Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание рекомбинантных антител человека против ортопоксвирусов с использованием методов фагового дисплея

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание рекомбинантных антител человека против ортопоксвирусов с использованием методов фагового дисплея"

На правах рукописи

'Р

Юн Татьяна Эвервстовна

Создание рекомбинантных антител человека против ортопоксвирусов с использованием методов фагового дисплея

03.00.03 - «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове- 2007

003160771

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

кандидат биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Локтев Валерий Борисович доктор биологических наук, профессор Дымшиц Григорий Моисеевич

Ведущая организация

НИИ молекулярной биологии н биофизики СО РАМН, г, Новосибирск

Зашита состоится «26» октября 2007 года в 9 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « 24 » сентября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Э.Г. Малыгин

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Роль антител в различных областях медицины трудно переоценить С развитием генетической инженерии стало возможным создание рекомбинантных производных моноклональных антител (МКА) К ним относятся химерные и гуманизированные АТ, которые в настоящее время применяют в терапии различных заболеваний Однако, несомненным является тот факт, что предпочтительнее использовать в терапии полностью человеческие молекулы иммуноглобулинов

В настоящее время источником для получения полноразмерных антител человека могут являться сыворотка крови человека, гибридомы на основе В-клеток человека и трансгенные мыши Однако, существует ряд ограничений в использовании этих источников для получения препаратов терапевтических антител В то же время получение антител человека возможно с использованием методологии фагового дисплея Несомненным преимуществом применения комбинаторной технологии является отсутствие необходимости использования лабораторных животных, относительная простота в исполнении, а также возможность скрининга большого количества кандидатных молекул за более короткий промежуток времени Из комбинаторных библиотек возможен отбор мини-антител человека против широкого круга антигенов, включая особо опасные вирусы Объединение в дальнейшем вариабельных доменов отобранных мини-антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в экспрессионных векторах позволяет получать полноразмерные антитела человека

Целью данной работы являлось получение на основе методов фагового дисплея одноцепочечных антител человека против инфекционного вируса натуральной оспы, штамм 1п<1-3а, конструирование и характеризация полноразмерных антител человека против ортопоксвирусов

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- отобрать из синтетической комбинаторной библиотеки одноцепочечные антитела человека против инфекционного вируса натуральной оспы, штамм М-За,

- исследовать иммунохимические и вируснейтрализующие свойства

отобранных антител,

- сконструировать полноразмерные аититела человека на основе одноцепочечных антител против ортопоксвирусов,

- исследовать иммунохимические и вируснейтрализующие свойства полученных полноразмерных антител

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые получены одноцепочечные антитела человека против вируса натуральной оспы, штамм Ind-За Определены аминокислотные последовательности полученных антител Исследовано связывание антител с различными ортопоксвирусами, включая различные штаммы вируса натуральной оспы

Получены штаммы Esherichia coli, продуцирующие растворимые одноцепочечные антитела slF4, slI6 и s2I19 специфично взаимодействующие с ортопоксвирусами Исследованы особенности продукции этих антител в клетках Б coil

Получены рекомбинангные плазмидные ДНК, pCHlF4 и pCLlF4, рСН116 и pCLlI6, рСН2119 и pCL2I19, рСНЬ9 и pCLb9, обеспечивающие продукцию в клетках млекопитающих полноразмерных человеческих антител класса IgGl, специфично взаимодействующих с ортопоксвирусами Антитела fhb9 и fhlF4 способны нейтрализовать инфекционность вируса осповакцины на культуре клеток VeroEö В случае антитела fhlF4 вируснейтрализующие свойства проявлялись только при совместной инкубации с сывороткой невакцинированного донора.

Антитело fhb9 после проверки противовирусных свойств в модельных экспериментах на животных, могло бы представлять интерес для создания на его основе иммунопрофилакгического средства, а также терапевтического препарата предупреждающего развитие поствакцинальных осложнений, и возможно, лечения ортопоксвирусных инфекций

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, получено два положительных решения о выдаче авторского свидетельства Материалы диссертации были представлены на 11 Международных конференциях 16-ой Международной конференции «Antiviral research» (Саванна, США, 2003), 17-ой Международной конференции «Antiviral research» (Туксон, США, 2004), 18-ой Международной конференции "Antiviral research" (Барселона,

Испания, 2005), 6th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, (Пущино, Россия, 2002), 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Москва, Россия, 2005), на XIII Международном вирусологическом конгрессе (Париж, 2002), 31-st FEBS Congress, Molecules in health and Disease (Стамбул, Турция 2006) VII Межгосударственная научно-практическая конференция (Оболенск, Россия 2006), 6th, 7th и 8й Meetings of the WHO Advisory Committee on Vanóla Virus Research (Женева, Швейцария, 2004, 2005 и 2006), и 1 Российской конференции Научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002)

Вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором В исследованиях, проводимых с использованием инфекционного вируса натуральной оспы в условиях специальной лаборатории с уровнем защиты BSL 3-4, вместе с автором принимали участие А А Гуськов, Е Б Сокунова, Е В Жираковская, В В Морозова, Е И Бовшик, Н В Тикунова Тестирование антител на наличие вируснейтрапюующей активности проводилось в лаборатории общей вирусологии, руководитель к м н Е Ф Беланов, в тестировании антител вместе с автором принимали участие НИ Бормотов и ЗФ Киселева Конструирование полноразмерных антител и эксперименты по эукариотической экспрессии проводились совместно с сотрудниками лаборатории инженерии белка и группы экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки института Биоорагнической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН г Москва кхн JIH Шингаровой и к б н ИВ Мерсияновой.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, включая 23 рисунка и 6 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (148 наименований)

Основное содержание работы

В данной работе с использованием технологии фагового дисплея были отобраны одноцепочечные антитела человека, специфичные к вирусу натуральной оспы, штамм Ind-За. Последующее объединение вариабельных доменов из отобранных антител с константными доменами иммуноглобулина человека привело к созданию полноразмерных антител человека против ортопоксвирусов В работе использовали неинактивированный вирус для максимального сохранения антигенного профиля, так как известно, что инактивация разрушает конформационные эпитопы вирусных белков

Все эксперименты с инфекционными штаммами вируса натуральной оспы, то есть аффинное обогащение библиотеки, отбор и исследование отобранных фаговых антител, проводили в специальной лаборатории со степенью защиты BSL 3-4, сертифицированной ВОЗ и Министерством здравоохранения РФ

Отбор одноцепочечных антител человека против вируса натуральной оспы Ind-За проводили из синтетической комбинаторной библиотеки антител человека Griffinl (Nissim А, et al, 1994), которая была любезно предоставлена Медицинским исследовательским центром (Кэмбридж, Англия)

На первом этапе проводили три раунда аффинного обогащения (биопэннинга) исходной библиотеки бактериофагами, экспонирующими одноцепочечные антитела против вируса натуральной оспы, штамм Ind-За Для того чтобы избежать отбора антител на содержащиеся в вирусных препаратах белки тканевого или клеточного происхождения, в ходе аффинной селекции использовали вирусы, наработанные на ХАО РКЭ или на культуре клеток Vero Е6 В первом и втором раундах обогащения использовали вирус, выделенный из ХАО РКЭ, а третий раунд обогащения проводили с использованием препарата вируса, наработанного на культуре клеток Vero Е6 Отбор клонов проводили с использованием препарата вируса натуральной оспы, очищенном из ХАО РКЭ Выбранный нами способ очистки ортопоксвирусных препаратов позволял получить хорошо очищенную популяцию зрелых внутриклеточных вирионов (IMV), что подтверждалось отсутствием у данных препаратов гемагглютинирующих свойств

Полученные после каждого раунда селекции поликлональные популяции фаговых антител, а также исходную библиотеку тестировали методом ИФА для оценки изменения связывания с вирусом натуральной оспы Результаты тестирования показали значительное превышение сигнала при связывании антигена фаговой популяцией, полученной после 3-го раунда селекции, над сигналом, обеспечиваемым исходной библиотекой, что подтвердило ее обогащение фагами, экспонирующими на поверхности одноцепочечные антитела специфичные к вирусу натуральной оспы, штамм 1п<1-3а (рис 1)

Рве 1 Связывание поликлональных фаговых популяций антител, полученных в результат раундов аффинного обогащения синтетической библиотеки против вируса натуральной оспы, штамм ЬЛ-За, в ИФА В качестве отрицательного контроля использовали БСА, в качестве контроля неспецифического связывания бактериофаг М13К07, не несущий на своей поверхности фрагментов антител.

В результате тестирования отдельных бактериофагов из популяции, полученной после третьего раунда селекции, против вируса натуральной оспы 1пё-За был отобран 41 клон, что составило около 15% от общей суммы протестированных клонов, продуцирующих фаговые антитела, специфично взаимодействующие с антигеном

После определения нуклеотидных последовательностей и анализа соответствующих им аминокислотных последовательностей было выявлено 8 уникальных анштел (114, 116, 213, 2119, 2146, 313, 315, 317) Анализ выведенных аминокислотных последовательностей исследуемых антител с помощью баз данных 1{£ВЬА8Т и У-Ьаве показал, что Ун-домены антител принадлежат к Уц1- и Ун3 семействам иммуноглобулинов (табл 1) Возможно, это объясняется тем фактом, что именно вариабельные домены этих семейств в составе одноцепочечных антител обладают максимальной термодинамической стабильностью (ЕшеП е1 а1,2003) У^домены полученных одноцепочечных антител

1,4

1.2 т

1 1

X ■

г о.в ^ ■ «вво-ыза

а 0,6 ■ О БСА

о & |

0,4 1 1

02 0 шп Шг\ 1-1 11 Ш

& Раунды е*лмции

принадлежат к к) (213, 2119, 2146, 313, 315, 317) и ХЗ (114, 116, 2119) подтипам и м м у но гл обули нов

Следует отметить, что гены, кодирующие пять однодепочечных антител (114, 2ЕЗ, 2!46, 315, 3!7), содержали стоп-кодон TAG а пределах FRl-района Ун-ДОмена. Однако при наработке фаговых антител в супрессорных штаммах E.coli, таких как TG1, этот кодон транслируется в глютаминовую кислоту.

Таблица I. Аминокислотные последовательности гипервариабелъных районов Vh-цепей антител и классификация кодирующих их V-генов

Клон CPR1 CDR2 CDR3 Vh-сеыейст&о* Vl-rnil

213 SYAMH WINAGHGNTKYSÜKFQG GSLRRAGPH Vhl-03 к

2146 STAMM HI NAGNGNTKYSQK FQG GSLRRAGPH Vhl-03 к

315 EYAMH WINAGNGNT KY3QKFQG GSLRRAGPH vhl-03 к

313 SV АМН WINAGNG NT KY SQKFQG RSLRAAGPH Vhl-03 к

114 SYAMH WINAGNGNT KY SÖK FQG LTRNKFKSRGH Vhl-03 к

116 SYASMS AI SGSGG S TY YADSVKG SKTIKDLIALRL Vh3-23 К

2119 5 YAMS AISGSGG ST YYAESVKG VKRSLKGTEG Vh 3 - 2 3 к

317 SYAMH VIS Y DGSM KYYADSVKG KKGKHLD vh3-30.5 к

Все отобранные фаговые антитела (114, 116, 213, 2119, 2146, 313, 315, 337) исследовали в реакциях перекрестного реагирования с различными штаммами вируса натуральной оспы lnd-3a, Butler, Brazil 131, Congo-9, Kuw-5 (рис. 2) и различными видами ортопоксвирусов: вирус осповакцины (ВОВ), вирус оспы коров (ВОК) и вирус эктромелии (ВЭ) при последовательных разведениях этих вирусов (табл. 2).

Рис. 2. 'Электрофоре грамма белков ортопоксв кругов д 15% ДСН-ПААГ. Окраска кумасси '-i-250

Дорожки: Al 1 — анрус натуральной оспы (ипаым ürazi] i3 J, культура клеток VcroEü), 2 - вирус натуральной оспы (игтакм Butler, ХАО РКЭ), 3 - вирус натуральной оспы (пгт&мм Kuw-5, культура клеток VeroE6), 4 - вирус натуральной оспы (пгт&ым Congo-9, культура клеток VcroE6), М - маркер молекулярных масс, 5 - вирус осповакцины (штамм Листер, вариант Л-ИБГ1), б - вирус натуральной оспы (пгтамч lnd-За, ХАО РКЭ).

! 2 3 J М 5 6

Результаты экспериментов показали, что каждое фаговое антитело выявляло приблизительно равные концентрации вируса разных штаммов вируса натуральной оспы и видов ортопоксвирусов, отличаясь друг от друга по связыванию исследуемых антигенов Стоит отметить, что антитела 2119 и 313 эффективнее взаимодействовали с вирусом эктромелии по сравнению с другими ортопоксвирусами. Можно предположить, что эпитопы, узнаваемые этими антителами, представлены в большем количественном отношении на этом вирусе, или конформационная представленность этих эпитопов на вирусе эктромелии наиболее удобна для связывания с отобранными антителами

Таблица 2 Свойства отобранных одноцепочечных антител против ортопоксвирусов

Клон Концентрация ортопоксвирусов в ИФА (нг/лунка) Вирус-нейтрализующая активность Бслок-мишень

ВНО ВОВ ВОК ВЭ ШЗа Вийег ВОВ ВОВ

М-З» Сопво 9 Кш»5 Вийег Впш1и ш

114 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 ,12,5 12,5 - - - -

116 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 12,5 12,5 - - - +(54-56кДа)

213 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 12,5 12,5 - - - -

2119 9,4 37,5 9,4 37,5 37,5 12,5 12,5 0,8 - - - +(27кДа)

2146 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 12,5 12,5 12,5 • - - -

313 150 150 37,5 150 150 50 50 12,5 - - - -

315 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 12,5 12,5 3,1 - - - -

317 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 12,5 12,5 12,5 - - - -

При исследовании специфичности отобранных антител с помощью иммуноблот анализа, оказалось, что два антитела из восьми были способны взаимодействовать с белками ортопоксвирусов Антитело 116 выявляло белок 54-56 кДа, а антитело 2119 - белок 27 кДа Вероятно, остальные антитела направлены к конформационным эпигонам вируса

Далее все антитела, отобранные из синтетической библиотеки по связыванию с вирусом натуральной оспы, штамм 1п<!-3а, были протестированы в реакции ингибирования бляшкообразования с использованием ВОВ (Листер,

штамм Л-ИВП) и штаммов вируса натуральной оспы Ind-За и Butler (табл 2) В этих экспериментах в качестве контроля неспецифической нейтрализации использовали фаг-помощник М13К07, не экспонирующий на своей поверхности одноцепочечное антитело В качестве положительного контроля было использовано МКА 2D5 (Ichihashi, 1996) В результате проведенных экспериментов не было обнаружено фаговых антител, способных ингибировать инфекционносгь указанных ортопоксвирусов

Известно, что одной из основных характеристик антител является степень сродства к соответствующему антигену, которая характеризуется константой аффинности Для определения констант аффинности полученных антител необходимо было получить индивидуальные молекулы не связанные с оболочечным белком бактериофага В этом случае для синтеза индивидуальных молекул одноцепочечных антител используют несупрессорные штаммы Ecoli, такие как НВ2151, BL21DE3, BL21RIL, транслирующие TAG, находящийся в структуре антитела перед белком рШ бактериофага, как сгоп-кодон (рис 3) Были проведены эксперименты по выбору штамма Е colt, для экспрессии одноцепочечных антител в растворимой форме, в результате которых было определено, что наиболее оптимальным несупрессорным штаммом Е coli является НВ2151 Было также отмечено, что необходимо подбирать экспериментально время культивирования каждого рекомбинантного штамма после индукции ИПТГ для получения максимально возможного урожая белка и наиболее удобной его локализации в клеточном компартменте

Так как из восьми полученных антител пять содержали сгоп-кодон TAG в первом каркасном регионе, для получения растворимых молекул можно было использовать фагмиды, кодирующие антитела 116,2119 и 317

Кроме того, в экспериментах использовали фагмиду, кодирующую антитело 1F4 Это антитело было ранее отобрано из этой же библиотеки Griffinl, по способности связывать ВОВ и способное взаимодействовать с вирусами натуральной оспы, штаммы Ind-За и Butler

После трансформации клеток Е coli штамм НВ2151 фагмидами, содержащими гены, кодирующие последовательности вариабельных доменов одноцепочечных

антител 1F4, 116, 2119 и 317, были получены рекомбинантные штаммы Ecoli, НВ2151 /pHEN-s 116, НВ2151 /pHEN-s2I19, HB2151/pHEN-s3I7 и HB2151/pHEN-slF4

Рис 3 Схема фагмиды pHEN-scFv, содержащей ген одноцепочечного антитела. Указаны сайты для эцдонукпеаз рестрикции Sfll, Notl и EcoRI, промотор лакгозного оперона Р lac Z, место посадки рибосом RBS, гены вариабельных доменов тяжелых (Vh) и легких (VI) цепей иммуноглобулинов, фрагмент гена белка рШ, on репликации ColEl, on фага M13, ген устойчивости к ампициллину Ар'

С помощью дот (рис 4) и иммуноблот анализа была определена внутриклеточная локализация растворимых одноцепочечных антител В результате нами было показано, что антитело slF4 выявлялось в культуральной среде, в периплазматической и цитоплазматической фракциях Одноцепочечные антитела 116 и 2119 выявлялись в периплазматической фракции, а одноцепочечное антитело 317 - во фракции нерастворимых белков

После очистки периллазматических фракций (рис 5) с помощью набора «Ni-NTA Spin Kit» («Qiagen», США) были определены концентрации растворимых антител, которые составили для антитела 1F4 приблизительно 0,18 мг/мл, а для антител 116 и 2119 - приблизительно 0,2 мг/мл

MMOrigbw PlacZ

apf

•EcoRI

• — 1

ф ф ф 2

ф 3 4

1F4 116 2119 317 НВ2151

Рис 4 Схематическое изображение результатов дот-анализа по определению локализации растворимых одноцепочечных антител slF4, slI6, s2I19 и s317 в субклеточных фракциях рекомбинантных штаммов Ecoh Нанесения 1-культуральная среда, 2- периплазматическая фракция, 3-растворимая щпоплазматическая фракция, 4- нерастворимая цитоплазматическая фракция

Определение констант аффинности полученных одноцепочечных антител проводили согласно (Берзовски Д и др, 1989, Альберте Б и др, 1994) с использованием программы «Origin 7 0», при последовательном титровании антител

М 1 2 3 4 1 2 3 4

А Б

Рис 5 Электрофореграмма в 12% ДСН-ПААГ (А) иымуноблот анализ с анти c-myc МКА (Б) фракций, полученных при хроматографии на Ni-NTA-агарозе лизагов Е coh, содержащихslF4 М-стандарта молекулярных масс, 1 - периплазма клеток В coli HB2151/pHEN-slF4 до нанесения на колонку, 2 - несвязавшахся периплазматическая фракция клеток £ colt HB2151/pHEN-slF4 после нанесения на колонку, 3 -фракция промывок, 4 - фракция элюата

Расчетные величины констант аффинности для одноцепочечных антител в1Р4, б 116 и 82119 составили (1,6± 0,3)х107М"\ (1,5± 0,3)х107М"\ (9,1 ± 3,8)х106 М"1, соответственно (рис 6)

Рис 6 Определение константы аффинности одноцепочечных антител с использованием иммуноферыентного анализа

Полученные константы аффинности соответствовали ожидаемым, так как согласно литературным данным из библиотеки представительностью 108 вариантов антител, чаще всего отбираются антитела с константами аффинности 106-107 М"1 (О'СоллеЦ, 2002)

На следующем этапе, на основе вариабельных доменов одноцепочечных антител №4,116 и 2119 были созданы полноразмерные молекулы иммуноглобулина соответствующих антител Дг1Р4, АН 16 и Й12119 Поскольку одноцепочечные антитела 1Р4, 116 и 2119 не обладали вируснейгрализующими свойствами, дополнительно дня конструирования полноразмерных антител были выбраны два одноцепочечных антитела Ъ9 и ЗУАЮ, отобранные из иммунной библиотеки и обладающие способностью нейтрализовать ортопоксвирусы вирусы оспы обезьян, осповакцины и оспы коров

Для конструирования полноразмерного антитела 1Б4 к генам, кодирующим вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, были соответственно присоединены гены, кодирующие лидерные пептиды тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (ЯаШсо е1 а1, 2002), константные домены Сн1- Сн2- Сн3- тяжелой цепи человека и каппа-домен легкой цепи антитела человека (А1юу е1 а1, 2002) Сконструированные гены, кодирующие тяжелую цепь 1§01 и легкую каппа-цепь

антител человека, были независимо встроены в экспресс ионную плазм иду рсРЫА3.1(+) (1от1(гоееп). Результирующие плазм иды рС1Р4Н и рС1Р41. (рис. 7,8) использовали для ко-трансфекции эукзриотических клеток линии НЕК293Т

Фрагменты ДНК, содержащие гены лидерныч и констаных последовательностей были любезно предоставлены к.х.н. Л.Н. Шингаровой, с.н.с. лаборатории инженерии белка ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Москва),

Аналогичным образом были сконструированы пары плазмид для синтеза полноразмерных антител Ш116, Й12П9 №Ь9 и ЛЗУАШ.

рСИЗД

ч

г

Ч

рС1Р41»

Ьр

\

ж мм+унск

I

Рис. 7. Схема плдзмид рС1Р4Н и рС1Р4Ь содержащих лидерный, вариабельный и константный участки г ена тяжелой (Н<1ег+\Ъ+СЬ 1+СЬ2+СЬЗ) и легкой цепи (1ккг*У1+Ск), соответственно. Указаны сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, Решу - цнтомегаловирусный промотор; 1Ш$ - сайт связывания рибосомы; гены устойчивости к антибиотикам ампициллину и неомицину,

Рис 8. Элехтрофореграмма рестрихционного анализа плазмндиых ДНК рС1Р4Н (дорожки 1,3) и рС1Р4Ь (дорожки 2,4), содержащих полноразмерные гены тяжелых и легких цепей им м ун о ло глобулин о в Дорожки М-)кЬ; 1-рС1Р4Н - N00!, 2-рС1Р4Ь -Ысо1; 3- рС1Р4Н - М»[-Ара1; 4- рС1Р4Ь - ЫЪе1~ Ара!.

Для получения рекомбинантных полноразмерных антител fh!F4, fhlI6, fh21\9, fh№, fh3VAlCi клетки HEK29JT трансфецнровали соответствующими парами полученных экспрессионных плазм нд с использованием реагента «Липофектамин» с «Klus reagent». Уровени экспрессии составили от 0,1 мгУмл для 11п№ до более 1,0 мг/мл для антител fhlF^, fhll6, fii2119. Полноразмерное антитело fh3VA10 синтезировалось в течении 48 часов, затем синтез продукта по данным ИФА прекращался.

Очищенные и диалдаовзнные антитела характеризовали с помощью электрофореза в 12% ПААГ с ДСН в присутствии и отсутствии 2-меркшттоэтанола. Результаты электрофореза продемонстрировали наличие полипе гггидов, по подвижности соответствующих природной молекуле иммуноглобулина {рис. 9).

Рис 9. Элнпрофорегрйммц очншеннйго рбкоыбкнантного fhb9 в дсвпурнруЮВДем 12% ПААГ. Дорожки: 1 - целевой IV-'IÜK, обработанный 2-мерк&хптотанолом, 2 - целевой белок, не обработанный 2~меркаптозтанолом, М- маркер молекулярных наос.

Сохранение специфичности полученных полнораэмерных антител человека подтверждали в нммуноблот анализе с белками ортопоксвирусов, Белки вирусов осповакцины, оспы коров и вируса натуральной оспы, штамм Brazilia 131 разделяли электрофоретнчески в 12% ПААГ с ДСН и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Белки ортопоксвирусов выявляли полноразмерными рекомбинантными антителами человека - fhlF4, fhll6, fh2U9 и fbbi>, которые, в свою очередь, проявляли коньюгатом антител человека со щелочной фосфатазой. В качестве положительного коЕПрОяя использовали асщггную жидкость, содержащую моноклональное антитело 2D5 (Ichihashi and Oie,I996).

Результаты проведенных экспериментов продемонстрировали сохранение специфичности исходных одноцепочечных антител для полученных полноразмерных антител, которые выявляли белки вируса осповакцины, оспы коров и вируса натуральной оспы, штамм ВгагШа 131 Антитело Ш16 выявляло белок с молекулярной массой около 54-56 кДа, ШР4, Ш2И9 и МКА 205 взаимодействовали с белками 54-5бкДа и 27кДа исследуемых вирусов Полноразмерное рекомбинангаое моноклональное антитело человека №Ь9 взаимодействовало с белком ортопоксвирусов с молекулярной массой около 35 кДа (рис 10)

Ранее было показано, что белком-мишенью, для оц-АТ Ь9 является белок р35, кодируемый открытой рамкой трансляции (ОРТ) НЗЬ ВОВ Так как полученное нами полноразмерное антитело на основе оц-АТ Ь9 выявляло белок осповакцины с такой же молекулярной массой 35 кДа, можно заключить, что специфичность полноразмерного антитела сохранилась (рис. 10)

7. 4 4 S fi 7 Я t m II 11 M

КДа -56-

i I %

-27-

" * ^Àf^Sf

V

V >■ At?

ЙИ

t ч^ о

î * ~

! - s. Л

! ' _ 'Шф"

Рис. 10 Иммуноблот анализ белков ВОВ (дорожки 1,4,7,10,11,12), ВОК (дорожки 2,5,8) и ВНО-ВпшЬа 131 (дорожки 3,6,9) с полнораэмерныни антителами &1F4 (дорожки 1,2,3), Ш116 (дорожки 4, 5, 6), fh2I19 (дорожки 7,8,9), fhb9 (дорожка 10) и моноклональным антителом 2D5 (дорожка 12). 11 - контроль коньюгата, 13 • вирус осповакцины,

иммобилизованный иа

юпроцелтолозной мембране, М - белковый маркер молекулярных весов.

Для двух других антител fhlF4 и fh2I19 возможной мишенью является белок, кодируемый ОРТ вируса осповакцины L1R, так как использованная в качестве положительного контроля асцитная жидкость, содержащая моноклональное антитело 2D5 (Ichihashi and Oie, 1996), направленное к белку L1R, выявляла тот же белок с молекулярной массой около 27 кДа, а также белок с молекулярной массой 54-56 кДа, который, вероятно, является гетеромером,

содержащим 1ЛВ. (\Volffe, 1995)

Для всех сконструированных полноразмерных антител были определены константы аффинности путем титрования антител с известной начальной концентрацией, на антигене в непрямом ИФА (рис 11)

mile k_=(4 4±1 9) 10° fti2H9 k„=(1 5405)10" fh1F4 k„-(9 8±1 3)10* fhb9 k„»(15±0J2)10r

02-1E1

1E-10 tE-e 1Е-е 1E-7

концентрация анппепа, M

Рис 11 Определение констант аффинности полноразмерных

рекомбинантных антител человека с использованием ИФА.

Величину константы связывания рассчитывали, используя формулу

x + R+V-Mx+R+Vj -4 х R

ODa. = А-/К V -—-

«s 2 R

где х - концентрация антител в растворе (мг/мл), R - концентрация осажденного антигена (мг/мл), к - константа аффинности, А - нормировочный множитель

Константы аффинности составили (9,6± 1,3)х108М"', (4,4± 1,9)х109М'', (1,5 ± 0,2)хЮ8 М"1 и (1,5 ± 0,2) xl О9 М"1, соответственно для полноразмерных антител fhlF4, fhlI6, fh2I19 и fhb9

Наличие вируснейтрализующих свойств у полученных полноразмерных рекомбинантных антител человека проверялось в реакции нейтрализации ВОВ в культуре эукариотических клеток Vero Е6 (рис 12) Исследование проводили при постоянном титре ВОВ, 250 БОЕ/мл В качестве положительного контроля использовали МКА мыши 2D5 (Ichihashi and Oie, 1996)

Результаты показали, что только антитело П)Ь9, сконструированное на основе вариабельных доменов, отобранных из иммунной библиотеки, обладает выраженной вирус нейтрализующей активностью, как и исходное одно не почечное антитело Ь9.

Рис. 12. Ингнбировяние инфекционное™ ВОВ полноразыернымн ргкомбшгачшынн анттгл&ык человека против орттшокс виру сов в культуре клеток Ует Е6. Кониеетраннк антител bLF4. Q1II6 н &Ш9 . 40 мкг/кл, (ЬЬ9 - 25 мкг/мп, МКА 2D5 - 0.06 и кг/мл Тигр ВОВ - 250 БОЕ/ИЛ

Полноразмерные антитела человека fhlF4, fhlI6 к fh2E19 выраженными вируснейтрализующимн свойствами не обладали. Однако, наблюдалось достоверное интибирование б ля шкообр азо в алия в культуре клеток Vero Е6 приблизительно на 40% для антител fhlF4 и fhlI6 и на 32% для анитела fh2119 (рис. 12). Эти антитела были отобраны из синтетической библиотеки, и исходные одноточечные антитела 2119, 1F4 и 116 вируснейтрализующимн свойствами не обладали.

РисЛЗ Интибирование кнфекционностн ВОВ полиоразиерным алппетом человека ÍMI:4, использованной в концентрации 20 ыкгУкл, совиестно с сывороткой невакцнцкрованного против ВОВ донора в разведении 1:100 НА культуре клеток Vero Еб, Тнтр ВОВ - 250 БОЕЛст, кокцеггтрацнг контрольного МКА 2D5-0.06 мкг/чл.

Известно, что сконструированный нами кзотйп [gGl спосо&н к активации компяемеш-а н последующему лизису оболочечных вирусов в составе комплекса

IjJL

вирус-антитело (Weiss, 2002, Zinkernagel, 2002) Для проверки наличия такой комплемент-активирующей функции нами был поставлен эксперимент по нейтрализации ВОВ совместно антителом fhlF4 и сывороткой невакцинированиого против ВОВ донора в разведении 1 100 (рис. 13) Было показано, что процент ингибирования бляшкообразования в пробе с добавлением сыворотки увеличивается до 53%, по сравнению с пробой, содержащей только полноразмерное антитело Аналогичный эффект был обнаружен в работе (Lustig et al, 2004) на примере поликлональных антител против мембранного белка АЗЗ вируса осповакцины Эти антитела не обладали вируснейтрализующей активностью (Galmiche et al, 1999), однако, добавление к ним комплемента обеспечило лизис вирусной мембраны (Lustig et al, 2004) Таким образом, возможно усиление ингибирования бляшкообразования вируса до 53% процентов антителом fhlF4 происходит из-за присутствия в сыворотке невакцинированиого донора неспецифических ингибиторов вирусов, в том числе и белков комплемента

Мы предположили, что вируснейтрализукмцее антитело, fhb9, сконструированное в данной работе и взаимодействующее с белоком H3L, ингибирует вирусную инфекционность за счет блокирования эпитопа H3L, отвечающего за присоединение к специфическим клеточным рецепторам, так как известно, что белок H3L обладает способностью связываться с поверхностью клетки через глюкозаминогликаны клеточной поверхности и, таким образом, задействован в процессе проникновения вируса в клетку (Ichihashi et al, 1996, Hsiao et al,1999) Более того, было показано, что рекомбинантный белок H3L конкурирует с вирусом осповакцины в процессе присоединения вируса к клетке (Lrn et al, 2000)

Известно, что контрольное МКА 2D5 направлено к миристилированному мембранному белку, кодируемому ОРТ HR BOB (Ichichashi et al, 1996) Показано, что белок L1R необходим для протеолитического процессинга коровых белков р4Ь, р4а, VP8 (Ravanello and Hruby, 1994) и для проникновения вируса в клетку (Ichihashi et al, 1996, Wolffe et al, 1995) Вероятно, антитела fh2I19 и fhlF4, как и MRA 2D5 ингибируют вирусную инфекционность также блокируя эпитоп, отвечающий за присоединение к специфическим клеточным рецепторам, экспонированным на белке L1R Эти факты подтверждают гипотезу о сложном, опосредованном

несколькими белками, механизме проникновения ортопоксвирусов в клетку и о наличии нескольких рецепторов к ортопоксвирусам на поверхности клетки

Таким образом, в ходе проделанной работы были получены одноцепочечные антитела против вируса натуральной оспы, штамм 1пс1-3а. Определены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих вариабельные домены полученных антител Исследовано связывание полученных антител с инфекционными оропоксвирусами, определены константы аффинности для некоторых антител На основе отобранных одноцепочечных антител были сконструированы полноразмерные антитела человека, эффективно взаимодействующие с ортопоксвирусами Кроме того, была показана способность подавлять инфекционное«, вируса осповакцины для антитела Ш>9 и ШР4 В случае антитела Й11Р4 вируснейтрапизующие свойства проявляются только при совместном инкубировании с сывороткой невакцинированного донора

Выводы

1 Впервые получены фаговые одноцепочечные антитела человека против вируса натуральной оспы, штамм Ind-За Определение аминокислотных последовательностей позволило выявить, что V-сегменты тяжелых цепей относятся к Vhl и Vh3 семействам иммуноглобулинов человека, а V-сегменты легких цепей - к к1- и ХЗ-подтипам

2 Продемонстрировано, что отобранные антитела обладают способностью к перекрестному связыванию различных штаммов вируса натуральной оспы, а также вирусов осповакцины, ослы коров и эктромелии

3 Впервые получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие в растворимой форме одноцепочечные антитела slF4, si 16 и s2I19 против ортопоксвирусов Константы аффинности антител slF4, slI6 и s2I19 в реакции связывания с вирусом осповакцины составили (1,6 ± 0,3)-107 М"1, (1,5 ± 0,3) 107 М"1, (9,1 ± 3,8)-106 М"1, соответственно

4 Получены пары рекомбинакгаых плазмщщых ДНК, pCHlF4 и pCLlF4, рСНИб и pCLlI6, рСН2И9 и pCL2I19, рСНЬ9 и pCLb9, обеспечивающие при совместном введении в клетки HEK293T синтез полноразмерных антител человека, fhlF4, fhlI6, fh2I19 и fhb9, специфически взаимодействующих с ортопоксвирусами. Определены константы аффинности полноразмерных антител fhlF4, flilI6, fh2I19 и fhb9, которые составили (9,6 ± 1,3)х10' М"1, (4,4 ± 1,9)* Ю9 М"1, (1,5 ± 0,2)х 10* М"1, и (1,5± 0,2)* 109 М"1, соответственно

5. Показано, что полноразмерные антитела человека fhb9 и fhlF4 обладают способностью нейтрализовать инфекционность вируса осповакцины на культуре клеток VeroE6 В случае антитела fhlF4 вируснейтрализующие свойства проявлялись только при совместной инкубации с сывороткой невакцинированного донора.

Основные результаты опубликованы в следующих работах

1 Юн ТЭ. Тикунова НВ, Шингарова ЛН, Алиев ТК, Болдырева ЕФ, Морозова В В , Швалов А А, Некрасова О В , Полыхалова И В , Панина А А, Ильичев А А, Кирпичников М П, Сандахчиев Л С Полноразмерное рекомбинангное антитело человека против вируса осповакцины //Доклады Российской Академии Наук (ДАН), 2007, т 407 стр 98-101

2 Тикунова НВ, Бовшик ЕИ, Юн ТЭ. Жираковская ЕВ, Морозова В В, Баталова Т А, Гуськов А А, Сокунова Е Б, Ильичев А А, Сандахчиев Л С Рекомбинантные антитела человека против вируса натуральной оспы //Вопр Вирусол 2005, т 50, № б, с 20-25

3 Морозова ВВ, Тикунова НВ, Баталова ТА, Юн ТЭ. Бовшик ЕИ, Жираковская Е В , Воронина В В , Бобко Д И, Беланов Е Ф , Ильичев А А, Сандахчиев Л С Мини-антитела человека против ортопоксвирусов // Вестник РАМН, 2004, № 8, с 22-27

Патенты

1 Шингарова ЛН, Тикунова НВ, Юн ТЭ. Баталова ТА, Алиев ТК, Болдырева Е Ф, Некрасова О В, Полыхалова И В, Панина А А, Кирпичников М П, Ильичев А А, Сандахчиев Л С Рекомбинантная плазмидная ДНК pCLl, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи антитела человека против вируса Эбола, рекомбинантная плазмидная ДНК рСН1, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи указанного антитела, и их применение Патент РФ № 2285043 2006

2 Тикунова НВ, Шингарова ЛН, Юн ТЭ, Морозова ВВ, Алиев ТК, Болдырева Е Ф, Некрасова О В, Полыхалова И В, Панина А А, Кирпичников МП, Ильичев А А и Сандахчиев Л С Рекомбинантные плазмидные ДНК pCL37 и рСН37, кодирующие полипептиды со свойст-вами легкой и тяжелой цепей антитела человека против вируса осповак-цины, обеспечивающие совместно биосинтез полноразмерных антител человека против вируса осповакцины в клетках млекопитающих, и рекомбинантное полноразмерное ангиге-ло человека класса IgGl, взаимодействующее с вирусом осповакцины Заявка на патент РФ Справка о приоритете № 2006100694 от 16 0106 Положительное решение от 03 07 07

Тезисы или статьи в сборниках конференций

1 Tikunova N, Dubrovskaya V, Morozova V, Yun T, Batanova T, Schweigert M, Bormotov N, Belanov E, Philipenko M, Shingarova L, Sennikov S Development of therapeutic antibodies International conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine" September 3-7,2006, Novosibirsk, Russia, Abstract book - p 30

2 TYun, L Shingarova, N Tikunova. Generation and characterization of fully human antibodies against Orthopoxviruses // Poster presentation at 31-st FEBS Congress, Molecules m health and Disease, 24-29 June 2006, Istanbul, Turkey / FEBS Journal, V 273, supplement 1, June 2006

3 Ilyichev A, Yun T, Tikunova N / Generation of folly human Mabs against Orthopoxviruses for prophylaxis of Vaccme-related adverse events/ Vaccine

Congress New Approaches to Vaccine Development From the bench to the field 8 -10 September 2005, abstract, Berlin, Germany

4. Yun Т.Е., Shingarova L.N., Tikunova NT Fully size human antibody against Orthopxv ¡ruses // 7lh John Humphrey advanced summer programme in immunologythe interface between immunology and medicine - 2005, abstract, Moscow, Russia

5. Tanya Yun, Ludmila Shingarova, Tanya Batanova, Nina Tikunova. Fully -size human antibodies against Orthopoxviruses // Poster Presentation at International Symposium of Antiviral Research -Barselona, Spain /Antiviral research. Volume 65/3 (2005), p.A.83

6. E. Bovshik, T. Yun, E. Zhirokovskaya, V. Moro ¿ova, A. Guskov, T. Batanova, A. llyichev, N. Tikunova Combinatorial Antibodies against Orthopoxviruses // Antiviral research, Volume 62 (2004), pA,72

7. N, Tikunova, V. Morozova E. Bovshik, E. Del ano v, A.Guskov, T. Yun. A. llyichev. Combinatorial antibodies against orthopoxviruses // Antiviral research, Volume 57 (1003), p.A.73

8. Batanova Т.,Yun Т., llyichev A., Tikunova N. Human mini-antibodies against against tick-bome encephalitis virus.// Poster presentation at VII International Potsdam Symposium on Tick-Bome Diseases, 13-14 March 2003, Berlin.

9. A A. llyichev, N.V. Tikunova el aL T.A. Batanova, E I., Т.Е. Yun and L.S. Sandakhiev. Characterization of orthopoxvirus antigenic profile using combinatorial phage antibodies.// XII th Inlernational Congress of Virology July 27-30, 2002, Paris, France.

10. Bovshik E.I., Yun Т.Е., Morozova B.B., Guskov A.A., Zhirakovskaya E.V., llyichev A.A., Tikunova N.V Development of combinatorial human antibodies to variola virus II 6th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology September 15-21, 2002, Puschino, Russia./Abstract

11. Bovshik E, Tikunova N, Guskov A, Morozova V, Yun T, Zhirakovskaya E, llyichev A, Sandakchiev L.

Generation of recombinant antibodies against small pox viruses// Scientific conference "Problems of an infection pathology in Siberian region, Far East and Extreme North", Novosibirsk, Russia May, 2002. Abstract.

12.Бовшик В.И., Тикунова H.B., Гуськов А.А., Морозова В.В., Юн Т.Э., Жираковская Е.В., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Получение ре комби нангных антител человека против вируса натуральной оспы. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. 29-31 мая, 2002, Новосибирск.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юн, Татьяна Эверестовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 СТРУКТУРА И СВОЙСТВА МОЛЕКУЛ

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ.

1.1.1 Общий план строения иммуноглобулинов.

1.1.2 Гены иммуноглобулинов.

1.1.3 Организация генов, кодирующих легкие цепи иммуноглобулинов.

1.1.4 Организация генов, кодирующих тяжелые цепи иммуноглобулинов.

1.1.5 Механизмы ДНК рекомбинации меяеду V- и Л-генами.

1.2 ИНЖЕНЕРИЯ АНТИТЕЛ.

1.2.1 Химерные антитела.

1.2.2 Гуманизированные антитела.

1.2.3 Полноразмерные антитела человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание рекомбинантных антител человека против ортопоксвирусов с использованием методов фагового дисплея"

Роль антител в различных областях медицины трудно переоценить. С развитием генетической инженерии стало возможным создание рекомбинантных производных моноклональных антител (МКА). К ним относятся химерные и гуманизированные АТ, которые в настоящее время применяют в терапии различных заболеваний. Однако, несомненным является тот факт, что предпочтительнее использовать в терапии полностью человеческие молекулы иммуноглобулинов.

В настоящее время источником для получения полноразмерных антител человека могут являться сыворотка крови человека, гибридомы на основе В-клеток человека и трансгенные мыши. Однако, существует ряд ограничений в использовании этих источников для получения препаратов терапевтических антител. В то же время получение антител человека возможно с использованием методологии фагового дисплея. Несомненным преимуществом применения комбинаторной технологии является отсутствие необходимости использования лабораторных животных, относительная простота в исполнении, а также возможность скрининга большого количества кандидатных молекул за более короткий промежуток времени. Из комбинаторных библиотек возможен отбор мини-антител человека против широкого круга антигенов, включая особо опасные вирусы. Объединение в дальнейшем вариабельных доменов отобранных мини-антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в экспрессионных векторах позволяет получать полноразмерные антитела человека.

Целью данной работы являлось получение на основе методов фагового дисплея одноцепочечных антител человека против инфекционного вируса натуральной оспы, штамм 1пс1-3а, конструирование и характеризация полноразмерных антител человека против ортопоксвирусов.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: отобрать из синтетической комбинаторной библиотеки одноцепочечные антитела человека против инфекционного вируса натуральной оспы, штамм 1пс1-3а;

- исследовать иммунохимические и вируснейтрализующие свойства отобранных антител;

- сконструировать полноразмерные антитела человека на основе одноцепочечных антител против ортопоксвирусов;

- исследовать иммунохимические и вируснейтрализующие свойства полученных полноразмерных антител.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые получены одноцепочечные антитела человека против вируса натуральной оспы, штамм Ind-За. Определены аминокислотные последовательности полученных антител. Исследовано связывание антител с различными ортопоксвирусами, включая различные штаммы вируса натуральной оспы.

Получены штаммы Esherichia coli, продуцирующие растворимые одноцепочечные антитела slF4, slI6 и s2I19 специфично взаимодействующие с ортопоксвирусами. Исследованы особенности продукции этих антител в клетках E.coli.

Получены рекомбинантные плазмидные ДНК, pCHlF4 и pCLlF4, рСНИб и pCLIIö, рСН2119 и pCL2I19, рСНЬ9 и pCLb9, обеспечивающие продукцию в клетках млекопитающих полноразмерных человеческих антител класса IgGl, специфично взаимодействующих с ортопоксвирусами. Антитела fhb9 и fhlF4 способны нейтрализовать инфекционность вируса осповакцины на культуре клеток VeroEö. В случае антитела fhlF4 вируснейтрализующие свойства проявлялись только при совместной инкубации с сывороткой невакцинированного донора.

Антитело fhb9 после проверки противовирусных свойств в модельных экспериментах на животных, могло бы представлять интерес для создания на его основе иммунопрофилактического средства, а также терапевтического препарата предупреждающего развитие поствакцинальных осложнений, и, возможно, лечения ортопоксвирусных инфекций.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, получено два положительных решения о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 11

Международных конференциях: 16-ой Международной конференции «Antiviral research» (Саванна, США, 2003), 17-ой Международной конференции «Antiviral research» (Туксон, США, 2004), 18-ой Международной конференции "Antiviral research" (Барселона, Испания, 2005), 6th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, (Пущино, Россия, 2002), 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Москва, Россия, 2005), на XIII Международном вирусологическом конгрессе (Париж, 2002), 31-st FEBS Congress, Molecules in health and Disease (Стамбул, Турция 2006) VII Межгосударственная научно-практическая конференция (Оболенск, Россия 2006), 6th, 7th и 8th Meetings of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Женева, Швейцария, 2004, 2005 и 2006), и 1 Российской конференции: Научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002).

Вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором. В исследованиях, проводимых с использованием инфекционного вируса натуральной оспы в условиях специальной лаборатории с уровнем защиты BSL 3-4, вместе с автором принимали участие A.A. Гуськов, Е.Б. Сокунова, Е.В. Жираковская, В.В. Морозова, Е.И. Бовшик, Н.В. Тикунова. Тестирование антител на наличие вируснейтрализующей активности проводилось в лаборатории общей вирусологии, руководитель к.м.н. Е.Ф. Беланов, в тестировании антител принимали участие вместе с автором Н.И. Бормотов и З.Ф. Киселева. Конструирование полноразмерных антител и эксперименты по эукариотической экспрессии проводились совместно с сотрудниками лаборатории инженерии белка и группы экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки института Биоорагнической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН г. Москва: к.х.н. JI.H. Шингаровой и к.б.н. И.В.Мерсияновой.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Юн, Татьяна Эверестовна

выводы

1. Впервые получены фаговые одноцепочечные антитела человека против вируса натуральной оспы, штамм Ind-За. Определение аминокислотных последовательностей позволило выявить, что V-сегменты тяжелых цепей относятся к Vhl и Vh3 семействам иммуноглобулинов человека, а V-сегменты легких цепей - к к1- и 13-подтипам.

2. Продемонстрировано, что отобранные антитела обладают способностью к перекрестному связыванию различных штаммов вируса натуральной оспы, а также вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии.

3. Впервые получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие в растворимой форме одноцепочечные антитела slF4, si 16 и s2I19 против ортопоксвирусов. Константы аффинности антител slF4, si 16 и s2I19 в п реакции связывания с вирусом осповакцины составили (1,6 ± 0,3)-10 М' (1,5 ± 0,3)-107 М'1; (9,1 ± 3,8)-106 М'1, соответственно.

4. Получены пары рекомбинантных плазмидных ДНК, pCHlF4 и pCLlF4, рСНПб и рСЬПб, рСН2119 и pCL2I19, рСНЬ9 и рСЬЬ9, обеспечивающие при совместном введении в клетки НЕК293Т синтез полноразмерных антител человека, fhlF4, fh 116, fh2119 и fhb9, специфически взаимодействующих с ортопоксвирусами. Определены константы аффинности полноразмерных антител fhlF4, fh 116, fh2I19 и fhb9, которые составили (9,6 + 1,3)х108 М"1; (4,4 ± 1,9)х109 М"1; (1,5 + 0,2)х108 М'1; и (1,5± 0,2)хЮ9 М'1, соответственно.

5. Показано, что полноразмерные антитела человека fhb9 и fhlF4 обладают способностью нейтрализовать инфекционность вируса осповакцины на культуре клеток УегоЕб. В случае антитела fhlF4 вируснейтрализующие свойства проявлялись только при совместной инкубации с сывороткой невакцинированного донора.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор хотел бы выразить огромную благодарность и признательность коллегам:

- Ирине Гавриловой и Алле Качко за неустанное секвенирование приносимых фрагментов; Евгению Федоровичу Беланову, Николаю Ивановичу Бормотову и Зинаиде Федоровне Киселевой за предоставленные вирусы и помощь в организации экспериментов по нейтрализации; Александру Николаевичу Швалову за безотказную помощь в обсчете констант и «войне» с тяжелым нравом компьютера.

Хотелось бы поблагодарить рецензентов Галину Вадимовну Кочневу и Валерия Борисовича Локтева за критические высказывания и ценные замечания. Также хотелось бы выразить благодарность Александру Алексеевичу Ильичеву за общее руководство.

Огромная благодарность москвичам Людмиле Николаевне Шингаровой и Ирине Владимировне Мерсияновой за помощь в конструировании и экспрессии полноразмерных антител. 4

Большая благодарность Виктории Дубровской и Ольге Вороновой за ценные советы, критические замечания и обсуждение работы; Льву Леванову за постоянную помощь при выполнении работы и неуёмное чувство юмора, позволявшее проще относится к случавшимся неудачам. Искренняя и теплая благодарность Ирине Викторовне Матяш и Татьяне Батановой за обучение, советы и неоценимую помощь в работе. Особая благодарность и признательность Александру Алексеевичу Гуськову и Елене Владимировне Сокуновой за доверие, бережное отношение и огромную помощь в работе, а также благодарность всей «шестерочной» команде нашей лаборатории Евгению Бовшику, Елене Жираковской, Вере Морозовой, Наталье Денисовой и Нине Викторовне Тикуновой, с кем так много и в то же время, как никогда, вдохновенно и с энтузиазмом мы работали. Особую благодарность хотелось бы выразить научному руководителю Нине Викторовне Тикуновой за руководство, организацию работы, тепреливое вычитывание диссертации и ценные замечания.

И наконец, самые теплые слова благодарности моим родителям и младшей сестренке, чья неизменная поддержка помогла мне довести до конца эту работу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Очевидно, что в настоящее время существует огромное количество технологий по созданию рекомбинантных иммуноглобулинов наиболее близких по своим характеристикам и свойствам к природным молекулам. Существует мнение, что практически невозможно определить, какая из существующих на сегодняшний день технологий является предпочтительной, и выбор технологии определяется лишь финансовыми и техническими возможностями исследователя.

Преимущества технологии фагового дисплея по сравнению с дргугими технологиями получения МКА заключается в том, что выбор антигенов к которому будут получены специфические антитела не ограничивается только набором тех антигенов, которые могут использованы для иммунизации человека или животных. Кроме этого, разнообразие стратегий создания комбинаторных библиотек и отбора специфических клонов позволяет получать антитела с желаемыми иммунологическими и биологическими свойствами.

Получение коллекций рекомбинантных антител против различных вирусных патогенов, в том числе и ортопоксвирусов является важным элементом в разработке иммунопрофилактических и иммунотерапевгических противовирусных препаратов. Кроме этого противовирусные антитела могут найти применение для изучения механизмов патогенеза и формирования гуморального ответа в организме человека.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ 2.1.1. Реактивы

Реактивы, использованные для электрофореза:

Акриламид, бромистый этидий, додецилсульфат натрия (ДСН), ксиленцианол, Кумасси R-250, Ы,Ы-метиленбисакриламид, персульфат аммония, N,N,N\N'-тетраметилэтилендиамид (TEMED), Трис(гидроксиметил)аминометан, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), глицин, бромфеноловый синий, 2-меркаптоэтанол, агароза ("Sigma", США).

Реактивы, использованные для культивирования Escherichia coli и амплификации комбинаторных библиотек:

Агар-агар и бактотриптон ("Difco", США); дрожжевой экстракт ("Fluka", Швеция); полиэтиленгликоль (ПЭГ) 6000-8000 и глицерин ("Sigma", США). Реактивы для иммуноанализа:

Бычий сывороточный альбумин (БСА), пара-нитрофенилфосфат (pNPP); анти-С-тус антитела, анти-кроличий и анти-мышиный конъюгаты со щелочной фосфатазой ("ICN", США); пунцовый С, нитро-тетразолиевый голубой (NBT), нитроцеллюлоза, Tween-20 (Твин-20), конъюгат антител человека - IgG со щелочной фосфатазой ("Sigma", США); 5-бромо-4-хлор-3-индолил-фосфат (BSIP) ("Roche", Франция); поликлональные анти-М13 антитела сыворотки кролика были любезно предоставлены Белановым Е.Ф., к.м.н., зав. лабораторией общей вирусологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово.

Реактивы, использованные для культивирования эукариотических клеток и процедуры трансфекции:

Культуральная среда DMEM ("Gibcp", США), трипсин ("Sigma", США) фетальная бычья сыворотка ("Gibco" США) или фетальная бычья сыворотка с низким содержанием иммуноглобулинов ("HyClone" США), «Липофектамин 2000» и «Липофектамин» с «Плюс реагентом» ("Invitrogen", США). Реактивы, использованные для аффинной очистки антител:

Ni-NTA Qiagen Kit» ("Qiagen", США), Protein G Sepharose 4 Fast Flow ("Amersham", США)

Наборы, использованные для выделения плазмидной ДНК и элюции фрагментов ДНК:

QIAquick Gel Extraction Kit», «QIAquick PCR Purification Kit», «Plasmid Mini (Maxi) Kit» ("Qiagen", США); наборы для выделения плазмидной ДНК "EndoFree" ("Promega", США).

Прочие реактивы:

Азид натрия, диметилсульфоксид (DMSO), дезоксину кл еотид-5' -трифосфаты (dNTP), 3-[Ъ1-морфолино]пропансульфоновая кислота (MOPS), триэтиламин ("Sigma", США); кристаллический фиолетовый ("ICN", США); 100 bp и lkb ДНК маркеры («СибЭнзим», Россия).

Все остальные использованные реактивы были произведены в "Реахим", СССР, или «Союзхимпром», Россия, и имели квалификацию не ниже «ОСЧ» и «ХЧ».

2.1.2. Растворы

АР буфер: 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 100 мМ Трис-HCl, pH 9.5.

Буфер (хб) для нанесения проб ДНК на гель: 0.25% бромфеноловый синий, 0.25% ксиленцианол, 30% глицерин.

Буфер лизирующий для нанесения белковых проб на полиакриламидный гель: 100 мМ Трис-HCl, pH 6.8, 3% 2-меркаптоэтанол, 4% ДСН, 0.2% бромфеноловый синий, 20%-ный глицерин.

Буфер ТЕ - 10 мМ Трис-HCl, pH 7.4, 1 мМ ЭДТА.

Буфер трис-глициновый (хЮ): 25 мМ трис pH 8.3, 192 мМ глицин, 0.1%

ДСН.

Буфер трис-ацетатный (ТАЕ): 20 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ трис, pH 8.0 доводили ледяной уксусной кислотой.

Буфер STE -10 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 1 мМ ЭДТА, 0.1 М NaCl.

ПЭГ/NaCl: 20% ПЭГ, 2.5 М NaCl.

Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР): 100 мМ NaCl, 33 мМ Na2HP04,17 мМ NaH2P04x2H20, pH 7.2.

Буфер для переноса белка из акриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану: 39 мМ глицин, 48 мМ Трис-HCl, 0.037% ДСН, 20% метанол.

2.1.3. Ферменты

Эндонуклеазы рестрикции ApaLI, NotI, Sfil, Nhel, Apal, XmaJI, Xhol ("Fermentas", Литва), BamHI, BgUI, BstEII, EcoRI, HaelII, Hindlll, HincII, Kpnl, Mspl, PstI, PvuII, SacI ("Сибэнзим", Россия).

Полинуклеотидкиназа фага Т4, ДНК-лигаза фага Т4, Pfu ДНК полимераза Taq ДНК полимераза ("Fermentas", Литва), Taq ДНК полимераза ("Сибэнзим", Россия).

2.1.4. Олигонуклеотиды, использованные в данной работе представлены в таблице 4.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юн, Татьяна Эверестовна, Кольцово

1. Галактионов В.Г. Иммунология. Издательство "РИЦ МКД" Москва, 2000 г., 488 с.

2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Издательство "Мир" Москва, 2002 г., 589 с.

3. Дубровская В.В. и Тикунова Н.В. Получение одноцепочечных антител человека к основному иммунодоминантному белку ортопоксвирусов. // Вестник НГУ. 2006. - V.4 - .100-105.

4. Льюин Б. Гены. Издательство "Мир" Москва, 1987 г., 544 с.

5. Маренникова С.С., Щелкунов СН Патогенные для человека ортопоксвирусы. Издательство "КМК Scientific Press Ltd" Москва, 1998 г., 386 с.

6. Морозова В.В. Получение и характеризация рекомбинантных антител человека против ортопоксвирусов. автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. - 2005.

7. Пол У. Иммунология. Издательство "Мир" Москва, 1989 г.

8. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Издательство "Мир" -Москва, 2000 г., 592 с.

9. П.Фрейдлин И.С., Тотолян A.A. Клетки иммунной системы. Издательство "Наука" Санкт-Петербург, 2001 г. - 456 с.

10. Adair J.R. Engineering antibodies for therapy. // Immunol. Rev. 1992. - V.130 - p.5-40.

11. Aliev Т.К., Panina A.A., Petrovskaya L.E., Shingarova L.N., Radko V.B., Nedospasov S.A., Korobko V.G., Zavyalova V.P. and Zavyalov V.P. // Clinical Immunology. 2002. - V. 103 - 90.

12. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res. 1997. - V.25 - p.3389-3402.

13. Baca M., Presta L.G., O'Connor S.J. and Wells J.A. Antibody humanization using monovalent phage display. // J; Biol. Chem. 1997. - V.272 - p. 1067810684.

14. Baert F., Noman M., Vermeire S., Van Assche G., D1 Haens G., Carbonez A. and Rutgeerts P. Influence of immunogenicity on the long-term efficacy of infliximab in Crohn's disease. // N. Engl. J. Med. 2003. - V.348 - p.601-608.

15. Barbas C.F., III, Kang A.S., Lerner R.A. and Benkovic S.J. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1991. V.88 - p.7978-7982.

16. Batra S.K., Jain M., Wittel U.A., Chauhan S.C. and Colcher D. Pharmacokinetics and biodistribution of genetically engineered antibodies. // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - V.13 - p.603-608.

17. Berger M., Shankar V. and Vafai A. Therapeutic applications of monoclonal antibodies. // Am. J. Med. Sci. 2002. - V.324 - p. 14-30.

18. Bianchi A.A. and McGrew J.T. High-level expression of full-length antibodies using trans-complementing expression vectors. // Biotechnol. Bioeng. 2003. -V.84 - p.439-444.

19. Birnboim H.C. and Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucleic Acids Res. 1979. - V.7 - p. 1513-1523.

20. Blazek D. and Celer V. The production and application of single-chain antibody fragments. // Folia Microbiol. (Praha). 2003. - V.48 - p.687-698.

21. Booy E.P., Johar D., Maddika S., Pirzada H., Sahib M.M., Gehrke I., Loewen S., Louis S.F., Kadkhoda K., Mowat M. and Los M. Monoclonal and bispecific antibodies as novel therapeutics. // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). 2006. - V.54-p.85-101.

22. Boss M.A., Kenten J.H., Wood C.R. and Emtage J.S. Assembly of functional antibodies from immunoglobulin heavy and light chains synthesised in E. coli. // Nucleic Acids Res. 1984. - V.12 - p.3791-3806.

23. Breedveld F.C. Therapeutic monoclonal antibodies. // Lancet. 2000. - V.355 -p.735-740.

24. Chothia C., Gelfand I. and Kister A. Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain. // J. Mol. Biol. 1998. - V.278 - p.457-479.

25. Chothia C., Lesk A.M., Tramontano A., Levitt M., Smith-Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E.A., Davies D., Tulip W.R. and . Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. // Nature. 1989. - V.342 - p.877-883.

26. Cox J.P., Tomlinson I.M. and Winter G. A directory of human germ-line V kappa segments reveals a strong bias in their usage. // Eur. J. Immunol. 1994. -V.24 - p.827-836.

27. Davies A., Greene A., Lullau E. and Abbott W.M. Optimisation and evaluation of a high-throughput mammalian protein expression system. // Protein Expr. Purif. 2005.-V.42-p.l 11-121.

28. Dick J.E., Lapidot T. and Pflumio F. Transplantation of normal and leukemic human bone marrow into immune-deficient mice: development of animal models for human hematopoiesis. // Immunol. Rev. -1991. V. 124 - p.25-43.

29. Dotto G.P., Horiuchi K. and Zinder N.D. The functional origin of bacteriophage fl DNA replication. Its signals and domains. // J. Mol. Biol. 1984. - V.172 -p.507-521.

30. Durocher Y., Perret S. and Kamen A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. // Nucleic Acids Res. 2002. - V.30 - E9.

31. Esposito J.J., Obijeski J.F. and Nakano J.H. The virion and soluble antigen proteins of variola, monkeypox, and vaccinia viruses. // J. Med. Virol. 1977. -V.l -p.95-110.

32. Ewert S., Huber T., Honegger A. and Pluckthun A. Biophysical properties of human antibody variable domains. // J. Mol. Biol. 2003. - V.325 - p.531-553.

33. Finn G.K., Kurz B.W., Cheng R.Z. and Shmookler Reis R.J. Homologous plasmid recombination is elevated in immortally transformed cells. // Mol. Cell Biol. 1989,-V.9-p.4009-4017.

34. Fishwild D.M., Hudson D.V., Deshpande U. and Kung A.H. Differential effects of administration of a human anti-CD4 monoclonal antibody, HM6G, in nonhuman primates. // Clin. Immunol. 1999. - V.92 - p. 138-152.

35. Foote J. and Winter G. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. // J. Mol. Biol. 1992. - V.224 - p.487-499.

36. Forrer P., Jung S. and Pluckthun A. Beyond binding: using phage display to select for structure, folding and enzymatic activity in proteins. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1999. - V.9 - p.514-520.

37. Franchini M. Rituximab in the treatment of adult acquired hemophilia A: A systematic review. // Crit Rev. Oncol. Hematol. 2007.

38. Frazer J.K. and J.D.Capra. Immunoglobulins: structure and function.- 1999.

39. Galili U., Rachmilewitz E.A., Peleg A. and Flechner I. A unique natural human IgG antibody with anti-alpha-galactosyl specificity. // J. Exp. Med. 1984. -V.160 - p.1519-1531.

40. Gavilondo J.V. and Larrick J.W. Antibody engineering at the millennium. // Biotechniques. 2000. - V.29 - p.128-6, 138.

41. Gelfand I.M. and Kister A.E. Analysis of the relation between the sequence and secondary and three-dimensional structures of immunoglobulin molecules. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. - V.92 - p.10884-10888.

42. Gispen R. and Brand-Saathof B. Three specific antigens produced in vaccinia, variola, and monkeypox infections. // J. Infect. Dis. 1974. - V. 129 - p.289-295.

43. Goldman J.P., Blundell M.P., Lopes L., Kinnon C., Di Santo J.P. and Thrasher A.J. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. // Br. J. Haematol. 1998. - V.103 -p.335-342.

44. Goldsby R.A., Kuby J, Osborne BA Immunology. "W H Freeman & Co", 2003. 556 c.

45. Goncalves L.F., Ribeiro A.R., Berdichevski R., Joelsons G., Proenca M.C. and Manfro R.C. Basiliximab improves graft survival in renal transplant recipients with delayed graft function. // Transplant. Proc. 2007. - V.39 - p.437-438.

46. Graham F.L. and van der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. // Virology. 1973. - V.52 - p.456-467.

47. Hanes J. and Pluckthun A. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. - V.94 -p.4937-4942.

48. Hoogenboom H.R. Overview of antibody phage-display technology and its applications. // Methods Mol. Biol. 2002. - V.178 - p.1-37.

49. Ichihashi Y. and Oie M. Neutralizing epitope on penetration protein of vaccinia virus. // Virology. 1996. - V.220 - p.491-494.

50. Ilan E., Eren R., Lubin I., Nussbaum O., Zauberman A. and Dagan S. The Trimera mouse: a system for generating human monoclonal antibodies and modeling human diseases. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2002. - V.4 - p. 102-109.

51. Jakobovits A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. // Curr. Opin. Biotechnol. 1995. - V.6 - p.561-566.

52. Kamel-Reid S. and Dick J.E. Engraftment of immune-deficient mice with human hematopoietic stem cells. // Science. 1988. - V.242 - p. 1706-1709.

53. Karpas A., Dremucheva A. and Czepulkowski B.H. A human myeloma cell line suitable for the generation of human monoclonal antibodies. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. - V.98 - p.1799-1804.

54. Karpas A., Harder L., Czepulkowski B., Bloxham D., Saward R., Dremucheva A. and Siebert R. Studies of four new human myeloma cell lines. // Leuk. Lymphoma. 2005. - V.46 - p.101-112.

55. Kellermann S.A. and Green L.L. Antibody discovery: the use of transgenic mice to generate human monoclonal antibodies for therapeutics. // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - V.13 - p.593-597.

56. Kettleborough C.A., Saldanha J., Heath V.J., Morrison C.J. and Bendig M.M. Humanization of a mouse monoclonal antibody by CDR-grafting: the importance of framework residues on loop conformation. // Protein Eng. 1991. - V.4 - p.773-783.

57. Kretzschmar T. and von Ruden T. Antibody discovery: phage display. // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - V.13 - p.598-602.

58. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. - V.227 - p.680-685.

59. Laffly E. and Sodoyer R. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. // Hum. Antibodies. 2005. - V.14 - p.33-55.

60. Lee B.M., Oh C.K., Jin S.H., Kim J.H., Kim S J., Kim H. and Shin G.T. Effect of basiliximab on renal allograft rejection within 1 year after transplantation. // Transplant. Proc. 2006. - V.38 - p.2025-2028.

61. Lee C.V., Liang W.C., Dennis M.S., Eigenbrot C., Sidhu S.S. and Fuh G. High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab libraries with a single framework scaffold. // J. Mol. Biol. 2004. - V.340 - p. 1073-1093.

62. Le Hir H., Nott A. and Morre M.J. How introns influence and enhance eukaryotic gene expression. // Trends. Biochem. Sci. 2003. - V.28. - p.215-220

63. Lewis A.P., Barber K.A., Cooper H.J., Sims M.J., Worden J. and Crowe J.S. Cloning and sequence analysis of kappa and gamma cynomolgus monkey immunoglobulin cDNAs. // Dev. Comp Immunol. 1993. - V.17 - p.549-560.

64. Liu A.Y., Robinson R.R., Hellstrom K.E., Murray E.D., Jr., Chang C.P. and Hellstrom I. Chimeric mouse-human IgGl antibody that can mediate lysis of cancer cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987. - V.84 - p.3439-3443.

65. Lo K.M., Sudo Y., Chen J., Li Y., Lan Y., Kong S.M., Chen L., An Q. and Gillies S.D. High level expression and secretion of Fc-X fusion proteins in mammalian cells. // Protein Eng. 1998. - V.l 1 - p.495-500.

66. Markides, SC. Components of vectors for gene transfer and expression in mammalian cells. // Protein Expr. Purif. 1999. - V. 17. - p. 183-202.

67. Matsuda F., Ishii K., Bourvagnet P., Kuma K., Hayashida H., Miyata T. and Honjo T. The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. //J. Exp. Med. 1998. - V.l 88 - p.2151-2162.

68. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G. and Chiswell D.J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. // Nature. 1990. -V.348 - p.552-554.

69. Mendez M.J., Green L.L., Corvalan J.R., Jia X.C., Maynard-Currie C.E., Yang X.D., Gallo M.L., Louie D.M., Lee D.V., Erickson K.L., Luna J., Roy C.M.,

70. Mian I.S., Bradwell A.R. and Olson A.J. Structure, function and properties of antibody binding sites. //J. Mol. Biol. -1991. V.217 - p.133-151.

71. Mosier D.E., Gulizia R.J., Baird S.M. and Wilson D.B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. // Nature. 1988. - V.335 - p.256-259.

72. Nilsson K. Characteristics of established myeloma and lymphoblastoid cell lines derived from an E myeloma patient: a comparative study. // Int. J. Cancer. -1971. V.7 - p.380-396.

73. Nissim A., Hoogenboom H.R., Tomlinson I.M., Flynn G., Midgley C., Lane D. and Winter G. Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents. // EMBO J. 1994. - V.13 - p.692-698.

74. Oettinger M.A., Schatz D.G., Gorka C. and Baltimore D. RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V(D)J recombination. // Science. -1990.-V.248-p.1517-1523.

75. Padlan E.A. A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. // Mol. Immunol. 1991. - V.28 - p.489-498. •

76. Page M.J. and Sydenham M.A. High level expression of the humanized monoclonal antibody Campath-IH in Chinese hamster ovary cells. // Biotechnology (N. Y.). -1991. V.9 - p.64-68.

77. Pallares N., Frippiat J.P., Giudicelli V. and Lefranc M.P. The human immunoglobulin lambda variable (IGLV) genes and joining (IGLJ) segments. // Exp. Clin. Immunogenet. 1998. - V.15 - p.8-18.

78. Pan-Hammarstrom Q., Zhao Y. and Hammarstrom L. Class switch recombination: a comparison between mouse and human. // Adv. Immunol. -2007,- V.93 p. 1-61.

79. Park S.S., Kim J., Brandts J.F. and Hong H.J. Stability of murine, chimeric and humanized antibodies against pre-S2 surface antigen of hepatitis B virus. // Biologicals. 2003. - V.31 - p.295-302.

80. Parmley S.F. and Smith G.P. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. // Gene. 1988. - V.73 - p.305-318.

81. Pavlou A.K. and Belsey M.J. The therapeutic antibodies market to 2008. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2005. - V.59 - p.389-396.

82. Persic L., Roberts A., Wilton J., Cattaneo A., Bradbury A. and Hoogenboom H.R. An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries. // Gene. 1997. -V.187 -p.9-18.

83. Pescovitz M.D. Rituximab, an anti-cd20 monoclonal antibody: history and mechanism of action. // Am. J. Transplant. 2006. - V.6 - p.859-866.

84. Presta L.G. Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function. //Adv. DrugDeliv. Rev. 2006. - V.58 - p.640-656.

85. Ramsden D.A., McBlane J.F., van Gent D.C. and Gellert M. Distinct DNA sequence and structure requirements for the two steps of V(D)J recombination signal cleavage.//EMBO J. 1996. - V.15 - p.3197-3206.

86. Rastetter W., Molina A. and White C.A. Rituximab: expanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases. // Annu. Rev. Med. 2004. - V.55 -p.477-503.

87. Reff M.E. High-level production of recombinant immunoglobulins in mammalian cells. // Curr. Opin. Biotechnol. 1993. - V.4 - p.573-576.

88. Reichert J.M., Rosensweig C.J., Faden L.B. and Dewitz M.C. Monoclonal antibody successes in the clinic. //Nat. Biotechnol. 2005. - V.23 - p. 1073-1078.

89. Reichmann L., Clark M., Waldmann H. and Winter G. Reshaping human antibodies for therapy. //Nature. 1988. - p.323-327.

90. Roder J.C., Cole S.P. and Kozbor D. The EBV-hybridoma technique. // Methods Enzymol. 1986. - V. 121 - p. 140-167.

91. Schmaljohn C., Cui Y., Kerby S., Pennock D. and Spik K. Production and characterization of human monoclonal antibody Fab fragments to vaccinia virus from a phage-display combinatorial library. // Virology. 1999. - V.258 - p.l 89200.

92. Silverton E.W., Navia M.A. and Davies D.R. Three-dimensional structure of an intact human immunoglobulin. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977. -V.74-p.5140-5144.

93. Smith D.K. and Xue H. Sequence profiles of immunoglobulin and immunoglobulin-like domains. // J. Mol. Biol. 1997. - V.274 - p.530-545.

94. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. // Science. 1985. - V.228 - p. 1315-1317.

95. Smith G.P. and Scott J.K. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. // Methods Enzymol. 1993. - V.217 - p.228-257.

96. Spada S., Krebber C. and Pluckthun A. Selectively infective phages (SIP). // Biol. Chem. 1997. - V.378 - p.445-456.

97. Tada H., Kurokawa T., Seita T., Watanabe T. and Iwasa S. Expression and characterization of a chimeric bispecific antibody against fibrin and against urokinase-type plasminogen activator. // J. Biotechnol. 1994. - V.33 - p. 157174.

98. Thomas P. and Smart T.G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2005. - V.51 - p. 187200.

99. Tomlinson I.M., Cox J.P., Gherardi E., Lesk A.M. and Chothia C. The structural repertoire of the human V kappa domain. // EMBO J. 1995. - V.14 -p.4628-4638.

100. Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. and Winter G. The repertoire of human germline VH sequences reveals about fifty groups of VH segments with different hypervariable loops. // J. Mol. Biol. 1992. - V.227 -p.776-798.

101. Trikha M., Zhou Z., Timar J., Raso E., Kennel M., Emmell E. and Nakada M.T. Multiple roles for platelet GPIIb/IIIa and alphavbeta3 integrins in tumor growth, angiogenesis, and metastasis. // Cancer Res. 2002. - V.62 - p.2824-2833.

102. Trill J.J., Shatzman A.R. and Ganguly S. Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells. // Curr. Opin. Biotechnol. 1995. - V.6 - p.553-560.

103. Udey J.A. and Blomberg B. Human lambda light chain locus: organization and DNA sequences of three genomic J regions. // Immunogenetics. 1987. - V.25 -p.63-70.

104. Umana P., Jean-Mairet J., Moudry R., Amstutz H. and Bailey J.E. Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgGl with optimized antibody-dependent cellular cytotoxic activity. // Nat. Biotechnol. 1999. - V. 17 - p. 176-180.

105. Vaisbourd M., Ignatovich 0., Dremucheva A., Karpas A. and Winter G. Molecular characterization of human monoclonal antibodies derived from fusions of tonsil lymphocytes with a human myeloma cell line. // Hybrid. Hybridomics. 2001. - V.20 - p.287-292.

106. Williams S.C., Frippiat J.P., Tomlinson I.M., Ignatovich O., Lefranc M.P. and Winter G. Sequence and evolution of the human germline V lambda repertoire. // J. Mol. Biol. 1996. - V.264 - p.220-232.

107. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E. and Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technology. // Annu. Rev. Immunol. 1994. - V.12 -p.433-455.

108. Wolffe E.J., Vijaya S. and Moss B. A myristylated membrane protein encoded by the vaccinia virus L1R open reading frame is the target of potent neutralizing monoclonal antibodies. //Virology. 1995. - V.211 - p.53-63.

109. Wood C.R., Dorner A.J., Morris G.E., Alderman E.M., Wilson D., O'Hara R.M., Jr. and Kaufman R.J. High level synthesis of immunoglobulins in Chinese hamster ovary cells. //J. Immunol. 1990. - V.145 -p.3011-3016.

110. Wright A. and Morrison S.L. Effect of glycosylation on antibody function: implications for genetic engineering. // Trends Biotechnol. 1997. - V.l5 - p.26-32.

111. Wright A., Tao M.H., Kabat E.A. and Morrison S.L. Antibody variable region glycosylation: position effects on antigen binding and carbohydrate structure. // EMBO J. 1991. - V.10 - p.2717-2723.

112. Wurm F.M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. //Nat. Biotechnol. 2004. - V.22 - p. 1393-1398.

113. Xiong H., Ran Y., Xing J., Yang X., Li Y. and Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies. // J. Biochem. Mol. Biol. 2005. - V.38 -p.414-419.