питательной среды в течение 30 минут.

2. Ме(анол удаляли и промывали кле1ки раствором IM PBS (по 2 мл на ячейку) три раза по 10 минут на роторной мешалке Sky Line ELM1 (Латвия) со скоростью 125 об/мин.

3. Клетки инкубировали в течение 40 минут с 0,4% раствором казеина ("Aldrich", USA) в PBS (раствор готовился ex témpora из расчета 1 мл на ячейку) на роторной мешалке.

4. Удаление казеина, троекратная промывка ячеек (см п.2).

5. Инкубацию клеток с 0,05% раствором сапонина (Aldrich, USA) в PBS проводили в течение 20 минут на роторной мешалке. Раствор roí овили ех temporo из расчета 1,5 мл на ячейку.

6. Параллельно с инкубацией клеток в растворе сапонина производили подготовку первых антител (моноклональные анти-ОРАР-антитела). Для предотвращения неспецифической сорбции первичные антитела адсорбировали печеночным порошком. Печеночный порошок добавляли в пробирку с раствором антител в соотношении 1 : 4. Полученную суспензию осторожно взбалтывали в течение 1 часа. Затем ее центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об/мин. Супернатант переносили пипеткой в чистую пробирку.

7. По окончании инкубации клеток сапонин удаляли и без отмывки раствором PBS на покровные стекла наносили первые антитела в количестве 200 мкл. Инкубацию с первыми антителами проводили при комнатной температуре в течение 1 часа на роторной мешалке.

8. Параллельно производили подготовка вторых антител (козьи антитела к иммуноглобулинам мыши), меченных сульфохлоридом родамина ("Sigma", USA). Адсорбция вторичных антител печеночным порошком производили аналогичным способом (см. п.6).

9. Первичные антитела удаляли и промывали ячейки раствором PBS 3 раза (см. п.2).

10. На покровные стекла с клетками глиомы наносили вторые антитела из расчета 200 мкл на стекло. Инкубацию проводили в течение 1 часа при комнатной температуре на роторной мешалке.

11. Через 1 час вторичные антитела удалили, и ячейки троекратно промыли раствором PBS.

Связывание ПЭГилированных липосом, конъюгированных с моно-клональными антителами к GFAP, с эмбриональными астроцитами мозга крысы и клетками глиомы С6 определяли методом прямой иммунофлюо-ресценции по появлению свечения, обусловленного липидным флуоресцентным индикатором Dil, введенным в состав липосомных мембран. На клетки, помещенные на покровные стекла, наносили препараты иммуно-липосом в количестве 1 мл с концентрацией 10 мг/мл. Инкубацию проводили в течение Зх часов. Затем клетки тщательно отмывали от несвязав-шихся иммунолипосом.

Микроскопирование полученных препаратов производили с помощью микроскопа "DMLB" ("Leica", Germany), с использованием флуоресцентного фильтра XF 100-2 ALPHA, при длине волны возбуждения 515560 нм. Документация результатов проводилась путем автоматического компьютерного сканирования изображений случайно выбранных участков (по 8-10 снимков каждого препарата) при увеличении в 400 раз.

Количественное определение GFAP в сыворотке крови больных гли-альными опухолями мозга (полученных из отделения нейрохирургии МОНИКИ) проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных анти-ОРАР-антител (Гурина О.И., 2005). В ячейки полистироловых 96-луночных планшетов Costar (США) вносили антитела с последующей инкубацией в течение 12 часов при температуре 4°С. За это время происходит адсорбция антител на поверхности полисти-

рольной твердой фазы дна и стенок ячеек (так называемая активация твердой фазы). Затем активирующий раствор сливали и ячейки промывали отмывающим буфером. После промывки в ячейки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки; в отдельные ряды ячеек внесли стандартные пробы с известной концентрацией антигена. Эти растворы оставлялись в ячейках на 2 часа при комнатной температуре. За это время происходило связывание антигена с адсорбированными антителами. Не связавшиеся белки отмывали тем же промывочным буфером. Ячейки заполнили разведенным конъюгатом фермента пероксидазы с антителами к GFAP, приготовленным по методике, описанной выше. Инкубация с конъюгатом продолжалась 3 часа при комнатной температуре, после чего не связавшийся конъюгат тщательно отмывали тем же буфером. Проявление ферментативной активности пероксидазы в связанном конъюгате проводили с использованием субстратного буфера. В качестве хромогена в субстратной смеси применяли раствор ортофенилендиамина (ОФД) в концентрации 0,4 мг/мл.

В субстратную смесь непосредственно перед внесением в лунки, добавляли 10 мкл 30% перекиси водорода. Субстратную смесь вносили в лунку в количестве 100 мкл и инкубировали в течение 10-20 минут при комнатной температуре. По истечении времени инкубации ферментативную реакцию останавливали внесением в лунки планшетов 100 мкл стоп-реагента (4 М H2SO4). Считывание результатов проводили с помощью многоканального спектрофотометра «Е1х 800» («Bio-Tek Instruments Inc.», USA) при длине волны 490 нм. По результатам определения оптической плотности и известным концентрациям антигенов в стандартных пробах, строили калибровочные кривые.

Статистическая обработка полученных значений и установление зависимости между размером опухоли (по данным компьютерной томографии, проведенной в диагностическом отделении МОНИКИ) и концентрацией GFAP в сыворотке крови производили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 с использованием критерия Пирсона Гистологическое исследование образцов опухолей проводили в паталогоанатомиче-ском отделении МОНИКИ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение иммунолипосом.

Отобранные в соответствии с расчетом количества лецитина, холестерина, МРВ-РЕ (для конъюгации антител), DSPE-PEG (для создания сте-рически стабилизированных липосом) (Табл. 1) и Dil растворяли в смеси хлороформа с метанолом (9 • 1) в концентрации ~10 мг суммарных липи-дов в 1 мл растворителя в молярном отношении 23 : 16 : 1 : 1,6 : 0,4. Эту смесь сушили на роторном испарителе при пониженном давлении аргона (начальное -300 мБар, конечное - 40 мБар). Сухую липидную пленку растворяли в абсолютном циклогексане (до концентрации общих липидов 15 мг/мл), замораживали в жидком азоте и лиофилизовывали Липосомы, предназначенные для загрузки доксорубицином, готовили гидратацией

лиофилизованной липидной смеси в 0,25 М растворе сульфата аммония с рН 5,1 при концентрации общих липидов 50 мг/мл. Для созревания эту эмульсию оставляли вращаться на роторе до следующего дня при комнатной температуре в атмосфере аргона при нормальном давлении.

Таблица 1.

Липидный состав липосом.

Компонент Молярное соотношение Весовое соотношение

моли мольные %

Лецитин 23 55,3 18,3

Холестерин 16 38,5 6,5

МРВ-РЕ 1 2,4 1,0

DSPE-PEG-2000 1,6 3,8 4,7

Сумма 41,6 — 30,5

Включение доксорубицина проводили по принципу активной загрузки при искусственно созданных трансмембранных градиентах рН и концентрации сульфата аммония Этот метод применяется для «закачивания» в липосомы умеренно липофильных соединений, обладающих свойствами слабых кислот или оснований. В зависимости от кислотности или основности подобного соединения, для первичной гидратации липидной фазы готовится его раствор, в котором оно будет представлено преимущественно в ионной форме, которая является относительно более водорастворимой. С этим раствором и проводятся все манипуляции по формированию липосом нужного размера, после чего рН внешней водной фазы искусственно сдвигается в сторону, способствующую деионизации рассматриваемого соединения. (При этом рН водной фазы, уже включенной в липосомы, остается неизменным.) При таком сдвиге рН, во внешней водной фазе повышается липофильность загружаемого вещества, и оно начинает диффундировать в мембраны липосом. А поскольку диффузионные процессы не ограничиваются этой стадией, вещество из липидного бислоя таким же диффузионным путем попадает и во внутреннюю водную фазу, где оно немедленно ионизуется (и становится менее липофильным), что предотвращает его обратное движение через мембрану во внешнее пространство В случае с доксорубицином, дополнительным фактором, удерживающим его внутри липосом, является трансмембранный градиент концентрации сульфата аммония. Сульфат доксорубицина [Dox]2SC>4 малорастворим, поэтому свободный доксорубицин, направляемый градиентом рН из внешнего менее кислого раствора (без сульфата) внутрь липосом, содержащих более кислый раствор сульфата, остается в них в виде квазикристаллической фазы [AJlen ТМ., Hansen C.B., Zalipsky S., 1995]. Перед обработкой ультразвуком и экструзии липосомальную эмульсию диализовали против 0,02 M раствора HEPES рН 7,0 с 10% сахарозы, а затем к ней добавляли определенное количество концентрированного раствора доксорубицина в том же буфере (25 мг/мл) В такой системе при комнатной температуре активная

«закачка» доксорубицина требует всего 10-15 минут. Известно, что наличие в составе липосом малеимидного производного значительно нарушает параметры загрузки препарата. Был проведен ряд экспериментов, в ходе которых удалось преодолеть это препятствие. Для этого эмпирическим путем была определена емкость липосомальной эмульсии. Установлено, что если количество вводимого доксорубицина не является избыточным по отношению к внутрилипосомальному сульфату, то достигается практически полное (на 99,5-99,7%) его включение в липосомы (по результатам анализа ультрафильтрата загруженной липосомальной эмульсии). По результатам проведенных нами экспериментов, такой уровень загрузки имеет место при соотношении 0,2-0,3 мг доксорубицина на 1 мг общих липидов.

После загрузки препарата эмульсию обрабатывали в специальном ультразвуковом дезинтеграторе, предназначенном для приготовления липосом Эту обработку проводили четыре сеанса по 20 минут с 20-минутными перерывами. Затем смесь подвергалась последовательной экструзии через поликарбонатные мембранные фильтры Nucleopore с размерами пор 400, 200, 100 и 50 нм (по 15 раз через каждый фильтр) с помощью ручного миниэкструдера. При этом происходило калибрование липосом, при котором они делались значительно мельче, а их распределение по размерам становилось более узким.

Загруженные липосомы конъюгировали с векторными антителами с помощью малеимидного метода. Молекулы белка перед связыванием с ли-посомами, содержащими малеимидные группы, протиолировали. Для этого к раствору антител (1-5 мг/мл) добавляли реактив Траута (2-иминотиолан в виде раствора с концентрацией 1-10 мг/мл) в количестве 1 мг на 1 мг белка, и смесь в течение часа инкубировали при комнатной температуре в темноте и в атмосфере аргона. После этого реакцию тиолирования останавливали посредством разделения белка и тиолирую-щего агента на 1х17-см колонке с сефадексом G-25 (superfine) Тиолиро-ванный белок немедленно использовали для конъюгирования со свежеприготовленными липосомами Для этого липосомы инкубировали с антителами не менее 12 часов при рН 7,6 и 4°С в темноте. Реакцию останавливали введением 100-кратного молярного избытка (по отношению к белку) N-этилмалеимида. После этого реакционная смесь концентрировали до минимального объема (~0,5 мл) ультрафильтрацией через мембранные фильтры CentriFlo CF50, и иммунолипосомы отделяли от остальных компонентов реакционной смеси гельфильтрацией на колонке с сефарозой CL-4В (-1x50 см).

Физико-химические характеристики иммунолипосом.

Количественное определение суммарных фосфолипидов иммунолипосом с роданидом железа проводили после предварительной экстракции лиидов и перевода их в органическую фазу. Измеренные значения оптической плотности проанализированных аликвот соответствовали концентрации фосфолипидов, равной в среднем 47 мг/мл, что лишь на 6% отличалось от расчетного (50 мг/мл).

Количество связавшихся с липосомамн антител, по результатам спектрофотометрического анализа комплексов отделенного от липидов белка с бицинхониновой кислотой, составило 150-600 мкг/мкмоль фосфо-липидов. Это означает, что с одной липосомой связывалось от 60 до 240 молекул антител в зависимости от исходной концентрации раствора антител.

Электронно-микроскопическое изучение препаратов липосом показало, что их размер варьировал от 85 до 140 нм.

Иммуноморфологический анализ иммунолипосом

Адекватность векторной функции и иммунохимическую активность созданных иммунолипосомальных систем изучали с помощью иммуноморфологический анализа моноклональных анти-СРАР-антител и иммунолипосом в препаратах культур эмбриональных астроцитов мозга крысы и клеток глиомы С6 крыс.

Иммуноморфологический анализ свободных нативных антител проводили методом непрямой иммунофлюоресценции. В препаратах культур эмбриональных астроцитов мозга крысы и клеток глиомы С6, инкубированных с монокпональными анти-ОРАР-антителами, при люминесцентной микроскопии обнаруживали яркое свечение тел клеток и отростков, характерное для родамина. Интенсивность свечения в обеих культурах была приблизительно одинаковой. В качестве контролей использовали инкубацию клеток с монокпональными антителами к нейроспецифической енола-зе, иммуноглобулинами мыши, а также инкубацию только со вторыми антителами. В контрольных препаратах свечения не наблюдалось. Все антитела наносились в одинаковых количествах.

Иммуноморфологический анализ иммунолипосом показал наличие ярко-красного интенсивного свечения (обусловленного наличием липид-ного флюоресцентного индикатора Dil в составе липосом), появившегося после трехчасовой инкубации с эмбриональными астроцитами мозга крысы и клетками глиомы С6 крыс. В предыдущих работах (Гурина О.И., 2005) было показано, что увеличение периода инкубации до 9 часов не влияет на интенсивность свечения. Интенсивность свечения в препаратах обеих клеточных культур была одинаковой и не отличалась от таковой моноклональных анти-СРАР-антител. В качестве контроля использовали ли-посомы, конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами мыши, неконъюгированные липосомы. В контрольных препаратах свечения не наблюдалось. В качестве дополнительного контроля проводили преин-кубацию клеток обеих культур со свободными нативными моноклональ-ными анти-GFAP-антителами в течение 1 часа с последующей инкубацией в течение 3 часов с липосомами, конъюгированными с монокпональными анти-СРАР-антителами Преинкубация свободных антител полностью элиминировала появление свечения в препаратах обеих культур. Полученные результаты иммуноморфологического анализа свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия моноклональных анти-GFAP-

антител, конъюгированных с липосомами, с антигеном-мишенью, а также о иммунохимической активности созданной нами системы направленного транспорта в клетки астроглии и опухолей астроглиального происхождения.

Количественное определение вРАР в сыворотке крови больных глиальными опухолями мозга.

Для адресной доставки биологически активных веществ в клетки необходимо, что бы взаимодействие иммунолипосом с молекулярными мишенями происходило на поверхности клеток. Появление значительных количеств антигена в крови вследствие прогрессирования патологического процесса минимизирует векторную доставку препаратов, поэтому необходимым этапом изучения возможности использования созданной нами им-мунолипосомальной транспортной системы на основе моноклональных ан-ти-ОРАР-антител было количественное определение вРАР в сыворотке крови больных глиальными опухолями мозга.

Изучаемая нами группа состояла из 51 пациента. Забор крови у больных производили до начала лечения По данным гистологического исследования образцов опухолей, полученных после оперативного вмешательства, пациенты были поделены на 2 группы: группа злокачественных глиом и группа глиом низкой степени злокачественности.

В группу злокачественных глиом вошли 26 пациентов в возрасте от 10 до 63 лет. Гистологически опухоли представляли собой изоморфокле-точную глиобластому (п=17), мультиформную спонгиобластому (п=1), глиосаркому (п=2), смешанную анапластическую астроцитому-изоморфную глиобластому (п=4), смешанную анапластическую астроци-тому-мультиформную спонгиобластому (п=1), смешанную анапластическую олигоастроцитому-изоморфную глиобластому (п=1).

Определение содержания ОРАР в сыворотке крови, проводившееся высокочувствительным методом твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных анти-ОРАР-антител, показало значительную вариабельность признака в данной группе (табл 2). Содержание ОРАР составило 32-256 нг/мл при норме 4 нг/мл, медиана составила 128 нг/мл, интерквартильный размах — 64-256 нг/мл.

В группу глиом низкой степени злокачественности вошло 25 человек в возрасте от 4 до 57 лет. Гистологически опухоли представляли собой по-лиморфоклеточную анапластическую астроцитому (п=7), фибриллярную астроцитому (п=5), анапластическую астроцитому II степени злокачественности (п=10) и анапластическую олигоастроцитому (п=3).

Концентрация ОРАР в сыворотке крови больных данной группы находилась в пределах 64-128 нг/мл (табл 3). Медиана составила 64 нг/мл, нижний квартиль — 64, верхний квартиль — 128 нг/мл. Полученные зна-

чения превышают норму, но в целом, они ниже, чем у предыдущей группы.

Таблица 2.

Результаты иммуноферментного определения вРАР в сыворотке крови больных злокачественными глиомами

Концентрация ОРАР в сыворотке крови, нг/мл Всего:

4 8 16 32 64 128 256

Число проб 0 0 0 2 6 8 10 26

% 0 0 0 7,7 23 30,8 38,5 100

Таблица 3. Результаты иммуноферментного определения ОРАР в сыворотке крови больных глиомами низкой степени злокачественности

Концентрация ОРАР в сыворотке к рови, нг/мл Всего.

4 8 16 32 64 128 256

Число проб 0 0 1 5 9 10 0 25

% 0 0 4 20 36 40 0 100

По полученным данным был проведен статистический анализ зависимости концентрации ОРАР в сыворотке крови от размера опухоли с использованием критерия Пирсона. В группе злокачественных глиом коэффициент корреляции г составил 0,223, коэффициент Стьюдента 1=1,122, р=0,041. Следовательно, между двумя этими признаками существует слабая прямая зависимость (рис. 1). В группе глиом низкой степени злокачественности коэффициент корреляции г составил -0,261, коэффициент Стьюдента 1=-1,299, ¡>=0,207, то есть статистически достоверной зависимости обнаружено не было (рис. 2).

Определение ОРАР в сыворотке крови больных показало, что, несмотря на многократное превышение нормы, количество этого белка в крови остается низким (даже при больших размерах опухолей), а, следовательно, не должно связывать значительное количество иммунолипосом при их парентеральном введении.

диаметр опухоли, см

Рисунок 18 График рассеяния при анализе корреляционной связи между размером опухоли (злокачественные глиомы) и концентрацией вРАР в сыворотке крови.

140 ч

§ ч • X • • т • •

I 120 ч ч

X а ч ч

£ 100 V

н & 80 о а

• 60

О. < ч ^^^

О ч ч

« 40 ч

п л • • •

а 1 30 X О 3£ ч ч •

1 2 3 4 5 6 7 8

диаметр опухоли, см

Рисунок 19. График рассеяния при анализе корреляционной связи

между размером опухоли (глиомы низкой степени злокачественно-

сти) и концентрацией СРАР в сыворотке крови.

выводы

1. Эмульсионно-экструзионная технология обработки липидной смеси из лецитина, холестерина, малеимидного производного фосфатидилэтано-ламина и дистеароилфосфатидилэтаноламина, конъюгированного с ПЭГ-2000, в молярном соотношении 23:16:1:1,6 позволяет создавать стерически стабилизированные липосомы с диаметром 85-140 нм.

2. Введение в состав липосом малеимидного производного фосфатиди-лэтаноламина позволяет проводить конъюгацию с тиолированными моно-клонапьными антителами к глиофибриллярному кислому белку (СРАР) и получать иммунолипосомы, способные иммунохимически взаимодействовать с этим антигеном.

3. Получена оригинальная иммунолипосомальная система, в которой на 1 мкмоль суммарных фосфолипидов приходится 375 мкг антител (одна ли-посома содержит примерно 150 молекул антител).

4. Технология загрузки по концентрационному и рН-градиенту позволяет ввести в иммунолипосомы до 200-300 мкг доксорубицина на 1 мг суммарных фосфолипидов.

5. Стерически стабилизированные иммунолипосомы на основе моно-клональных антител к йРАР способны селективно захватываться астроци-тами дефинитивной нервной ткани, а также клетками глиомы С6, что делает возможным применение иммунолипосом в качестве специфических на-ноконтейнеров для векторной доставки биологически активных веществ в клетки-мишени.

6. Иммуноферментный мониторинг ОРАР на основе моноклональных антител может применяться для дополнительной диагностики опухолей астроглиального происхождения. Количественное содержание ОРАР в сыворотке крови не должно существенно снижать концентрацию специфических иммунолипосом в сыворотке крови при их парентеральном введении и лимитировать возможности специфической иммунотерапии

Список работ по теме диссертации:

1. Березов Т.Т., Яглова Н.В., Дмитриева Т.Б., Чехонин В.П., Жирков Ю.А. Направленный транспорт лекарственных средств с помощью липосом. И Вестник РАМН. — 2004. — № 5. — С. 42-47.

2. Березов Т.Т., Яглова Н.В., Чехонин В.П., Жирков Ю.А. Липосомальные формы антрациклиновых антибиотиков. // Биомедицинская химия. — 2004. —Т. 50, — №5, — С. 11-19.

3. Яглова Н.В. Перспективы адресной доставки лекарственных препаратов в клетки головного мозга. // Материалы V Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» — М., 2004. — С. 434.

4. Яглова Н.В. Получение стерически стабилизированных иммунолипосом, специфичным к астроцитам крысы, и их физико-химические ха-

рактеристики. II Материалы Межрегиональной научно-практической конференции «Новая идеология в единстве фундаментальной науки и клинической медицины». —- Самара, 2005. — С. 478-481.

5. Яглова Н.В., Биктимиров Р.Г. Количественное определение глиофиб-риллярного кислого белка (GFAP)b сыворотке крови больных глиомами мозга методом твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных анти-СЗРАР-антител. // Вестник РУДН. — 2005. — №3.

— с ,21-г5-

6. Чехонин В.П., Березов Т.Т, Сырков С.А., Турина О.И., Яглова Н.В., Семенова A.B., Дмитриева Т.Б. Получение и характеристика ПЭГили-рованной иммунолипосомальной системы специфичной для астроцитов нервной ткани. // Биомедицинская химия. — 2005 — Т 51. — № 3. —

с. sie-ггб.

Яглова Наталья Валентиновна (Россия). Создание стерически стабилизированной иммунолипосомальной системы на основе моноклональных антител с целью специфической доставки биологически активных веществ к клеткам-мишеням.

Работа посвящена созданию системы направленного транспорта препаратов в клетки астроглии и опухолей астроглиального происхождения на основе стерически стабилизированных липосом, конъюгированных с мо-ноклональными анти-СРАР-антителами. Липосомы изготовлены эмульси-онно-экструзионным методом и полностью загружены доксорубицином с использованием искусственно созданных концентрационного и рН градиентов. Конъюгация моноклональных анти-СРАР-антител с липосомами произведена малеимидным методом. Адекватность векторной функции иммунолипосом подтверждена результатами иммунофлюоресцентного анализа в препаратах культур эмбриональных астроцитов мозга крысы и клеток глиомы С6 крыс. Низкое содержание GFAP в сыворотке крови больных глиальными опухолями мозга, определенное высокочувствительным методом твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных анти-СРАР-антител, подтвердило возможность использования GFAP в качестве потенциальной мишени для направленного транспорта в клетки астроглиальных опухолей.

Natalia V. Yaglova (Russia). Preparation of sterically stabilized liposomes coupled with monoclonal anti-GFAP-antibodies for cell-targeted delivery of medicinal substances.

The dissertation is devoted to the problem of targeted delivery to normal and neoplastic astroglial cells. The liposomes were prepared by emulgation and extrusion of lipid mixture and coupled with monoclonal anti-GFAP-antibodies by MPB-PE method. Active loading of doxorubicin into liposomes by a transmembrane pH and concentration gradient was 99,5-99,7%. Specific binding of the immunoliposomes with fetal rat astocytes and rat C6 glioma cells was demonstrated by fluoroimmunoassay. Quantification of GFAP in sera of patients with brain gliomas by ELYSA employing monoclonal anti-GFAP-antibodies revealed low concentration of targeted antigen irrespective of tumor size. It provides the possibility for application of GFAP as a molecular target of astroglial tumor cells.

РНБ Русский фонд

2006-4 8848

Подписано в печать /(/"¿^¿зГФормат 60x84/16. Тираяс^Я^экз. Усл. печ. л. ■/ Заказ 9

Типография Издательства РУДН 117923, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д. 3

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Яглова, Наталья Валентиновна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Направленный транспорт лекарственных средств с помощью липосом

1.2. Глиофибриллярный кислый белок.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

ГЛАВА 3. Получение стерически стабилизированных липосом и их физико-химические характеристики.

3.1. Получение ПЭГилированных липосом

3.2. Конъюгирование моноклональных антител с ПЭГилирован- 85 ными липосомами

3.3. Физико-химические характеристики иммунолипосом

ГЛАВА 4. Иммуноморфологический анализ ПЭГилированных липосом, конъюгированных с моноклональными антителами к GFAP в культуре эмбриональных астроцитов крысы и клеток глиомы Сб.

4.1. Иммуноморфологический анализ моноклональных антител к GFAP в культуре эмбриональных астроцитов крысы и клеток глиомы С

4.2. Анализ специфичности связывания ПЭГилированных липосом, конъюгированных с моноклональными анти-GFAP антителами, с клетками глиомы С6 и эмбриональными астроцитами мозга 104 крысы

ГЛАВА 5. Количественное определение содержания GFAP в сыворотке крови больных глиальными опухолями мозга. 5.1. Определение GFAP в сыворотке крови пациентов со злокачественными глиомами

5.2. Определение GFAP в сыворотке крови пациентов с глиомами низкой степени злокачественности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание стерически стабилизированной иммунолипосомальной системы на основе моноклональных антител с целью специфической доставки биологически активных веществ к клеткам-мишеням"

Актуальность проблемы.

Создание систем, способных осуществлять специфический направленный транспорт биологически активных веществ из системного кровотока к клеткам центральной нервной системы является одной из самых актуальных задач нейрофармакологии. Известно, что инкапсуляция препаратов в различные микроконтейнеры существенно улучшает их фармакокинетические параметры, снижает токсичность, позволяет уменьшать разовые и курсовые дозы. На современном этапе доставка препаратов к клеткам мозга сводится к использованию конъюгатов лекарственных препаратов с векторными антителами, наночастиц и липосом. Наиболее перспективными системами для доставки различных лекарственных средств считаются стерически стабилизированные липосомы, обладающие свойством длительно циркулировать в системном кровотоке, будучи нераспознанными макрофагами ретикулоэндотелиальной системы [16]. Конъюгация их с различными векторными молекулами должна обеспечить нацеливание их на определенные клетки-мишени [14, 102]. Основным недостатком таких систем является неспособность преодолевать ге-матоэнцефалический барьер. Что касается направленного транспорта в опухоли мозга, то он в значительной степени облегчен благодаря нарушению целостности гематоэнцефалического барьера. За последнее десятилетие было создано несколько липосомальных транспортных систем для доставки противоопухолевых препаратов к клеткам злокачественных глиальных опухолей, которые по частоте занимают первое место среди первичных опухолей мозга [114, 139]. Для повышения эффективности их действия в качестве векторов использовались молекулы трансферрина, антитела к трансферрину, фолиевая кислота, так как опухолевые клетки экспрессируют рецепторы к этим веществам в больших количествах, нежели нормальные клетки [125, 211, 221]. Это, с одной стороны, делало доставку препаратов в опухолевые клетки избирательной по отношению к нормальным клеткам мозга, а с другой стороны, приводило к накоплению препарата практически во всех органах и тканях, так как выбранные молекулярные мишени являлись неспецифичными. Решить такую проблему было бы возможно, если в качестве мишеней можно было использовать молекулы, экспрессируемые только опухолевой клеткой. Изучение молекулярного профиля злокачественных глиом на сегодняшний день не обнаружило присутствия постоянно экспрессируемых опухолевыми клетками специфических маркеров [137]. Исследования специфического маркера нормальных астроцитов — глиофибриллярного кислого белка (GFAP), показали возможность использования его в качестве мишеней для направленного транспорта [7, 8], а разработка методов получения моноклональных антител к ней-роспецифическим белкам позволило вплотную подойти к решению проблемы [3, 7]. Наличие данных о сохранении экспрессии этого белка опухолевыми клетками астроглиального происхождения [4, 129] позволяет рассматривать его как потенциальную мишень для доставки биологически активных веществ к соответствующим клеткам с помощью микроконтейнеров, конъюгирован-ных с моноклональными анти-GF АР-антителами, создание которых и являлось целью данного исследования.

Цель исследования:

Разработать способ получения ПЭГилированных иммунолипосомаль-ных контейнеров, способных направленно доставлять противоопухолевые препараты к клеткам астроглиальных опухолей и изучить ряд их физико-химических свойств.

Задачи исследования:

1. Разработать способ получения ПЭГилированных липосом.

2. Разработать способ конъюгирования моноклональных антител к глиофиб-риллярному кислому белку (GFAP) с ПЭГилированными липосомами.

3. Изучить ряд физико-химических свойств иммунолипосом.

4. Провести иммуноморфологическую оценку специфичности связывания ПЭГилированных иммунолипосом с эмбриональными астроцитами мозга крысы и клетками глиомы крыс.

5. Определить количественное содержание GFAP в сыворотке крови больных глиомами мозга разной степени злокачественности.

Научная новизна:

Разработан способ практически 100%ной загрузки липосом доксоруби-цином с использованием трансмембранных градиентов рН и сульфата аммония в присутствии малеимидного производного фосфатидилхолина.

Практическая значимость исследования:

Показана возможность направленного транспорта в клетки глиальных опухолей с помощью иммунолипосом с использованием GFAP в качестве молекулярной мишени, что открывает очевидные перспективы для патогенетически обусловленного метода терапии глиом, обеспечивающего избирательное накопление препарата в клетках опухоли и позволяющего значительно повысить эффективность терапии при снижении побочного действия противоопухолевых препаратов.

Положения, выносимые на защиту: 1. Эмульсионно-экструзионная технология обработки липидной смеси, состоящей из лецитина, холестерина, малеимидного производного фосфати-дилэтаноламина и дистеароилфосфатидилэтаноламина, конъюгированного с ПЭГ-2000, в молярном соотношении 23:16:1:1,6. использование активной загрузки доксорубицина с помощью трансмембранных концентрационного и рН градиентов и малеимидного метода конъюгации анти-СРАР-антител обеспечивают получение стерически стабилизированных иммунолипосом заданного размера.

2. Специфическое взаимодействие иммунолипосом с эмбриональными астро-цитами мозга крысы и клетками глиомы С6 обусловлено иммунохимиче-ским взаимодействием конъюгированных анти-ОРАР-антител с антигеном, расположенным на поверхностной мембране клеток.

3. Глиофибриллярный кислый белок может использоваться в качестве молекулярной мишени для адресной доставки биологически активных веществ в клетки опухолей астроглиального происхождения, поскольку его содержание в сыворотке крови больных глиальными опухолями мозга остается низким даже при больших объемах опухолей и не может препятствовать проникновению иммунолипосом в патологический очаг при их парентеральном введении.

Апробация работы:

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы:

Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 19 рисунками. Указатель литературы включает 245 источников, из них 8 отечественных, 237 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Яглова, Наталья Валентиновна

выводы

1. Эмульсионно-экструзионная технология обработки липидной смеси из лецитина, холестерина, малеимидного производного фосфатидилэтаноламина и дистеароилфосфатидилэтаноламина, конъюгированного с ПЭГ-2000, в молярном соотношении 23:16:1:1,6 позволяет создавать стерически стабилизированные липосомы с диаметром 85-140 нм.

2. Введение в состав липосом малеимидного производного фосфатидилэтаноламина позволяет проводить конъюгацию с тиолированными моноклональными антителами к глиофибриллярному кислому белку (GFAP) и получать иммунолипосомы, способные иммунохимически взаимодействовать с этим антигеном.

3. Получена иммунолипосомальная система, в которой на 1 мкмоль суммарных фосфолипидов приходится 375 мкг антител (одна липосома содержит примерно 150 молекул антител).

5. Стерически стабилизированные иммунолипосомы на основе моноклональных антител к GFAP способны селективно захватываться астроцитами дефинитивной нервной ткани, а также клетками глиомы С6, что делает возможным применение иммунолипосом в качестве специфических наноконтейнеров для векторной доставки биологически активных веществ в клетки-мишени.

6. Иммуноферментный мониторинг GFAP на основе моноклональных антител может применяться для дополнительной диагностики опухолей астроглиального происхождения. Количественное содержание GFAP в сыворотке крови не может существенно снижать концентрацию специфических иммунолипосом в сыворотке крови при их парентеральном введении и лимитировать возможности специфической иммунотерапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Яглова, Наталья Валентиновна, Москва

1. Березин В.А. Специфические белки нервной ткани в норме и при патологии: Дис. . д-ра мед. наук. Днепропетровск, 1985. — 252 с.

2. Березин В.А., Белик Я.В. Специфические белки нервной ткани. — Киев: Наукова думка, 1990. 264 с.

3. Турина О.И. Моноклональные антитела к нейроспецифическим антигенамполучение, иммунохимический анализ, исследование проницаемости гематоэнцефалического барьера): Дис. . д-ра мед. наук. Москва, 2005, 319с.

4. Коршунов А.Г., Сычева Р.В. Экспрессия ГФКБ и белка S-100 в астроцитарных глиомах головного мозга различной степени злокачественности: иммунохимическое исследование. // Арх. Патологии. -1995. Т.57. - № 4. - С. 30-38.

5. Руководство по паталогоанатомической диагностике опухолей человека // Под ред. Н.А. Краевского, А.В. Смольянникова, Д.С. Саркисова. 3-е изд. -М.: Медицина, 1982, 512с.

6. Чехонин В.П. Специфические белки нервной ткани человека и животных (идентификация, выделение, физико-химическая характеристика и клинико-лабораторные исследования): Дис. . д-ра мед. наук. М., 1989.

7. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. М.: Медицина, 2000. - 416 с.

8. Чехонин В.П., Жирков Ю.А., Турина О.И., Рябухин И.А. и др. Пэгилированные иммунолипосомы, специфичные к астроцитам. // Доклады Академии наук. 2003. - Т. 391. - № 6. - С. 1 -4.

9. Absolom D. Opsonins and dysopsonins an overview. // Methods Enzymol. -1986.-Vol. 132.-P. 281-318.

10. Ahmad I., Allen T.M. Antibody-mediated specific binding and cytotoxicity of Iiposome-entrapped doxorubicin to lung cancer cells in vitro. // Cancer Res. — 1992. Vol. 52. - P. 4817-4820.

11. Albrechtsen M., Massaro A., Bock E. Enzyme-linked immunosorbent assay for human glial fibrillary acidic protein using a mouse monoclonal antibody. // J. Neuroimmunol. 1985. - Vol. 8. - P. 301-309.

12. Albrechtsen M., von Gerstenberg A.C., Bock E. Mouse monoclonal antibodies reacting with human glial fibrillary acidic protein. // J. Neurochem. 1984. -Vol. 42. - N 1. - P. 86-93.

13. Allen T.M., Agrawal A., Ahmad I., Hansen C., Zalipsky S. Antibody-mediated targeting of long circulating (Stealth) liposomes. // J. Liposome Res. 1994. -N.4. - P. 1-25.

14. Allen T.M., Austin G.A., Chonn A., Lin L., Lee K.S. Uptake of liposomes by cultured mouse bone marrow macrophages: influence of liposomal composition and size. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. - Vol. 1061. - P. 56.

15. Allen T.M., Hansen C. Pharmacokinetics of stealth vs conventional liposomes: effect of dose. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - Vol. 1068. - P. 131-141.

16. Allen T.M., Hansen C.B., Zalipsky S. Antibody-targeted stealth liposomes, in: D. Lasic, F. Marin, (Eds.), Stealth liposomes, CRS Press, Boca Raton, 1995, P. 233-244.

17. Allen T.M., Martin F., Redemann C., Hansen C., Yau-Young A. Liposomes containing synthetic lipid derivatives of polyethyleneglycol show prolongedcirculation Tm in vivo. // Biochim. Biophys. Acta. -1991. Vol. 1066. - P. 2936.

18. Amaducci L., Forno K., Eng L.F. Glial fibrillary acidic protein incriogenic lesions of the rat brain. // Neurosci. Lett. 1981. - Vol. 265. - P. 27-32.

19. Aragnol D., Leserman L.D. Immune clearance of liposomes inhibited by an anti-Fc receptor antibody in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol. 83. -P. 2699-2703.

20. Auer R., Del Maestro R.F., Anderson R. A simple and reproducible experimental in vivo glioma model. // Can. J. Neurol. Sci. 1981. - N 8. - P. 325-331.v

21. Balasingham V., Tejada-Berges Т., Wright E., et al. Reactive astrogliosis in the neonatal mouse brain and its modulation by cytokines. // J. Neurosci. 1994. -Vol. 14.-P. 846-856.

22. Balcarec J.M., Cowan N.J. Structure of the mouse glial fibrillary acidic protein gene: implications for the evolution of the intermediate filament multigene family. //Nucl. Acids Res. 1985. - Vol. 13. - P. 5527-5543.

23. Bangham A.D. Physical structure and behavior of lipids and lipid enzymes. // Adv. Lipid Res. 1963. - Vol. 1. - P. 65-104.

24. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins J.C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. //J. Mol. Biol. 1965. - Vol. 13. - P. 238-252.

25. Barber P.C., Lindsay R.M. Schwann cells of the olfactory nerve contain glial fibrillary acidic protein and resemble astrocytes. // Neuroscience. 1982. - Vol. 7. - P. 3077-3090.

26. Barnea A., Roberts J. A method for dissociation and aggregate culture of human fetal brain cells in serum-free medium. // Brain Res. Protocols. 1999. - Vol. 4. -P. 156-164.

27. Bartnik E., Weber K. Widespread occurrence of intermediate filaments in vertebrates; common principles and aspects of diversion. // Eur. J. Cell. Biol. -1989.-Vol. 50.-P. 17-33.

28. Benda P., Lightbody J., Sato J., Levine L., Sweet W. Differentiated rat glial strain in tissue culture. // Science. 1968. - Vol. 161. - P. 370-371.

29. Benzinger P., Martiny-Baron G., Reusch P., Siemeistcr G., Kley J.T., Marme D., Unger C., Massing U. Targeting of endothelial KDR receptors with 3G2 immunoliposomes in vitro. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol.1466. - P. 71-78.

30. Bernstein J.J., Goldberg W.J., Laws E.R., Morreale V., Wood L. C6 glioma cell invasion and migration of rat brain after neural homografting: ultrastructure. // Neurosurgery. 1990. - Vol. 26. - P. 652-658.

31. Berry M. Regeneration in the central nervous system In: Smith W.T., Canavagh J.B. (eds.). Recent advances in neuropathology. - Edinburgh: Churchill Livingstone, 1979. - Vol. 1. - P. 67-111.

32. Besnard F., Brenner M., Nakatani Y. Multiple interacting sites regulate astrocyte-specific transcription of the human gene for GFAP. // J. Biol. Chem. -1991.-P. 18877-18883.

33. Bestman-Smith J., Desormeaux A., Gourde P., Tremblay M., Bergeron M. Sterically stabilized liposomes bearing anti-HLA-GR antibodies for targeting the primary cellular reservoirs of HIV-1. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1468 (1-2).-P. 161-171.

34. Bianchi R., Garbuglia M., et al. S-100 protein and annexin 112p-112 (calpactin 1) act in concert to regulate the state of assembly of GFAP intermediate filaments in vitro. // Bioch. Biophys. Res. Commun. 1995. - Vol. 208. - N. 3. -P. 910-918.

35. Bianchi R., Giambanco I., Donato R. S-100 protein, but not calmodulin, binds to the GFAP and inhibits its polymerization in a Ca2+-dependenl manner. // J. Biol. Chem.- 1993. -Vol. 268.-N. 17.-P. 12669-12674.

36. Bigbee J.W., Eng L.F. Glial fibrillary acidic protein synthesized in vitro using messenger RNA from Jimpy mouse spinal cord. // Brain Res. 1982. - Vol. 249. -P. 383-386.

37. Bignami A., Dahl D. Astrocyte-specific protein and neuroglial differentiation. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic protein. //J. Сотр. Neurol. 1974. - Vol. 153. - P. 27-38.

38. Bignami A., Dahl D. Astroglial protein in the developing spinal cord of the chick embryo. // Develop. Biol. 1975. - Vol. 44. - P. 204.

39. Bignami A., Dahl D. Differentiation of astrocytes in cerebellar cortex and the pyramidal tracts of the newborn rat. An immunofluorescence study to a protein specific to astrocytes. // Brain Res. 1973. - Vol. 49. - P. 393-402.

40. Bignami A., Dahl D. The astroglial response to stubbing. Immunofluorescence studies with antibodies to astrocyte-specific protein (GFA) in mammalian and submammalian vertebrates. // Neuropathol. Appl. Neurobiol. 1976. - Vol. 43. -P. 429-435.

41. Bignami A., Eng L., Dahl D., Uyeda C. Localization of the glial fibrillary acidic protein in astrocytes by immunofluorescence. // Brain Res. 1972. - Vol. 43. -P. 429-435.

42. Bignami A., Swanson J., Dahl D. GFAP expression in aggregating cultures of rat C6 glioma. //Experientia (Basel).- 1979.-Vol. 35.-P. 1170-1171.

43. Bissel M.J., Eng L.F. Herman M.M., Bensch K.G., et al. Quantative increase of neuroglia-specific GFA protein in rat C6 glioma cells in vitro. // Nature. 1975. -Vol. 225.-P. 633-634.

44. Bjorklund H., Dahl D., Seiger A. Neurofilament and GFAP-related immunoreactivity in rodent enteric nervous system. // Neuroscience. 1984. -Vol. 12.-P. 277-287.

45. Black С., Gregoriadis G. Interaction of liposomes with blood plasma protein.// Biochem. Soc. Trans. 1976. - N 4. - P. 253-256.

46. Blume G., Cevs G. Liposomes for sustained drug release in vivo. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. - Vol. 1029. - P. 91-97.

47. Bock E. Nervous system specific proteins. // J. Neurochem. 1978. - Vol. 30. -P. 7-14.

48. Boerman O.C., Laverman P., Oyen W.J.G., Corstens F.H.M., Storm G. Radiolabeled liposomes for scintigraphic imaging. // Prog. Lipid Res. — 2000. — Vol. 39.—P. 461-475.

49. Bogner J.R., Goebel F.D. Efficacy of DOX-XL in the treatment of advanced AIDS-related Kaposi's sarcoma. // "Stealth Liposomes". Edited by Lasic D. and Martin F. CRC Press. - London. - 1995. - P. 51-62.

50. Bongcam-Rudloff E., Nister M., Besholtz C., et al. Human GFAP: complementary DNA cloning, chromosome localization, and massanger RNA expression in human glioma cell lines of various phenotypes. // Cacer Res. -1991.-Vol. 51.-P. 1553-1560.

51. Bonnin J., Rubinstein I. Immunohistochemistry of central nervous system tumores. Its contribution to neurosurgical diagnosys. // J. Neurosurg. 1984. -Vol. 60.-P. 1121-1133.

52. Bonte F., Juliano R. Interaction of liposomes with plasma proteins. // Chem. Phys. Lipids. 1986. - Vol. 40. - P. 359-372.

53. Brenner M. Structure and transcriptional regulation of GFAP gene. // Brain Pathol. 1994. - Vol. 4. - P. 245-257.

54. Brenner M., Lampel K., Nakatani Y. Characterization of human cDNA and genomic clones for GFAP. // Mol. Brain Res. 1990. - Vol. 7. - P. 277-286.

55. Bruckdorfer K., Demel R., DeGrier G., Deenen L. The effect of partial replacement of membrane cholesterol by other steroids on the osmotic fragilityand glycerol permeability of erythrocytes. I I Biochim. Biophys. Acta. 1969. -Vol. 183.-P. 334.

56. Cavanagh J. The proliferation of astrocytes around a needle wound in the rat brain. // J. Anat. 1970. - Vol. 106. - P. 471-487.

57. Chang J.W., Lee H., Kim E., Lee Y., et al. Combined antitumor effects of an adenoviral cytosine deaminase/thymmidine kinase fusion gene in rat C6 glioma. // Neurosurgery. 2000. - Vol. 47. - P. 931-938.

58. Chiu F.-C., Goldman J. Regulation of GFAP expression in CNS development and in pathological states. // J. Neuroimmunol. 1985. - Vol. 8. - P. 283-292.

59. Choi В., Kim R. Expression of GFAP by immature oligodendroglia and its implications. //J. Neuroimmunol. 1985. - Vol. 8. - P. 215-235.

60. Chucoine M.R., Silbergeld D.L. Invading C6 glioma cells maintaining tumorogenicity. // J. Neurosurg. 1995. - Vol. 83. - P. 665-671.

61. Coakham H. Surface antigenes common to human astrocytoma cells. // Nature (London). 1974. - Vol. 250. - P. 183-197.

62. Cohen I., Shani Y,. Schwartz M. Cloning and characteristics of fish GFAP: implications for optic nerve regeneration. // J. Сотр. Neurol. 1993. - Vol. 334. -P. 431-443.

63. Dahl D. Isolation and initial characterization of GFAP from chicken, frog, turtle and fish central nervous system. // Biochim. Biophys. Acta. 1977. - Vol. 446. -P. 41.

64. Dahl D. The vimentin-GFA protein transition in rat neuroglia cytoskeleton occurs at the time of myelination //J. Neurosci. Res. — 1981. — Vol. 6. — P. 741 748.

65. Dahl D., Bignami A. Glial fibrillary acidic protein from normal and gliosed human brain. Demonstration of multiple related polypeptides // Biochim. biophys. Acta. 1975 - Vol. 386 — P. 41 - 51.

66. Dahl D., Bignami A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties // Brain Res. — 1973. — Vol. 57. — P. 343.

67. Dahl D., Bignami A. Immunogenic properties of the glial fibrillary acidic protein // Brain Res. — 1976. — Vol. 116. — P. 150.

68. Dahl D., Bjorklund H., Bignami A. Immunological markers in astrocytes. In: Fedoroff S., Vernadakis A. (eds). Astrocytes. Cell biology and pathology of astrocytes. — Orlando: Acad. Press, 1986. — Vol. 3. — P. 1 - 25.

69. Dahl D., Chi N.H., Miles L.E., et al. Glial fibrillary acidic (GFA) protein in Schwann cells // J. Histochem. Cytochem. — 1982. — Vol. 30. — P. 912 918.

70. Dahl D., Crosby C.J., Sethi J.S., Bignami A. Glial fibrillary acidic (GFA) protein in vertebrates: immunofluorescence and immunoblotting study with monoclonal and polyclonal antibodies //J. Сотр. Neurol. — 1985. — Vol. 239.1. P. 75-88.

71. Dahl D., Rueger D.C., Bignami A., et al. Vimentin, the 57,000 molecular weight protein of fibroblast filaments, is the major cytoskeletal component of immature glia//Eur. J. Cell Biol.—1981. —Vol. 24. —P. 191 -196.

72. DeArmond S., Eng L., Rubinstein L. The application of GFAP immunohistochemistry in neurooncology: a progress report. // Pathol. Res. Pract.- 1980. Vol. 168. - P. 374-394.

73. Debus E., Weber K., Osborn M. Monoclonal antibodies specific for glial fibrillary acidic (GFA) protein and for each of the neurofilament triplet polypeptides. // Differentiation. — 1983. — Vol. 25. — P. 193 203.

74. Deck J., Eng L., Bigbee J. A priliminary study of glioma morphology using the peroxidase anti-peroxidase method for the GFA protein. // J. Neuropatol. Exp.

75. Neurol. 1976. - Vol. 35. - P. 193-203.

76. Deck J., Eng L., Bigbee J. The role of GFAP in the diagnosis of central nervous system tumores. // Acta Neuropathol. 1978. - Vol. 42. - P. 183-190.

77. Del Maestro R., Shivers R., McDonald W., Del Maestro A. Dinamics of C6 astrocytoma invasion into three-dimensional collagen gells. // J. Neurooncol. -2001.-Vol. 53.-P. 87-98.

78. Delpech В., Delpech A., Vidard M., Girard N. GFAP in tumors of the nervous system. // Br. J. Cancer. 1978. - Vol. 37. - P. 33.

79. Drummond D.S., Zignani M., Leroux J.-C. Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery. // Prog. Lipid Res. 2000. - Vol. 39. - P. 405-460.

80. Duffy P., Graf L., Rapport M. identification of GFAP by the immunoperoxidase method in human brain tumors. // J. Neuropatol. Exp. Neurol. 1977. - Vol. 36. - P. 645-652.

81. Dufresne I., Desormeaux A., Bestman-Smith J., Gourde P., Tremblay M., Bergeron M. Targeting lymph nodes with liposomes bearing anti-HLA-GR Fab-fragments. // Biochim. Biophys. Acta. -1999. Vol. 1421. - P. 284-294.

82. Dvorak H., Nagy J., Dvorak J., Dvorak A. Identification and characterization of the blood vessels of solid tumores that are leaky to circulating macromolecules. //Am. J. Pathol. 1988.-Vol. 133.-N.1.-P. 95-100.

83. Eng L. F., Reply to the comments of Bignami and Dahl. // J. Histochem. Cytochem. 1979. - Vol. 27. - P. 694-696.

84. Eng L.F. Glial fibrillary acidic protein: the major protein of glial intermediate filaments in differentiated astrocytes. // J. Neuroimmunol. — 1985. — Vol. 8. — P. 203 214.

85. Eng L.F., Bigbee J. Immunohistochemistry of nervous system specific proteins. // Adv. Nerochem. 1978. - Vol. 3. - P. 43-98.

86. Eng L.F., DeArmond S.J. Immunochemistry of the glial fibrillary acidic protein.

87. Prog. Neuropathol. — 1983. — Vol. 5. — P. 19 39.

88. Eng L.F., Gerstl В., Vanderhaeghen J.J. A study of proteins in old multiple sclerosis plaques. // Trans. Amer. Soc. Neurochem. 1970. - Vol.1. - P. 42.

89. Eng L.F., Lee Y.L., Fukayama G. Isolation of glial fibrillary acidic (GFA) protein from bovine spinal cord. //Trans. Amer. Soc. Neurochem. — 1979. — Vol. 10. —P. 126.

90. Eng L.F., Rubinstein L. Contribution of immunohistochemistry to diagnostic problems of human cerebral tumors. // J. Histochem. Cytochem. 1978. - Vol. 26.-P. 513-522.

91. Eng L.F., Smith M., de Velles T. Recent studies of GFAP. In: Intermediate filaments. // Ann. NY Acad. Sci. 1985. - Vol. 455. - P. 527-537.

92. Eng L.F., Vanderhaeghen J.J. et al. An acidic protein isolated from fibrous astrocytes. // Brain Res. 1971. - Vol. 28. - P. 351.

93. Eng L.F., Yu A., Lee Y. Astrocytic response to injury. In: Yu A. (ed.) Neuronal-astrocytic interactions: implications for normal and pathological CNS function. -Amsterdam etc.: Elsevier, 1992. P. 353-365.

94. Errante L., Wiche J., Shaw G. Distribution of plectin, an intermediate filament-associated protein, in the adult rat central nervous system. // J. Neurosci. Res. -1994.-Vol. 37.-P. 512-528.

95. Fischer W., Heller Т., Herrman E., Schreiber D. A simple method for the isolation of GFAP and its use for study of brain tumors. // Zentralbl AUg. Pathol. 1989.-Vol. 135.-N. 1.-P. 33-41.

96. Froes M.M., Correia A.H.P., Garcia-Abreu J. et al. Gap-junctional couplingbetween neurons and astrocytes in primary central nervous system cultures. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 7541-7546.

97. Gabizon A., Huberty J., Straubinger R.M., Price D.C., Papahadjopoulos D. An improved method for in vitro tracing and imaging of liposomes using a gallium67-deferoxamine complex. // J. Liposome Res. 1988. - N.l. — P. 123.

98. Gabizon A., Papahadjopoulos D. Liposome formulations with prolonged circulation time in blood and enhanced uptake to tumors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. - P. 6949-6953.

99. Gabizon A., Papahadjopoulos D. The role of surface charge and hydrophilic groups on liposome clearence in vivo. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. — Vol. 1103.-P. 94-100.

100. Gabizon A., Shiota R., Papahadjopoulos D. Pharmacokinetics and tissue distribution of doxorubicin encapsulated in stable liposomes with long circulation times. // J. Natl. Cancer Inst. 1989. - Vol. 81. - P. 1485-1488.

101. Gard A.L., White F.P., Dutton G.R. Extra-neural glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunoreactivity in perisinusoidal stellate cells of rat liver. // J. Neuroimmunol. — 1985. — Vol. 8. — P. 359 375.

102. Gheuens J., de Schutter E., Noppe M. et al. Identification of several forms of GFAP, or a-albumin, by a specific monoclonal antibodies. // J. Neurochem.1984. Vol. 43.-P.964-970.

103. Goldman J., Chiu F. Growth kinetics, cell shape, and the cytosceleton of primary astrocytes cultures. // J. Neurochem. 1984. - Vol. 42. - P. 175-184.

104. Goldman J., Chiu F. Dibutyryl-cyclic AMP causes intermediate filament accumulation and actin reorganization in primary astrocytes. // Brain Res. -1984.-Vol. 306.-P. 85-95.

105. Goldman J., Zacroff R., Steinert P. Intermediate filaments: overview. In: Goldman R.D., Steinert P. (eds). Cellular and molecular biology of intermediate filaments. - NY: Plenum, 1990. - P. 3-20.

106. Gomes-Pinilla F., Lee J., Cotman C. Basic FGF in adult rat brain: cellular distribution and response to entorhinal lesion and fimbria fornix transection. // J. Neurosci.- 1992.-Vol. 12.-P. 345-455.

107. Gomi H., Yokoyama Т., Fujimoto K., et al. Mice devoid of the glial fibrillary acidic protein develop normally and are susceptible to scrapie prions. // Neuron. — 1995. — Vol. 14. — P. 29 41.

108. Graham D., Thomas D., Brown I. Nervous system antigens. Invited review. // Histopathology. 1983. - Vol. 7. - P. 1 -21.

109. Gregoriadis G., Davis C. Stability of liposomes in vivo and in vitro is promoted by their cholesterol content and the presence of blood cells. // Biochim. Biophys. Res. Commun. 1979. - Vol. 89. - P. 1287-1293.

110. Gregoriadis G.,Ed., Liposomes as drug carriers: Recent trend and progress. -John Wiley &Sons. New York. - 1988. - P. 10.

111. Hagiwara N., Imada S., Sueoka N. Cell type specific segregation oftranscriptional expression of glial genes in the rat peripheral neurotumor RT4 cell lines. // J. Neurosci. Res. 1993 - Vol. 36 - P. 646 -656.

112. Haran G., Cohen R., Bar L.K., Barenholz Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. - Vol. 1151. - P. 201-215.

113. Hatfield J.S., Skoff R.P., et al. The lens epithelium contains glial fibrillary acidic protein // J. Neuroimmunol. — 1985. — Vol. 8. — P. 347-357.

114. Hayakawa Т., Morimoto K., Ushio Y. Levels of astroprotein (an astrocyte-specific cerebroprotein) in cerebrospinal Fluid of patients with brain tumors. An attempt at immunochemical diagnosis of gliomas. // J. Neurosurg. 1980. -Vol. 52.-P. 229-233.

115. Heath T. Covalent attachment of proteins to liposomes. // Methods Enzymol. -1987.-Vol. 149,- P. 111.

116. Heath T. Interaction of liposomes with cells.// Methods Enzymol. 1987. -Vol. 149.- P. 135-143.

117. Higley H.R., McNulty J.A., Rowden G. Glial fibrillary acidic protein and S100 protein in pineal supportive cells: an electron microscopic study. // Brain Res. — 1984. — Vol. 304. — P. 117 -120.

118. Hofler H., Walter G.F., Denk H. Immunohistochemistry of folliculo-stellate cells in normal human adenohypophyses and in pituitary adenomas. // Acta Neuropathol. — 1984. — Vol. 65. — P. 35-40.

119. Holland E.C. Glioblastoma multiforme: the terminator. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 6242-6244.

120. Huwyler J., Cerletti A., Drewe J., Fricker G., Eberle A.N. Endocytosis and transcytosis of an immunoliposome-based brain drug delivery system. // J. Drug Target. — 2000. — Vol. 8. — No. 6. — P. 435-446.

121. Hwang K., Beaumier P. Disposition of liposomes in vivo. // Gregoriadis G.,Ed., Liposomes as drug carriers: Recent trend and progress John Wiley &Sons. - New York.- 1988.- P. 19.

122. Inagaki M., Nakmura Y., Takeda M. GFAP: dynamic property and regulation by phosphorilation. // Brain Pathol. 1994. - Vol. 4. - P. 239-243.

123. Inagaki M., Nishi Y., Nishizawa K. Site-specific phosphorilation induces disassembly of vimentin filaments in vitro. // Nature. 1987. - Vol. 328. - P. 649-652.

124. Iwa N., Yutani C., Ishibashi-Ueda H., Katayama Y. Immunocytochemical demonstration of GFAP in impregnated smears of human brain tumors. // . — 1989.

125. Jacque C., Vinner C., Kujas M., et al. Determination of GFAP in human brain tumors.//J. Neurol. Sci. 1978. - Vol. 35. - P. 147.

126. Jain R. Transport of molecules across tumor vasculature. // Cancer Methastasis Rev. 1987. -N. 6. - P. 559-593.

127. Jensen K., Mirsky R. Glial fibrillary acidic polypeptides in peripheral glia. Molecular weight, heterogeneity and distribution. // J. Neuroimmunol. 1985. -Vol. 8.-P. 377-393.

128. Kirby С., Clarke J., Gregoriadis G. Cholesterol content of small unilamellar liposomes controls phospholipid loss to high density lipoproteins in the presence of serum. // FEBS Lett. 1980. - Vol. 111.- P. 324-328.

129. Kirby C., Clarke J., Gregoriadis G. Effect of the cholesterol content of small unilamellar liposomes on their stability in vivo and in vitro. // Biochem. J. -1980. Vol. 186. - P. 591-598.

130. Klibanov A., Maruyama K., Torchilin V., Huang L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. // FEBS Lett. 1990. - Vol. 268. - P. 235-237.

131. Kondo Y., Hollingworth E., Kondo S. Molecular targeting for malignant gliomas. // Int. J. Oncol. 2004. - Vol. 24. - P. 1101 -1109.

132. Kornblith P.L. Humoral immunity. In: Thomas D.G.T., Graham D.I. (eds). Brain tumors: scientific basis, clinical investigation and current therappy. -London: Butterworth, 1980. P. 133-144.

133. Koukourakis M., Koukouraki S., Fezoulidis I., et al. High intratumoral accumulation of stealth liposomal doxorubicin (Caelyx) in glioblastomas and in metastatic brain tumors. // Br. J. Cancer. 2000. - Vol. 83. - P. 1281-1286.

134. Krupp L., Chobanian A., Brecher J. The in vivo transformation of phospholipid vesicles to a particle resembling HDL in the rat. // Biochim. Biophys. Res. Commun. 1976. - Vol. 72. - P. 1251-1258.

135. Landry C.F., Ivy G.O., Brown I.R. Developmental expression of glial fibrillary acidic protein mRNA in the rat brain analyzed by in situ hybridization // J. Neurosci. — 1990. — Vol. 25. — P. 194 203.

136. Lapham L.W., Johnstone M. Cytologic and cytochemical studies of neuroglia. The DNA content of fibrous astrocytes with implication concerning the nature of the cells. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1964. - Vol. 23. - P. 419-430.

137. Laping N., Teter В., Nichols N. GFAP: regulation by hormones, cytokines, andgrowth factors. // Brain Pathol. 1994. - Vol. 1. - P. 259-275.

138. Lasic D., Martin F., Gabizon A., Huang S., Papahadjopoulos D. Sterically stabilized liposomes: a hypothesis on the molecular origin of the extended circulation times. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - Vol. 1070. - P. 187192.

139. Laws E., Taylor W., Clifton M. et al. Neurosurgical management of low-grade astrocytomas of the cerebral hemispheres. // J. Neurosurg. 1984. - Vol. 61. -P. 665-673.

140. Lazanas M., Tsekes G., Scandali A., Saroglou G. Liposomal amphotericin В for leischmaniasis treatment of AIDS patients unresponsive to antimonium compounds.//AIDS.- 1993.- N. 7.-P. 1018.

141. Lee K., Hong K., Papahadjopoulos D. Recognition of liposomes by cells: in vitro binding and endocytosis mediated by specific lipid headgroups and surface charge density. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. - Vol. 1103. - P. 185-197.

142. Lee V.-M., Page C., Wo H. et al. Monoclonal antibodies to gel-excisied glial filament protein and their reactivities with other intermediate filaments. // J. Neurochem. 1984. - Vol. 42. - P. 25-32.

143. Lendahl U., Zimmerman L., McKay R. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. // Cell. 1990. - Vol. 60. - P. 585-595.

144. Liedtke W., Edelmann W., Biery P.L., et al. GFAP is necessary for the integrity of CNS white matter architecture and long-term maintenance of myelination. // Neuron. — 1996. — V. 17. — P. 607 615.

145. Litzinger D., Buiting A., van Rooijen N., Huang L. Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic polyethyleneglycol-containing liposomes. // Biochim. Biophys. Acta. -1994. -Vol. 1190.- P. 99-107.

146. Liu D., Mori A., Huang L. Large liposomes containing ganglioside GM1 accumulate effectively in spleen. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - Vol. 1066.- P. 159-165.

147. Loughrey H., Bally M., Choi L., Cullis P. Optimized procedures for coupling of proteins to liposomes. // J. Immunol. Methods. 1990. - Vol. 132. - P. 2535.

148. Loughrey H., Bally M., Cullis P. A noncovalent method of attaching antibodies to liposomes. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - Vol. 901. - P. 157-160.

149. Loughrey H., Bally M., Reinish L., Cullis P. The binding of phosphatidylglycerol liposomes to rat platelets is mediated by complement.// Thromb. Haemost. 1990. - Vol. 64. - P. 172.

150. Lundberg В., Griffiths G., Hansen H. Specific binding of sterically stabilized anti-B-cell immunoliposomes and cytotoxicity of entrapped doxorubicin.// Int. J. Pharm. 2000. - Vol. 205 (1-2). - P. 101-108.

151. Majno G., Gilmore V., Leventhal M. On the mechanism of the vascular leakage caused by histamine-type medialores. // Circ. Res. 1976. - Vol. 21. -P. 833.

152. Majno G., Palade G. Studies of inflammation. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability. An electron microscopic study. // J. Biophys. Cytol.-1961,- N.ll.- P. 571.

153. Malloh D., Clark Т., Burnet F. GFAP in the cytoskeletal and soluble protein fractions of the developing rat brain. // J. Neutochem. 1987. - Vol. 49. - P.299.324.

154. MargoJis L. Cell interaction with solid and fluid liposomes.// Gregoriadis G.,EcL, Liposomes as drug carriers: Recent trend and progress. John Wiley &Sons. - New York. - 1988. - P. 75.

155. Martin F. Liposome technology, Inc., Internal Report. 1987.

156. Maruyama K., Kennel S., Huang L. Lipid composition is important for highly efficient target binding and retention of immunoliposomes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 5744-5748.

157. Mayer L.D., Bally M.B., Hope M.J., Cullis P.R. Uptake of antineoplastic agents into large unilamellar vesicles in response to a membrane potential. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. - Vol. 816. - P. 294-302.

158. Mayhew E., Lasic D., Babbar S., Martin F. Pharmacokinetics and antitumor activity of epirubicin encapsulated in long circulating liposomes. // Int. J. Cancer. 1992. - Vol. 80. - P. 302-309.

159. Mayhew E., Rustum Y., Szoca F., Papahadjopoulos D. Role of cholesterol in enhansing the antitumor activity of cytocine arabinoside entrapped in liposomes. // Cancer Treat. Rep. 1979. - Vol. 63. - P. 1923-1928.

160. McDonald D. Neurogenic imflammation in the rat trachea. // J. Neurocitol. -1988.-Vol.17.-P. 583-586.

161. Mencarelli C., Magi В., Marzocchi B. et al. Immunological and charge properties of GFAP in lower vertebrates. // Сотр. Biochem. Physiol. 1993. -Vol. 105B,N2.-P. 375-380.

162. Moghimi S., Patel H. Differential properties of organ-specific serum opsonins for liver and spleen macrophages. // Biochim. Biophys. Acta. 1989. - Vol. 984.- P. 379-383.

163. Moghimi S., Patel H. Techniques to study the opsonic effect of serum on uptake of liposomes by phagocytic cells from varies organs of the RES. // Gregoriadis G. Liposome Technology. Vol.3. - CRC Press, Boca Raton. — 1993.- P. 44.

164. Mori Т., Morimoto K., Hayakawa Т., et al. Radioimmunoassay of astroprotein (an astrocyte specific cerebroprotein) in cerebrospinal fluid and its clinical significance // Neurol. Med.-Chir. (Tokyo). — 1978. — Vol. 18. — P. 25 31.

165. Nakanishi K., Nakanishi M., Kukita F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia coculture system. // Brain Res. Protocols. -1999.-Vol. 4.-P. 105-114.

166. Nakatani Y., Horikoshi M., Brenner M. et al. A downstream initiation element required for efficient TATA box binding and in vitro function of TFIID. // Nature. 1990. - Vol. 348. - P.86-88.

167. Nakazato Y., Ishizeki J., et al. Localization of S100 and glial fibrillary acidic protein-related antigen in pleomorphic adenoma of salivary glands // Lab. Invest. — 1982. — Vol. 46. — P. 621 626.

168. Nathaniel E., Nathaniel D. Astroglial response to degeneration of dorsal root fibers in adult rat spinal cord. // Exp. Neurol. 1977. - Vol. 54. - P. 621-626.

169. Nathaniel E., Nathaniel D. The reactive astrocyte. // Adv. Cell Neurobiol. -1981.-Vol. 2.-P. 249-301.

170. Needham D., Mcintosh T.J., Lasic D. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. // Biochim. Biophys. Acta. -1992.-Vol. 1108.- P. 40-48.

171. Nir S., Nieva J.L. Interactions of peptides with liposomes: pore formation and fusion.//Prog. Lipid Res. -2000.- Vol.39. P. 181-206.

172. Norenberg M. Immunohistochemistry of glutamine synthetase. In: Hertz L., Kuamme E., et al. (eds). Glutamine, glutamate, and GABA in central nervous system. NY: Alan R. Liss, Inc., 1983. - P. 95-111.

173. Northfelt D.W., Martin F., Kaplan L., Russell J., Anderson M., Lang J., Volberding P. Pharmacokinetics, tumor localization and safety of Doxil in AIDS patients with Kaposi's sarcoma. // Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1993. -N.12. - P.151.

174. Ochmichen M. Enzyme-histochemical differentiation of neuroglia and microglia: a contribution to the cytogenesis of microglia and globoid cells. // Pathol. Res. Pract. 1980.-Vol. 168.-P.344-373.

175. Onteniente В., Kimura H., Maeda T. Comparative study of the glial fibrillary acidic protein in vertebrates by PAP immunohistochemistry // J. Сотр. Neurol. — 1983. — Vol. 215 P. 427-436.

176. Pagano R., Schroit A., Struck D. Liposomes from physical structure to therapeutic applications. Knight C.G., Ed., Elsevier. - Holland. - 1981. - P. 324.

177. Palfreyman L., Thomas D., Ratcliffe J., Graham D. GFAP purification from human fibrillary astrocytoma, development and validation of radioimmunoassay for GFAP-KE immunoreactivity. // J. Neurol. Sci. 1979. -V. 41.-P. 101-103.

178. Papahadjopoulos D., Cowden M., Kimelberg H. Role of cholesterol in membranes. Effects of phospholipid-protein interactions, membrane permeability and enzyme activity. // Biochim. Biophys. Acta. 1973. - Vol. 310.- P. 8-26.

179. Papahadjopoulos D., Gabizon A. Targeting of liposomes to tumor cells in vivo. // Ann. NY Acad. Sci. 1987. - Vol. 507. - P. 64-74.

180. Papasozomenos S., Shapiro S. Pineal astrocytoma— report of a case, confined to the epiphysis, with immunocytochemical and electron microscopic studies. // Cancer. 1981.-Vol. 47.-P. 99-103.

181. Park J., Hong K., Carter P., Kotts S., Shalaby R., Giltinan D., Wirth C., Asgary H., Wood W., Papahadjopoulos D. Development of anti-HER-2 immunoliposomes for breast cancer therapy. // Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. -1993. -N.12. -P. 118-122.

182. Pekny M., Leveen P., Pekna M. et al. Mice lacking GFAP display astrocytes devoid of intermediate filaments but develop and reproduce normally. // EMBO J. 1995-Vol. 14-P. 1590-1598.

183. Polak M., Haymaker w., Johnson J.E., D'Amelio J. Neuroglia and their reactions. In: Haymaker W., Adams R. (Eds.) Histology and histopathology of the nervous system. Springfield, III.: Thomas, 1982. — Vol. 1. — P. 363-480.

184. Poste G. The interaction of lipid vesicles with cultured cells and their use as carriers for drugs and macromolecules.// Liposomes in biological systems. Gregoriadis G. And Alison A., Eds., Wiley. New York. - 1980. - P. 101.

185. Pytela R., Wiche J. High molecular weight polypeptides from cultured cells are related to hog brain microtubule-associated proteins but copurify with intermediate filaments. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - Vol. 77. - P. 4808-4812.

186. Quinlan R., Moir R., Stewart M. Expression of E. coli fragments of GFAP: Characterization, assembly, properties and paracrystal formation. // J. Cell Sci. 1989.-Vol. 93.-P. 71-83.

187. Raju T.R., Bignami A., Dahl. D. GFAP in monolayer cultures of C6 glioma cells: effect of aging and dibutyryl cyclic AMP. // Brain Research. 1980. -Vol. 200.-P. 225-230.

188. Reeves S. A., Helman L.J., Allison A., el al. Molecular cloning and primary structure of human glial fibrillary acidic protein // Proc. natl. Acad. Sci. — 1989. —Vol. 86. —P. 5178 -5182.

189. Reier P.J., Stensaas L., Goth L. The astrocytic scar as an impediment to regeneration in the CNS. In: Kao C.C., Bunge R.P., Reier P.J. (eds). Spinal cord redonstruction.- NY: Raven Press, 1983. P. 163-195.

190. Richards R., Gewurz H., Siegel J., Alving C. Interaction of C-reactive protein and complement with liposomes. // J. Immunol. 1979. - Vol. 112. - P. 11851189.

191. Rossi J., Wallace B. Binding of fibronectin to phospholipid vesicles.// J. Biol. Chem. 1983. - Vol. 258. - P. 3327-3331.

192. Rostogi S., Clausen J., Fog F. Multiple-sclerosis-specific antigens in MS brain. // Acta Neurol. Scand. 1978. - Vol.57. - P. 438-442.

193. Rubinstein L. Tumors of the central nervous system. Washington, DC: Arm. Forces Inst. Pathol., 1972.

194. Rutka J., DeArmond S., Giblin J., et al. Effects of retinoids on the proliferation, morphology, and expression of GFAP of an anaplastic astrocytoma cell line. // Int. J. Cancer. 1988. - Vol. 42. - P. 419-427.

195. Rutka J.T., Murakami M., Dirks P.B., et al. Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review. // J. Neurosurg. — 1997. — Vol. 87. — P. 420 -430.

196. Ruutiainen J., Newcombe J., Salmi A. et al. Measurement of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and anti-GFAP antibodies by solid-phase radioimmunoassays. // Acta Neurol Scand. 1981 - Vol. 63 - P. 297-305.

197. Salm A.K., Hatton G.I., Nilaver G. Immunoreactive glial fibrillary acidic protein in pituicytes of the neurohypophysis. //Brain Res. — 1982. — Vol. 236. —P. 471 -476.

198. Sampson J.H., Archer G.E., Bigner D.D. Use of experimental models in neuro-oncological research. In: Clocard A., Hayward R., Hoff J.T. (eds) Neurosurgery: the specific basis of clinical practice. Vol. 1, chap. 41, p.596. Blackwell Science, Oxford.

199. Saul J., Annapragada A., Natarajan J,. Bellamkonda R. Controlled targeting of liposomal doxorubicin via the folate receptor in vitro. // J. Control Release. -2003. Vol. 92 (1-2). - P. 49-67.

200. Scherphof G., Roerdink G., Waite M., Parks J. Disintegration of phosphatidylcholine liposome in plasma as a result of interaction with highdensity lipoproteins. // Biochim. Biophys. Acta. 1978. - Vol. 542. - P. 296307.

201. Schmechel D.E. Methods of localizing cell-specific proteins in brain. In: Marangos P.J., Campbell I.C., Cohen R.M. (Eds.) Neuronal and glial proteins: Structure, function, and clinical application. — San Diego etc.: Acad. Press, 1988. —P. 69-102.

202. Schnitzer J., Franke W.W., Schachner M. Immunocytochemical demonstration of vimentin in astrocytes and ependymal cells of developing and adult mouse nervous system // J. Cell Biol. — 1981. — Vol. 90. — P. 435 — 447.

203. Seifert G., Lawson D., Wiche G. Immunolocalization of the intermediate filament-associated protein plectin at focal contacts and actin stress fibers. // Eur. J. Cell Biol. 1992. - Vol. 59. - P. 138-147.

204. Senior J., Gregoriadis G. Is half-life of circulating small unilamellar liposomes determined by changes of their permeability? // FEBS Lett. 1982. - Vol. 145. -P. 109-114.

205. Senior J.H. Fate and behaviour of liposomes in vivo: a review of controlling factors. // Crit. Rev. Therap. Drug Carrier System. 1987. - N. 3. - P. 123193.

206. Shi G, Guo W, Stephenson SM, Lee RJ. Efficient intracellular drug gene delivery using folate receptor-targeted pH-sensitive liposomes composed of cationic/ anionic lipid combinations. // J. Control Release. 2002. - Vol. 80. -P. 129-137.

207. Stewart J.C.M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. // Anal. Biochem. 1980. - Vol. 104. - P. 10-14.

208. Stewart M. Intermediate filament structure and assembly. // Curr. Opin.Cell Biol.- 1993.-Vol. 214,N 1.-P. 100-112.

209. Strik H.M., Schlueseher H.J., Seid K., Meyermann R., et al. Localization of endostatine in rat in human gliomas. // Cancer. 2001. - Vol. 91. - P. 10131019.

210. Svesjo E., George G. Evidence for endothelial cell-mediated regulation of macromolecular permeability by postcapillary venules. // Fed. Proc. 1986. -Vol. 45. - P. 89-95.

211. Szoca F., Papahadjopoulos D. Liposomes: preparation and characterization.// Liposomes: From physical structure to therapeutic applications. Knight G., Ed., Elsevier/North Holland Biomedical Press. -1981.- P. 51.

212. Tascos N., Parr J., Gonatas N. Immunocytochemical study of the glial fibrillary acidic protein in human neoplasms of the central nervous system. // Hum Pathol. 1982. - Vol. 13. - N. 5. - P. 454-458.

213. Torchilin V., Trubetskoy V., Narula J., Khaw B. // "Stealth Liposomes". Edited by Lasic D. and Martin F. CRC Press. - London. - 1995. - P. 219231.

214. Trojanowski J.Q., Lee V.M.-Y., Schlaepfer W.W. An immunohistochemical study of human central and peripheral nervous system tumors, using monoclonal antibodies against neurofilaments and glial filaments // Hum. Pathol. — 1984 —Vol. 15. —P. 248-257.

215. Tsujimura K., Tanaka J, Ando S., et al. Identification of phisphorilation sites on GFAP for cdc2 kinase and Ca calmodulin-dependent protein kinase II. // J. Biochem. 1994. - Vol. 116. - P. 426-434.

216. Urdal D., Hakomori S. Tumor-associatcd ganglio-N-triosylceramide: target for antibody-dependent, avidin-mediated drug killing of tumor cells.// J. Biol. Chem. 1980. - Vol. 255. - P. 10509.

217. Uyeda C.T., Eng L.F., Bignami A. Immunological study of the glial fibrillary acidic protein // Brain Res. — 1972 — Vol. 37. — P. 81-89.

218. Weller Т.Н., Coons A.H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954. -Vol. 86. - P. 787-794.

219. Wessel D., Flugge U.I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. // Anal. Biochem. -1984.-Vol. 138.-P. 141-143.

220. Whittle I.R., McArthur D.C., Malcom G.P., Li M., et al. Can experimental models of rodent implantation glioma be improved? A study of pure and mixed glioma cell line tumors. // J. Neurooncol. 1998. - Vol. 36. - P. 231-242.

221. Wiche G. Plectin: general overview and appraisal of its potentional role as a subunit protein of the cytomatrix. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1989. -Vol. 24.-P. 41-67.

222. Woodle M., Lasic D. Sterically stabilized liposomes. // Biochim. Biophys. Acta.-1992.-Vol. 1113.- P. 171-199.

223. Woodle M., Neuman M., Collins L., Redemann C., Martin F. Improved long circulating liposomes "Stealth" using synthetic lipids. // Proc. Int. Symp. Control Release Bioact. Mater. 1990. - Vol. 17. - P. 77-78.

224. Woodle M., Storm G., Neuman M., Jekot J., Collins L., Martin F., Szoca F. Prolonged systemic delivery of peptide drugs by long circulating liposomes; illustration with vasopressin in the Brattleboro rat. // Pharm. Res. 1992. - N. 9.-P. 260-265.

225. Woodle M.C., Papahadjopoulos D. Liposome preparation and size characterization. // Methods in Enzymology. Vol.171. - Biomembranes, part R, Fleischer S. and Packer L., Eds. - 1989. - P. 193.

226. Yang Y., Dowling J., Yu Q., et al. An essential cytoskeletal linker protein connecting actin microfilaments to intermediate filaments. // Cell. 1996. -Vol. 86.-P. 655-665.

227. Zalipsky S. Synthesis of end-group functionalized polyethylene glycol-lipid conjugate for preparation of polymer-grafted liposomes. // Bioconj. Chem. -1993.-Vol. 4.-P. 296-299.

228. Zalipsky S., Newman M., Punatambekar В., Woodle M. Model ligands linked to polymer chains on liposomal surfaces: application of a new functionalizedpolyethylene glycol-lipid conjugate. // Polym. Mater. Sci. Eng. 1993. - Vol. 67.-P. 519.

229. Zang X., Nilaver G., Stein В., et al. Immunocytochemistry of pineal astrocytes: species differences and functional implications. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1985. - Vol. 44. - P. 486-495.

Информация о работе

Яглова, Наталья Валентиновна
кандидата медицинских наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Создание стерически стабилизированной иммунолипосомальной системы на основе моноклональных антител с целью специфической доставки биологически активных веществ к клеткам-мишеням - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы