Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих РНК в клетки-мишени

Цибулькина, Елена Арнольдовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих РНК в клетки-мишени
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих РНК в клетки-мишени"

На правах рукописи

ЦИБУЛЬКИНА Елена Арнольдовна

ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК В КЛЕТКИ-МИШЕНИ

03.00.23 — биотехнология 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2008

003454286

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в лаборатории иммунохимии отдела биологической психиатрии ФГУ «Государственного научного центра социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского».

Научные руководители: академик РАМН, доктор химических наук

ШВЕЦ Виталий Иванович

академик РАМН, доктор медицинских наук ЧЕХОНИН Владимир Павлович

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАМН, доктор химических наук

СЕВЕРИН Сергей Евгеньевич

чл.-корр. РАМН, доктор медицинских наук ТЕРЕНТЬЕВ Александр Александрович

Ведущая организация: ГУ НИИ биомедицинской химии

им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится «08» декабря 2008 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В. Ломоносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.

Автореферат разослан «07» ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

А.И. Лютик

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

моноклональные антитела к основному белку миелина моноклональные антитела к нейроспецифической енолазе моноклональные антитела матричная РНК малая интерферирующая РНК основной белок миелина оптическая плотность

полиэтиленгликоль с молекулярной массой 2000 Да

конъюгированный с полиэтиленгликолем

РНК-интерференция

центральная нервная система

диметилдиоктадециламмоний бромид

1,2-дистеароил-5И-глицеро-3-фосфоэтаноламин-М-[метокси (полиэтиленгликоль)-2000]

1,2-дистеароил^/1-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Ы-[малеимидо (полиэтиленгликоль)-2000]

1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат иммуноглобулины класса G

комплекс белков, индуцирующий подавление экспрессии гена при РНК-интерференции (RNA induced silencing complex)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы

Специфичная пост-транскрипционная деградация мРНК, происходящая при РНКи, представляет собой новый многообещающий подход для направленного ингибирования экспрессии генов в клеточных культурах и т vivo. Эффекторами этого процесса являются дуплексы миРНК длиной около 21-26 п н , которые непосредственно отвечают за специфичный распад целевой мРНК. Метод РНКи считается весьма перспективным в качестве новой технологии функциональной геномики, а миРНК - потенциальными терапевтическими агентами при лечении болезней генетической этиологии [Sioud М., 2004; Sontheimer Е. J., 2005; Gil-more I.R, 2006]. Однако из-за большого молекулярного веса (~ 13 кДа) и полианиониой структуры (~ 40 отрицательно заряженных фосфатных групп) свободные миРНК не проникают через клеточную мембрану, что является главным препятствием широкого применения РНКи т vivo. В связи с этим разработка систем направленного транспорта и доставки внутрь клеток-мишеней миРНК приобретает особую актуальность в современной медицине [Akhtar S , 2007; Pirollo К. Z, 2008]

Анти-ОБМ-антитела

AHTH-NSE-aHTHTena

МАТ

мРНК

миРНК

ОБМ

ОП

ПЭГ 2000

ПЭГилиро ванный

РНКи

ЦНС

DDAB

DSPE-PEG

DSPE-PEG-M

Dil IgG RISC

В настоящей работе при выборе объекта исследования (культуры клеток-мишеней) основным доводом была возможность решить одну из первостепенных проблем нейрофар-макологии - создание систем, способных осуществлять специфический направленный транспорт лекарственных средств из системного кровотока к клеткам центральной и периферической нервных систем [Pardndge W. М., 2004].

Поскольку ОБМ является главным структурным компонентом мембраны миелинобра-зующих клеток, этот белок рассматривают в качестве ведущего маркера состояний, сопровождающихся нарушением целостности миелиновой оболочки [Чехонин В П., 2000, Laraers К. J., 1998], таких как острый демиелинизирующий процесс, рассеянный склероз, травматические повреждения головного мозга, опухолевые процессы в ЦНС, затрагивающие ее гли-альный компонент [Чехонин В. П., 2007].

Для диагностики и регуляции демиелинизации или детектирования патологического процесса можно использовать транспортные системы, специфически направленные к миели-нобразующим клеткам, в частности, к шванновским клеткам.

В настоящее время одним из наиболее популярных и эффективных методов контролируемого направленного транспорта миРНК и других биологически активных веществ к местам их специфического действия является использование липосом, или липидных везикулярных систем. Важным достоинством таких транспортных средств является возможность продления их срока жизни в кровотоке посредством введения в состав липосомных мембран конъюгатов липидов с полизтиленгликолем, т е. ПЭГилирование липосом, в результате чего происходит значительное замедление системной элиминации таких стерически стабилизированных липосом ("stealth" - липосом) [Lasic D. D., 1995].

Специфичность липосомальных транспортных систем обусловливается наличием в их структуре векторных молекул (МАТ к антигенам клеток-мишеней или белка-лиганда). Вектор является своего рода «троянским конем» [Pardndge W М., 2006] - он взаимодействует с клеточными мишенями (белковыми и иными антигенами, рецепторами, липопротеидными комплексами и т.п), что может приводить к поглощению содержимого липосомы клеткой В частности, для селективного векторного транспорта к миелинобразующим клеткам оптимальной мишенью представляется ОБМ.

Все это дает иммунолипосомальному транспорту миРНК неоценимые преимущества по сравнению с другими системами доставки нуклеиновых кислот в шванновские клетки-мишени В свете вышеизложенного актуальность выбранной темы исследования определяется крайней необходимостью в создании иммунолипосомапьных систем селективной доставки миРНК, способных подавлять синтез целевого белка в шванновских клетках

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ в рамках госбюджетной темы № 1Б-5-356 "Исследования липидов, нуклеозидов,

пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения (онкологические и вирусные болезни, возрастные патологии)", а также по проекту № 3243 аналитической ведомственной программы Рособразо-вания "Развитие научного потенциала высшей школы, 2006-2008".

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось создание ПЭГилированных иммунолипосомальных систем, способных специфически связываться со шванновскими клетками и осуществлять доставку внутрь клеток миРНК, блокирующих синтез целевого белка.

В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи:

1. Разработка способа получения ПЭГилированных липосом;

2. Разработка способа загрузки миРНК в синтезированные липосомы;

3. Подбор и тестирование иммунохимического вектора для конструирования транспортной системы;

4. Конъюгация полученных липосом с моноклональными антителами;

5. Исследование специфичности полученных иммунолипосомальных транспортных систем на фиксированной и нативной культурах клеток in vitro,

6. Оценка эффективности доставки миРНК внутрь клеток-мишеней

Научная новизна

В ходе данной работы впервые была разработана иммунолипосомальная транспортная система, способная специфически связываться со шванновскими клетками. Важно отметить, что специфическое взаимодействие ПЭГилированных иммунолипосом, векторно ориентированных анти-ОБМ-антителами, с ОБМ клеток-мишеней происходило как в условиях фиксации культуры, так и с нативными шванновскими клетками. Впервые была разработана и охарактеризована иммунолипосомальная система доставки миРНК, подавляющих синтез ОБМ в шванновских клетках. Для определения эффективности доставки миРНК в клетки-мишени впервые был разработан сэндвич-вариант твердофазного иммуноферментного анализа ОБМ в лизатах шванновских клеток.

Практическая значимость

Результаты настоящей исследовательской работы демонстрируют высокую специфичность сконструированных иммунолипосомальных контейнеров к ОБМ, презентирован-ному на шванновских клетках Это говорит о том, что разработанные ПЭГилированные им-мунолипосомы в перспективе могут найти применение в качестве препарата для диагностики заболеваний, сопровождающихся нарушением миелинизации.

В ходе работы показано, что полученные иммунолипосомальные контейнеры способны селективно доставлять миРНК в нефиксированную культуру клеток, что в будущем может быть использовано при разработке терапевтических препаратов для лечения заболеваний различной генетической этиологии.

С помощью разработанного нами сэндвич-варианта иммуноферментного анализа ОБМ в биологических жидкостях (лизаты шванновских клеток) был подтвержден факт внутриклеточной доставки миРНК посредством ПЭГилированных иммунолипосом, что вносит определенный вклад в понимание до сих пор до конца неизученных основных механизмов проникновения содержимого компартмента иммунолипосом в клетки-мишени.

Апробация работы и публикации

Основные результаты исследований были представлены на I Международной конференции «Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине» (Россия, Туапсе, 3-9 октября 2007), 6-ой Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Россия, Астрахань, 8-11 сентября 2008), а также на заседании кафедры биотехнологии факультета биоорганического синтеза и биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова и на заседании Проблемного совета ФГУ «ГНЦССП им. В.П. Сербского». По материалам диссертации опубликовано семь научных работ, отражающих основное содержание проведенных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 150 страницах печатного текста, содержит 28 рисунков и 3 таблицы; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 266 наименований

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение препарата ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных миРНК

В соответствии с целью настоящего исследования была сконструирована иммуноли-посомальная транспортная система, способная специфически доставлять миРНК в шваннов-ские клетки

Главными молекулярными компонентами липосом, как известно, являются липиды, которые при эмульгировании в водной среде образуют систему жировых пузырьков, ограниченных внешней бислойной липидной мембраной и содержащих в своем внутреннем пространстве некоторый объем водной фазы, захваченной при механическом эмульгировании.

В настоящей работе для получения катионных липосом в качестве главных липидных компонентов (рис.1) использовали фосфатидилхолин из желтков куриных яиц - пальмитои-лолеоилфосфатидилхолин, холестерин и катионный липид DDAB - диметилдиоктадеци-ламмоний бромид (Avanti Polar Lipids, Alabaster AL, USA).

Катионный липид в составе липосом обеспечивает им эффективное связывание с отрицательно заряженными молекулами миРНК. В качестве флуоресцентной метки для проведения цитохимического анализа культуры клеток к липосомам на стадии смешения липидных компонентов добавляли индикатор Dil (1,Г-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат; Fluka) (Хв01б = 549 нм, Х„С1| = 565 нм).

Для устранения основного недостатка липосом первого поколения - их быстрый клиренс из системного кровотока - в состав липосомных мембран вводили конъюгат липида с химически инертным гидрофильным полимером, DSPE-PEG - 1,2-дистеароил-^п-глицеро-3-фосфоэтаноламин-М-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] Данный липид представляет собой дистеароилфосфатидилэтаноламин, конъюгированный с ПЭГ-2000 - цепочкой полиэтиленг-ликоля с молекулярной массой 2000 Да, присоединенной к этаноламинной группе липида (рис. 2).

Рис. 2. Химическое строение молекулы производного липида DSPE-PEG. 1,2-дистеароил-1и-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Ы-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000]

За счет цепочек ПЭГ на внешней оболочке липосомы образовывалась как бы дополнительная "щетина", что приводило к значительному продлению срока жизни таких стериче-ски стабилизированных липосом в кровотоке [Ьайк О. О., 1995] (рис. 3).

липосомл

ПЭГ

Рис. 3. Схема строения ПЭГилированной катионной липосомы.

Рис. 4. Схема предупреждения процесса опсониза-ции за счет наличия цепочек ПЭГ у стерически стабилизированных ("stealth") липосом.

Механизм этого явления остается до конца неизученным и предполагает, что подвижные и биохимически инертные цепочки полимера препятствуют опсонизации липосом соответствующими компонентами плазмы крови, что необходимо для последующего фагоцитоза (рис. 4).

Эффективность действия любого препарата во многом определяется "адресностью" его доставки, что особенно важно при генетической терапии миРНК, поскольку подавление экспрессии целевого белка в клетках тех органов, для которых оно не предназначено, обуславливает несостоятельность и множественные побочные действия такого рода терапии.

Для эффективного и высокоспецифичного связывания с поверхностью клетки-мишени система направленной доставки должна содержать так называемый "молекулярный адрес", обеспечивающий слияние липосомальных конструкций с мембранами клеток-мишеней для проникновения их содержимого внутрь клетки. Специфическая направленность липосомальных систем обеспечивается присоединением к 1 -2% цепочек ПЭГ молекулярных векторов. Как правило, ими являются МАТ к специфическим рецепторам на поверхности клеток-мишеней. Поскольку ОБМ является специфическим маркером шванновских клеток, в качестве иммунохимического вектора липосомальных систем были выбраны МАТ к ОБМ.

В настоящей работе для дальнейшего конъюгирования МАТ к ОБМ с липосомами в состав последних вводили малеимидное производное фосфатидилэтаноламина ОБРЕ-РЕв-М (1,2-дистеароил-^«-глицеро-3-фосфоэтаноламин-К-[малеимидо(полиэтиленгликоль)-2000]). В его молекуле малеимидная группа присоединена к терминальному звену цепочки полиэти-ленгликоля, конъюгированного с этаноламинной группой фосфолипида (рис. 5).

DSPE-PEG-M

Рис. 5. Химическое строение молекулы производного линида DSPE-PEG-M: 1,2-дистеароил-от-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Ы-[малеимидо(полиэтиленгликоль)-2000].

Отобранные в соответствии с расчетом количества липидных компонентов (фосфати-дилхолина, холестерина, DDAB, DSPE-PEG-M, DSPE-PEG, Dil) растворяли в смеси хлороформа с метанолом (9:1) в концентрации 10-20 мг суммарных липидов в 1 мл растворителя. Эти растворы смешивали в молярном соотношении 23 : 16 : 4,4 : 1 : 1,6 : 0,4. Растворитель удаляли упариванием на роторном испарителе при пониженном давлении в атмосфере аргона. Затем смесь липидов растворяли в сухом циклогексане, замораживали в жидком азоте и лиофилизовали. Все манипуляции по приготовлению липосом (за исключением кратковременных - взвешивание и т.п.) осуществляли в атмосфере аргона высокой чистоты.

Для загрузки в липосомы нуклеиновых кислот (миРНК длиной'21 п.н., блокирующие синтез ОБМ, - Syntol) за основу была выбрана методика N. Shi [Shi N., 2000]. Модификация заключалась в том, что загрузка миРНК проводилась на стадии эмульгирования липидной пленки. Обработка ультразвуком и серия циклов замораживания - оттаивания исключались за ненадобностью. Таким образом, модифицированная методика оказалась менее трудоемкой и адекватно обеспечивала выполнение поставленных задач.

Полученный липоплекс пропускали через поликарбонатные фильтры (Nucleopore) с размерами пор 400, 200, 100 и 50 нм с помощью ручного мини-экструдера (Avanti) для получения липосом определенного размера (рис. 6).

1. Смесь липидов Сушкл Лнофнлизлцня

ж1щ.л301

DDAB

2. Сухая пнпиднля пленка

Перемешивание

Рис. 6. Схема загрузки миРНК в липосомы на этапе эмульгирования липидной пленки.

После этого эмульсию ПЭГилироваииых липосом можно разбавлять до необходимых концентраций, подвергать мягкой химической модификации, операциям гель-фильтрации, центрифугирования и т п.

Количество связавшихся с липосомами миРНК определяли люминесцентным методом следующим образом: полученный препарат липосом, загруженных миРНК, подвергали ультрафильтрации через конические поликарбонатные мембраны с порогом отсечения 50 кДа (CentnFlo, Amicon, Голландия) при центрифугировании в течение 1 ч при 3000 об/мин. В ультрафильтрате определяли количество РНК с помощью коммерческой системы Quant-iT RNA Assay Kit (Invitrogen, США) и флуориметра Qubit (Invitrogen, США) Результаты показали, что в ультрафильтрате РНК обнаружено не было (предел чувствительности данной флуориметрической системы 20 нг/мл), т.е все молекулы миРНК связались с липосомами.

Конъюгацию липосом с векторным белком (МАТ) проводили малеимидным способом в соответствии со стандартной методикой [Benzinger Р., 2000]. Сохранность иммунокомпе-тенции антител на всех этапах тиолирования и конъюгации тестировали методом иммуноги-стохимии на срезах мозга крыс.

Мапеимидная группа DSPE-PEG-M, входящего в состав полученных липосом, способна связываться со свободной сульфгидрильной группой белка, образуя прочный тио-эфирный конъюгат. По этой причине молекулы белка перед конъюгацией с липосомами необходимо тиолировать, т.е. ввести в них дополнительные свободные сульфгидрильные группы. Для этого МАТ подвергали взаимодействию с 2-иминотиоланом (реактив Траута), который реагировал со свободными первичными аминогруппами белка, например, с е-аминогруппами остатков лизина, присоединяя к ним SH-содержащий радикал (рис 7).

NH'HCl

МАТ-NHo 2-иминстиолан тдрохлорид МАТ-NH-С-(С1Ь К SH

-II

моноклонапьные антитепа * ''

с Е-лминогруппами NJI I

остатков лизина

Рис. 7. Реакция тиолирования антител реактивом Траута

Реакцию проводили в атмосфере инертного газа, чтобы избежать окисления введенных сульфгидрильных групп и побочных реакций неспецифического конъюгирования Антитела инкубировали с 20-кратным молярным избытком тиолирующего агента Отделение продукта реакции проводили с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом G25 (superfine) (рис. 8 А) Контроль за движением препарата осуществляли фотометрическим детектором при X = 280 нм.

<а

Рис. 8. Хроматограмма гельфильтрации смеси тиолированных моноклональных антител к ОБМ с избытком тиолирующего агента на колонке с сефадексом 025 (А) и смеси ПЭГилированных иммунолипосом, моноклональных антител к ОБМ и стоп-реагента на колонке с сефарозой СХ-4В (Б).

Для конъюгирования с векторным белком свежеприготовленные липосомы инкубировали 12 ч со свежетиолированными антителами в темноте при слабом перемешивании в атмосфере инертного газа (рис. 9).

°ч

МлТ-Ь1Н-С-(СН;)з-5Н Аг ГС

DSPE-PEG —N

/ DSPE-PEG-M

тжопирвваимые ититепв

О,

OSPEPEG— N

О'

S—(СН;)3—С—NH—МАТ NH

Коиъюгвг антител«

С ПИПИДОМ ЛИП6ССШЫ

Рис. 9. Реакция конъюгирования малеимидного производного липида липосомы с тиолированным мо-

ноклональным антителом.

Реакцию останавливали введением 100-кратного молярного избытка (по отношению к белку) N-этилмалеимида, который блокировал оставшиеся несвязанными сульфгидрильные группы. После этого целевые иммунолипосомы отделяли от остальных компонентов реакционной смеси с помощью гель-фильтрации на колонке с сефарозой CL-4B (рис. 8 Б). Контроль за движением образца осуществляли визуально по окраске Dil.

В результате получен препарат ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных миРНК (рис. 10), размером 100 нм в виде эмульсии. Процедура приготовления таких транспортных систем была основана на методике, предложенной нидерландской группой исследователей [Kamps J.A.A.M, 2000], и оказалась вполне адекватной поставленным целям и задачам работы, о чем свидетельствуют характеристики полученного препарата.

Рис. 10. Схема строения ПЭГилированной иммунолипо-сомы, загруженной миРНК.

2. Характеристика полученного препарата иммунолипосом

2.1. Определение размера липосом Методом динамического светорассеяния на гониометре, оборудованном He-Ne лазером (Pliotocor Instruments), проводили измерение гидродинамических радиусов невекторных катионных липосом и ПЭГилированных иммунолипосом, конъюгированных с векторными антителами (рис. 11). Флуктуации интенсивности света регистрировали с помощью 288-канального коррелятора Photocor FC. Для обработки полученных данных использовали программное обеспечение Dyna LS. Величины гидродинамических радиусов рассчитывали с использованием уравнения Стокса в приближении для сферических частиц.

Рис. 11. Распределение по размерам ПЭГилиро- Рис. 12. Средние диаметры невекторных липосом ванных иммунолипосом, эмульгированных в и ПЭГилированных иммунолипосом.

фосфатно-солевом буфере рН 7,4.

Распределение по размеру ПЭГилированных невекторных катионных липосом и ПЭГилированных иммунолипосом, конъюгированных с МАТ, в обоих случаях было узким унимодальным. Средний диаметр невекторных липосом составил 70±10 нм, а ПЭГилированных иммунолипосом - 100±12 нм (рис. 12).

Важной частью настоящей работы являются разделы, посвященные методам аналитического контроля состава и качества каждого получаемого препарата ПЭГилированных им-мунолипосом, загруженных миРНК, блокирующих синтез ОБМ. Для этой цели были проведены количественные определения фосфолипидов и конъюгированного белка. Все эти методики обеспечивают высокое качество контроля и соответствуют стандартам, принятым в данной области.

2.2. Количественное определение фосфолипидов в водных эмульсиях

Определение суммарных фосфолипидов основано на спектрофотометрической регистрации окрашенных комплексных соединений, образованных молекулами липидов и ферро-тиоцианатом (роданидом) аммония. Определение фосфолипидов с тиоцианатом железа (III) позволяет избежать ненадежной процедуры кислотного разложения анализируемого препарата и последующего определения неорганического фосфата.

В работе использовали 0,1 н раствор ферротиоцианата аммония, приготовленного путем смешения гексагидрата хлорного железа и тиоцианата аммония (рис. 13).

Н,о «irr Фосфатидил-

2FeCI} X бНгО +10NH<SCN-»-2 (NHjhFe(SCN)5

г*ксагидрат хлорида жиоцианат — NHjCI форротиоцианат шал«|а(Н1) аммония _ Н2О аммония

ХЛф

Fe(SCN)3

Рис. 13. Реакция получения ферротиоцианата аммония и образование его комплекса с фосфатидил-холином для колориметрического определения фосфолипидов

Окрашенный в красный цвет ферротиоцианат аммония нерастворим в хлороформе, однако, он образует комплекс с хорошо растворимым в хлороформе фосфатидилхолином. Когда хлороформный раствор липида при комнатной температуре тщательно перемешивается с водным раствором ферротиоцианата аммония, в результате ионного взаимодействия образуется окрашенный комплекс (Хшкс = 488 нм), который распределяется между водной и органической фазами.

Предварительно строили калибровочный график для серии растворов лецитина различной концентрации в хлороформе (рис. 14)

Рис. 14. Калибровочный график для определения фосфолипидов (р<0,0001)

В указанном диапазоне оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации с коэффициентом пропорциональности, равным 0,0168 мл/мг (при длине оптического пути в измерительной кювете спектрофотометра, равной 10 мм) Линейный регрессионный анализ показал очень высокую достоверность корреляции (вероятность ее отсутствия меньше 0,0001, коэффициент определенности R2 = 0,9863), а также достаточно высокую точность анализа — коэффициент вариации в середине рассмотренного диапазона составляет 4,2%.

В ходе работы определение липидов в водных эмульсиях проводили вышеописанным методом и с тем же калибровочным графиком, но с предварительной экстракцией липидов из водной фазы Преимуществом такой экстракции является то, что она позволяет отделить ли-пиды от многих компонентов анализируемой системы, нерастворимых в органических растворителях (неорганические соли, белки и пр.).

В частности, был проанализирован препарат ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных миРНК, полученный после гельфильтрации (~ 10-тикратное разведение исходной эмульсии). Были взяты три аликвоты (по 50 мкл) разведенной еще в 80 раз липосомальной эмульсии. Среднее значение ОП образцов составило 0,464. Среднее значение концентрации липидов в разведенной водной эмульсии по калибровочному графику - 27,6 мкг/мл. Таким образом, количество липидов в 1 мл анализируемой эмульсии составило 22,08 мг. Истинная концентрация липидов в эмульсии при приготовлении липосом составляла 21,45 мг/мл, что лишь на 2,9 % отличается от величины, полученной в ходе количественного определения фосфолипидов. Приведенные данные показывают, что используемый метод колориметрического определения фосфолипидов с ферротиоцианатом аммония достаточно чувствителен и точен.

2.3. Определение общего белка с бицинхониновой кислотой Определение общего белка в препаратах ПЭГилированных иммунолипосом проводили с бицинхониновой кислотой по методике Р.К. Smith и R. Brown [Smith Р К, 1985, Brown R, 1989] с предварительным отделением белка от липидов при использовании коммерческой

тест-системы ВСА Protein Assay Reagent Kit 23227 фирмы Pierce (США). Метод основан на известной биуретовой реакции и на высокочувствительной спектрофотометрической регистрации образующихся окрашенных хелатных комплексов меди (I) с бицинхониновой кислотой (рис 15)

ftN

у-/ CuSOt \ / п бииинхониновая кислота

у 9M,nu \ к СН-К (2,2-6икинол»*4,4-

¿ц | дикарбоноаая кислота)

СиЗО, / \

2№ОН

2Я-СН -2НгО Я-СН Л\ Сл.

Аминокислота Медный комплекс

биурет ^ Медный комплекс

Рис. 15. Реакция образования биурста и окрашенных хелатных комплексов меди (I) с бицинхониновой кислотой для количественного определения белка

Эти комплексы характеризуются высокой экстинкцией при 562 нм, которая линейно

зависит от концентрации белка в широком рабочем диапазоне. Данный метод не допускает

использования одного и того же калибровочного графика для неодновременных анализов, но

коэффициент пропорциональности для всех графиков оказался одинаков и равен 0,0013 (при

длине оптического пути в измерительной кювете спектрофотометра, равной 10 мм) (рис. 16)

Концентрация Бедка (»чкг/мл}

Рис. 16. Калибровочный график для серии растворов бычьего сывороточного альбумина для количественного определения белка с бицинхониновой кислотой (р< 0,0001)

Для анализа были взяты три аликвоты (по 50 мкл) эмульсии ПЭГилированных имму-нолипосом, которые разводили 0,1 моль/л фосфатным буфером в 8 раз. Среднее значение ОП образцов составило 0,338 Средняя концентрация белка в разведенной пробе по калибровочному графику - 260 мкг/мл Таким образом, количество антител в 1 мл составило 1,824 мг Если учесть, что одну липосому диаметром 100 нм составляют 100 000 молекул липидов, средняя молекулярная масса липидов 760, а молекулярная масса иммуноглобулинов 150.000, зная соотношение фосфолипидов и белка в полученном препарате, можно вычислить, сколько антител приходилось на одну липосому:

м= !21Ла м

где N - число молекул, m - масса вещества, взятого согласно методике приготовления имму-нолипосом, М - молекулярная масса вещества. N липидов = 20* 10"3 * 6,02*1023/760= 16*1018 молекул N липосом= 16*1018/1*105= 16*1013 липосом N мат = 1,824*10"3 * 6,02*1023/1,5*105= 7,32*10'5 молекул N мат/ N липосом ~ 46 молекул МАТ на одну липосому

Аналогичным образом при известной молекулярной массе РНК рассчитывается число молекул миРНК, приходящихся на одну липосому:

N миРНК = 15*10"* * 6,02*1023/6,5*103 = 15*1014 молекул на партию липосом N миРНК/ N липосом ~ 10 молекул миРНК на одну липосому.

Таким образом, определение липидного и белкового состава полученного препарата ПЭГилированных иммунолипосом показало, что в среднем на одну липосому приходилось около 50 молекул конъюгированных антител и 10 молекул миРНК, что соответствует рефе-ренсным данным по использованной процедуре приготовления иммунолипосом [Lasic D. D., 1995].

2.4. Определение стабильности липосом в сывороточной среде Стабильность ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных миРНК, была проанализирована после инкубации в 50% плазме в течение 1 ч по методике Lasic D D. и соавт. [Lasic D. D, 1997] ОПсреД ультрафильтрата иммунолипосомальной эмульсии составила 0,006 единиц, в то время как ОПсред ультрафильтрата плазмы - 0,004. Флуориметрически было подтверждено отсутствие миРНК в ультрафильтрате иммунолипосом. Следовательно, разрушение иммунолипосомальных систем и высвобождение содержимого контейнеров практически не происходило. Согласно полученным данным, можно сделать вывод, что иммуно-липосомы в присутствии плазмы не разрушаются

2.5. Определение срока сохранности липосом Срок сохранности стерильных невекторных липосом, загруженных миРНК, определяли методом ускоренного старения при инкубации в термостате при 37°С в течение 3 месяцев и 2 недель. Стерилизацию липосом проводили методом фильтрования через ацетатцеллю-лозные фильтры (Millipore) с диаметром отверстий 0,22 мкм в условиях стерильного бокса.

ОПСред фильтрата липосомальной эмульсии после инкубации составила 0,005 единиц, ОПсрсд фильтрата фосфатно-солевого буфера - 0,006, из чего следует, что липосомы не разрушились. Количественное определение миРНК в ультрафильтрате липосомальной эмульсии методом флуориметрии показало отсутствие миРНК в исследуемых образцах Исходя из полученных данных согласно требованиям, установленным Фармакопейным Комитетом, срок сохранности полученного препарата липосом составляет один год.

3. Исследование специфичности ПЭГилированных иммунолипосом на культуре шванновских клеток

3.1. Иммунопероксидазный анализ препарата культуры шванновских клеток Культуру шванновских клеток, полученную из спинальных ганглиев крысиных эмбрионов на сроке гестации 19 дней [Brockes J. P.. 1980], любезно предоставили сотрудники лаборатории иммунохимии ФГУ "ГНЦ ССП им. В.П. Сербского".

Шванновские клетки являются одним из редких клеточных типов, который может быть весьма определенно фенотипически идентифицирован в культуре. Но для более точной верификации полученной культуры, а также для подтверждения наличия в клетках цито-плазматического и мембранного ОБМ и способности этого белка специфически связываться с анти-ОБМ-антителами, используемыми в настоящей работе в качестве векторных составляющих липосом, проводили иммунопероксидазный анализ как фиксированной, так и нефиксированной клеточной культуры (рис. 17).

Рис. 17. Микрофотографии фиксированной (а - опыт, б - отрицательный контроль, увеличение *400) и нефик-® сированной (в - опыт, г - отрицательный контроль, увеличение х200) культуры шванновских

клеток крысы после иммунопероксидазного окрашивания на 10 день культивирования.

Иммуноцитохимический анализ анти-ОБМ-антител, использованных в настоящей работе для синтеза иммунолипосом, показал их высокую аффинность и авидность, а также полную пригодность для применения в данных системах доставки к шванновским клеткам.

3.2. Оценка специфичности связывания препарата иммунолипосом со шванновскими клетками

Адекватность векторной функции приготовленных иммунолипосом была подтверждена в экспериментах in vitro.

Исследовали специфичность связывания препарата ПЭГилированных иммунолипосом, содержащих в липидной мембране флуоресцентный индикатор Dil и моноклональные

Г с. , .

r J0 Щ ч

> : ' 1 * ФЩ

в ф. шК

F^ J , Jß * 4

антитела к ОБМ в качестве вектора, с нефиксированными эмбриональными шванновскими клетками крысы.

Интенсивную флуоресценцию препарата нативных шванновских клеток, возбуждаемую светом с длиной волны 515-560 нм, наблюдали после инкубации с исследуемыми ПЭГилированными векторными липосомами, что обусловлено специфическим связыванием анти-ОБМ-антител на поверхности иммунолипосом с ОБМ, презентированным на мембране клеток-мишеней (рис. 18).

а, б - инкубация с препаратом ПЭГилированнных иммунолипосом, меченных Dil и конъюгирован-ных с анти-ОБМ-антителами, в течение 3 (а) и 6 (б) ч;

в - инкубация в течение 6 ч с препаратом ПЭГилированнных иммунолипосом, меченных Dil и содержащих в качестве вектора неспецифические мышиные иммуноглобулины IgG.

Важно отметить, что такое взаимодействие не наблюдалось при следующих условиях, взятых в качестве отрицательных контролей:

1. Инкубация шванновских клеток с ПЭГилированными липосомами, меченными Dil и не конъюгированными ни с какими белками (невекторные липосомы);

2. Инкубация с ПЭГилированными иммунолипосомами, меченными Dil и конъюгированными с неспецифическими мышиными иммуноглобулинами;

3. Инкубация с ПЭГилированными иммунолипосомами, меченными Dil и содержащими в качестве вектора неспецифические aHTH-NSE-антитела;

4. Преинкубация культуры со свободными анти-ОБМ-антителами (без липосом) с последующей инкубацией с ПЭГилированными иммунолипосомами, меченными Dil и содержащими в качестве вектора анти-ОБМ-антитела;

5. Инкубация культуры фибробластов с ПЭГилированными иммунолипосомами, меченными Dil и содержащими в качестве вектора анти-ОБМ-антитела.

Результаты иммунофлуоресцентного анализа показали, что малеимидный метод связывания ПЭГилированных липосом с анти-ОБМ-антителами, используемый в настоящей работе, обеспечивает сохранность иммунокомпетентности конъюгированного вектора.

Кроме того, доказана специфичность связывания иммунолипосомальных систем со шванновскими клетками без нарушения их жизнеспособности, обусловленная аффинным

Рис. 18. Микрофотографии культуры эмбриональных шванновских клеток крысы (увеличение х400, флуоресдентная окраска индикатором Dil):

взаимодействием между иммунохимическим вектором липосом (МАТ к ОБМ) и ОБМ, пре-зентированным на поверхности шванновских клеток.

Результаты проведенных исследований т vivo по определению токсичности катион-ного липида DDAB и катионных невекторных липосом, содержащих DDAB [Якушев В.А , 2007], демонстрируют, что используемое в настоящей работе количество катионного липида DDAB при получении иммунолипосом нетоксично. В экспериментах in vitro было установлено, что внесение катионных иммунолипосомальных систем, содержащих DDAB в предусмотренном методикой количестве, не влияет на выживаемость шванновских клеток

Таким образом, следует отметить в качестве достоинства полученной иммунолипосо-мальной транспортной системы ее безопасность для живых клеток

Резюмируя вышесказанное, следует сделать вывод о том, что конъюгация монокло-нальных анти-ОБМ-антител с ПЭГилированными липосомами позволяет создать высокоспецифичную безопасную контейнерную систему, способную направленно доставлять диагностические и лекарственные препараты к шванновским клеткам

Нет сомнений, что решение этой задачи открывает перспективы создания диагностических и лекарственных препаратов векторного типа действия, способных специфически воздействовать на ОБМ-продуцирующие клетки центральной и периферической нервной системы, вовлеченные в патологический процесс.

3.3. Иммунолипосомальная доставка миРНК, подавляющих синтез ОБМ, в шванновские клетки Для направленной доставки миРНК в шванновские клетки была сконструирована

транспортная система, представляющая собой ПЭГилированные иммунолипосомы, вектор-

но-ориентированные моноклональными антителами к ОБМ, которые загружали препаратом

миРНК, специфически подавляющих синтез ОБМ в клетках.

Эффективность доставки в шванновские клетки препарата, загруженного в

ПЭГилированные иммунолипосомы, оценивали по физиологическому ответу клеток-

мишеней на проникновение в них миРНК, — непосредственно по снижению уровня синтеза

ОБМ (рис. 19).

<1пуск.1ет механизм РНКи в клетг.е

Рлсплетлние дуплец ,i миРНК. •:>.1Н|||м.в.1име i.iPHK клетки

Пространственно« затруднение связывания рибосомы с мРНК

ИЛИ —1

Разрезание и деградация мРНК-мишени ;

Трансляция нРНК

' целееой.,белк'а

комппем^нтлрнои ипедйолтепыкнтн мРНК

Рис. 19. Схема подавления синтеза целевого белка при запуске миРНК механизма РНК-интерференции.

Для определения концентрации ОБМ в лизате шванновских клеток нами был разработан сэндвич-вариант иммуноферментного анализа (рис. 20). При этом на подложке лунок 96-луночного планшета (Sarsdedt, USA) иммобилизовали поликлональные антитела человека к ОБМ, полученные из сыворотки крови пациентов с рассеянным склерозом при проведении терапевтической процедуры плазмофереза. В качестве стандартного антигена для построения калибровочной прямой использовали нативный ОБМ (полученный ранее в нашей лаборатории [Чехонин В. П., 2007]) в концентрациях от 0,25 до 32 нг/мл, шестикратно измеряя оптическую плотность при каждом варианте концентрации. В качестве вторых антител использовали моноклональные анти-ОБМ антитела мыши, с которыми реагировали антивидовые (к IgG мыши) антитела козы, конъюгированные с пероксидазой VI типа из хрена (Sigma, USA).

W 1 vjt^ I=> Ж

Рис. 20. Сэндвич-вариант иммуноферментного анализа ОБМ.

1. Адсорбция поликлональных антител к ОБМ на твердой фазе.

2. Внесение образцов биологических жидкостей (лизаты шванновских клеток); комплементарное связывание молекулы ОБМ с поликлональными антителами к ОБМ.

3. Внесение МАТ к ОБМ; их комплементарное связывание с ОБМ из лизата шванновских клеток. Внесение конъюгата антивидовых антител к IgG с пероксидазой.

4. □ Внесение субстратной смеси и О изменение цвета субстратной смеси, регистрируемое фотометром.

Количество связанного конъюгата оценивали с помощью хромогенного субстрата ор-/ио-фенилендиамина. При этом интенсивность окрашивания субстратной смеси пропорцио-

пальца количеству антигена в лизате клеток. ОП продукта ферментативной реакции измеряли при длине волны 450 нм с помощью многоканального спектрофотометра «Е1х 800» («Bio Тек Instruments Inc », USA)

Калибровочный график по стандартному антигену представляет собой линейную зависимость ОП от концентрации ОБМ в исследуемом образце. Рабочий диапазон определен в интервале концентраций ОБМ от 0,5 до 16 нг/мл (рис. 21).

Рис. 21. Калибровочный график иммуноферментного определения ОБМ

С помощью сэндвич-варианта иммуноферментного анализа определили концентрацию ОБМ в образце лизата двух миллионов шванновских клеток после инкубации с ПЭГилированными иммунолипосомами, векторно-ориентированными анти-ОБМ-антителами и нагруженными препаратом миРНК, которые подавляют синтез ОБМ. Иммуно-липосомы вносили из расчета 1 мл готовой эмульсии на 2х106 клеток культуры. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева Среднее значение концентрации ОБМ составило 0,93 ± 0,02 нг/мл (п=4), что в 10 раз меньше значений, полученных в следующих контрольный системах:

• лизат 2 млн шванновских клеток после инкубации с иммунолипосомами, конъюгирован-ными с неспецифическими IgG мыши (использованными вместо специфического имму-нохимического вектора) и загруженными миРНК, - 9,55 ± 0,27 нг/мл;

• лизат 2 млн нативных шванновских клеток (без внесения липосом) - 9,05 ±0,18 нг/мл;

• лизат 2 млн шванновских клеток после инкубации со свободными миРНК (без системы доставки) - 9,43 ± 0,28 нг/мл

В ходе этого эксперимента было установлено, что степень подавления синтеза ОБМ зависела от дозы липосом, загруженных миРНК (точнее, от соотношения их количества и количества клеток). Для выяснения этого обстоятельства одинаковое количество полученных иммунолипосом вносили в клеточные препараты, содержавшие 2 млн и 4 млн шванновских клеток. Концентрации ОБМ в этих лизатах составили 0,93 ± 0,02 и 3,50 ± 0,14 нг/мл, соответственно.

Представленные результаты доказывают, что полученный препарат ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных миРНК, за счет векторной ориентации, определяемой анти-ОБМ-антителами, способен специфически доставлять нуклеиновые кислоты к живым клеткам-мишеням, а также способствует проникновению миРНК внутрь клеток. Важно отметить, что доставленные миРНК сохраняют способность специфически ингибировать трансляцию ОБМ, т.е после высвобождения из липосом они запускают в клетках механизм РНК-интерференции, что приводит к 90%-ному подавлению синтеза целевого белка

Резюмируя вышесказанное, следует сделать вывод о том, что технология получения векторных иммунолипосомальных систем позволяет создать высокоспецифичный контейнерную транспортную систему, способную направленно доставлять нуклеиновые кислоты в шванновские клетки. При этом факт внутриклеточной доставки малых интерферирующих РНК подтверждается детектированием 10-кратного снижения интенсивности биосинтеза целевого белка. Есть основания предполагать, что подобные системы окажутся эффективными при диагностике и лечении заболеваний, связанных с патологией миелина, таких как острый демиелинизирующий процесс, рассеянный склероз, травматические повреждения головного мозга, глиальные опухоли [Чехонин В П., 2007].

Кроме того, разработанная система направленной доставки миРНК может быть использована в дальнейшем в качестве модели при создании терапевтических препаратов для лечения заболеваний различной генетической этиологии. Поскольку для большинства таких болезней уже идентифицированы конкретные белковые системы, нарушение функций которых способно инициировать патологический процесс, возможно проводить коррекции белкового метаболизма на генетическом уровне, что позволило бы получить длительный терапевтический эффект.

Весьма перспективными представляется лечение миРНК опухолевых заболеваний. Например, при раке молочной железы с помощью соответствующих миРНК проводить блокаду синтеза белка межклеточного вещества тенасцина С и транскрипционного фактора БОХ4, специфических для опухолевых клеток и отвечающих за развитие метастаз [Смирнов П А, 2007]. Системы доставки миРНК могут рассматриваться как основа терапевтических препаратов для повышения эффективности химиотерапии опухолевых заболеваний Например, при введении синтетических анти-МОЮ -миРНК, можно добиться восстановления чувствительности раковых клеток к цитостатику винбластину [Логашенко Е.В , 2007].

Другой областью применения липосомальных систем доставки миРНК может служить терапия сердечно-сосудистых заболеваний. Например, введение в кровяное русло липосом, загруженных дуплексами миРНК, подавляющих экспрессию гена аполипопротеина Б (АроВ), может привести к снижению уровня аполипопротеина Б - фактора, участвующего в

транспорте холестерина, что, следовательно, приведет к замедлению формирования атеро-

скперотических бляшек в сосудах [Tracy S. Zimmermann, 2006].

ВЫВОДЫ

1. Эмульсионно-экструзионная технология обработки липидной смеси из лецитина, холестерина, катионного липида, малеимидного производного фосфатидилэтаноламина и фосфатидилэтаноламина, конъюгированного с ПЭГ-2000, в молярном соотношении 23'16 4,4.1:1,6 позволяет создавать стерически стабилизированные катионные липосомы

2. Введение в состав липосом малеимидного производного фосфатидилэтаноламина позволяет проводить его конъюгацию с тиолированными моноклональными антителами к основному белку миелина для получения иммунолипосомальных контейнеров.

3. Стерически стабилизированные иммунолипосомы, векторно-ориентированные моноклональными антителами к основному белку миелина, способны специфически связываться с эмбриональными шванновскими клетками крысы, что делает возможным их применение в качестве наноконтейнеров для векторной доставки биологически активных веществ в ОБМ-продуцирующие клетки центральной и периферической нервной системы

4 Технология пассивной загрузки малых интерферирующих РНК позволяет ввести в иммунолипосомы не менее 0,714 мкг миРНК на 1 мг суммарных фосфолипидов (не менее 10 молекул миРНК на одну липосому).

5. Стерически стабилизированные иммунолипосомы, загруженные миРНК, способны осуществлять направленную доставку нуклеиновых кислот в шванновские клетки, что предполагает эффективность подобных систем для диагностики и лечения заболеваний, ассоциированных с патологией миелина, а также при заболеваниях различной генетической этиологии.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Чехонин В П., Жирков Ю А., Турина О И., Дмитриева Т Б , Цибулькина Е А. Монокло-нальные антитела к нейроспецифическим антигенам как векторы при транспортировке микроконтейнерных систем к клеткам-мишеням нервной ткани Глава в книге: Чехонин В.П, Турина О.И., Дмитриева Т Б "Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам". М: ОАО "Издательство "Медицина" - 2007. - 344 с ил.

2. Чехонин В.П , Дмитриева Т Б , Жирков Ю.А , Цибулькина Е А . Буланов К А., Рябинина А Е, Павлов К.А, Швец В.И. Направленный транспорт генетического материала в мозг // Биотехнология. - 2007. - №5. - С. 14-23.

3. Чехонин В П , Цибулькина Е А.. Рябинина А Е , Жирков Ю.А., Савченко Е.А., Швец В.И. Иммунолипосомальные контейнеры как системы направленного транспорта малых ин-

терферирующих РНК в шванновские клетки.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2008.-Т. 145. -№ 10.-С. 431-435.

4. Чехонин В.П., Турина О И., Ухова О В., Рябинина А.Е , Пибулькина Е.А., Жирков Ю А. Иммунолипосомы, конъюгированные с полиэтиленгликолем, специфичные к обкладоч-ным глиальным клеткам обонятельного эпителия // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2008.-Т 145.-№4. - С. 427-431.

5. Чехонин В.П., Буланов К.А., Юсубалиева Г М., Цибулькина Е.А.. Швец В.И. Исследование биодеградации меченных 1251 моноклональных антител при системном введении крысам с экспериментальной глиомой Сб. // Биомедицинская химия. - 2007. - Т. 53. - Вып. 5. -С. 532-540.

6. Жирков Ю А , Рябинина А.Е., Лохонина А В., Цибулькина Е.А , Максимова М.А., Павлов К А, Ухова О В., Семенова A.B. Направленный транспорт ПЭГилированных липосом в клетки-мишени.// Программа и тезисы докладов I Международной конференции «Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине». -Туапсе, 3-9 октября 2007. - С 54.

7. Чехонин В.П , Цибулькина Е.А.. Рябинина А Е , Жирков Ю.А., Савченко Е А , Швец В.И. Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих РНК, блокирующих синтез основного белка миелина в шванновских клетках.// Материалы 6-й Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины».//Астраханский медицинский журнал - 2008. -№3.- С. 51-55.

Подписано в печать 05.11.2008 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.. (495) 785-00-38 www.autoref webstolica ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Цибулькина, Елена Арнольдовна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11 Доставка малых интерферирующих РНК в клетки-мишени

1.1. Механизм РНК-интерференции

1.2. Внутриклеточная интерналтзация миРНК

1.3. Вирусные системы доставки миРНК

1.3.1. Ретровирусные векторы

1.3.2. Аденовирусные векторы

1.3.3. Векторы на основе аденоассоциированных вирусов

1.3.4. Векторы на основе вируса простого герпеса

1.3.5. Векторы на основе пара- и ортомиксомирусов

1.3.6. Недостатки вирусных систем доставки препаратов

1.4. Невирусные системы доставки миРНК

1.4.1. Физические методы

1.4.2. Электрохимические методы

1.4.3. Полимеры и дендримеры

1.4.4. Биодеградабельные полимеры

1.4.5. Системы доставки миРНК на основе циклодекстрана

1.4.6. Катионные липосомы

1.4.7. Пенетрирующие клетку пептиды

1.4.8. Белковые системы доставки миРНК

1.5. Биораспределение миРНК in vivo

1.6. Способы введения миРНК in vivo

1.6.1. Системное введение миРНК

1.6.2. Локальное введение миРНК в органы и ткани

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Приборы и материалы

2.2. Методы исследования

2.2.1. Методика приготовления ПЭГилированных 55 иммунолипосом, загруженных миРНК

2.2.2. Характеристика полученного препарата иммунолипосом

2.2.3. Исследование специфичности ПЭГилированных 67 иммунолипосом на культуре шванновских клеток

2.2.4. Оценка эффективности иммунолипосомальной доставки 71 миРНК в шванновские клетки

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ 75 ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение препарата ПЭГилированных иммунолипосом, 75 загруженных миРНК

3.2. Характеристика полученного препарата иммунолипосом

3.2.1. Определение размера липосом

3.2.2. Количественное определение фосфолипидов в водных 83 эмульсиях

3.2.3. Определение общего белка с бицинхониновой кислотой

3.2.4. Определение стабильности липосом в сывороточной среде

3.2.5. Определение срока сохранности липосом

3.3. Исследование специфичности ПЭГилированных 88 иммунолипосом на культуре шванновских клеток

3.3.1. Иммунопероксидазный анализ культуры шванновских 88 клеток

3.3.2. Оценка специфичности связывания препарата 89 иммунолипосом со шванновскими клетками

3.3.3. Иммунолипосомальная доставка миРНК, подавляющих 92 синтез ОБМ, в шванновские клетки

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих РНК в клетки-мишени"

Актуальность темы

Специфичная пост-транскрипционная деградация матичной РНК (мРНК), происходящая при РНК-интерференции (РНКи), представляет собой новый многообещающий подход для направленного ингибирования экспрессии генов в клеточных культурах и in vivo. Эффекторами этого процесса являются дуплексы малых интерферирующих РНК (миРНК) длиной около 21-26 п.н., которые непосредственно отвечают за специфичный распад целевой мРНК. Метод РНКи считается весьма перспективным в качестве новой технологии функциональной геномики, а миРНК — потенциальными терапевтическими агентами при лечении болезней генетической этиологии [1-3]. Однако из-за большого молекулярного веса 13 кДа) и полианионной структуры 40 отрицательно заряженных фосфатных групп) свободные миРНК не проникают через клеточную мембрану, что является главным препятствием широкого применения РНКи in vivo. В связи с этим разработка систем направленного транспорта и доставки внутрь клеток-мишеней миРНК приобретает особую актуальность в современной медицине [4, 5].

В настоящей работе при выборе объекта исследования (культуры клеток-мишеней) основным доводом была возможность решить одну из первостепенных проблем нейрофармакологии — создание систем, способных осуществлять специфический направленный транспорт лекарственных средств из системного кровотока к клеткам центральной и периферической нервных систем [6].

Поскольку ОБМ является главным структурным компонентом мембраны миелинобразующих клеток, этот белок рассматривают в качестве ведущего маркера состояний, сопровождающихся нарушением целостности миелиновой оболочки [7, 8], таких как острый демиелинизирующий процесс, рассеянный склероз, травматические повреждения головного мозга, опухолевые процессы в ЦНС, затрагивающие ее глиальный компонент [9].

Для диагностики и регуляции демиелинизации или детектирования патологического процесса можно использовать транспортные системы, специфически направленные к миелинобразующим клеткам, в частности, к шванновским клеткам.

В настоящее время одним из наиболее популярных и эффективных методов контролируемого направленного транспорта миРНК и других биологически активных веществ к местам их специфического действия является использование липосом, или липидных везикулярных систем. Важным достоинством таких транспортных средств является возможность продления их срока жизни в кровотоке посредством введения в состав липосомных мембран конъюгатов липидов с полиэтиленгликолем, т.е. ПЭГилирование липосом, в результате чего происходит значительное замедление системной элиминации таких стерически стабилизированных липосом ("stealth" - липосом) [10].

Специфичность липосомальных транспортных систем обусловливается наличием в их структуре векторных молекул (МАТ к антигенам клеток-мишеней или белка-лиганда). Вектор является своего рода «троянским конем» [11] - он взаимодействует с клеточными мишенями (белковыми и иными антигенами, рецепторами, липопротеидными комплексами и т.п.), что может приводить к поглощению содержимого липосомы клеткой. В частности, для селективного векторного транспорта к миелинобразующим клеткам оптимальной мишенью представляется ОБМ.

Все это дает иммунолипосомальному транспорту миРНК неоценимые преимущества по сравнению с другими системами доставки нуклеиновых кислот в шванновские клетки-мишени. В свете вышеизложенного актуальность выбранной темы исследования определяется крайней необходимостью в создании иммунолипосомальных систем селективной доставки миРНК, способных подавлять синтез целевого белка в шванновских клетках.

Работа является, частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ в рамках госбюджетной темы № 1Б-5-356 "Исследования липидов, нуклеозидов, пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения (онкологические и вирусные болезни, возрастные патологии)", а также по проекту № 3243' аналитической ведомственной программы Рособразования "Развитие научного потенциала высшей школы, 2006-2008".

Цель и задачи исследования

В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи:

1. Разработка способа получения ПЭГилированных липосом;

2. Разработка способа загрузки миРНК в синтезированные липосомы;

3. Подбор и тестирование иммунохимического вектора для " конструирования транспортной системы;

4. Конъюгация полученных липосом с моноклональными антителами;

5. Исследование специфичности полученных иммунолипосомальных транспортных систем на фиксированной и нативной культурах клеток in vitro\

6. Оценка эффективности доставки миРНК внутрь клеток-мишеней.

Научная новизна

В ходе данной работы впервые была разработана иммунолипосомальная транспортная система, способная специфически связываться со шванновскими клетками. Важно отметить, что специфическое взаимодействие ПЭГилированных иммунолипосом, векторно ориентированных анти-ОБМ-антителами, с ОБМ клеток-мишеней 8 происходило как в условиях фиксации культуры, так и с нативными шванновскими клетками. Впервые была разработана и охарактеризована иммунолипосомальная система доставки миРНК, подавляющих синтез ОБМ в шванновских клетках. Для определения эффективности доставки миРНК в клетки-мишени впервые был разработан сэндвич-вариант твердофазного иммуноферментного анализа ОБМ в лизатах шванновских клеток.

Практическая значимость

Результаты настоящей исследовательской работы демонстрируют высокую специфичность сконструированных иммунолипосомальных контейнеров к ОБМ, презентированному на шванновских клетках. Это говорит о том, что разработанные ПЭГилированные иммунолипосомы в перспективе могут найти применение в качестве препарата для диагностики заболеваний, сопровождающихся нарушением миелинизации.

Апробация работы и публикации

Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Россия, Астрахань, 8 — 11 сентября 2008), а также на заседании кафедры биотехнологии факультета биоорганического синтеза и биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова и на заседании Проблемного совета ФГУ «ГНЦССП им. В.П. Сербского». По материалам диссертации опубликовано семь научных работ, отражающих основное содержание проведенных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах печатного текста; содержит 28 рисунков и 4 таблицы; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 255 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Цибулькина, Елена Арнольдовна

выводы

1. Эмульсионно-экструзионная технология обработки липидной смеси из лецитина, холестерина, катионного липида, малеимидного производного фосфатидилэтаноламина и фосфатидилэтаноламина, конъюгированного с ПЭГ-2000, в молярном соотношении 23:16:4,4:1:1,6 позволяет создавать стерически стабилизированные катионные липосомы.

4. Технология пассивной загрузки малых интерферирующих РНК позволяет ввести в иммунолипосомы не менее 0,714 мкг миРНК на 1 мг суммарных фосфолипидов (не менее 10 молекул миРНК на одну липосому).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Цибулькина, Елена Арнольдовна, Москва

1. Sioud М. Therapeutic siRNAs. //J. Trends Pharmacol. Sci. 2004. - V. 25.-Т. l.-P. 22-28.

2. Sontheimer E. J. Assembly and function of RNA silencing complexes. //J. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2005. - V. 6. - N. 2. - P. 127-138.

3. Gilmore I. R., Fox S. P., Hollinns A. J., Akhtar S. Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing. //J. Curr. Drug Deliv. 2006. - V.3. - P. 147-155.

4. Akhtar S., Benter I. F. Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo. //J. Clin Invest. 2007. - Т. 117. - N. 12. - P. 3623-3632.

5. Pirollo K. F., Chang E. H. Targeted delivery of small interfering RNA: approaching effective cancer therapies. //J. Cancer Res. — 2008. V. 68. -N. 5.-P. 1247-1250.

6. Pardridge W. M. Blood-brain barrier drug targeting: the future of brain drug development.// J. Mol Interv. 2004. V. 3. - N. 2. - P. 90-105.

7. Чехонин В. П., Турина О.И., Дмитриева Т. Б. и др. Основной белок миелина. Строение, свойства, функции, роль в диагностике демиелинизирующих заболеваний.// Вопр. мед. химии. 2000. — Т. 46. — №6.-С. 549-563.

8. Lamers К. J., de Reus Н. P., Jongen P. J. Myelin basic protein in CSF as indicator of disease activity in multiple sclerosis //J. Mult. Scler. — 1998. — V. 4.-N.3. —P. 124-126.

9. Чехонин В. П., Турина О. И., Дмитриева Т.Б. Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам. —М.: Медицина, 2007, 344 с.10. basic D. D., Martin F. Stealth liposomes. Boca Raton: CRC Press, 1995.

10. Pardridge W. M. Molecular Trojan horses for blood-brain barrier drug delivery. //J.Curr. Opin. Pharmacol. 2006. - V. 6. - N. 5. - P. 494-500.

11. Waseem T. RNA interference: a potential revolution in disease therapy. // J. Coll. Physicians Surg. Pak. 2006. - V. 16. - N. 7. - P. 491-492.

12. Sah D.W. Therapeutic potential of RNA interference for neurological disorders. // J. Life Sci. 2006. - V. 79. - N. 19. - P. 1773-1780.

13. Lee Y. S., Dutta A. MicroRNAs: small but potent oncogenes or tumor suppressors. // J. Curr. Opin. Investig. Drugs. 2006. - V. 7. - N. 6. - P. 560-564.

14. Pirollo K. F., Rait A., Zhou Q., et al. Materializing the potential of small interfering RNA via a tumor-targeting nanodelivery system. //J. Cancer Res. 2007. - V. 67. - N. 7. - P. 2938-2943.

15. Liu С. C., Shen Z., Kung, H. F., Lin M. С. M. Cancer gene therapy targeting angiogenesis: An updated review. // World J. Gastroenterol. -2006.-V. 12.-N. 43.-P. 6941-6948.

16. Akhtar S., Hughes M. D., Khan A., et al. The delivery of antisense therapeutics. //J. Adv. Drug Deliv. Rev. 2000. - V. 44. - N. 1. - P. 3-21.

17. Hughes M. D., Hussain M., Nawaz Q., et al. The cellular delivery of antisense oligonucleotides and ribozymes. //J. Drug Discov. Today. -2001.-V. 6.-N. 6.-P. 303-315.

18. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. //J. Plant Cell. 1990. - V. 2. - T. 4. - P. 279-289.

19. Fire A., Xu S., Montgomery M. K., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. // J. Nature.-1998.-V. 391.-P. 806-811.

20. Hammond S. M., Bernstein E., Beach D., Hannon G. J. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells// J. Nature. 2000. - V. 404. - N. 6775. - P. 293-296.

21. Elbashir S. M., Harborth J., Lendeckel W., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. //J. Nature. -2001.-V. 411.-N. 6836.-P. 494-498.

22. Ambros V. The functions of animal microRNAs. //J. Nature. 2004. - V. 431.-N. 7006.-P. 350-355.

23. Martin S. E., Caplen N. J. Applications of RNA interference in mammalian systems. //J. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. — 2007. V. 8. - P. 81— 108.

24. Parker J. S., Barford D. Argonaute: a scaffold for the function of short regulatory RNAs. //J. Trends Biochem. Sci. 2006. - V. 31. - P. 622-630.

25. Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., et al. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. //J. Cell 2002. - V. 110. -N. 5. - P. 563-574.

26. Song J. J., Smith S. K., Hannon G. J., Joshua-Tor L. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC sheer activity.//.!. Science. 2004. - V. 305. - N. 5689. - P. 1434-1437.

27. Rand T. A., Ginalski K., Grishin N. V., Wang X. Biochemical identification of Argonaute 2 as the sole protein required for RNA-induced silencing complex activity. //J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101.-N. 40.-P. 14385-14389.

28. Kim D.H., Rossi J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. //J. Nat. Rev. Genet. 2007. - V. 8. - P. 173-184.

29. Aigner A. Delivery systems for the direct application of siRNAs to induce RNA interference (RNAi) in vivo. //J. Biomed. Biotechnol. 2006. - V. 2006.-N. 4. -P.716-759.

30. Xie F. Y., Woodle M. C., Lu P. Y. Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. //J. Drug Discov. Today. — 2006.-V. 11.-P. 67-73.

31. Aagaard L., Rossi J. J. RNAi therapeutics: principles, prospects and challenges. //J. Adv. Drug Deliv. Rev. 2007. - V. 59. - P. 75-86.

32. Gollob J. A., Schnipper C. P., Orsini E., et al. Characterization of a novel subset of CD8(+) T cells that expands in patients receiving interleukin-12. // J. Clin Invest. 1998. - V. 102. - N. 3. - P. 561-575.

33. Bridge A. J., Pebernard S., Ducraux, A. //J. Nat. Genet. 2003. - V. 34. -N. 3.-P. 263-264.

34. Sledz C. A., Holko M., de Veer M. J., et al. Activation of the interferon system by short-interfering RNAs//J. Nat. Cell Biol. 2003. - V. 5. - N. 9. -P. 834-839.

35. Persengiev S. P., Zhu X., Green M. R. Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs).//J. RNA. 2004. - V. 10. - N. 1. - P. 12-18.

36. Kim D. H., Longo M., Han, Y., et al. Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase.//.!. Nat. Biotechnol. 2004. -V. 22.-N. 3.-P. 321-325.

37. Judge A. D., Sood V., Shaw J. R. I. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA.//J. Nat. Biotechnol. 2005. - V. 23. - N. 4. - P. 457-462.

38. Elbashir S. M., Martinez J., Patkaniowska, A., et al. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. //EMBO J. 2001. - V. 20. - P. 6877-6888.

39. Khvorova A., Reynolds A., Jayasena S. D. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias.//J. Cell. 2003. - V. 115. - P. 209-216.

40. Schwarz D. S., Hutvagner G., Du Т., et al. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex.//! Cell. 2003. - V. 115. - P. 199-208.

41. Ui-Tei K., Naito Y., Takahashi F., et al. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. //J. Nucl. Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 936-948.

42. Reynolds A., Leake D., Boese Q., et al. Rational siRNA design for RNA interference.//!. Nat. Biotechnol. 2004. - V. 22. - N. 3. - P. 326-330.

43. Nykanen A., Haley В., Zamore P. D. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway.// J. Cell. -2001.-V. 107.-P. 309-321.

44. Kretschmer-Kazemi Far R., Sczakiel G. The activity of siRNA in mammalian cells is related to structural target accessibility: a comparison with antisense oligonucleotides.//.!. Nucl. Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 4417-4424.

45. Xu Y., Zhang H. Y., Thormeyer D., et al. Effective small interfering RNAs and phosphorothioate antisense DNAs have different preferences for target sites in the luciferase mRNAs. // J. Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003.-V. 306. -P. 712-717.

46. Ryther R. C., Flynt A. S., Phillips J. A., Patton J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. //J. Gene Ther. 2005. - V. 12. - N. 1. -P. 5-11.

47. Shoji Y., Akhtar S., Periasamy A., et al. Mechanism of cellular uptake of modified oligodeoxynucleotides containing methylphosphonate linkages.//! Nucl. Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 5543-5550.

48. Hughes J., Astriab A., Yoo H., et al. In vitro transport and delivery of antisense oligonucleotides. //J. Methods Enzymol. 2000. - V. 313. - P. 342-358.

49. Yang G., Thompson J. A., Fang В., Liu J. Silencing of H-ras gene expression by retrovirus-mediated siRNA decreases transformation efficiency and tumorgrowth in a model of human ovarian cancer. //J. Oncogene. 2003. - V. 22. - N. 36. - P. 5694-5701.

50. Paez J., Montano R., Benatuil L., et al. High efficiency and long-term foreign gene expression in cultured liver sinusoidal endothelial cells by retroviral transduction. // J. Endothelium. 2006. - V. 113. — N. 4. - P. 279-285.

51. Maier P., Fleckenstein K., Li L., et al. Overexpression of MDR1 using a retroviral vector differentially regulates genes involved in detoxification and apoptosis and confers radioprotection. //J. Radiat Res. 2006. — V. 166. — N. 3. - P. 463^73.

52. Nienhuis A. W. Assays to evaluate the genotoxicity of retroviral vectors. //J. Mol Ther. 2006. - V. 14. - N. 4. - P. 459^60.

53. Мок Н. Р, Lever A. A method to estimate the efficiency of gene expression from an integrated retroviral vector. //J. Retrovirology. 2006. -V. 17.-P. 3-51.

54. Kinyanjui M. W., Ramos-Barbon D., Villeneuve A., Fixman E. D. Enhanced transduction of antigen-stimulated T lymphocytes with recombinant retroviruses concentrated by centrifugal filtration. // J. Immunol. Methods. 2006. - V. 314. - N. 2. - P. 80-89.

55. Menendez P., Wang L., Cerdan C., Bhatia M. Retroviral transduction of hematopoietic progenitors derived from human embryonic stem cells. // J. Methods Mol Biol. 2006. - V. 331. - P. 201-220.

56. Abramson J., Rozenblum G., Pecht I. Stable knockdown of MAFA expression in RBL-2H3 cells by siRNA retrovirus-delivery system. //J. Immunol. Lett. 2004. - V. 92. -N. 1, 2. - P. 179-184.

57. Barton G. M., Medzhitov R. Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. //J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99. - N. 23.-P. 14943-14945.

58. Devroe E., Silver P. A. Retrovirus-delivered siRNA. //J. BMC Biotechnol. — 2002. Y. 2.-P. 15.

59. Bunnell B. A., Morgan R. A. Gene therapy for HIV infection. //J. Drugs Today. 1996. - V. 32. - P. 209-224.

60. Lam P. Y. P., Breakefield X. O. Potential of gene therapy for brain tumors. //J. Human Mol. Genetics. 2001. - V. 10. - N. 7. - P. 777-787.

61. Storvold G. L., Gjernes E., Askautrud H. A., et al. A retroviral vector for siRNA expression in mammalian cells. //J. Mol. Biotechnol. — 2007. — V. 35.-N. 3.-P. 275-282.

62. Sun Y., Li Z., Li L. Effective inhibition of hepatitis В virus replication by small interfering RNAs expressed from human foamy virus vectors. // Int J. Mol. Med. 2007. - V. 19. - N. 4. - P.705-711.

63. Moms К. Y., Rossi J. J. Lentiviral-mediated delivery of siRNAs for antiviral therapy. //J.Gene Ther. 2006. - V. 13. - N. 6. - P. 553-558.

64. Schomber Т., Kalberer C. P., Wodnar-Filipowicz A., Skoda R. C. Gene silencing by lentivirus-mediated delivery of siRNA in human CD34+ cells. //J. Blood.-2004.-V. 103.-N. 12.-P. 4511-4513.

65. Li M., Rossi J. J. Lentiviral vector delivery of siRNA and shRNA encoding genes into cultured and primary hematopoietic cells. //J. Methods Mol. Biol.-2005. -V. 309. P. 261-272.

66. Short M. P., Choi В., Lee J., et al. Gene delivery to glioma cells in rat brain by grafting of a retrovirus packaging cell line. //J. Neurosci. Res. -1990. -V. 27. P. 427-439.

67. Mountain A. Gene therapy: the first decade. //J. Trends Biothechnol. -2000. -V. 18.-P. 119-128.

68. Caetano В. C., Bruna-Romero O., Fux В., et al. Use of adenoviral vectors as veterinary vaccines. //J. Gene Ther. 2005. - V. 12. - N. 1. - P. 73-83.

69. Sabbioni S., Callegari E., Spizzo R., et al. Anticancer activity of an adenoviral vector expressing siRNA against BK virus T-ag. //J. Cancer Gene Ther. 2007. - V. 14. - N. 3. - P. 297-305.

70. Cho-Rok J., Yoo J., Jang Y. J. Adenovirus-mediated transfer of siRNA against PTTG1 inhibits liver cancer cell growth in vitro and in vivo. //J. Hepatology. 2006. - V. 43. - N. 5. - P. 1042-1052.

71. Uchida H., Tanaka Т., Sasaki K., et al. Adenovirus-mediated transfer of siRNA against survivin induced apoptosis and attenuated tumor cell growth in vitro and in vivo. I I J. Mol. Ther. 2004. - V. 10. - N. 1. - P. 162-171.

72. Ghosh S.S., Gopinath P., Ramesh A. Adenoviral vectors: a promising tool for gene therapy. //J. Appl. Biochem. Biotechnol. 2006. - V. 133. - N. 1. - P. 9-29.

73. Shen C., Reske S. N. Adenovims-delivered siRNA. //J. Methods Mol. Biol. 2004. - V. 252. - P. 523-532.

74. Shen C., Buck A. K., Liu X., et al. Gene silencing by adenovirus-delivered siRNA.//FEBS Lett.-2003.-V. 539.-N. 1-3.-P. 111-114.

75. Benihound K., Yeh P., Perricaudet M. Adenovirus vector for gene delivery. //J. Curr. Opin. Biotech. 1999. - V. 10. - P. 440-447.

76. Mitani K., Graham F. L., Caskey С. Т., Kochanek S. Rescue, propagation, and partial purification of helper-dependent adenovirus vectors. //J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 95. - P. 3854-3858.

77. Moore M. D., McGarvey M. J., Russell R. A. Stable inhibition of hepatitis В virus proteins by small interfering RNA expressed from viral vectors. //J. Gene Med.-2005.-V. 7.-N. 7.-P. 918-925.

78. Shvetsova Z., Malik J. M. I., Michel U., et al. Promotors and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors in the rat central nervous system. //J. Exp. Phisiol. 2004. - V. 90. -N. 1. - P. 53-59.

79. Kugler S., Kilic E., Bahr M. Human synapsin-1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in adult rat brain depending on transduced area. //J. Gene Ther. — 2003.-V. 10.-P. 337-347.

80. Kugler S., Lingor P., Scholl U., et al. Differential transgene expression in brain cells in vivo and in vitro from AAV-2 vectors with small transcriptional control units. //J. Virology. 2003. - V. 311. - P. 89-95.

81. Andreansky S. S., He В., Gillespie G. Y., et al. The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors. //J. Proc. Netl. Acad. Sci. USA. 21996. - V. 93.-P. 11313-11318.

82. Latchman D. S. Herpes virus vectors for gene therapy in the nervous system. //J. Biochem. Soc. Trans. 1999. - V. 27. - P. 847-851.

83. Glorioso J. C., Bender M. A. Goins W. F., et al. Herpes simplex virus as a gene delivery vector for the central nervous system. //J. Viral Vectors. Academic Press. New York. 1995. - P. 1-23.

84. Moolnen F. L. Tumor chemosensivity conferred by inserted herpes thynidine kinase genes: paradigm for a prospective cancer control strategy. //J. Cancer Res. 1986. -V. 46.-P. 5276-5281.

85. Howard M. K., Coffin R. S., Maclean A. R., et al. Gene delivery to rat enteric neurons using herpes simplex vims-based vectors. // J. Mol. Neurosci. 1997. - V. 9. - P. 65-74.

86. Rainov N. G., Dobberstein K. U., Heidecke V., et al. Long-term survival in a rodent brain tumor model by bradykinin-enhanced intra-arterial delivery of a therapeutic herpes simplex virus vector. //J. Cancer Gene Ther. — 1998.-V. 5.-N. 3.-P. 158-162.

87. Palmer J. A., Branston R. H., Lilley С. E., et al. Development and optimization of herpes simplex virus vectors for multiple long-term gene delivery to the peripheral nervous system. // J. Virol. 2000. - V. 74. - N. 12.-P. 5604-5618.

88. Sabbioni S., Callegari E., Manservigi M. Use of herpes simplex virus type 1-based amplicon vector for delivery of small interfering RNA. //J. Gene Ther. 2007. - V. 14. - N. 5. - P. 459-464.

89. Kaneda Y. Applications of Hemagglutinating Virus of Japan in therapeutic delivery systems //J. Expert Opin. Drug Deliv. — 2008. — V. 5. — N. 2. — P. 221-233.

90. Ito M., Yamamoto S., Nimura K. Rad51 siRNA delivered by HVJ envelope vector enhances the anti-cancer effect of cisplatin. //J. Gene Med. 2005. - V. 7.-N. 8.-P. 1044-1052.

91. China О. K. Gene Therapy Drug. // J. Gen. Eng. News. 2003. - V. 6. - P. 22-30.

92. Kay M. A., Glorioso J. C., Naldini L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. // J. Nat. Med. -2001.-V. 7.-P. ЗЗ^Ю.

93. Favre D., Provost N., Blouin V., et al. Immediate and long-term safety of recombinant adeno-associated virus injection into the nonhuman primate muscle. //J. Mol. Ther. -2001. -V. 4. P. 559-566.

94. Aigner A. Nonviral in vivo delivery of therapeutic small interfering RNAs. //J. Curr. Opin. Mol. Ther. 2007. - V. 9. - N. 4. - P. 345-352.

95. Aoki M., Ishii Т., Kanaoka M., Kimura T. RNA interference in immune cells by use of osmotic delivery of siRNA. //J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - V. 341. - N. 2. - P. 326-333.

96. Huang H., Zegarra-Moro O. L., Benson D., Tindall D. Androgens repress Bcl-2 expression via activation of the retinoblastoma (RB) protein in prostate cancer cells. //J. Oncogene. 2004. - V. 23. - N. 12. - P. 21612176.

97. Usui I., Imamura Т., Huang J., et al. Cdc42 is a Rho GTPase family member that can mediate insulin signaling to glucose transport in 3T3-L1 adipocytes. //J. Biol.Chem. 2003. - V. 378. - P. 13765-13774.

98. Ling X., Li F. Silencing of antiapoptotic survivin gene by multiple approaches of RNA interference technology. //J. Biotechniques. — 2004. -V. 36.-N. 3.-P. 450-460.

99. Prud'homme G.J., Glinka Y., Khan A.S., Draghia-Akli R. Electroporation-enhanced nonviral gene transfer for the prevention or treatment of immunological, endocrine and neoplastic diseases. //J. Curr. Gene Ther. -2006. V. 6. - N. 2. - P. 243-273.

100. Prechtel A.T., Turza N.M., Theodoridis A.A., et al. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. //J. Immunol. Methods. 2006.-N. 311.-N. 1,2.-P. 139-152.

101. Bose A., Guilherme A., Robida S. I., et al. Glucose transporter recycling in response to insulin is facilitated by myosin Myolc. //J. Nature. — 2002. -V. 420.-P. 821-824.

102. North B. J., Marshall B. L., Borra M. Т., et al. The human Sir2 ortholog, SIRT2, is an NAD+-dependent tubulin deacetylase.// J. Mol. Cell. 2003. -V. 11.-P. 437-444.

103. Kakizawa Y., Furukawa S., Ishii A., Kataoka K. Organic-inorganic hybrid-nanocarrier of siRNA constructing through the self-assembly of calcium phosphate and PEG-based block aniomer. //J. Control Release. 2006. -V. 111.-N.3.-P. 368-370.

104. Porter L. A., Dellinger R. W., Tynan, J.A., et al. Human Speedy: a novel cell cycle regulator that enhances proliferation through activation of Cdk2. //J. Cell Biol. 2002. - V. 157. -N. 3. - P. 357-366.

105. Donze O., Picard D. RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase. //J. Nucl. Acids Res. 2002. - V. 30.-N. 10.: e46.

106. Kishida Т., Asada H., Gojo S., et al. Sequence-specific gene silencing in murine muscle induced by electroporation-mediated transfer of short interfering RNA.// J. Gene Med. 2004. - V. 6. - N. 1. - P. 105-110.

107. Golzio M., Mazzolini L., Moller P., et al. Inhibition of gene expression in mice muscle by in vivo electrically mediated siRNA delivery.// J. Gene Ther. 2005. - V. 12. - N. 3. - P. 246-251.

108. Akaneya Y., Jiang В., Tsumoto T. RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region. // J. Neurophysiol. 2005. - V. 93.-N. l.-P. 594-602.

109. Gary D. J., Puri N., Won Y. Y. Polymer-based siRNA delivery: perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery. //J. Control Release. 2007. - V. 121. -N. 1,2.-P. 64-73.

110. Tsubouchi A., Sakakura J., Yagi R., et al. Localized suppression of RhoA activity by Tyr31/118-phosphorylated paxillin in cell adhesion and migration. //J. Cell Biol. 2002. - V. 159. - P. 673-683.

111. Huang Y. Z., Zang M., Xiong W. C., et al. Erbin suppresses the MAP kinase pathway.// J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 1108-1114.

112. Duxbury M. S., Ito H., Benoit E., et al. RNA interference targeting focal adhesion kinase enhances pancreatic adenocarcinoma gemcitabinechemosensitivity.//J. Biochem. Biophys. Res. Commun. -2003. -V. 311. -P. 786-792.

113. Itaka K., Chung U.I., Kataoka K. Supramolecular nanocarrier for gene and siRNA delivery. //J. Nippon. Rinsho. 2006. - V. 64. - N. 2. - P. 253-257.

114. Jiang G., Park K., Kim J., et al. Hyaluronic acid-polyethyleneimine conjugate for target specific intracellular delivery of siRNA. //J. Biopolymers. 2008. - V. 89. - N. 7. - P. 635-642.

115. Swami A., Kurupati R. K., Pathak A. A. Unique and highly efficient non-viral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. //J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - V. 362. -N. 4. - P. 835541.

116. Inoue Y., Kurihara R., Tsuchida A. Efficient delivery of siRNA using dendritic poly(L-lysine) for loss-of-function analysis. //J. Control. Release.- 2008. V. 126. - N. 1. - P. 59-66.

117. Grayson A. C., Doody A. M., Putnam D. Biophysical and structural characterization of polyethylenimine-mediated siRNA delivery in vitro. //J. Pharm. Res.-2006.-V. 23.-N. 8.-P. 1868-18676.

118. LeHoux J. G., Grondin F. Some effects of chitosan on liver function in the rat. J. Endocrinology. 1993; 132: 1078-1084.

119. Howard K. A., Rahbek U. L., Liu X., et al. RNA interference in vitro and in vivo using a novel chitosan/siRNA nanoparticle system. // J. Mol. Ther.- 2006. V. 14. - N. 4. - P. 476-484.

120. Yuan X., Li L., Rathinavelu A., et al. SiRNA drug delivery by biodegradable polymeric nanoparticles. //J. Nanosc Nanotechnol. — 2006. -V. 6. — N. 9, 10.-P. 2821-2828.

121. Khan A., Benboubetra M., Sayyed P. Z., et al. Sustained polymeric delivery of gene silencing antisense ODNs, siRNA, DNAzymes and ribozymes: in vitro and in vivo studies. //J. Drug Target. — 2004. V. 12. — N. 6.-P. 393-404.

122. Heidel J. D. Administration in non-human primates of escalating intravenous doses of targeted nanoparticles containing ribonucleotide reductase subunit M2 siRNA. //J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007. -V. 104.-P. 5715-5721.

123. Bartlett D. W., Davis M. E. Impact of tumor-specific targeting and dosing schedule on tumor growth inhibition after intravenous administration of siRNA-containing nanoparticles. //J. Biotechnol. Bioeng. 2008. - V. 99. -N.4.-P. 975-985.

124. Pardridge W. M. Drug deliveiy to the brain. //J. Cereb. Blood Flow Metab. 1997.-V. 17.-P. 713-731.

125. Pardridge W. M. Blood-brain barrier drug targeting: The future of brain drug development. //J. Mol. Interv. 2003. - V. 3. - P. 90-105.

126. Cerletti A., Drewe J., Flicker G., et al. Endocytosis and transcytosis of an immunoliposome-based brain drug deliveiy system. //J. Drug Target. — 2000. V. 8. - N. 6. - P. 435-446.

127. Gutman R. L., Peacock G., Lu D. R. Targeted drug deliveiy for brain cancer treatment.// J. Control. Release. 2000. - V. 65. - N. 1-2. - P. 3141.

128. Huwyler J., Wu D., Pardridge W. M. Brain drug delivery of small molecules using immunoliposomes. // J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996.-V. 93.-P. 14164-14169.

129. Чехонин В. П., Жирков Ю. А., Дмитриева Т. Б. Направленная доставка лекарственных средств в мозг. // Вестник Российской АМН. -2006.-Т. 8.-С. 30-37.

130. Fattal E., Dubernet C., Couvreur P. Liposome-based fonnulations for the delivery of oligonucleotides. // J. S.T.P. Pharma Sciences. — 2001. — V. 11. -P. 31-44.

131. Дудниченко А. С., Краснопольский Ю. M., Швец В. И. Липосомальные лекарственные препараты в эксперименте и клинике. — Харьков.: Изд. «РА-Каравелла», 2001. 144 с.

132. Дудниченко А. С., Швец В. И., Темиров Ю. П., Краснопольский Ю. М. // Способ получения липосомальной формы противоопухолевого цитостатика. Патент Украины. — 1995; 6700.

133. Way К. J. Liposomal amphotericin В. //J. of Infection. 1994. -V. 28. -N. l.-P. 35-43.

134. Eckardt I. R., Campbell E., Burris H. A., et al. Phase II trial of Dauno Home, liposome-encapsulated daunomycin in patient with metastatic adenocarcinoma of the colon. // Amer. J. of clinical oncology. — 1994. — V. 17.-N. 6.-P. 498-501.

135. Lappalainen K., Jaaskelainen I., Syrjanen K., et al. Comparison of cell proliferation and toxicity assays using two cationic liposomes. //J. Pharm. Res. 1994.- V. 11.-P. 1127-1131.

136. Dokka S., Toledo D., Shi X., et al. Oxygen radical-mediated pulmonary toxicity induced by some cationic liposomes. //J. Pharm. Res. 2000. - V. 17.-P. 521-525.

137. Godbey W. Т., Mikos A. G. Recent progress in gene delivery using non-viral transfer complexes. //J. Control. Release. 2001. - V. 72. — P. 115125.

138. Feigner J. H., Kumar R., Sridhar C. N., et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. //J. Biol. Chem. 1994. -V. 269. - P. 2550-2561.

139. Hofland H. E. J., Shephard L., Sullivan S. M. Formation of stable cationic lipid/DNA complexes for gene transfer. // J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1996. V. 93. - P. 7305-7309.

140. Riu E., Grimm D., Huang Z., Kay M. A. Increased maintenance and persistence of transgenes by excision of expression cassettes from plasmid sequences in vivo. II J. Hum Gene Ther. 2005. - V. 16. - N. 5. - P. 558570.

141. Filion M. C., Phillips N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. //J. Biochim. Biophys. Acta. 1997. - V. 1329. - P. 345-356.

142. Greco O., Marples В., Dachs G. U., et al. Novel chimeric gene promoters responsive to hypoxia and ionizing radiation. // J. Gene Ther. 2002. - V. 9.-P. 1403-1411.

143. Huang L., Viroonchatapan E. Nonviral Vectors for Gene Therapy. //San Diego, CA: Academic Press. 1999. - P. 3-22.

144. Freimark B. D., Blezinger H. P., Florack V. J., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. //J. Immunol. — 1998. -V. 160.-P. 4580-4586.

145. Han S. E., Kang H., Shim G. Y., et al. Novel cationic cholesterol derivative-based liposomes for serum-enhanced delivery of siRNA. //Int. J. Pharm. 2008. - V. 353. - N. 1-2 - P. 260-269.

146. Zhang C., Tang N., Liu X., et al. siRNA-containing liposomes modified with polyarginine effectively silence the targeted gene. // J. Control. Release. -2006.-V. 112.-N. 2.-P. 229-39.

147. Yang D., Buchholz F., Huang Z., et al. Short RNA duplexes produced by hydrolysis with Escherichia coli RNase III mediate effective RNA interference in mammalian cells.//J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. -V. 99.-P. 9942-9947.

148. Leirdal M., Sioud M. Gene silencing in mammalian cells by preformed small RNA duplexes./Л. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - V. 295.-P. 744-748.

149. Zhang D., Li F., Weidner D., et al. Physical and functional interaction between myeloid cell leukemia 1 protein (MCL1) and Fortilin. The potential role of MCL1 as a fortilin chaperone. // J. Biol. Chem. 2002. — V. 277.-P. 37430-37438.

150. Troussard A. A., Mawji N. M., Ong C., et al. Conditional knock-out of integrin-linked kinase demonstrates an essential role in protein kinase B/Akt activation. //J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 22374-22378.

151. Leu Y. W., Rahmatpanah F., Shi H., et al. Double RNA interference of DNMT3b and DNMT1 enhances DNA demethylation and gene reactivation. //J. Cancer Res. 2003. - V. 63. - P. 6110-6115.

152. Potente M., Fisslthaler В., Busse R., Fleming I. 11,12-Epoxyeicosatrienoic acid-induced inhibition of FOXO factors promotes endothelial proliferation by down-regulating p27Kipl. //J. Biol. Chem. 2003. - V. 278.-P. 29619-29625.

153. Gaggar A., Shayakhmetov D. M., Lieber A. CD46 is a cellular receptor for group В adenoviruses. //J. Nat. Med. 2003. - V. 9. - P. 1408-1412.

154. Sorensen D. R., Leirdal M., Sioud M. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNAs in adult mice.//J. Mol. Biol. 2003. - V. 327. - P. 761-766.

155. Verma U. N., Surabhi R. M., Schmaltieg A. Small interfering RNAs directed against beta-catenin inhibit the in vitro and in vivo growth of colon cancer cells. //J. Clin. Cancer Res. 2003. - V. 9. - P. 1291-1300.

156. Cardoso A. L., Simoes S., de Almeida L. P. siRNA delivery by a transferrin-associated lipid-based vector: a non-viral strategy to mediate gene silencing. // J. Gene Med. 2007. - V. 9. -N. 3. - P. 170-183.

157. Sato A., Takagi M., Shimamoto A., et al. Small interfering RNA delivery to the liver by intravenous administration of galactosylated cationic liposomes in mice. //J. Biomaterials. 2007. - V. 28. - N. 7. - P. 14341442.

158. Drin G., Cottin S., Blanc E., et al. Studies on the internalization mechanism of cationic cell-penetrating peptides. //J. Biol. Chem. — 2003. — V. 278.-N. 33.-P. 31192-31201.

159. Richard J. P., Melikov K., Vives E., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.//J. Biol. Chem. — 2003. — V. 278. -N. l.-P. 585-590.

160. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., et al. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. //J. Nucl. Acids Res. — 1997. -V. 25. P. 2730-2736.

161. Simeoni F., Morris M. C., Heitz F., Divita G. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells.//J. Nucl. Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 2717-2724.

162. Zeng Y., Cullen B. R. RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm.//J. RNA. 2002. - V. 8. - N. 7. - P. 855-860.

163. Muratovska A., Eccles M. R. Conjugate for efficient delivery of short interfering RNA (siRNA) into mammalian cells. //J. FEBS Lett. 2004. -V. 558.-P. 63-68.

164. Chiu Y.L., Ali A., Chu C. Y., et al. Visualizing a correlation between siRNA localization, cellular uptake, and RNAi in living cells.//J. Chem. Biol. -2004. V. 11.-N. 8.-P. 1165-1175.

165. Davidson T. J., Harel S., Arboleda V. A., et al. Highly efficient small interfering RNA delivery to primary mammalian neurons induces MicroRNA-like effects before mRNA degradation. //J. Neurosci. 2004. — V. 24.-N. 45.-P. 10040-10046.

166. Minakuchi Y., Takeshita F., KosakaN., et al. Atelocollagen-mediated synthetic small interfering RNA delivery for effective gene silencing in vitro and in vivo .//J. Nucl. Acids Res. 2004. - V. 32. - N. 13: el 09.

167. Puebla I., Esseghir S., Mortlock A., et al. A recombinant HI histone-based system for efficient delivery of nucleic acids. // J. Biotechnol. — 2003. — V. 105.-P. 215-226.

168. Takei Y., Kadomatsu K., Yuzawa Y., et al. A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics. //J. Cancer Res. 2004. - V. 64.-N. 10.-P. 3365-3370.

169. Wang Y. H., Hou Y. W., Lee H. J. An intracellular delivery method for siRNA by an arginine-rich peptide. // J. Biochem. Biophys. Methods. — 2007. -V. 70. -N. 4. P. 579-586.

170. Merdan Т., Kopecek J., Kissel T. Prospects for cationic polymers in gene and oligonucleotide therapy against cancer. //J. Adv. Drug Deliv. Rev. -2002.-V. 54.-P. 715-758.

171. Yang R., Yang X., Zhang Z., et al.Single-walled carbon nanotubes-mediated in vivo and in vitro delivery of siRNA into antigen-presenting cells. //J. Gene Ther. 2006. - V. 13. - N. 24. - P. 1714-1723.

172. Derfiis A. M., Chen A. A., Min D. H., et al. Targeted quantum dot conjugates for siRNA delivery. // J. Bioconjug. Chem. 2007. - V. 18. -N. 5.-P. 1391-1396.

173. Moriguchi R., Kogure K., Akita H., et al. A multifunctional envelope-type nano device for novel gene delivery of siRNA plasmids. //Int J. Pharm. — 2005.-V. 301.-N. 1-2.-P. 277-285.

174. Kim S. H., Jeong J. H., Lee S. H., et al. PEG conjugated VEGF siRNA for anti-angiogenic gene therapy. //J. Control. Release. 2006. - V. 116. - N. 2.-P. 123-129.

175. Wen W. H., Liu J. Y., Qin W. J., et al. Targeted inhibition of HBV gene expression by single-chain antibody mediated small interfering RNA delivery. //J. Hepatology. 2007. - V. 46. - N. 1. - P. 84-94.

176. Braasch D. A., Jensen S., Liu Y., et al. RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA.//J. Biochemistry. 2003. - V. 42. - P. 7967-7975.

177. Song E., Lee S. K., Wang J., et al. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. //J. Nat. Med. 2003. - V. 9. - P. 347-351.

178. Lewis D. L., Hagstrom J. E., Loomis A. G., et al. Efficient delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice. //J. Nat. Genet. — 2002. V. 32.-P. 107-108.

179. McCaffrey A. P., Meuse L., Pham Т. Т., et al. RNA interference in adult mice. //J. Nature 2002. - V. 418. - N. 6893. - P. 38-39.

180. Zhang X., Shan P., Jiang D.,et al. Small interfering RNA targeting heme oxygenase-1 enhances ischemia-reperfusion-induced lung apoptosis.// J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - P. 10677-10684.

181. Massaro D., Massaro G. D., Clerch L. B.//Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.-2004.-V. 287.-N. 5.-P. 1066-1070.

182. Bitko V., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S. Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA. //J. Nat. Med. 2005. - V. 11.-N. 1.-P. 50-55.

183. Reich S. J., Fosnot J., Kuroki A., et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model.//J. Mol. Vis. 2003. -V. 9. - P. 210-216.

184. Nakamura H., Siddiqui S. S. Shen X., et al. RNA interference targeting transforming growth factor-beta type II receptor suppresses ocular inflammation and fibrosis. //J. Mol. Vis. 2004. - V. 10. - P. 703-711.

185. Pille J. Y., Denoyelle C., Varet J., et al. Anti-RhoA and anti-RhoC siRNAs inhibit the proliferation and invasiveness of MDA-MB-231 breast cancer cells in vitro and in vivo. //J. Mol. Ther. 2005. - V. 11. - N. 2. - P. 267274.

186. Dorn G., Patel S., Wotherspoon G., et al. siRNA relieves chronic neuropathic pain. //J. Nucl. Acids Res. 2004. - V. 32.: e49.

187. Tan P. H., Yang L. C., Shih H. C., et al. Gene knockdown with intrathecal siRNA of NMD A receptor NR2B subunit reduces formalin-induced nociception in the rat. //J. GeneTher. 2005. - V. 12. - N. 1. - P. 59-66.

188. MakimuraH., Mizuno Т. M., Mastaitis J. W., et al. Reducing hypothalamic AGRP by RNA interference increases metabolic rate and decreases body weight without influencing food intake. // BMC Neurosci. -2002. -V. 3. P. 18.

189. Thakker D. R., Natt F., Husken D., et al. Neurochemical and behavioral consequences of widespread gene knockdown in the adult mouse brain by using nonviral RNA interference. //J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -V. 101.-N. 49.-P. 17270-17275.

190. Duxbury M. S., Ito H., Benoit E., et al. RNA interference targeting focal adhesion kinase enhances pancreatic adenocarcinoma gemcitabine chemosensitivity. //J. Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003. V. 311. -P. 786-792.

191. Zender L., Hutker S., Liedtke C., et al. Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice. // J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —2003. V. 100. - P. 7797-7802.

192. Mohmmed A., Dasaradhi P. V., Bhatnagar R. K., et al. In vivo gene silencing in Plasmodium berghei—a mouse malaria model. //J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 309. - P. 506-511.

193. Hamar P., Song E., Kokeny G., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfiision injury. //J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA-2004.-V. 101. -N. 41. -P. 14883-14888.

194. Duxbury M. S., Matros E., Ito H., et al. Systemic siRNA-mediated gene silencing: a new approach to targeted therapy of cancer. //J. Ann. Surg. —2004. V. 240. - N. 4. - P. 667-674.

195. Contreras J.L., Vilatoba M., Eckstein C., et al. Caspase-8 and caspase-3 small interfering RNA decreases ischemia/reperfiision injury to the liver in mice. //J. Surgery 2004. - V. 136. - N. 2. - P. 390-400.

196. Soutschek J., Akinc A., Bramlage В., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. //J. Nature. 2004. - V. 432. -N. 7014. - P. 173-178.

197. Yano J., Hirabayashi K., Nakagawa S., et al. Antitumor activity of small interfering RNA/cationic liposome complex in mouse models of cancer. //J. Clin. Cancer Res. 2004. - V. 10. - N. 22. - P. 7721-7726.

198. Schiffelers R. M., Ansari A., Xu J., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with Iigand-targeted sterically stabilized nanoparticle. //J. Nucl. Acids Res. -2004. -V. 32. -N. 19.: el49.

199. Zimmermann T. S., Lee А. С. H., Akinc A., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. // J. Nature. — 2006. — V. 441. — P. 111114.

200. Miyawaki-Shimizu K., Presedscu D., Shimizu J., et al. siRNA-induced caveolin-1 knockdown in mice increases lung vascular prmeability via the junctional pathway. //Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2006. - V. 290.-N. 2.-P. 405-413.

201. Urban-Klein В., Werth S., Abuharbeid S., et al. RNAi-mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine (PEI)-complexed siRNA in vivo. //J. Gene Ther. 2005. - V. 12. - N. 5. - P. 461-466.

202. Pardridge W. M. Brain drug targeting: The future of brain drug development. //Cambridge, Cambridge Univ. Press. 2001.

203. Chekhonin V. P., Ryabukhin I. A., Zhirkov U. A. et al. Transport of hydrophobized fragments of antibodies through the blood-brain barrier. //J. Neuroreport. 1995. -V. 7. - P. 129-132.

204. Мок Н. P., Lever A. A method to estimate the efficiency of gene expression from an integrated retroviral vector. //J. Retro virology. — 2006. -V. 3.-P. 51-54.

205. Kinyanjui M. W., Ramos-Barbon D., Villeneuve A., Fixman E. D. Enhanced transduction of antigen-stimulated T lymphocytes with recombinant retroviruses concentrated by centrifugal filtration. //J. Immunol. Methods.-2006.-V. 314.-N. 1-2.-P. 80-89.

206. Paez J., Montano R., Benatuil L., et al. High efficiency and long-term foreign gene expression in cultured liver sinusoidal endothelial cells by retroviral transduction. //J.Endothelium. 2006. - V. 13. - N. 4. - P. 279285.

207. Menendez P., Wang L., Cerdan C., Bhatia M. Retroviral transduction of hematopoietic progenitors derived from human embryonic stem cells. //J. Methods Mol. Biol. 2006. - V. 331. - P. 201-220.

208. Schule S., Steidl S., Panitz S., et al. Selective gene transfer to T lymphocytes using coreceptor-specific MLV(HIV). pseudotype vectors in a transgenic mouse model. //J. Virology. 2006. - V. 351. - N. 1. - P. 237-247.

209. Kramm C.M., Rainov N.G., Sena-Esteves M., et al. Long-term survival in a rodent model of disseminated brain tumors by combined intrathecal delivery of herpes vectors and ganciclovir treatment. //J. Hum Gene Ther. 1996. - V. 7. - N. 16. - P. 1989-1994.

210. Rainov N.G., Dobberstein K.U., Heidecke V., et al. Long-term survival in a rodent brain tumor model by bradykinin-enhanced intra-arterial deliveryof a therapeutic herpes simplex virus vector. //J. Cancer Gene Ther. — 1998.-V. 5.-N. 3.-P. 158-162.

211. Rainov NG, Ren H. Oncolytic viruses for treatment of malignant brain tumours. //J. Acta. Neurochir. Suppl. 2003. - V. 88. -P.l 13-123.

212. Caetano B.C., Bruna-Romero O., Fux В., et al. Use of adenoviral vectors as veterinary vaccines. //J. Gene Ther. 2005. - V. 1. — P. 73-83.

213. Pardridge W.M. shRNA and siRNA delivery to the brain. //J. Adv. Drug Deliv. Rev. 2007. - V. 59. - N. 2-3. - P. 141-152.

214. Xia C.F, Zhang Y., Zhang Y., et al. Intravenous siRNA of brain cancer with receptor targeting and avidin-biotin technology.// J.Pharm. Res. — 2007. V. 24. - N. 12. - P. 2309-1236.

215. Kay M. A., Glorioso J. C., Naldini L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. //J. Nat. Med. -2001.-V. 7.-P. 33-40.

216. Favre D., Provost N., Blouin V., et al. Immediate and long-term safety of recombinant adeno-associated virus injection into the nonhuman primate muscle. //J. Mol. Ther. 2001. - V. 4. - P. 559-566.

217. Kamps J.A.A.M., Konig G. A., Velinova M.J., et al. Uptake of long-circulating immunoliposomes, directed against colon adenocarcinoma cells, by liver metastases of colon cancer. // J. Drug Target. — 2000. — V. 8. -N. 4.-P. 235-245.

218. Shi N., Pardridge W. M. Noninvasive gene targeting to the brain. // J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - N. 13. - P. 7567-7572.

219. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity .//J. Nature. — 1975. — V. 256 P. 495497.

220. Benzinger P., Martiny-Baron G., Reusch P., et al. Targeting of endothelial KDR receptors with 3G2 immunoliposomes in vitro. // J. Biochim. Biophys. Acta. -2000. -V. 1466.-N. 1-2.-P. 71-8.

221. Stewart J.C.M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate // J. Anal. Biochem. 1980. — V. 104. - P. 10-14.

222. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T. et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid // J. Anal. Biochem. 1985. - V. 150. - P. 76-85.

223. Brown R., Jarvis К., Ну land K. Protein measurement using bicinchoninic acid: elimination of interfering substances // J. Anal. Biochem. 1989. — V. 180.-P. 136-139.251. basic D.D. Liposomes in gene delivery. Boca Raton: CRC Press, 1997.

224. Brockes J.P., Raff M.C., Nishiguchi D.J., Winter J. Studies on cultured rat Schwann cells. III. Assays for peripheral myelin proteins // J. Neurocytol. — 1980. — V. 9(1). — P. 67-77.

225. Якушев B.A., Мансуров P.K. Токсичность катионных липосом in vivo. И Вестник РУДН. 2007. - Т. 3. - С. 11-12.

226. Pirollo К. F., Zon G., Rait A., et al. Tumor-targeting nanoimmunolipo-some complex for short interfering RNA delivery. //J. Hum Gene Ther. — 2006.-V. 17.-N. l.-P. 117-124.

Информация о работе

Цибулькина, Елена Арнольдовна
кандидата химических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих РНК в клетки-мишени - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы