Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование иммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и отбор из нее вируснейтрализующих антител против ортопоксвирусов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование иммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и отбор из нее вируснейтрализующих антител против ортопоксвирусов"

На правах рукописи

Дубровская Виктория Владиславовна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ИММУННОЙ КОМБИНАТОРНОЙ БИБЛИОТЕКИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА И ОТБОР ИЗ НЕЕ ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ОРТОПОКСВИРУСОВ

03.00.03 — «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2006

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора Мкюдравсоцразвитяя России.

Научный руководитель

кандидат биологических наук, доцент Н.В. Тикунова Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор В.Б, Локтев кандидат биологических наук, доцент Н.А. Попова

Ведущая организация

Институт б неорганической химии им, М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Защита состоится «28» декабря 2006 г. в часов иа заседании диссертационного совета при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан «£Ъ> ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Э.Г. Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Благодаря своей высокой специфичности н широкому спектру связываемых антигенов, шгктела нашли широкое применение в фундаментальных исследованиях, медицине и биотехнологии. Но, если в качестве диагностических и аналитических реагентов антитела применяются уже давно и довольно успешно, то применение антител в терапии связано с рядом проблем. Несмотр* на разнообразие, только ограниченный набор антител обладает свойствами, подходящими дня подобного использования. Так, терапевтические at тлела не должны быть иммуногекны н должны иметь длинный период полувыведения из организма человека. К тому же необходимо, чтобы они были устойчивы к агрегации, преципитации и действию протеаз. В соответствия с применением должны учитываться и другие свойства антител: размер, аффинность, эффекторная функция и способность проникать в ткани. Кроме того, необходимо наличие способа их наработки в препаративных количествах.

Открытие Kohler н Milstein гибридомной технологии в 1975 году позволило нарабатывать моиоклоналытые антитела грызунов разной специфичности. С тех пор гибридомы стали основным источником моноклональных ыггнтел (МАТ), использующихся в фундаментальных исследованиях и в биотехнологии при создании тест-систем. Но при использовании мышиных МАТ в терапии оказалось, что они имеют ряд недостатков, среди которых короткий период полувыведення, недостаточная активация эффекгорных функций и, главное, развитие у человека иммунного ответа против мышиных антител, особенно при повторном использовании. Для решения этих проблем были разработаны стратегии, позволяющие с помощью методов генетической инженерии избегать нежелательного иммунного ответа: создание химерных антител путем соединения вариабельных доменов AT мыши с константными доменами человеческих AT, «гуманизация» путем замены CDR и удаление т-хелперкых эпитопоа из состава молекулы антитела. Уменьшить степень иммунного ответа, направленного против антител, позволило также использование антител приматов.

Тем не менее, полностью человеческие МАТ наиболее ценны для терапевтического применения, поэтому было разработало несколько подходов к их получению из различных источников - человеческих гибридом, трансгенных мышей и in vitro библиотек. Однако, получать стабильные линии человеческих гибридом, продуцирующих высоко аффинные МАТ, удается очень редко по причине отсутствия подходящей клеточной линии человеческой миеломы. Еще одним способом получения МАТ человека стали трансгенные мыши, у которых собственные гены иммуноглобулинов заменены на человеческие. Но при таком подходе, как и при получении МАТ человека с помощью

гибрндомной технологии, набор антигенов, против которых могут быть получены антитела ограничен только теми антигенами, которые могут быть использованы для иммунизации, при этом невозможно получить необходимые s терапии антитела против собственных белков человека. Спектр антигенов может быть практически неограничен, если в качестве источника антигенсвязывакяцих доменов антител использовать комбинаторные библиотеки. В этом случае аигнгенсвязывающий сайг антитела желаемой специфичности отбирается нз огромных репертуаров фрагментов антител, которые экспонированы tía поверхности бактериофагов либо С помощью других дисплейных технологий - на рибосомах или дрожжах. При этом существуют различные подходы к созданию комбинаторных библиотек, к выбор того или иного подхода зависит от конкретной задачи.

В последнее время все чаще технологию фагового дисплея стали применять для отбора рекомбннантпых антител с целью получения на их основе терапевтических препаратов для лечения инфекционных заболеваний. Кроме того, такие антитела также используют для исследования антигенной природы различных вирусов.

Одними из наиболее многочисленных и сложноорганизованных представителей царства Vira являются поксвнрусы, которые поражают практически все известные таксономические группы животных, начиная от насекомых и кончая млекопитающими, в том числе и человека, при этом большая часть патогенных для человека поксвирусов относится к роду Ортопоксвирусов. Наиболее ri вгоге иными для человека являются вирус натуральной оспы (ВНО), кроме того, генерализованную инфекцию может также вызывать вирус оспы обезьян. Известно, что вакцинация вирусом осповакцины (BOBi ранее использовал нал для ликвидации натуральной оспы, приводит к формированию у вакцинированных людей длительного состояния напряженности иммунитета. Но высокий процент осложнений, возникающих в результате классического оспопрививания, особенно у людей с врожденным или приобретенным иммунодефицитом, делает необходимым разработку новых специфических средств профилактики посгвакцинальных осложнений, В настоящее время таким средством является сывороточный вакцинный иммуноглобулин (V1G), тем не менее, его применение сопровождается биологическим риском. Альтернативой VIO могли бы быть протегтвкые моноклональные AT человека против ортопоксвирусов.

Целью л «я ной работы являлось конструирование иммунной комбинаторной фаговой библиотеки scFv антител человека пр&гнв ортопоксвирусов, отбор из нее вируснейтралюующих антител и исследование их мммунохкмическнх свойств.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• сконструировать и охарактеризовать комбинаторную иммунную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе мРНК лимфоцитов периферической кроен доноров, предварительно вакцинированных вирусом осповакщшы;

• отобрать из сконструированной библиотеки вируспейтрализующне scFv антитела, специфичные к рекомбнншпному белку prA30L вируса натуральной оспы, к исследовать их связывание с этим антигеном;

• отобрать из комбинаторной иммунной библиотеки вируснейтрализующие scFv антитела, специфичные к вирусу оспы коров, н исследовать их иммунохимические свойства;

• определить белок-мишень для вируснейтрализуюших scFv ашител, специфичных к вирусу оспы коров;

• определить аминокислотные последовательности отобранных одно цепочечных антител.

Научная новизна и практическая ценность ааДоты. В настоящей работе впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных шггател человека против ортопоксвнрусов. Из сконструированной библиотеки впервые отобраны одноцепочечные антитела человека, специфичные к рекомбииантному белку вируса натуральной оспы prA30L, способные нейтрализовать вирус осповакцины. Получена панель вируснсйзрллизующнх одноцелочечных антител человека против вируса оспы коров. Сконструирован штамм Escherichia coli, продуцирующий рекомбинангный белок prJ3L вируса оспы коров (штамм Гришак). Показано, что 8 го 10 вируснейтралнзующих антител специфически взаимодействуют с рекомбннащным белком prJ3L, а также с его природными аналогами в составе вирионов вируса оспы коров, осповакцины и мстромелии. Получен штамм Escherichia coli, продуцирующий растворимое одноцепочечное антитело Ь9, специфически взаимодействующее с вирусом оспы коров. Определена константа аффинности одноцепочечного антитела Ъ9. Определены аминокислотные последовательности всех полученных антител.

Поскольку в данной работе получены антигеисвязывающие домены антител человека, на их основе к дальнейшем могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека. Такие полноразмерные антитела человека, после проверки их противовирусных свойств в модельных экспериментах яа животных, могли бы представлять интерес для создания на их основе иммунопрофилактичсских средств, а

также терапевтических препаратов предупреждеши поствакцинальных осложнений и, возможно, лечен и* ортопоксвирушых инфекций.

Апробация мбиги и итЯлшмпкн. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 7 Международных конференциях: 6*. Т1*1 и в"1 Meetings of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Женева, Швейцарии, 2004,2005 и 2006), 18-ой Международной конференции "Antiviral research" (Барселона, Испания, 2005% 7th John Humphrey advanced summer programme in immunologythe interface between immunology and medicine (Москва, Россия, 2005), Международная конференции «Физико-химическая биология» (Новосибирск, Россия, 2006). Международная конференция "Basic Science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, Россия, 2006); и 2 Российских конференциях: 111 Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск. Россия, 2006), VII Межгосударственная научно-практическая конференция (Оболенск, Россия, 2006).

Объем я структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, включая 43 рисунка и 3 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (140 наименований).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Конструирование и »растеризация библиотеки

В качестве источника генетического материала для конструирования библиотеки была использована мРНК клеток лнмфондного ряда четырех доноров, недавно вакцинированных ВОВ, причем двое из них была вакцинированы первично, а двое ревакциннроваиы. Забор крови проводили у каждого донора при явном проявлении гуморального иммунного ответа: у реваищн про ванных доноров - через две недели, при этом титр сывороток составлял 1:23600, а у впервые вакцинированных кровь отбирали неделей позже, и титр сывороток составлял 1:6000-8000. Исследование специфичности антиген, находящихся в сыворотках крови доноров, вакцинированных ВОВ, показало, что в сыворотках, полученных ОТ трех доноров, присутствовали AT против белка ортопоксвирусов с молекулярной массой около 35 кДа, в сыворотках двух доноров присутствовали AT, связывающие белок молекулярной массой около 14 кДа (рис, 1). Антитела исследуемых сывороток связывались также к с другими белками ортопоксвирусов с молекулярными массами 27,32,39,62,94 кДа.

б

М 123 4 56

Рис. 1. Иммуноблотинг белков ВОВ (а) и вируса оспы коров (6) с сыворотками доноров, вакцинированных впервые (2 и 3), с сыворотками ревакциниро-ванных допоров (4 и 5) и с сывороткой певахцнннро-ванвото донора (б). М — маркер молекулярных масс белков, 1 — белковые профили соот-ветствующих вирусов.

При амплификации УН- и УЬ-генов был использован набор праймсров, комплементарных концам У-генов тяжелых н легких цепей. Выбор олнгонуклеотшюв для амплификации был обусловлен первичной структурой V» н Уь доменов. Ввиду относительно высокой консервативности участков П11 и 3'-областей J•ceгмeктoвl соответствующие им олигоауклеотиды могут быть использованы в качестве праймсров для амплификации УН- и генов. Набор используемых праймеров был ограничен в пользу тех олигонуклеотндов, которые позволяют амплнфнцнровахь гены вариабельных доменов семейств, наиболее широко представленных в организме человека. Кроме того, Ун и Уь Домены выбранных структурных сёмейств в составе одноцепочечных антител обладают большей термодинамической стабильностью по сравнению с остальными и эффективно экспреосируются в различных прокариотическнх и эукариотических системах. Таким образом, мы рассчитывали увеличить содержание стабильных антител в конструируемой библиотеке, которые преобладают по сравнению с остальными потами АТ, в норме циркулирующих в крови человека.

Объединение ДНК фрагментов вариабельных доменов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов в последовательности, кодирующие м^у АТ человека, было проведено с использованием линкерного олигфнуклеотцда, содержащего сайт дня эндонуклеазы рестрикции АраИ. Сайт рестрикции был введен в последовательность линкерного праймера с целью оптимизации процесса сборки мру-генов (рис. 2).

Используя ПЦР, сначала линкер достраивали последовательностями, кодирующими 3'-концы УН-генов, а затем объединяли с УН-генамн, при этом праймеры содержали сайт для эндонуклеазы рестрикции 5/!1 на 5'-конце В случае легких цепей, уже

RhuJH

UnMpeU

i XpeU

линкер

VhbackSffl

"ft

VH

Sfl

VH I

4* Apeu

unwpeu Rtmiti—

ApaLl

ШШЖЙ^ЕШЗ

Ара LJ

ШИ^ШЕШЕ

vtforwoa

SD

scFv-ген

Sfl

1Ж1

Nod

• Рестрикция Дрв1.1

• Нитрование

• Амплификация

ГуП"!

s

Рис. 2. Схема конструирование генов, кодирующих одноцепочечные антитела человека. На схеме показаны: VH- и VL-гены; сайты для эндонуклсаз рестрикции АраЫ, SfiI, и №»Л; места отжига праймеров RhtUH, VhbactSJÎI, VlforM«! и UokApalA.

достроенный с 3'-конца линкер удлиняли последовательностями, комплементарными 5* концам VL-генов, а затем объединяли с VL-генами, при этом с помощью праймеров вводили сайт рестрикции NoA на 3' конце. Полученные таким образом фрагменты ДНК после экстракции из агарозного теля обрабатывали эндонукпеаэой рестрикции Ара\Л и объединяли в реакции лигированкя. Затем гены, кодирующие одноцепочечные антитела человека (около 800 п.н.), амппифнцнровали с использованием праймеров, содержащих сайты рестрикции SJil н Noll. Полученный репертуар scFv-геиов встраивали в векторную фаты иду pHEN2 (рис. 3).

После этого полученный репертуар фагмнд использовали для трансформации клеток £. coll TOI. Выбранный для создания библиотеки вектор относится к 3+3 фагмнаным векторным системам, в которых дикий теп белка рШ конкурирует с химерным белкам рШ, содержащим вставку фрагмента антитела, при включении в фаговую частицу. В получаемой в результате амплификации библиотеки фаговой популяции фаговые частицы экспонируют только одну копию фрагмента антитела. Так

называемый ноне валентный дисплей широко испояыуетс* для отбора высоко аффинных фрагментов антител.

Рис. Э. Схема фагмиды pHEN2-scFv, содержащей ген одаоцепочечного антитела. Указаны сайты для зноонуклеаз рестрикции Hindíll, Sfñ, ApaLY, Notl и üroRI; промотор лактозного оперона Р (acZ; место посадки рибосом (RBS); гены вариабельных доменов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей иммуноглобулинов, супрессируемый стоп кодон amber TAG; фрагмент гена белка рШ; оК репликации ColEl; on фага М13, Ají- ген устойчивости к ампициллину.

Размер сконструированной иммунной библиотеки составил ЗхЮ' независимых клонов. Был также оценен функциональный размер библиотеки, т.е. процент клонов, содержащих правильно собранные scFv-гены, способные продуцировать индивидуальные молекулы одноцепочечных антител. Функциональный размер всегда меньше исходного, определенного с помощью подсчета количества независимых трапсформантов непосредственно после электропорации, но именно он определяет возможность отбора из библиотеки антител с определенными свойствами. Фат иди ая ДНК из 40 случайно выбранных клонов была использована в качестве матрицы для амплифихации scFv-генов. Было показано, что фагиндные ДНК, выделенные из 39 клонов, содержали вставки, ло размеру совпадающие с scFv-генами. Разнообразие представленных- в библиотеке антител оценивали с помощью ПДРФ-анализа scFv-генов 20 случайно выбранных клонов. Дм каждого из них наблюдали уникальную картину рестрикции. Кроме этого оценивали процент антител, которые могут быть получены в виде индивидуальных молекул без

М13 orí

б His-tag amber

EcoRI

оболочечиого белка бактериофага, ЧУеЯет-блот анализ клеточных лизагов отдельных клонов показал, что 10 из 10 клонов действительно продуцировали &сРу АТ.

Таким образом, функциональный размер библиотеки составил не менее 97% от определенного первоначально. Такой размер библиотеки позволяет получать АТ с константами аффинности от 5*105 до 1*Ю7 М"'. Тот факт, что в нашем случае была сконструирована иммунная библиотека, позволял надеяться, что аффинность отбираемых нз нее антител может быть выше, поскольку для конструирования использовали мРНК лимфоцитов вакцинированных доноров, в ходе развития иммунного ответа которых происходило повышение аффинности антител, специфичных к ортопоксвирусам.

Отбор антител против рекомбынантного белка ргАЗОЬ

Очень важным моментом при использовании методологии фагового дисплея является выбор антигена для аффинного обогащения библиотеки. Одним из антигенов, использованных в данной работе был рекомбннантиый белок ргАЗОЬ (Разумов и др., 2005), тобеэно предоставленный Гнлевой И.П. (Лаборатория геномных исследований оргпоксвирусов и разработки вакцин нового поколения, ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспозребнадзора). Этот белок является аналогам поверхностного белка слияния ВНО (штамм Инд-За), закодированным в ОРТ АЗОЬ. ргАЗОЬ гомологичен белку слияния ВОВ массой 14 кДа, закодированному в гене А27Ц был выбран для обогащения библиотеки, поскольку он играет важную роль в жизненном цикле вируса: он участвует в процессах присоединения вируса к клегке-мишеин, слияния вирусной н клеточной мембран и высвобождения вирусных частиц. Белок 14 кДа расположен на поверхности внутриклеточного зрелого вируса (1МУ), самой многочисленной формы вируса. Он играет важную роль в формировании иммунного ответа хозяина, стаыулируя клеточный и гуморальный иммунный ответ. Среди оргопоксвнрусов этот белок консервативен, основные различия, выраженные точечными мутациями, сосредоточены в районе 26-40 а.о., и как раз в этом районе локализованы 4 вируснейтрализующих эпитопа. Ранее было показано, что использованный нами рекомбннантиый белок ргАЗОЦ подобно природному белку, сохраняет способность формировать димеры я тринеры. Кроме того, была получена панель мышиных моноклональных АТ, связывающих этот белок и перекрестно реагирующих с ВОВ, ВЭ и ВОК, некоторые из которых нейтрализовали инфекционное» ВОВ и ВНО. Все эти данные позволяли рассматривать рекомбннаншый белок ргАЗОЬ в качестве перспективного антигена для отбора шггител, обладающих шфуснейтрализующими свойствами.

Обогащение библиотеки клонами, продуцирующими веГу АТ против белка ргАЗОЬ, проводили в ходе трех раундов биопэннинга, при этом для получения высокоафинных АТ на каждом последующем раунде бионэнкиига уменьшали концентрацию рекомбинашного белка. Полученные после каждого раунда аффинной селекции лоликлональньк популяции фаговых антител, а также исходную фаговую библиотеку тестировали в ИФА на способность связываться с антигеном. Результаты тестирования (рис. 4) показали значительное увеличение сигнала при связывании антигенов фаговой популяцией, полученной после третьего раунда аффинной селекции, что свидетельствует об обогащении этой популяции клонами, продуцирующими специфические к белку ргАЗОЬ антитела.

Рис. 4. Исследование связывания популяций фаговых антител с рекомбннантным белком ВНО ртАЗОЬ с помощью ИФА.

1.2 1

■ 0.8 Е

8.0.4 02 о

• 1~Й И~Е1 1~Ш

неховная р«унд1 раунпа ет»ндЗ (Мпютана

об«и»ф«нн

Была также протестирована вируснейтралвзующая способность поликлональной популяции фаговых антител, полученной после аффинного обогащения комбинаторной иммупной библиотеки против белка ргАЗОЬ по сравнению с исходной библиотекой. Результаты тестирования внруснейтрализующей активности последовательных разведений соответствующих популяции фаговых антител (рис. 5) показали, что после аффинного обогащения библиотеки против белка ргАЗОЬ, уровень антител способных нейтрализовать ВОВ в ней {фактически не изменился.

Из обогащенной фаговой популяции отбирали клоны, способные продуцировать АТ, связывающиеся как с рекомбннантным белком ртАЗОЦ так и с жизнеспособным ВОВ. Анализ связывания $с¥у АТ, продуцируемых положительными клонами, проводили одновременно с обоими антигенами. Это позволяет преимущественно отбирать такие АТ, которые связывают эпнтопы рекомбинантного белка, присутствующие в его природном аналоге в составе вирионов. Задачей данного исследования был отбор из сконструированной библиотеки вируспейтралтующкх антител, поэтому для дальнейшего анализа были взяты только те антитела, которые были способны связывать

жизнеспособные вирусные частицы, поскольку именно они могли обладать

Рис. 5, Нейтрализация ВОВ популяцией фаговых

шттятел, полученной после аффинного обогащения комбинаторной фаговой библиотеки против белка prA30L (1), и исходной комбинаторной библиотекой (2) в культуре клеток Vera Еб. 3 - контроль неспецифической нейтрализации ВОВ (anti-Thy антитело). Титр ВОВ-250 БОЕ/ыл.

В результате проведения скрининга клонов методом дот-анализа и ИФА и проведения ПДРФ-энализа всру-генов было отобрано 20 уникальных АТ, связывающих как ргАЭОЦ так и ВОВ. Проверка способности отобранных против белка ргАЗОЬ фаговых АТ нейтрализовать инфекционноегь ВОВ показала, что два из 20 АТ - 4.1 и <14 проявили вирусней грализующую активность (рис. 6), При тестировании способности последовательных разведений фаговых шггител 4.1 и <14 нейтрализовать ВОВ, оказалось, что антитело 4.1 нейтрализовало ннфекцнонность ВОВ при разведении до 2,5 х 10м БОЕ/мл, а антитело <14-при разведении до 1013 БОЕ/мл.

биологической активностью.

Рис. 6. Нейтрализация ВОВ фаговыми одноцепочечными аатш-ргАЗОЬ антителами в культуре клеток Уего Е6. Титр фаговых антител 1011 БОЕ/мл, титр ВОВ — 250 БОЕ/ыл.

По результатам вестерн-блат анализа, вирусиейгрализующне анти-ргАЗОЬ антитела выявляли рекомбинантпый белок ргАЗОЦ перенесенный на нитроцеллюлозную мембрану, в отличие от всех остальных антител, отобранных против этого белка (рис. 7). Исходя из этих данным, было сделано предположение, что вируснсйтрализующие эпитоп или эпитопы ргАЗОЬ, связываемые АТ 4.1 и <14, являются линейными.

Связывание препаративно наработанных фаговых антител 4.1 и d4 с prA30L и DOB исследовали е использованием ИФА. Было показано!, что фаговые антитела 4.1 н d4 в разведении 4х 109 БОЕ/мл достоверно выявляют ВОВ.

После определения нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих отобранные против prA30L антитела, способные нейтрализовать ВОВ, н выведет» из них аминокислотных последовательностей VH и Vl доме1юв, оказалось что Vh домены этих антител относятся к 23 подсемейству УцЗ семейства иммуноглобулинов человека. CDR3-, участки VH доменов, в значительной степени определяющие специфичность, аффинность н внруснейтрализующие свойства антител, не имели гомологии между собой. Vl домены антител 4.1 и <И принадлежат разным подсемействам УкЭ семейства и отличаются лишь по нескольким аминокислотным остаткам.

пи

116

Рис. 7. Иммуноблотинг белка ргАЗОЬ с фаговыми антителами 4.1 (1) и (И (2) и anti-Tby 15 антителом (3); 4 - маркер

молекулярных масс белков.

14 4

Таким образом, из сконструированной комбинаторной библиотеки scFv AT человека были отобраны два уникальных антитела, 4.1 и сМ, специфично связывающие рекомбинантиый белок ргАЗОЬ н способные нейтрализовать ВОВ.

Отбор антител против ВО К

В качестве еще одного антигена для обогащения сконструированной библиотеки scFv AT человека был выбран вирус оспы коров (ВОК), штамм Гришак. В настоящее время показано, что этот вирус наиболее близок к предшественнику рода ортопоксвярусов и является патогенным для многих животных, представляющих различные таксономические группы (Shchelkunov et al,, 2005). У человека он вызывает заболевание, протекающее в местной форме, которое характеризуется развитием единичных поражений, чаще всего на кистях, предплечьях и лице; очень редко заболевание протекает в генерализованной форме. Для максимального сохранения всех возможных вирусных эпнтопов был использован жизнеспособный вирус, так как

prA30L~

известно, что при инактивации разрушаются конформационные эпитопы вирусных белков. Использованный препарат ВОК был наработан на ХАО Ю и очищен путем центрифугирований в градиенте плотности сахарозы. При таком способе очистки вирусная популяция в основном представлена инфекционной формой 1МУ.

Для обогащения библиотеки клонами, продуцирующими кРу АТ против ВОК, было подведено только два раунда биопэннинга, поскольку, как было показано ранее, дальнейшее обогащение привело бы к снижению разнообразия представленных в библиотеке ати-ВОК антител. К тому же, уже после второго раунда в библиотеке существенно увеличилось количество фагов, экспонирующих специфичные к ВОК антитела, как было показано с помощью НФА (рис. 8).

Рис. 8. Исспедованеи связывания популяций фаговых антител с ВОК с помощью ИФА. Титр популяций фаговых АТ — 1С?1 БОЕ/мл.

1 11 3 м »" й ОД ° м м 1 ■ вок ОКА □ ившйранш ыалсио

0 мвддка* библиотека рхщнлЗ

Способность фаговых популяций, полученных в ходе аффинного обогащения против ВОК, связывать различные белки ВОВ и ВОК была оценена с помощью Вестерн-блот анализа (рис. 9). Было показано, что после второго раунда аффинного обогащения против ВОК, в библиотеке одноце почечных антител человека доминируют антитела, связывающие белок с молекулярной массой около 35 кДа.

М

94_

67 —

31.

2014—1

ш.

-а;

ц*

т: ■■

М 12 345

—35 кДа

Рис, 9. Иммуноблотинг белков ВОВ (а) и ВОК (б) с исходной популяцией фаговых антител (2) н популяциями фаговых антител, полученных -35 кДа после первого (3) и второго (4) раунда аффинного обогащения библиотеки против БОК; и с апп-ТКу антителом (5). М - маркер молекулярных масс белков, 1 - белковые профили соответствующих вирусов.

Была также протестирована вируснейтрализующая способность полнклональной популяции фаговых антител, полученной после аффинного обогащения комбинаторной иммунной библиотеки против ВОК по сравнению с исходной библиотекой. Результаты тестирования показали, что после аффинного обогащения библиотеки прошв ВОК уровень антител, способных нейтрализовать ВОК, в ней значительно возрастает (рис. 10).

Рис. 10. Нейтрализация

у 100 £ »о | в» 8 то ~ м

АО 40

30

го 10 о

10(13) 2.8*10(13) 6*10(4) 1.5*10(11) коюинцмиия фггсвих частнь БОЕ/ОТ

ВОК популяцией фаговых антител, подученной после аффинного обогащения комбинаторной фаговой библиотеки против ВОК (IX и исходной комбинаторной библиотекой (2) в культуре клеток Уего Еб. 3 - контроль неспецифнчес-кой нейтрализации ВОК (атМЪу антитело). Титр ВОК 320 БОН/мл.

Из обогащенной против ВОК библиотеки было отобрано 15 клонов, способных продуцировать антитела, связывающиеся с ВОК, среди которых после проведения ПДРФ-аиализа было выявлено И уникальных антител. Для некоторых рестрикциоиных профилей размеры рестрикциоиных фрагментов, предположительно соответствующие УН-гепам, совпадали, что позволило выделшь 3 группы антител (рис. 11):

• группа 1 - а*, Ь9, ПI; группа 2 - с4, <12, е7, ей, Ь1;

• группа 3-(9, §1.

У антител еЮ, Ш, и Ь6 размеры рсстрнкциокных фрагментов, соответствующих УН генам, существенно различались (рис. 11).

М с4 (О е7 е< М »4 Ь9Ше10 » 19 В1 (4 М

Рис. 11. Электрофоретическнй анализ ДНК, кодирующей анти-ВОК АТ, парализованной эщюнуклеазой рестрикции ИаеШ, в 6% ПААГ. М -НаеШ-гкдрояизат плазмнды рВИ327.

трупп 2 группа )

группа 3

Все отобранные фаговые штлела были протестированы на способность нейтрализовать ВОК в культуре клеток Уего Е6 (рис. 12). Среди анти-ВОК антител внруснейтрализуюшими оказались 10 антител; а4, Ь9, Я1, с4,42, е7, е8, Ь1, g4 и (Б, причем выраженную вируснейтрализующую способность (уровень нейтрализации > 80%) лохаэалн 8 из них.

Рис, 12. Нейтрализация ВОК фаговыми одноцепочеч-ными анти-ВОК

антителами в культуре клеток Уего Бб. Титр фаговых антител — 1013 БОЕ/мл, титр ВОК -320 БОЕ/мл.

Поскольку уровень нейтрализации для антител, объединенных в группы 1 и 2 по результатам ПДРФ-анализа, различался незначительно, анализ способности нейтрализовать бляшкообразовакие ВОК и ВОВ последовательных разведений антител, был проведен только для одного антитела из каждой труппы {для Ь9 из группы 1 и для <12 из группы 2). Фаговое антитело Ь9 нейтрализовало инфекционность ВОВ и ВОК при разведении до 3,5х 10й БОЕ/мл, а фаговое антитело с12 — инфекционность ВОК при разведении до 8,9х !0И БОЕ/мл, а инфекционность ВОВ при разведении до 3,5*1011 БОЕ/мл (таблица I).

В качестве положительного контроля нейтрализации было взято МАТ 2Э5, отобранное против оргопоксвирусов [кЫЬазЫ с! а1., 1996]. Было оценено количество АТ, необходимых для нейтрализации инфекционносгн одного вириона. С учетом того, что физический титр оргопоксвирусов, используемых для нейтрализации в 100-1000 раз больше, чем инфекционный, на один внрион приходиться 10**10* молекул МАТ 205. Таким образом, поскольку для нейтрализации оргопоксвирусов недостаточно одной молекулы МАТ на вирион, можно предположить, что механизм нейтрализации является многоударным. При оценке количества фаговых антител мы учитывали литературные данных о том, что только 10% фаговых АТ экспонируют ксГу АТ на своей поверхности, и при этом большинство фаговых антител содержит только одну копию зсРу АТ. Оказалось, что для нейтрализации инфекционносгн одного вириона необходимо 10®-10' фаговых антител, что только на порядок больше, чем необходимое количество МАТ 2Р5. При этом фаговые антитела содержать только един аитигенсвязывающий центр, в что время как МАТ-два.

120 <00 * £ 80 I1 й * | и 1 I % § 1 3 г 1 й 1

£ " + к > « £

По результатам вестерн-блог анализа вируснейтрализующне антк-ВОК антитела а4, Ь9, П1, с4, <13, е7. е8 н Ы связывали белок ВОК массой около 35 кДа, а остальные, включая вируснейтрализующне антитела № и §4,- не выявляли какого-либо белка, и, по-видимому, связывали конформацнонные эпитопы вирусных белков (рис. 13). Исходя из этих данных, было сделано предположение, что вируснейтрализующне эпитопы (или эпигон) вирусного белка массой около 35 кДа, связываемого антителами а4, Ь9, ПI, с4, (12, е7, е8, е9 и 111, являются линейными.

Таблица 1. Характеристика внруо»ейтрал изующей способности фаговых антител, классификация кодирующих их У-генов и сравнение третьих гиперварнабельных участков

нк Ун доменов. '

АТ Нейтрализация Семейства У-генов УН СОМ

+/- Титр, БОЕ/мл УН УЬ

¡И н.о. 3-9 к! 012

Ь9 3.5x10" для ВОК и ВОВ 3-9 к! 1Л2 ЕЩААРН-САГОХ.

П1 + н.о. 3-9 к! 018 1Ж1АУАК-САРШ

С4 + н.о. 3-9 к1 \Л2 СЭГААЫШНАГШ

<12 + 1.56x10" для ВОК 6.25x10'® для ВОВ 3-9 к! 012 СЭIААЫШНАГБI

е7 + и.о. 3-9 к1 012 СЭГААЬНННАЕШ

ев + но. 3-9 012 СЗХААЫШНАПН

Ы + н.о. 3-9 к] 012 С51ААЫ1ННАГ01

К н.о. 1-18 XI 16 ТСТЙК---ЫСГШ

в1 - н.о. 3-11 Х2 13 КТС.<ЗС-1Л/Ы31Д

Ь6 - н.о. 3-11 Х2 16 впгиьстыкзн—

еЮ - и.о. 1-46 к| 018 --------

(9 - и.о. 1-2 к1 Ы2 БРВУ1АУАСУР0У

& + н.о. 1-18 к! 012 СРСУСЯ-СОСГОУ

* Семейства У-генов определены с помощью базы данных У-Ьазе,

С целью исследования кросс-реактивности вирусиейтрализующих внтн-ВОК антител, был проведен вестерн-блот анализ белков ВОВ и ВЭ с фаговыми аши-ВОК антителами. Было показано, что вируснейтрализующне антитела а4, Ь9, ЯI, с4, (12, е7, ев и Ы связывали также белки ВОВ и ВЭ массой около 35 кДа. Также было проанализировано связывание последовательных разведений всех отобранных против ВОК фаговых антител с ВОК, ВОВ и ВЭ (Таблица 2). Оказалось, что все отобранные фаговые антитела оказались способными связывать эти ортопоксвирусы.

Так же, как н Ун домены внруснейтралиэукицих антн-ргАЗОЬ антител, V» домены анти-ВОК антител, продемонстрировавших выраженную нейтрализующую активность, относятся к УдЗ семейству. При этом анализ аминокислотных последовательностей этих антител, также, как и ПДРФ-аяализ, позволил выделять среди ото брата« антител группы шгтител со сходными последовательностями Ун доменов: группу 1 -а4,Ь9 и П1;

и группу 2 — с4, (Е, е7, ев и Ь1. При этом СИО-участкн Ун доменов антител второй группы имеют одинаковую последовательность С ЭIАА1ЛШНАГ0I, а СОЮ-участкн Ун доменов антител первой группы различаю«* по нескольким аминокислотам, но в них Таблица 2. Характеристики связывания антител с различными ортопоксвнрусами.

АТ Титр фаговых антител в ИФА, ЕОЕ/мл*

ВОК ВОВ вэ

84 1.6x10" 1.6x10' 1.6x10*

Ь9 в*!»* 8*10* 8x10*

Ш 1.6*10* 1.6*10* 1.6x10*

с4 3.2x10' 1.6x10' 1.6x10"

(12 3.2x10' 1,6x10' 1.6x10'

е7 3.2x10' 1.6x10' 1.6x10"

е8 1.6x10* 8x10* 8x10'

Ы 1.6x10* 8x10* вхМ"1

№ 10м 10" 10"

к» 1011 . 2x10™ 2хЮ,и

1)6 ю" 4x10" 4x10'

•Титр фаговых антител, при котором положительный сигнал в ИФА выше отрицательного контроля в 2 раза. Вирус сорбирован в концентрации 2 мкг/мл.

М к1 а4 Ъ9 П ] с4Л2 «7е1]11 Я> в1 Ь6 42

щш

1111'

Рис. 13. Иммуноблотинг белков ВОК (А), ВОВ (Б) и вируса эктромелин (В) с фаговыми анти-ВОК

антителами и ап(1-ТЬу антителом (к2). М — мфкер молекулярных масс белков, к1 - белковые профили соответствующих вирусов.

можно выделить мотив DRIAARRGATDI (выделен жирным шрифтом и подчеркнут)!, присутствующий и в CDR3 Vh доменов аетител второй группы. Интересно, что в последовательности CDR3 Vh домена антитела fi>. показавшего менее выраженную вируснейтрализующую активность (уровень нейтрализации около 60%), можно выделить аминокислоты, содержащиеся в том же положении в CDR3 VH доменов антител второй группы Dg|gkngH| (выделены серым), хотя VH домен этого антитела принадлежал V« 1 семейству.

Оценка аффинности отобранных внруенейтралнзующнх scFV антител.

При работе с фаговыми антителами концентрацию scFv AT можно оценить лишь приблизительно, с учетом литературных данных о том, что из пяти копий белка рШ, только одна является гибридным белком, содержащим вставку scFv, а фаговых частиц, содержащих такой гибридный белок только 10% от всей фаговой популяции. Основываясь на этих данных невозможно определить константу аффинности того или иного scFv AT. Поэтому с целью оценки аффинности полученных scFv AT необходимо переводить их в растворимую форму, то есть получать их в виде отдельных, не связанных с бактериофагом молекул, не содержащих фрагмента оболочечного белка бактериофага.

В данной работе для оценки константы аффинности были выбраны 2 антитела, обладающие выраженной нейтрализующей активностью, входящие в состав ) и 2 групп, выделенных по данным ПДРФ-анализа и секвеиирования. Для этого клетки Е. coli нессупрессорного штамма НВ2151, транслирующие TAG как стоп-кодоп, находящийся в структуре антитела перед белком рШ бактериофага (рис. 3), были трансформированы фаги иди ыми ДНК pllEN-b9 и pHEN-d2. После наработки и очистки рекомбшшгтных белков оказалось, что способность связывать ВОК сохранило только scFv AT Ь9.

Некоторые авторы полагают, что уровень наработки растворимых ScFv AT с правильной информацией зависит в основном от аминокислотной последовательности, входящих в их состав вариабельныьх доменов. На основании этого было сделано предположение, что сохранить функциональность молекуле scFv AT Ъ9 позволила его повышенная гилрофнльность, поэтому был проведен сравнительный анализ аминокислотного состава scFv AT Ь9 н dZ Оказалось, что относительное количество гидрофобных остатков в молекуле scFv AT d2 было большим по сравнению с таковым в молекуле scFv AT Ь9, что, по-видимому, могло привести к неправильному фоцдингу молекулы одноцепочечного антитела и, как следствие, к потере его функциональности.

После измерения концентрация белка и проведения ИФА при последовательном титровании одноцепочечного антитела с помощью программы «0п§т 7.0» была' рассчитана константа аффинности одноцепочечного антитела $Ь9, которая составила Кдо =3,13 ± 0,32*10* М"' (рис. 14). Как уже упоминалось ранее, по литературным данным, размер сконструированной в данной работе библиотеки позволяет получать фрагменты антител с константами аффинности от 5*10® до 1*107 М"1.

о,»

£ 03 »г,

§ м

ГГ

3.137 Ев

15 276Е7

А

Рис. 14. Определение константы аффинности одноцепочечного антитела &Ь9 с использованием непрямого иммуноферментного анализа.

1Е-* 1Е.7

Концентрация антитела ®Ь9, М

Поскольку выбранная для конструирования библиотеки фагмидная векторная система приводит к моновалентному дисплею зсРу АТ на поверхности фаговой частицы, в результате аффинного обогащения в библиотеке преобладают бактериофаги, экспонирующие на своей поверхности высоко аффинные антитела. Как и ожидалось, константа аффинности одного ю отобранных бсРу АТ 5Ь9 превысила это значение.

. Поскольку по результатам вестерн-блот анализа, фаговое антитело Ь9, как н большинство ант г ел, отобранных из обогащенной против ВОК комбинаторной фаговой библиотеки, было специфично к белку массой около 35 кДа, было сделано предположение о том, что вирусный белок массой около 35 кДа является основной мишенью для внруснейтрализующих антител, аффинность которых увеличивается при развитии иммунного ответа после вакцинации ВОВ.

Определение белка мишени для вируснейтрализующи! я ти-ВО К асРг АТ

В данной работе методом вестсрн-блот анализа было показано, что в результате аффинного обогащения против ВОК, в комбинаторной иммунной библиотеке преобладают 8сРу АТ, специфичные к белку ВОК и ВОВ массой 35 кДа, и большинство вирус нейтрализующих анти-ВОК бсРу АТ выявляло этот же белок. Среди иммунодомннантных белков ортопоксвирусов, белки, обладающие молекулярными массами около 35 кДа, закодированы в ОРТ 08Ь и НЗЬ (ВОВ, Копенгаген). Нами было

сделано предположение, что белок с которым связывается основная масса антител, отобранных из сконструированной библиотеки, возможно, является белок, закодировать в ОРТ ШЬ ВОВ или ЛЬ ВОК.

Для проверки этого предположения в данной работе впервые был получен штамм-продуцент рекомбнкантното белка ВОК ргГЗЬ, являющегося аналогом белка р35 ВОВ. Праймеры для амплификации гена, кодирующего белок ВОК ЛЬ, были подобраны таким образом, чтобы амшшфицнруемый фрагмент гена не содержал части, кодирующей трансмембранный домен белка, по всей видимости, не содержащих антигенных детерминант, экспонированных на поверхности вирусной частицы.

В качестве Экслрессирующего вектора был взята плаэмнда риЕ1291, содержащая ген, кодирующий р-галактоэядаэу, а составе которого был клонирован фрагмент ДНК, кодирующий часть белка Ь (рис. 15). При использовании такого метода наработки рекомбинантного белка 5*-концевая область мРНК прокариотического гена сохраняется нативной, н поэтому оптимальна для инициации трансляции. Кроме того, гибридный белок в меньшей степени, чем «чистый», подвергается протеолтнческой деградации. Гибридные белки, полученные таким образом, как правило, сохраняют ферментативную активность и антигенные свойства, характерные для продуктов бактериального гена, входящего в состав гибридного белка, что существенно упрощает процедуру их очистки и выделения.

Рис. 15. Схема плазм иды р1Ж-131~, содержащей ген 131, кодирующий р35 белок ВОК. Указаны сайты для зндонуклеазы рестрикции йотЩ промотор лаетозного оперона Р ]ас2; ген Ьасг, кодирующий р-галактозндазу £со//; Ар'- ген устойчивости к ампициллину.

ПяЛ

А

1ас

ВатИ1

После встраивания фрагмента гена, кодирующего белок J3L ВОК, в плазмиду pUK29l, клетки E.coh DHJaF, содержащие результирующую плазмиду pUR-J3L, культивировали в присутствии индуктора Lac промотора ИПТГ. Уровень продукции гибридного белка в этих клетках был оценен с помощью алектрофоретического анализа клеточного лизата в 10% ПЛАТ н составил около 15 % от суммарного клеточного белка Для подтверждения того, что в составе гибридного рекоыбипатного белка сохранились эпигоны, присутствующие в его природном аналоге в составе вирионов, с помощью вестерн-блот анализа было показано, что антитела из сывороток ревакцинированных ВОВ людей связывали рекомбинантный белок prJ3L.

Для подтверждения того, что белком-мишенью вируеяейтралязующнх фаговых антител, отобранных против ВОК, является иммуподоминантный белок р35 оргопоксвирусов, с помощью вестерн-блот аналша была исследована их способность связывать рекомбинантный белок prJ3L. Оказалось, что фаговые антитела а4, Ь9, fl I, с4, d2, е7, е8, е9 и hl выявляли рекомбинантный белок prJ3L (рис. 16),

Рис. 16. Иммунобло-тинг белков клеток Е. coil, трансформированных плаэмидой pUR-J3L (к1), и клеток К cali, трансформировать)! плаэмидой pUR291 (кЗ), с фаговыми антн-ВОК антителами и anti-Thy антителом (к2). М -маркер молекулярных масс белков.

pUR-JJL

pUR291

Кроме того, было показано, что после двух раундов биопэннинга комбинаторной библиотеки $сРу АТ человека против ВОК, в обогащенной фаговой популяции доминируют антитела, связывающие рекомбинантный белок рг-ГЗЬ (рис. 17). Поскольку эта я« фаговая популяция выявляет белок ВОК, ВОВ и ВЭ, массой около 35 хДа (рис. 9), был сделан вывод, что после аффинного обогащения против жизнеспособного ВОК, в библиотеке преобладают антитела, связывающие белок, закодированный ОРТ .13Ь ВОК/и перекрестно реагирующие с белками р35 ВОВ и ВЭ, Следовательно, можно сделать вывод, что в ходе иммунного ответа на ВОВ, одним из основных нммунодомннантных белков, против которого нарабатывается основная масса вирусвейтраллзующих антител, является белок р35, закодированный ОРТ НЗЬ.

М «I » 2 3 .2 lilt!

203_

й*=| S4 -

53 -

36 -

29 -24 -

■■■ ^ Ц'зШ' iiijl

s^ffill

pur-j3l

■ V- т s-i i; i

К

.г?.- К

МЧ % :: I 7.

i5S2 1 i s,-: ; ! ;

г ,j

.: L — ■i ,11 и

!"■'■ f«.j iS sa {jj. 9

pUR2>i

Рис. 17, Имыуноблотинг белков клеток Е. coll, трансформированы ых плазм идой pUR-J3L (к1), и клеток Я coil, трансформированных плазмкдой

pUR291 (кЗ), с исходной популяцией фаговых антител (1), с популяциями фаговых антител, полученных после первого (2) и второго (3) раунда аффинного обогащения библиотеки против ВОК; и с anti-Thy антителом (¿2). М - маркер молекулярных масс белков.

Таким образом, в ходе проделанной работы впервые бьела сконструирована комбинаторная иммунная библиотека одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов размером 3*10? независимых клонов. Было показано, что более 97"/« клонов сконструированной библиотеки содержат гены, кодирующие одноцепочечные антитела человека, которые могут быть наработаны в вине индивидуальных молекул без оболочечного белка бактериофага.

Сконструированная библиотека была обогащена против двух различных по своей природе антигенов: рекомбииантного белка ВНО ргАЗОЬ н жизнеспособного ВОК. Из обогащенной > против рекомбкнанпюго белка библиотеки были отобраны два вируснейтрализующих фаговых АТ, специфичных к рекомбинантному белку ВНО ргАЗОЬ, Из обогащенной против ВОК библиотеки было отобрано 10 фаговых антител, способных нейтрализовать ВОК. С целью определения белка-мишени для вируснейтрализующих антител был получен иттаым ЕхоН, продуцирующий рекомбинаишый белок ргЛЬ ВОК (штамм Гришек). Оказалось, что из 10 вируснейтрализующих антител, 8 выявляли рекомбинантный белок методом весгерн-блот анализа. Эти же антитела выявляли вирусные аналоги рДОЬ белка - р35 белок ВОК, ВОВ и ВЭ при проведении весгерн-блот анализа белковых профилей соответствующих .вирусов. Было также показано, что после обогащения против жизнеспособного ВОК, в комбинаторной иммунной библиотеке преобладают антитела, связывающие р35 белок ВОК и ВОВ, что являлось подтверждением нммунодоминаитиых свойств р35 белка ВОВ при развитии иммунного ответа у человека после вакцинации.

выводы

1. Впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека о дно цепочечных антител человека против ортопоксвирусов. размер библиотеки составил 3*107 независимых клонов, функциональный размер - не менее 97%.

2. Получен штамм Escherichia coli, продуцирующий рекомбннантиый белок prJ3L вируса оспы коров (штамм Гриша*) с уровнем продукции около 15% суммарного клеточного белка.

3. Из сконструировал ной библиотеки методом аффинной селекции было отобрало 20 уникальных одноцепочечных антител человека, специфичных к рекомбннаптпому белку вируса натуральной оспы ргАЗОЬ. Было показано, что антитела 4,1 и (И способны нейтрализовать ннфекциопность вируса осповакцииы.

4. Методом аффинной селекции из сконструированной библиотеки было отобрано 14 уникальных одноцепочечных антител человека, специфичных к вирусу оспы коров. Показано, что 10 из отобранных антител способны нейтрализовать инфекционноегь вируса оспы коров. Показано, что S из 10 вируснейтрализующих антител специфически взаимодействуют с рекомбинавдным белком prJ3L, а также с его природными аналогами в составе вирионов вирусов оспы коров, осповакщшы и эктромеяии.

5. Определены нуклеоткдные последовательности генов, кодирующих вируснейтрапшуюнще антитела и показано, что:

■ Vh домены антител 4.1 н (И принадлежат к 23 подсемейству Vh3 семейства иммуноглобулинов человека, а их Vl домены - к A3 0 и LI9 подсемействам Vk3 семейства иммуноглобулинов человека;

■ Vh домены антител, отобранных против ВО К, принадлежат к 9 подсемейству VH3 семейства и к 18 подсемейству VhI семейства иммуноглобулинов человека, а их VL домены - к 012, Ol 8 н L12 подсемействам Viel семейства н к 16 подсемейству VX1 семейства иммуноглобулинов человека.

6. Впервые получен штамм Escherichia coli, продуцирующий в растворимой форме одноцепочечное антитело Ь9, отобранное против вируса оспы коров. Определена константа аффинности одноцепочечного антитела Ъ9 в реакции связывания с вирусом оспы коров, которая составила 3,1*10*±0,5x10* М"1.

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

1. В. В. Морозова, Н. В. Тикунова, Т. А. Баталова, Т. Э. Юн, Е. И. Бовщик, Е. В. Жираковская, В. В. Воронина (ДубррвскакУ Д. И. Бобко, Е. Ф. Беланов, А. А. Ильичев, JI. С. Сандахчнев. Мини-антител» человека против ортопоксвнрусов. И Вестник РАМН.-2004.-Кгв:-С. 22-27.

2. р, В, ДубрррскРЯ- Н. В. Тикунова, В. В. Морозова, Н. И. Бор мотов, А. Г. Ламан,

A. Б. Улнгин, Ф. А. Бровко, Е. Ф. Беланов, А. А. Ильичев Комбинаторная фаговая библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами против вируса осповакцины, рекомбинантная фагмцдная ДНК pHEN-ЗАЮ, содержащая уникальный ген одноцепочечного антитела человека, способного нейтрализовать ортопоксвнрусы, н искусственное одноцепочечное антитело человека ЗАМ, способное нейтрализовать ортопоксвнрусыУ/ Заявка на патент РФ. Справка о приоритете № 2005125994 от 15.08,05.

3. Т, А. Батанов а, А. Б. Улитии, В, В. Морозова, А. Г. Ламан, Е. В. Жнраковская,

B. В. Дубровская, Ф. А. Бровко, Н. В. Тикунова Создание и характеризация наивной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека. Мол. ген. вирусол. и мнкробиол. 2006. №3, с. 35-41.

4. В. В. Дубровская, Н. В. Тикунова Получение одноцепочечных антител человека к основному нммунйдоминантному белку ортопоксвнрусов, Вестник НГУ.-2006.-Том 4.-выпуск 4.-С. 100-105.

5. V. V. Voronina (Dubrovskaya), Е. F. Belanov, К. V. Titunova Phage display immune library of human scFv against orthopoxviruses. IS1*1 International conference on antiviral research. Barcelona, Spain. 2005, Antiviral research, 2005 - V.65. p. 83.

6. V. V. Voronina (Dubrovskaya). A. B. Ulitin, A. G. Laman, F. A. Brovko, A. A. llyichev N. V. Tilomova Human scFvs to orthopoxviruses Sore phage display immune library. 7th John Humphrey advanced summer programme in immunologythe interface between immunology and medicine. 2005. c. 61.

7. V, V. Morozova, V. V. Voronina (Dubrovskaya), M. V. Shveigert, E. F. Belanov, A. A. llyichev, N. V. Tikunova Group-specific and neutralizing human scFv to Orthopoxviruses from a combinatorial phage library, IS* International conference on antiviral research. Barcelona, Spain. 2005. Antiviral research, 2005 • V.65. p. 83.

8. H. В. Тикунова, Л. Э. Матвеев, В. В. Морозова, В, В. Дубровская, Т, А. Баталова, Т. Э. Юн, Н. И. Бормотов, Е. Ф. Беланов, Л. Н. Шингарова, А. А. Ильичев, Л. С. Сандахчиев Дизайн рекомбииантных антител. Международная конференция

«Физико-химическая биология» 30 июля — 3 августа 2006, Новосибирск, Россия, с. 67.

9. N. Tikunova, V, Dubrovskaya, V. Morozova, Т. Yun, Т. Batanova, М. Schweigert, N. Bormotov, E. Belanov, M. Philipenko, L. Shingarova, S. Sennikov Development of therapeutic antibodies. International continence "Basic Science for Biotechnology and Medicine" September 3-7,2006, Novosibirsk, Russia, p. 30.

10. В. В. Дубровская, А. Б. Уяктип, А. Г. Ламан, В. В. Морозова, Н. И. Бормотав, А. А. Ильичев, Ф. А. Бровко, Е. Ф. Белаиов, Н. В. Тикунова. Отбор вируснейтрализующих одаоцепочечных антител человека к иммунодоминакгаому белку H3L ортопоксвирусов из комбинаторной иммунной библиотеки. Ш Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии' в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Новосибирск, Россия, 27-29 сентября 2006. с. 173.

11. Н, В, Тикунова, В. В. Дубровская, В, В. Морозова, Т. Э. Юн, Н. И. Бормотав, Е. Ф. Беланов, А. А. Ильичев, Л. С. Сандахчиев разработка искусственных антителчеповека против ортопоксвирусов. Vli Межгосударственная научно-практическая конференция. Оболеиск, Россия, 3-5 октября 2006. с. 162.

12. Результаты исследований были доложены на ежегодных Meeting of the WHO Advisory Commetee on Variola Vims Research (Женева, Швейцария, 2004, 2005, 2006).

Дубровская Виктория Владиславовна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ИММУННОЙ КОМБИНАТОРНОЙ БИБЛИОТЕКИ ОДНОЦЕПОЧЕШЫХ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА И ОТБОР ИЗ НЕЕ ВИРУСНЕЙТРАЛИЭУЮЩИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ

ОРТОПОКСВИРУСОВ

Аггореф. дисе,» еояемнж у^вой степени индидя« виодапиеыок вау«, Поллпсано • печт, 16.11.2006. Заш№ 127. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 мо. Типографии Института катали» ш. Г.К. Борескояа СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дубровская, Виктория Владиславовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 СТРУКТУРА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ИХ ГЕНОВ.

1.1.1 Структура антител.

1.1.2 Гены иммуноглобулинов.

1.1.3 Реорганизация генов иммуноглобулинов в ходе дифференцировки В-лимфоцитов.

1.2 ПОЛУЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ.

1.2.1 Фаговый дисплей.

1.2.1.1 Фрагменты антител, используемые для фагового дисплея.

1.2.1.2. Фаги, используемые для дисплея фрагментов антител.

1.2.2 Комбинаторные библиотеки антител человека.

1.2.2.1 Конструирование наивных библиотек.

1.2.2.2 Конструирование синтетических библиотек.

1.2.2.3. Конструирование иммунных библиотек.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование иммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и отбор из нее вируснейтрализующих антител против ортопоксвирусов"

Благодаря своей высокой специфичности и широкому спектру связываемых антигенов, антитела нашли широкое применение в фундаментальных исследованиях, медицине и биотехнологии. Но, если в качестве диагностических и аналитических реагентов антитела применяются уже давно и довольно успешно, то применение антител в терапии связано с рядом проблем [1]. Несмотря на разнообразие, только ограниченный набор антител обладает свойствами, подходящими для подобного использования. Так, терапевтические антитела не должны быть иммуногенны и должны иметь длинный период полувыведения из организма человека. К тому же необходимо, чтобы они были устойчивы к агрегации, преципитации и действию протеаз. В соответствии с применением должны учитываться и другие свойства антител: размер, аффинность, эффекторная функция и способность проникать в ткани [2]. Кроме того, необходимо наличие способа их наработки в препаративных количествах.

Открытие Kohler и Milstein гибридомной технологии в 1975 году [3] позволило нарабатывать моноклональные антитела грызунов разной специфичности. С тех пор гибридомы стали основным источником моноклональных антител (МАТ), использующихся в фундаментальных исследованиях и в биотехнологии при создании тест-систем. Но при использовании мышиных МАТ в терапии оказалось, что они имеют ряд недостатков, среди которых короткий период полувыведения, недостаточная активация эффекторных функций и, главное, развитие у человека иммунного ответа против мышиных антител, особенно при повторном использовании. Для решения этих проблем были разработаны стратегии, позволяющие с помощью методов генетической инженерии избегать нежелательного иммунного ответа: создание химерных антител путем соединения вариабельных доменов AT мыши с константными доменами человеческих AT, «гуманизация» путем замены CDR и удаление Т-хелперных эпитопов из состава молекулы антитела. Уменьшить степень иммунного ответа, направленного против антител, позволило также использование антител приматов [4].

Тем не менее, полностью человеческие МАТ наиболее ценны для терапевтического применения, поэтому было разработано несколько подходов к их получению из различных источников - человеческих гибридом, трансгенных мышей и in vitro библиотек. Однако, получать стабильные линии человеческих гибридом, продуцирующих высокоаффинные МАТ, удается очень редко по причине отсутствия подходящей клеточной линии человеческой миеломы [5, 6]. Еще одним способом получения МАТ человека стали трансгенные мыши, у которых собственные гены иммуноглобулинов заменены на человеческие [4,7]. Но при таком подходе, как и при получении МАТ человека с помощью гибридомной технологии, набор антигенов, против которых могут быть получены антитела ограничен только теми антигенами, которые могут быть использованы для иммунизации, при этом невозможно получить необходимые в терапии антитела против собственных белков человека [4]. Спектр антигенов может быть практически неограничен, если в качестве источника антигенсвязывающих доменов антител использовать комбинаторные библиотеки. В этом случае антигенсвязывающий сайт антитела желаемой специфичности отбирается из огромных репертуаров фрагментов антител, которые экспонированы на поверхности бактериофагов [8] либо с помощью других дисплейных технологий - на рибосомах [9] или дрожжах [10]. При этом существуют различные подходы к созданию комбинаторных библиотек, и выбор того или иного подхода зависит от конкретной задачи.

В последнее время все чаще технологию фагового дисплея стали применять для отбора рекомбинантных антител с целью получения на их основе терапевтических препаратов для лечения инфекционных заболеваний. Кроме того, такие антитела также используют для исследования антигенной природы различных вирусов [11-15].

Одними из наиболее многочисленных и сложноорганизованных представителей царства Vira являются поксвирусы, которые поражают практически все известные таксономические группы животных, начиная от насекомых и кончая млекопитающими, в том числе и человека, при этом большая часть патогенных для человека поксвирусов относится к роду Ортопоксвирусов [16]. Наиболее патогенными для человека являются вирус натуральной оспы, кроме того, генерализованную инфекцию может также вызывать вирус оспы обезьян. Известно, что вакцинация ВОВ, ранее использованная для ликвидации натуральной оспы, приводит к формированию у вакцинированных людей длительного состояния напряженности иммунитета [17, 18]. Но высокий процент осложнений, возникающих в результате классического оспопрививания, особенно у людей с врожденным или приобретенным иммунодефицитом, делает необходимым разработку новых специфических средств профилактики поствакцинальных осложнений. В настоящее время таким средством является сывороточный вакцинный иммуноглобулин (VIG) [19], тем не менее, его применение сопровождается биологическим риском. Альтернативой VIG могли бы быть протективные моноклональные AT человека против ортопоксвирусов.

Целью данной работы являлось конструирование иммунной комбинаторной фаговой библиотеки scFv антител человека против ортопоксвирусов, отбор из нее вируснейтрализующих антител и исследование их иммунохимических свойств.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• сконструировать и охарактеризовать комбинаторную иммунную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе мРНК лимфоцитов периферической крови доноров, предварительно вакцинированных вирусом осповакцины;

• отобрать из сконструированной библиотеки вируснейтрализующие scFv антитела, специфичные к рекомбинантному белку ргАЗОЬ вируса натуральной оспы, и исследовать их связывание с этим антигеном;

• отобрать из комбинаторной иммунной библиотеки вируснейтрализующие scFv антитела, специфичные к вирусу оспы коров, и исследовать их иммунохимические свойства;

• определить белок-мишень для вируснейтрализующих scFv антител, специфичных к вирусу оспы коров;

• определить аминокислотные последовательности отобранных одноцепочечных антител.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов. Из сконструированной библиотеки впервые отобраны одноцепочечные антитела человека, специфичные к рекомбинантному белку вируса натуральной оспы ргАЗОЬ, способные нейтрализовать вирус осповакцины. Получена панель вируснейтрализующих одноцепочечных антител человека против вируса оспы коров. Сконструирован штамм Escherichia coli, продуцирующий рекомбинантный белок prJ3L вируса оспы коров (штамм Гришак). Показано, что 8 из 10 вируснейтрализующих антител специфически взаимодействуют с рекомбинантным белком prJ3L, а также с его природными аналогами в составе вирионов вируса оспы коров, осповакцины и эктромелии. Получен штамм Escherichia coli, продуцирующий растворимое одноцепочечное антитело Ь9, специфически взаимодействующее с вирусом оспы коров. Определена константа аффинности одноцепочечного антитела Ь9. Определены аминокислотные последовательности всех полученных антител.

Поскольку в данной работе получены антигенсвязывающие домены антител человека, на их основе в дальнейшем могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека. Такие полноразмерные антитела человека, после проверки их противовирусных свойств в модельных экспериментах на животных, могли бы представлять интерес для создания на их основе иммунопрофилактических средств, а также терапевтических препаратов предупреждения поствакцинальных осложнений и, возможно, лечения ортопоксвирусных инфекций.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 7 Международных конференциях: 6th, 7th и 8th Meetings of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Женева, Швейцария, 2004, 2005 и 2006), 18-ой Международной конференции "Antiviral research" (Барселона, Испания, 2005), 7th John Humphrey advanced summer programme in immunologythe interface between immunology and medicine (Москва, Россия, 2005), Международная конференция «Физико-химическая биология» (Новосибирск, Россия, 2006), Международная конференция "Basic Science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, Россия, 2006); и 2 Российских конференциях: III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), VII Межгосударственная научно-практическая конференция (Оболенск, Россия, 2006).

Вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором, за исключением тестирования антител на наличие вируснейтрализующей активности, которое проводилось в лаборатории химических антимикробных препаратов, руководитель к.м.н. Е.Ф.Беланов. Вместе с автором в тестировании антител принимали участие Н.И. Бормотов, З.Ф. Киселева и Т.Э. Юн.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Дубровская, Виктория Владиславовна

выводы

1. Впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов. Размер библиотеки составил 3><10 независимых клонов, функциональный размер - не менее 97%.

2. Получен штамм Escherichia coli, продуцирующий рекомбинантный белок prJ3L вируса оспы коров (штамм Гришак) с уровнем продукции около 15% суммарного клеточного белка.

3. Из сконструированной библиотеки методом аффинной селекции было отобрано 20 уникальных одноцепочечных антител человека, специфичных к рекомбинантному белку вируса натуральной оспы ргАЗОЬ. Было показано, что антитела 4.1 и d4 способны нейтрализовать инфекционность вируса осповакцины.

4. Методом аффинной селекции из сконструированной библиотеки было отобрано 14 уникальных одноцепочечных антител человека, специфичных к вирусу оспы коров. Показано, что 10 из отобранных антител способны нейтрализовать инфекционность вируса оспы коров. Показано, что 8 из 10 вируснейтрализующих антител специфически взаимодействуют с рекомбинантным белком prJ3L, а также с его природными аналогами в составе вирионов вирусов оспы коров, осповакцины и эктромелии.

5. Определены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих вируснейтрализующие антитела и показано, что:

- Vh домены антител 4.1 и d4 принадлежат к 23 подсемейству Vh3 семейства иммуноглобулинов человека, а их Vl домены - к A3 0 и L19 подсемействам УкЗ семейства иммуноглобулинов человека;

- Vh домены антител, отобранных против ВОК, принадлежат к 9 подсемейству Vh3 семейства и к 18 подсемейству VhI семейства иммуноглобулинов человека, а их Vl домены - к 012, 018 и L12 подсемействам VkI семейства и к 16 подсемейству VX1 семейства иммуноглобулинов человека.

6. Впервые получен штамм Escherichia coli, продуцирующий в растворимой форме одноцепочечное антитело Ь9, отобранное против вируса оспы коров. Определена константа аффинности одноцепочечного антитела Ь9 в реакции связывания с вирусом оспы коров, которая составила 3,1хЮ8±0,5ХЮ8 М'1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дубровская, Виктория Владиславовна, Кольцово

1. Maynard J. and Georgiou G. Antibody engineering. // Annu. Rev. Biomed. Eng. -2000. V.2. - P.339-376.

2. Ewert S., Huber T., Honegger A. and Pluckthun A. Biophysical properties of human antibody variable domains. //J. Mol. Biol. 2003. - V.325. - P.531-553.

3. Kohler G. and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. //Nature. 1975. - V.256. - P.495-497.

4. Laffly E. and Sodoyer R. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after . // Hum. Antibodies. 2005. - V.14. - P.33-55.

5. Karpas A., Dremucheva A. and Czepulkowski B.H. A human myeloma cell line suitable for the generation of human monoclonal antibodies. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. - V.98. - P.1799-1804.

6. Kellermann S.A. and Green L.L. Antibody discovery: the use of transgenic mice to generate human monoclonal antibodies for therapeutics. // Curr. Opin. Biotechnol. -2002. V.13. - P.593-597.

7. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E. and Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technology. // Annu. Rev. Immunol. 1994. - V.12. - P.433-455.

8. Hanes J. and Pluckthun A. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. - V.94. - P.4937-4942.

9. Feldhaus M. and Siegel R. Flow cytometric screening of yeast surface display libraries. // Methods Mol. Biol. 2004. - V.263. - P.311-332.

10. Schmaljohn C., Cui Y., Kerby S., Pennock D. and Spik K. Production and characterization of human monoclonal antibody Fab fragments to vaccinia virus from a phage-display combinatorial library. // Virology. 1999. - V.258. - P.189-200.

11. Kim S.J., Jang M.H., Stapleton J.T., Yoon S.O., Kim K.S., Jeon E.S. and Hong H.J. Neutralizing human monoclonal antibodies to hepatitis A virus recovered by phage display. // Virology. 2004. - V.318. - P.598-607.

12. Fields. Virology. Lippincott-Raven Publishers. Philadelphia. New York 1996.

13. Галактионов В.Г., Иммунология, Издательство "РИЦ МКД". Москва. 2000. 488 с.

14. Richard A.Goldsby, Thomas J.Kindt, Janis Kuby, Barbara A.Osborne. Immunology. W H Freeman & Co. 2003.556 p.

15. Chothia C., Lesk A.M., Tramontano A., Levitt M., Smith-Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E.A., Davies D., Tulip W.R. and . Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. // Nature. 1989. - V.342. - P.877-883.

16. Chothia C., Lesk A.M., Gherardi E., Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. and Winter G. Structural repertoire of the human VH segments. // J. Mol. Biol. -1992. V.227. - P.799-817.

17. Morea V., Tramontano A., Rustici M., Chothia C. and Lesk A.M. Conformations of the third hypervariable region in the VH domain of i mmunoglobulins. //J. Mol. Biol. 1998. - V.275. - P.269-294.

18. Tomlinson I.M., Cox J.P., Gherardi E., Lesk A.M. and Chothia C. The structural repertoire of the human V kappa domain. // EMBO J. 1995. - V.14. - P.4628-4638.

19. Kabat E.A., Wu T.T., Perry H.M., Gottesman K.S., Foeller C., Sequences of Proteins of Immunological Interest. US Department of Health and Human Services, Washington, DC -1991.

20. Williams S.C., Frippiat J.P., Tomlinson I.M., Ignatovich 0., Lefranc M.P. and Winter G. Sequence and evolution of the human germline V lambda repertoire. // J. Mol. Biol. 1996. - V.264. - P.220-232.

21. Cox J.P., Tomlinson I.M. and Winter G. A directory of human germ-line V kappa segments reveals a strong bias in their usage. // Eur. J. Immunol. 1994. - V.24. -P.827-836.

22. Barbie V. and Lefranc M.P. The human immunoglobulin kappa variable (IGKV) genes and joining (IGKJ) segments. // Exp. Clin. Immunogenet. 1998. - V.15. -P.171-183.

23. Kawasaki K., M inoshima S., N akato E., S hibuya K., S hintani A., S chmeits J.L., Wang J. and Shimizu N. One-megabase sequence analysis of the human immunoglobulin lambda gene locus. // Genome Res. 1997. - V.7. - P.250-261.

24. Pallares N., Frippiat J.P., Giudicelli V. and Lefranc M.P. The human immunoglobulin lambda variable (IGLV) genes and joining (IGLJ) segments. // Exp. Clin. Immunogenet. 1998. - V.15. - P.8-18.

25. Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. and Winter G. The repertoire of human germline VH sequences reveals about fifty groups of VH segments with different hypervariable loops. // J. Mol. Biol. 1992. - V.227. -P.776-798.

26. Matsuda F. and Honjo T. Organization of the human immunoglobulin heavy-chain locus. // Adv. Immunol. 1996. - V.62. - P. 1-29.

27. Ignatovich 0., Tomlinson I.M., Jones P.T. and Winter G. The creation of diversity in the human immunoglobulin V(lambda) repertoire. // J. Mol. Biol. 1997. -V.268. - P.69-77.

28. Willats W.G. Phage display: practicalities and prospects. // Plant Mol. Biol. 2002. - V.50. - P.837-854.

29. Huston J.S., Mudgett-Hunter M., Tai M.S., McCartney J., Warren F., Haber E. and Oppermann H. Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proteins. // Methods Enzymol. -1991. V.203. - P.46-88.

30. Hoogenboom H.R., de Bruine A.P., Hufton S.E., Hoet R.M., Arends J.W. and Roovers R.C. Antibody phage display technology and its applications. // Immunotechnology. 1998. - V.4. - P. 1-20.

31. Sternberg N. and Hoess R.H. Display of peptides and proteins on the surface of bacteriophage lambda. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. - V.92. - P. 16091613.

32. Zucconi A., Dente L., Santonico E., Castagnoli L. and Cesareni G. Selection of ligands by panning of domain libraries displayed on phage lambda reveals new potential partners of synaptojanin 1. // J. Mol. Biol. 2001. - V.307. - P.1329-1339.

33. Huse W.D., Sastry L., Iverson S.A., Kang A.S., Alting-Mees M., Burton D.R., Benkovic S.J. and Lemer R.A. Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda. // Science. 1989. - V.246. - P. 12751281.

34. Danner S. and Belasco J.G. T7 phage display: a novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. - V.98. - P. 12954-12959.

35. Ren Z. and Black L.W. Phage T4 SOC and HOC display of biologically active, full-length proteins on the viral capsid. // Gene. 1998. - V.215. - P.439-444.

36. Beck E. and Zink B. Nucleotide sequence and genome organisation of filamentous bacteriophages fl and fd. // Gene. -1981. V. 16. - P.35-58.

37. Hill D.F. and Petersen G.B. Nucleotide sequence of bacteriophage fl DNA. // J. Virol.- 1982.-V.44.-P.32-46.

38. Kay B.K., Winter G., McCafferty J. Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual. Academic press. 1996.306 p.

39. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. // Science. 1985. - V.228. - P.1315-1317.

40. Bass S., Greene R. and Wells J.A. Hormone phage: an enrichment method for variant proteins with altered binding properties. // Proteins. 1990. - V.8. - P.309-314.

41. McCafferty J., Jackson R.H. and Chiswell D.J. Phage-enzymes: expression and affinity chromatography of functional alkaline phosphatase on the surface of bacteriophage. // Protein Eng. -1991. V.4. - P.955-961.

42. Scott J.K. and Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. // Science. 1990. - V.249. - P.386-390.

43. Devlin J.J., Panganiban L.C. and Devlin P.E. Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules. // Science. 1990. - V.249. - P.404-406.

44. Barbas C.F., III, Kang A.S., Lerner R.A. and Benkovic S.J. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1991. V.88. - P.7978-7982.

45. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G. and Chiswell D.J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. // Nature. 1990. - V.348. - P.552-554.

46. Clackson T., Hoogenboom H .R., Griffiths A .D. and Winter G. Making antibody fragments using phage display libraries. // Nature. -1991. V.352. - P.624-628.

47. Milstein C. The Croonian lecture, 1989. Antibodies: a paradigm for the biology of molecular recognition. // Proc. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 1990. - V.239. - P. 1-16.

48. Gao C., Mao S., Kaufmann G., Wirsching P., Lerner R.A. and Janda K.D. A method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. - V.99. - P.12612-12616.

49. Rodi D.J. and Makowski L. Phage-display technology-finding a needle in a vast molecular haystack. // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. - V.10. - P.87-93.

50. Rondot S., Koch J., Breitling F. and Dubel S. A helper phage to improve single-chain antibody presentation in phage display. // Nat. Biotechnol. 2001. - V.19. -P.75-78.

51. Duenas M. and Borrebaeck C.A. Novel helper phage design: intergenic region affects the assembly of bacteriophages and the size of antibody libraries. // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V.125. - P.317-321.

52. Skerra A. and Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. // Science. 1988. - V.240. - P.1038-1041.

53. Better M., Chang C.P., Robinson R.R. and Horwitz A.H. Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody fragment. // Science. 1988. - V.240. - P.1041-1043.

54. Larrick J. W., W allace E .F., C oloma M .J., B ruderer ULang A .B. and Fry K .E. Therapeutic human antibodies derived from PCR amplification of B-cell variable regions. // Immunol. Rev. 1992. - V.130. - P.69-85.

55. Marks J.D., Hoogenboom H.R., Bonnert Т.Р., McCafferty J., Griffiths A.D. and Winter G. By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. // J. Mol. Biol. -1991. V.222. - P.581-597.

56. Johnson G. and Wu T.T. Kabat Database and its applications: future directions. // Nucleic Acids Res. 2001. - V.29. - P.205-206.

57. Perelson A.S. and Oster G.F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. // J. Theor. Biol. 1979.-V.81.-P.645-670.

58. Little M., Welschof M., Braunagel M., Hermes I., Christ C., Keller A., Rohrbach P., Kurschner Т., Schmidt S., Kleist C. and Terness P. Generation of a large complex antibody library from multiple donors. // J. Immunol. Methods. 1999. -V.231. - P.3-9.

59. Waterhouse P., Griffiths A.D., Johnson K.S. and Winter G. Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires. // Nucleic Acids Res. 1993. - V.21. - P.2265-2266.

60. Sblattero D. and Bradbury A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. // Nat. Biotechnol. 2000. - V.18. - P.75-80.

61. Geoffroy F., Sodoyer R. and Aujame L. A new phage display system to construct multicombinatorial libraries of very large antibody repertoires. II Gene. 1994. -V.151. - P.109-113.

62. Barbas C.F., III, Bain J.D., Hoekstra D.M. and Lerner R.A. Semisynthetic combinatorial antibody libraries: a chemical solution to the diversity problem. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1992. V.89. - P.4457-4461.

63. Hoogenboom H.R. and Winter G. By-passing immunisation. Human antibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro. // J. Mol. Biol. -1992. V.227. - P.381-388.

64. Braunagel M. and Little M. Construction of a semisynthetic antibody library using trinucleotide oligos. // Nucleic Acids Res. 1997. - V.25. - P.4690-4691.

65. Noronha E.J., Wang X., Desai S.A., Kageshita T. and Ferrone S. Limited diversity of human scFv fragments isolated by panning a synthetic phage-display scFv library with cultured human melanoma cells. II J. Immunol. 1998. - V.161. -P.2968-2976.

66. Carlsson R. and Soderlind E. n-CoDeR concept: unique types of antibodies for diagnostic use and therapy. // Expert. Rev. Mol. Diagn. 2001. - V.l. - P.102-108.

67. Gavilondo J.V. and Larrick J.W. Antibody engineering at the millennium. // Biotechniques. 2000. - V.29. - P.128-6,138.

68. Amersdorfer P., Wong C., Smith T., Chen S., Deshpande S., Sheridan R. and Marks J.D. Genetic and immunological comparison of anti-botulinum type A antibodies from immune and non-immune human phage libraries. // Vaccine. -2002. V.20. - P.1640-1648.

69. Kipriyanov S.M. and Little M. Generation of recombinant antibodies. // Mol. Biotechnol. -1999. V.12. - P.173-201.

70. Welschof M., Temess P., Kipriyanov S.M., Stanescu D., Breitling F., Dorsam H., Dubel S., Little M. and Opelz G. The antigen-binding domain of a human IgG-anti-F(ab')2 autoantibody. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. -V.94. - P.1902-1907.

71. Dantas-Barbosa C., Brigido M.M. and Maranhao A.Q. Construction of a human Fab phage display library from antibody repertoires of osteosarcoma patients. // Genet. Mol. Res. 2005. - V.4.- P.126-140.

72. Li J., Pereira S., Van Belle P., Tsui P., Elder D., Speicher D., Deen K., Linnenbach A., Somasundaram R., Swoboda R. and Herlyn D. Isolation of the melanoma-associated antigen p23 using antibody phage display. // J. Immunol. -2001. V.166. - P.432-438.

73. Маренникова C.C., Щелкунов C.H. Патогенные для человека ортопоксвирусы, КМК Scientific Press Ltd., Москва. -1998. 386 с.

74. Jacobs N., Chen R.A., Gubser C., Najarro P. and Smith G.L. Intradermal immune response after infection with Vaccinia virus. // J. Gen. Virol. 2006. -V.87. - P.1157-1161.

75. Fenner F, Wittek R., Dumbell K., The Orthopoxviruses, Acad. Press., USA -1989.432 p.

76. Chaudhri G., Panchanathan V., Bluethmann H. and Karupiah G. Obligatory requirement for antibody in recovery from a primary poxvirus infection. // J. Virol. 2006. - V.80. - P.6339-6344.

77. Crotty S., Feigner P., Davies H., Glidewell J., Villarreal L. and Ahmed R. Cutting edge: long-term B cell memory in humans after smallpox vaccination. // J. Immunol. 2003. - V.171. - P.4969-4973.

78. Hopkins R.J. and Lane J.M. Clinical efficacy of intramuscular vaccinia immune globulin: a literature review. // Clin. Infect. Dis. 2004. - V.39. - P.819-826.

79. Demkowicz W.E., Maa J.S. and Esteban M. Identification and characterization of vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans. // J. Virol. 1992. -V.66. -P.386-398.

80. Czemy C.P., Johann S., Holzle L. and Meyer H. Epitope detection in the envelope of intracellular naked orthopox viruses and identification of encoding genes. // Virology. 1994. - V.200. - V.164-111.

81. Dotto G.P., Horiuchi K. and Zinder N.D. The functional origin of bacteriophage fl DNA replication. Its signals and domains. // J. Mol. Biol. 1984. -V.172. - P.507-521.

82. Birnboim H.C. and Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucleic Acids Res. 1979. - V.7. - P.1513-1523.

83. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва. 1984.1-477 с.

84. Laemmli U .К. С leavage о f s tructural р roteins d uring t he assembly о f t he head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V.227. - P.680-685.

85. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1979. - V.76. - P.4350-4354.

86. Ichihashi Y. and Oie M. Neutralizing epitope on penetration protein of vaccinia virus. // Virology. 1996. - V.220. - P.491-494.

87. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж., Молекулярная биология клетки. Мир. Москва -1994. С. 215-283.

88. Берзовски Д., Берковер Д. Взаимодействие антиген-антитело. Иммунология. Мир. Москва. 1989. 89 с.

89. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. //Nucleic Acids Res. 1997. - V.25. - P.3389-3402.

90. Brekke O.H. and Loset G.A. New technologies in therapeutic antibody development. // Curr. Opin. Pharmacol. 2003. - V.3. - P.544-550.

91. Tang Y., Jiang N., Parakh C. and Hilvert D. Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology. // J. Biol. Chem. -1996. V.271. - P.15682-15686.

92. Turner D.J., Ritter M.A. and George A.J. Importance of the linker in expression of single-chain Fv antibody fragments: optimisation of peptide sequence using phage display technology. // J. Immunol. Methods. 1997. - V.205. - P.43-54.

93. Vazquez M.I. and Esteban M. Identification of functional domains in the 14-kilodalton envelope protein (A27L) of vaccinia virus. // J. Virol. 1999. - V.73. - P.9098-9109.

94. Meyer H., Osterrieder N. and Czerny C.P. Identification of binding sites for neutralizing monoclonal antibodies on the 14-kDa fusion protein of orthopox viruses. // Virology. 1994. - V.200. - P.778-783.

95. Meyer H., Totmenin A., Gavrilova E. and Shchelkunov S. Variola and camelpox virus-specific sequences are part of a single large open reading frame identified in two German cowpox virus strains. // Virus Res. 2005. - V.108. -P.39-43.

96. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д, Краев А.С., и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Наука. Сиб. отделение, Новосибирск 1990. 248 с.