Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеризация рекомбинантных антител человека против ортопоксвирусов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеризация рекомбинантных антител человека против ортопоксвирусов"

На правах рукописи

Морозова Вера Витальевна

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ОРТОПОКСВИРУСОВ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2005

Работа выполнена в ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗСР РФ.

Научный руководитель

кандидат биологических наук Тикунова Н.В.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Рябчикова Е.И. доктор биологических наук Гуляева Л.Ф.

Ведущая органшация

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск

Защита состоится « 29 » декабря 2005 года в часов на заседании

диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ по адресу: ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559, тел.(383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « 28.» ноября 2005 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Малыгин Э.Г

2006-4 2IS40M

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Род Orthopoxvirus состоит из сложных ДНК-содержащих чирусов, реплицирующихся в цитоплазме клеток позвоночных. Для человека на протяжении всей его истории наиболее важным из ортопоксвирусов был вирус натуральной оспы, который более двух тысяч пет являлся причиной -отидемий опасного генерализованною заболевания Ее гественная трансмиссия натуральной оспы была прервана в 1977 год)', менее чем через два столетия после начала применения профилак! ических прививок вирусом оспы коров и вирусом осповакцины. Возобновление интереса к ортопоксвирусам у исследователей можно объяснить распрос гранением оспы обезьян в Африке и других странах, а также сохраняющейся возможностью использования вируса на1урачьной оспы для биотерроризма.

В настоящее время в мире имеется только две официальные коллекции вируса натуральной оспы, одна из которых находится в ГНЦ ВБ «Вектор». Поэтому по рекомендации ВОЗ в нашей стране была разработана Программа комплексных исследований вируса натуральной оспы, включающая фундаментальные исследования ортопоксвирусов и получение иммунобиологических препаратов. Данная работа выполнялась в рамках этой программы.

Большая часть информации о гуморальном иммунитете к ортопоксвирусам получена при изучении моноклоиальиых антител грызунов против ортопоксвирусов, исключая вирус натуральной оспы, а имеющиеся данные о молекулярных механизмах naiorcHcia вируса натуральной оспы получены на модельных инфекциях лабораторных живо I кмх. Иоэюму панели человеческих антител, специфических к ортопоксвирусам, включая вирус натуральной оспы, кроме их несомненной ценности в качестве источника для разработки иммунопрофииактических и иммунотерапевтических средств, могут быть полезны как инирумент для изучения особенностей иммунологического профиля ортопоксвирусов и молекулярных основ их вирулентности, а шкже 4ля иес юдований особенностей иммунного ответа человека.

Целью данной работы являлось лонучение методами фагового дисплея одноцепотечных антител человека против ортопоксвирусов, включая вирус натуральной оспы, поиск 1руш10специфических или, в случае антител против вируса натуральной оспы, штаммо-специфических антител и отбор алтител, обладающих вирусиейтрали зующими свойствами Для выполнения посгавленной цели необходимо было реши гь следующие задачи.

o'ioopaib из иммунной и сшпет иблио!ек

одноцепочечные антитела человека пр |ая вирус

натуральной оспы, штамм Butler;

- определит!, аминокислотные последовательности полученных одноцепочечных антител;

- исследовать отобранные антитела в реакции кросс-реактивного связывания с различными ортопоксвирусами;

- исследовать связывание (побранных антител с различными штаммами вируса нагуральной оспы,

- провеет поиск вируснейтралшующих антител в полученной коллекции. Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые

получены одноцеиочечные антитела человека против вируса натуральной оспы, штамм Butler, против вируса осповакцины и вируса жтромелии. Определены аминокислотные последовательное га полученных атител. Исследовано связывание антител с различными ортопоксвирусами, выявлены грунпосиецифические антитела Проведенные исследования способности отобранных а шжел к кросс-реактивном у связыванию позволили высказать предположение о вкладе в иммуноло! ические профили ортолоксвирусов шитопов, конформании коюрих могут раччичаться у различных ортоноксмирусов

Впервые исследовано связывание антител с различными штаммами вируса на|уралыгой оспы Впервые обнаружены антитела, обеспечивающие различное связывание штаммов вируса натуральной оспы, обладающих разной вирулентностью (variola major и variola al as I г im)

В ходе данной работы впервые были огобраны одноценочечные антитела человека, способные подавлял» инфекционноегь вирусов осповакцины, оспы коров и жтромелии. На основе данных антител » дальнейшем Moryi быть сконструированы полноразмерные аитшела человека. Такие нолноразмерные антитела человека, после проверки их противовирусных свойств в модельных 'жепериментах на животных, моши бы представлять интерес для создания на их основе иммунопрофилакгических средств, а также терапевтических препаратов для предупреждения поствакцинальных осложнений и, возможно, лечения ор гопоксьирусных инфекций.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетелынва. Материалы диссертации были представлены на 11 Международных конференциях: 5lh John Humphrey Advanced Summer Programme in immunology (Пущяно, Россия, 2000), "Human antibodies and hybridomas" (llpaia, Чехия, 200!; Берн, Швейцария. 2002), 15-ой Международной конференции «Antiviral research» (Ilpaia, Чехия. 2002), на ХШ Международном вирусологическом конгрессе (Париж. 2002), Научной конференции «Проблемы

инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнею Севера» (Новосибирск, 2002); Международной на> ч но-практи ческой школе-конференции «Цитокины. Воспаление Иммунитет. (Санкт-Петербурт, Россия, 2002); 6th John Humphrey Advanced Summer Programme m irnmunology, (Пущино, Россия, 2002), !6-ой Международной конференции ((Antiviral research» (.Саванна, США. 2003), 17-ой Международной конференции «Antiviral research» (Туксон, США, 2004). 18-ой Международной конференции "Antiviral research" (Барселона, Испания, 2005)

Вклад автора. В исследованиях, проводимых с использованием жизнеспособного вируса натуральной осиы в условиях специальной лаборатории с уровнем защиты BSL 3-4, вместе с аьтором участвовали А.А.Гуськов, Е.Б Сокуиова. Т Э Юн, Р.В.Жираковская, F И Ьовшик, кбн ИВ Гикунова Тестирование антигел на наличие вяруспеифалшующгй активности гроподилось в лаборатории общих вирусов, руководитель к м н Е Ф.Беланов, в тестировании анти тел принимали участие вместе с автором НИБормотов и 3 Ф.Киеелсва. Все остальные эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текст«, включая 27 рисунков и 6 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (202 наименования)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В данной работе испольювали иммунную и синтетическую библиотеки одноцепочечных антител человека. Такой выбор был обусловлен хем, что из синтетических библиотек можно получить более широкий спектр антител против определенного антигена, а из иммунных библиотек, как правило, отбирают узкий репертуар специфических антител, но полученные антитела чаще обладают биологической активностью

Иммунная библиотек? однопепочечных антител была сконструирована в лаборатории рекомбипаптных белков ПГЦ ВЬ «Вектор» на основе м!'НК периферических лимфоцитов крови 4 доноров, предварительно вакцинированных вирусом осповакцины Синтетическая библиотека однопепочечных анти>ел человека Griffini была любезно предоставлена Médical Research Center (Кембридж, Англия)

Пропесс получения специфических антител из комбинаторной библиотеки включал несколько последовательных раундов аффинного обогащения (биопигнинга) исходной

библиотеки клонами, продуцирующими специфические антитела, с последующим отбором из обогащенных популяций уникальных антител, направленных против целевого антигена.

В качестве антигенов для аффинного обогащения использовали следующие ортопоксвирусы (рис. 1): вирус осповакцины, штамм ЛИВЛ, и вирус натуральной оспы,

Рис. 1. Антигены, использованные для аффинного обогащения библиотек специфическими антителами. 15% ЗОв-ПААГ:

1 - вирус осповакцины, штамм ЛИВП

2 - вирус натуральной оспы, штамм Ва^ег

1 2

фт

кДа

116

66,2

45 35 25 18,4

штамм Butler, относящийся к группе alastnm штаммов минорной оспы Дяя максимапьно1 о сохранения антшенных профилей ортопоксвирусов в рабоге использовали жизнеспособные вирусы, так как известно, чю инактивация, как правило, разрушает конформационные эгаггопы вирусных белков. Все эксперименты со штаммами вируса натуральной оспы, то есть аффинное обогащение библиотеки, отбор и исследование отобранных фаговых антител, проводили в специальной лаборатории со степенью защи гы BSL 3-4, сертифицированной ВОЗ и Министерством здравоохранения РФ.

В ходе экспериментов было независимо проведено аффинное обогащение синтетической библиотеки клопами, продуцирующими ангитеяа против вируса осповакцины, и клонами, продуцирующими антитела против вируса натуральной оспы (рис. 2). Иммунная библиотека была обогащена клонами, продуцирующими антитела против вируса осповакцины (рис. 2).

Для того, чтобы избежать отбора антител на содержащиеся в вирусных препаратах белки тканевого или клеточного происхождения, в ходе аффинной селекции

Натуральная иммунная

библиотека однсцепочечных антител человека

(Лаборатория рекомбинантных белков, ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор»)

С

Вирус

осповакцины

Фаговые антитела

IIUSÍÍ

Синтетическая библиотека одноцепочечных антител человека (MRC, Кэмбридж, Англия)

С

Вирус

осповакцины

Вирус

натуральной оспы

SU Mi

Рис. 2. Аффинное обогащение иммунной и синтетической библиотек клонами, специфическими к вирусу осповакцины и вирусу натуральной оспы.

использовали вирусы, наработанные па различных объектах. I ак, аффинное обогащение библиотек антшелами. специфическими к вирусу осповакцины, велось с использованием вируса, полученного в результате пассажей на коже телят, а отбор клонов осуществлялся против вирусов осповакцины и эктромслии. наработгшых на ХАО РЮ При аффинной селекции антител прогив вируса натуральной оспы в первом и втором раундах обогащения был использован вирус, очищенный из ХАО РКГ), а третий раунд обогащения проводился против вируса, наработанного на культуре клеток Vero Ь6. В этом случае отбор клонов осуществляли против ВНО, очищенного из ХАО РЮ

Надо отметил, «то ясночьзованный нами способ очистки ортоноксвирусных препаратов позволяет получить хорошо очищенную популяцию зрелых внутриклеточных вирионов (IMV), что подтверждалось 0|сутетвием у данных препаратов гематгяютинирующих свойств.

Всего было проведено по 3 раунда биотннинга с каждым вирусом. Полученные после каждого раунда селекции поликлонадьные популяции фаговых антител, а также исходные библиотеки ;естировали методом ИФА для оценки изменения связывания с соотретс|вую)цим вирусом, использованным для аффинного обогащения Результаты

тестирования показали значительное превышение сигнала при связывании антигена фаговыми популяциями, полученными после 3-ю раунда селекции, над сигналом, обеспечиваемым исходными библиотеками, что подтвердило обо!ащение их фагами, экспонирующими на поверхносгн зсГ-'у антитела против ортопоксвирусов (рис. 3.).

2,5 2

i5 о ,

О 1

0,5 0

ала

Раунды селекцид1

1,4 1,2 . 1

0,2

m in

■вно

0 белок TBI Q6CA

Раунды селекции

\ Т, 'Ъ Раунды селекции

Рис 3 ИФА связывания с ортоиоксвирусами поликлональных

фаговых популяций ангшел, полученных в результате раундов аффинного обращения иммунной (А) и синтетической библиотеки (Б) против ВОВ, и синтетической библиотеки против ВНО (В).

Контроль неспецифического связывания-белок ТВ1 и бактериофаг М13К07, не несущий на своей пооверхности фрагментов антител.

Из популяции клонов, полученной в результате обогащения иммунной библиотеки антителами про шв вируса ословакцины, 8 клонов, продуцирующих антигела (2VC3, 2VD1Ü, 3VA10, 4VC1. 3VB7, 3VF11, 2VAS, 3VG8), оказались позитивными но связыванию вируса осповакцины в ИФА.

Из популяции клонов, полученных в резулыате обогащения синтетической библиотеки антителами прогив вируса осповакцины, было отобрано по связыванию с вирусом осповакцины в ИФА 7 клонов, продуцирующих антитела (1F4, 10Н2, 16НЗ, 8С5, 8G4, I0E3, 1501 ). Аналогично, из популяции клонов, полученных в результате обогащения синтетической библиотеки антителами против вируса плюральной оспы, щтамм Butler, было отобрано по связыванию с вирусом натуральной оспы 7 положительных клонов, продуцирующих антитела (2В2, 2В20, 2В36, 2В34, 2В25, 2В28, 2ВЗ).

Известно, что вирус эктромелии не является инфекционным агентом для

человека, поскольку способен размножаться тишь в организме мелких 1рызунов. Подобно вирусу натуральной оспы вирус эктромелии имеет одного хозяина и способен вызывать генерализованную инфекцию восприимчивого организма. Поэтому вирус эктромелии, штамм К-1, также был использован нами в качестве антигена для отбора специфических антител.

Из обогащенной против вируса осповакцины иммунной библиотеки было отобрано по связыванию с вирусом эктромелии в ИФА 10 клонов, продуцирующих антитела. Данные антитела при дальнейшем анализе оказались одинаковыми с отобранными против вируса осповакцины из этой же библиотеки.

Из синтетической библиотеки, обогащенной антителами к вирусу осповакцины, было отобрано по связыванию с вирусом эктромелии в ИФЛ 5 клонов, продуцирующих антитела, 3 из которых совпали с антителами, отобранными на вирус осповакцины из >той же библиотеки, а 2 (9G2 и 20Л5) оказались уникальными.

Далее в ходе работы были определены нуклеотидные последователымсти генов, кодирующих отобранные анштсла и с использованием программы «VectorNTI», баз данных IgBT ASI и V-base проанализированы соответствующие им аминокислотные последовательности. В результате анализа последовательностей антител, отобранных из иммунной библиотеки, выяснилось, что вариабельные домены тяжелых цепей 7 клонов (2VC3, 2VD10, 3VA10, 4VC1, 3VB7, 2VA8, 3VFin относились к УкЗ-ссмейству, а вариабельный домен тяжелой цепи клона 3VG8 принадлежал Vhl-семейству. В то же время вариабельные домены легких цепей всех проанализированных клонов принадлежали к типу к-1.

В результате анализа последовательностей антител, отобранных из сишетической библиотеки, было выявлено, чю вариабельные домены тяжелых целей 8 антител (9G2, 8Ü4, 16НЗ, 2В28, 2В36, 2В2, 2В25, 2В34) относились Vhl-семейству, а еще 8 антител О 0112, 10ЕЗ, 20А5, 1F4, 8С5, 15G1, 2В20, 2ВЗ; имели в своем составе вариабельные домены тяжелых цепей УЬЗ-семейства. Что касается классификации полученных последовательностей вариабельных доменов легких пеней антител, то VI-домены 8 антител C8G4, 9G2, ÎF4, 15G1, 10ЕЗ, 2В20. 2В34, 2ВЗ) относились к ХЗ-типу, а VI-домены еще 8 антител (16НЗ, 8С5, 10Н2, 20А5, 2В2, 2В36, 2В28, 2В36, 2R28, 2В25) принадлежали к типу к-1.

Таким образом. Vh-домены всех отобранных из обеих библиотек антител, относились к Vhl- и УМ-семействам. Отбор Vh-доменов, принадлежащих к этим двум семействам, из иммунной библиотеки может быть связан с тем, что данные семейства Vh-доменон представлены п человеческом организме в наибольшей степени и

максимальном разнообразии по сравнению с остальными Также известно, чю Vh3- и Vhl-домены одноцепочечных антител обладаю! максимальной термодинамической стабильностью и способны принимать правильную конформацию /и vivo, что может быть причиной отбора таких Vh-доменов из синтетической библиотеки.

Далее, все фаговые антитела, отобранные из иммувной библиотеки, исследовали в реакциях кросс-реактивного связывания с вирусами оспы коров (ВОК), эктромелии (ВЭ) и осповакцины (ВОВ) (рис. 4).

Рис. 4 Антигены, использованные в реакции кросс-реактивного связывания. 15% ЗОБ-ПА АГ. Дорожки:

1. вирус осповакцины, штамм ЛИВП 2 вирус эктромелии, штамм К-1, очищен из ХАО РКЭ

3. вирус эктромелии, штамм К-1, очищен из культуры клеток

4. маркер молекулярных масс

5. вирус оспы коров, шгамм Гришак

1 2 3 4 5

кДа

<- - 216

<- 132

78

45,7 32,5

18,4

По результатам проведенных экспериментов, отобранные фаговые антитела можно разделить на две группы. Антитела первой группы (ЗУА10. ЗУВ7, ЗУ08. ЗУРП) отличаются друг от друга по связыванию исследуемых вирусов, но каждое из них выявляет приблизительно равные концентрации разных представителей данного рода (рис. 5а). Вероятно, эти антитела являются родосиецифическими. Ко второй группе относятся антитела 2УСЗ, 2\Т)10, 2УА8, связывающие разные виды сртопоксвирусов (ОИВ1 с различной эффективностью (рис. 56). При этом антитела 2УСЗ и 2УОЮ связывают вирусы осповакцины и эктромелии эффективнее, нежели вирус оспы коров, а антитело 2УА8 не связывает вирус эктромелии (рис 5в). Это антитело является строго группоспецифичсским. Вероятно, эпитоп, узнаваемый этим антителом, отсутствует у вируса эктромелии.

2УА8

1,8

Рис. 5 Примеры свя ¡ывания АТ с различными оргопоксвирусами в ИФА при последовательных разведениях антител. ВОВд - вирус основакцины, пассированный ча коже телят, ВОВх -вирус осповакцины, наработанный на ХАО РКЭ, ВОК - вирус оспы корон, ВЭ - вирус эктромелии БС А - бычий сывороточный альбумин (кожроль неспецифическот о связывания)

Аналошчно были исследованы уникальные АТ, отобранные из синтетической библио!еки против ВОВ, В НО и ВО По результатам проведенных экспгримгнюв, среди А Г, отобранных из синтетической библиотеки, также можно выделить антитела, способные связывать разные виды оргоноксвирусов с различной эффективностью К этой группе относятся антитела 902, 20А5. отобранные по связыванию с вирусом "жтромелии. и антитспо !Р4, отобранное по связыванию с вирусом осповакцины Остальные исследованные А'Г выявляли приблизительно равные концентрации разных ортопоксвирусньга антигенов, отличаясь при этом друг от друга по связыванию исследуемых вирусов.

Разные представители рода ортопоксвирусов обладают высоким серологическим сходством при сильно различающихся биологических свойствах, поэтому антигенная структура ортопоксвирусов являлась предметом изучения многих авторов В настоящее время полагают, что иммунологический профиль отдельных видов ОПВ создается как из

набора родо- и видоспецифических эгш топов, так и и; композиции опшопов, складывающихся для каждого вида в определенную мозаику, причем па мозаичная композиция вносит значительный вклад в формирование разнообразия ортопоксвирусов

В нашей работе были отобраны фаювые антитела, связывающие разные виды ортопоксвирусов с различной эффективностью. Ранее были получены коллекции мышиных МКА, специфических к различным видам ОПВ, часть МКА также продемонс i рировали способность по-разному взаимодействовать с различными видами орюпоксмир>сов Исходя иi по ¡ученных ретультатов можно нредноложить, что наряду с видоснеиифическими эпитонами ортопоксвирусных белков существую! и общеродовые зпитотты, конформации которых имеют некоторые различия у разных видов ортопоксвирусов. Возможно, эпигоны, узнаваемые AT 1F4, 902, 20А5, 2VC3 и 2VD10. обладают межвидовыми конформ анионными отличиями, и подобные омичия вносят существенный вклад в формирование иммунологических профилей ортопоксвирусов.

В данной работе впервые была сделана попытка обнаружить штамм-спеиифические эпигопы вируса натуральной оспы (ВПО). Известно, что штаммы вируса натуральной оспы рашичаются по степени тяжесш заболевания, которое они вызывают, и по уровню смертности К vitriola major относят возбудителей, вызывавших классическое заболевание, приводившее к летальном) исходу у 10 - 40% невакцинированых пациентов, тогда как смертность при заболевании, вызванном variola minor (,alastrim.), составляла менее 1%.

Поиск штамм-специфических эпитопов проводили с помощью фаговых антител, отобранных из синтетической библиотеки по способности специфически связывал в ИФА ВОВ, ВЭ и ВНО. В работе использовали штаммы вируса натуральной оспы, относящиеся к ■рупнам штаммов как variola major (штаммы Ind-За, Соп-9, Kiiw-5), так и alastrim (Butler, Brazil 131) (рис 6). Все использованные штаммы ВПО принадлежа! коллекции ГИД ВБ «Веморл.

Результаты экспериментов показали, что большинст во фат овых антител отличались между собой по эффективности связывания исследуемых штаммов вируса натуральной оспы, по каждое из них выявляло приблизительно равные концентрации разных представителей данного вида (рис 7) Исключение составили антитела 2В2 и 902 (рис. 7). Оба них фаговых антитела эффективнее связывали штаммы труппы alastrim, нежгли штаммы variola major. Вероятно, эпитет, узнаваемый фаговыми антителами 2В2 и 9G2, обладает межштаммовыми конформапиоттными отличиями для ВНО. Следовательно, штаммы вируса натуральной оспы также могут иметь различия в иммунологических профилях за счет конформационных отличий в аналот ичньтх эпигонах.

Рис. 6. Штаммы ВНО, использованные для поиска штаммоспецифических опитопов. !5%SDS-ITAAr. Дорожки: 1 - ВНО, ВгагйП!; 2 - ВНО, Butler; 3 -ВНО, K.uw-5; 4 - ВНО, Соп-9: 5 - маркер мол. масс; 6 - ВОВ, ЛИВП; 7 - ВНО, Ind-3a.

А

28? 2ВЗ 2В20 2825 2В28 2В34 2ВЭ6 1Р4 8С6 8CJ4 9Ü2 100 10К2 15G1 I6H3 20А5

Рис. 7. Связывание фаговых антител, отобранных против BHO-Butler (А) и ВОВ- ЛИВП (В) с различными штаммами вируса натуральной оспы в ИФА при последовательных ра ¡ведениях антигенов. Начальная концентрация вирусов 6 мкг/мл. S - Ind-За, ■ - CongO-9, ■Kow-5, □Butler, Ш Brazil 131

Для фаговых антител 9G2 и 2В2 были определены белки-мишени. Для этого белки ВОВ (ЛИВП) и ВНО (Butler), разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с данными фаговыми AT Оказалось, что оба AT выявляют белок ВОВ с молекулярным весом около 34 кДа и аналогичный белок ВНО (рис. 8).

Рис 8. Взаимодействие фаговых антител 902 и 2В2 с ВОВ (А) и ВНО (Б) в Вестерн-блот анализе. А' 1 - связывание антитела 902 г ВОВ, 2 связывание антитела 2В2 с ВНО, 3 -связывание антитела апИ'-ТЬу с вирусом осповакцины (контроль специфичности связывания). Б: 1 - связывание антитела апй-ТЬу с ВНО (контроль специфичности связывания), 2 -связывание антитела 9С2 с ВНО; 3 — связывание антитела 2В2 с ВНО, 4 - связывание поликлональной фаговой популяции с ВНО.

Мы предположили, что связываемый белок является продуктом экспрессии открытой рамки трансляции (ОРТ) НЗЬ по нумерации, соответствующей НшсШ1-рестрикционной карте ДНК штамма Копенгаген вируса осповакцины. Белок, кодируемый ОРТ НЗЬ, является мембранным белком внутриклеточного зрелого вириона (1МУ) с молекулярным весом 34 кДа и содержит на Ы-конце различные аминокислотные остатки у мажорных и минорных штаммов ВНО.

Следует отметить, что гены, кодирующие У1-домены одноцепочечных антител 2В2 и 902, принадлежат к различным типам (табл 1), а гепы, кодирующие УЬ-домены этих

аитител, хотя и принадлежат к одному семейсгву, но имеют совершенно разные С1ЖЗ фрагменты, структура которых, как известно, траст решающую роль в процессе узнавания антителом специфического антигена.

Таким образом, в результате проведенных эксиерименюв нам не удалось выявить строго ппаммоспецифических АТ, но были выявлены два различных фаговых А'1, которые выявляли низко вирулентные (и1а.Ипт) штаммы эффективнее, чем остальные шгаммы ВПО. Следовательно, штаммы вируса натуральной оспы также могут иметь различия в иммуиоло] ических профилях за '„чет информационных отличий в аналогичных эпиюпах

Все полученные нами антитела были протестированы в реакции внрушейфализации, то есть подавления бтяшкообразования в культуре клеток УегоРб. Три антитела ЗУАЮ, 4УС1 и 2У010, отобранные из иммунной библиотеки, и два антитела 16НЗ и 10Н2, отобранные из сицтетической библиотеки, обладали вируснейтрализующей активностью (табл 1). Добавление к вирусной суспензии А Г ЗУА10 и 4VС1 в концентрации приблизюельно 1нмоль/мл приводило к уменьшению количества вирусных бляшек в культуре клеток на 50% (рис. 9) В случае АТ 2\Т)1(1 16НЗ и 10112 для получения тою же эффекта необходимо было использовать концентрацию антител в 17-20 раз больше При этом АТ ЗУА10 обладало способностью нейтрализовать все исследованные орюпоксвирусы.

Так как аминокислотные последовательности антител ЗУА10 и 4\'С 1 имеют отчичия только в каркасных районах У1-домена и отличие в одном аминокислотном остатке С1Ж1 легкой цепи, вероятно, оба оц-АТ взаимодействуют с одним и тем же вируснейтрализующим эпигоном. В то же время, УЪ-домеиы вируспейфализующих А Г ЗУАЮ и 2У010, отобранных из иммунной библиотеки, обладают одинаковыми СОЯ!, СТЖ2, но имеют различия в С О КЗ фрагментах; кроме тою, существенно различаююя их

VI-домены По-видимому, данные различия имеют решающее значение для уровня вируснейтрализующей активности данных АТ.

Надо отметить, что А1 !6НЗ и 10Н2, отобранные из сшпетической библиотеки, обладали совершенно различными последовательностями ! ипсрвариабсльных районов как

VII- так и VI-доменов (табл. 1).

Все антитела, отобранные из синтетической библиотеки, были протестированы на вируснейтрализационную активность в отношении ВНО. Ни одно ьроверошое А1 такой активностью не обладало.

180 00

-60 ос

140 00

120,00

о

о 100 00

X

1 80,00

с:

> 50,00

40 00

20,00

0 00

0 07 0,27 1,06 4,25 17 Концентрация АТ нмоль/мл

—0—4 -£3-5 -А-6

Рис 9. Реакция нейтрализации фаговым антителом ЗУД 10 образования бляшек 011В в культуре клеток УетоЕб Уп - количество бляшек в пробе, Уо - количество бняшек в контроле вируса Графики' I, 2, 3 - фаговое антитело ЗУА10; графики 4, 5, 6 -контроль неспецифической

нейтрализации (фаговое антитело атМ Ьу) 1,4- ВОВ, 2, 5 ВОК; 3, 6- ВО.

Результаты Вестерн-блот анализа белков ВОВ, ВОК и ВЭ показали, что нейтрализующие АТ 16113 и 10Н2 не выявляли белков-мишеней, а анштела ЗУА10 и 2УОН) выявляли белок оргопоксвирусов молекулярным весом около 34 кДа (рис.10) Среди с[рук1урпых белков ОГ1В известны 2 мембранных иммунодомипантных белка с молекулярным весом около 34 кДа, антитела к коюрым имеют вируспейтрализующую активность. Это белки, кодируемые ОРТ НЗГ, и ОРТ 081,. Возможно, АТ 3\"А10 и 2УГ>10 выявляют один иних.

Все отобранные АТ были протестированы методом Вес I ерн-блот аналша, и бьшо показано, что большинство полученных АТ не выявляли белков ортопоксвирусов. Верояттю, эти АТ взаимодсйс1вовали с конформационными эпитопами, которые разрушаются при проведении шектрофореза в восстановительных условиях Кроме вышеперечисленных АТ, только фаговое антитело !Р4 выявляло белок ортопоксвирусов молекулярным весом нриблнзитечьно 27 кДа (рис. 11).

А

Б

12 34567 8

34кДа

! <

! !

Ц-

кДа

116 66,2

35 25

18,4

14,4

123456 7 8

34кДа

f! >

fs

Т

кДа

116 66,2

35 25

18,4 14,4

Рис.10. Взаимодействие фаговых антител 2У1310 (А) и ЗУАЮ (Б; с белками ортопоксвирусов в Вестерн-блот анализе: 1,3, 5 - связывание антитела апй-ТЬу с ВОВ, БОК и ВЭ соответственно (контроль специфичности связывания), 2, 4, 6 - связывание антител 2У1310 (А) и ЗУАЮ (Б) с белком 34 кДа ВОВ, ВОК и ВЭ, соответственно, 7 -- вирус осповакцины, иммобилизованный ни нитроцеллюлозной мембране, 8 - белковый маркер молекулярных весов.

27 кДа

1 2 3 4 5678

4

кДа

116 66,2

35 25

18,4

14,4

Рис. 11. Взаимодействие фагового антитела 1F4 с белками ОПВ в иммуноблот-анализе: 1, 3, 5 - связывание антитела anti-Thy с ВОВ, ВОК и ВЭ соответственно (контроль специфичности связывания) 2, 4, 6 - связывание антитела 1F4 с белком 27кДа ВОВ, ВОК и ВЭ, соответственно, 7 - вирус осповакцины, иммобилизованный на нитроцеллюлозной мембране, & - белковый маркер молекулярных весов.

Таблица 1

оц-АТ Т Vh ! VI

CDR1

CDR2

CDR3 Vh- —! Выявляемый в имму 1106.101 е белок-^

Вирусней грали зующая

Vh-димена Vh-домена домена ортоноксвир\сов, кДа am явность

■ BOB BOK В'Э BHO BOB BOK ВЭ BHO

2VD10 Vh3 Kl DYAMH GISWNSGFIGYADSVKG DMAARRG 34 34 34 H.O + - + H. 0.

3VA10 Vh3 K1 DYAMH GISWNSGFIGYADSVKG GSIAALRGH 34 34 34 H.O +++ +++ +++ 1 H. 0. __ L .

rivci Vh3 Kl DYAMH GISWNSGFIGYADSVKG GSÍAALRGH 34 34 34 H.O +++ H. 0 H. 0 H. 0

16HJ Vhl K1 GSAVQ NIWGSGNTNYAQKFQE REDQQSKTRV - - ■ - + -

ю ю Vh3 Kl NHYTS YSSGNSGY'INYADSN KG YTAl'LFDY ■ - - + - -

1F4 Vh3 .. X3 DYYMS Y'ISSSGSTIYY AI) SVKG NKKKGKFAE 27 27 27 27 - - -

9G2 Vhl X3 SYAMH WINAGNGNT KY SQKFQG RIRLRIGTK 34 34 34 34 - • -

2В2 Vhl Kl SYAMH 1 1 WINAGNGNTKYSQKFQG RSLRPAGPH 34 34 34 34 - -

Таким образом, в ходе проделанной работы впервые были отобраны бактериофаги, экспонирующие на своей поверхности одноцепочечные антитела человека прочив вируса натуральной оспы, штамм Butler, против вируса осповакцины и вируса жтромелии. Определены аминокислотные последовательности порченных антител Исследовано связывание полученных антител с жизнеспособными ортопоксвнрусами, включая различные штаммы вируса натуральной оспы, показана способность полученных антител к кросс-реак¡ивному связыванию различных представителей этого рода. Выявлены групяоепецифические антитела, впервые обнаружены антитела, обеспечивающие различное связывание штаммов вируса натуральной оспы, об латающих разной вирулентностью (variola major и variola alastrini). Часть антител из полученной коллекции связывали эпитопы оргопоксвирусов, обладающие межвидовыми и межшгаммовыми конформационными отличиями, а одно антитело являлось группоспецифическим, т с вяаимодей с ш > нал о с эпитопом, отсутствующим на поверхности ьируса эктромелии Кроме того, в ходе данной работы впервые были отобраны одноцепочечные антитела человека, способные подавлять инфекционное 1Ь вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены фаговые одноцепочечные антитела человека против вируса натуральной ослы, вируса осповакцины и вируса жтромелии. Определены аминокислотные последовательности полученных антител и показано, что V-сегмсн1ы тяжелых цепей полученных антител относятся к семействам Vhl и Vh3 иммуног лобулинов человека, а V-сегменгы легких цепей принадлежа! к kl и ¡3-лодтиггам.

2. Исследовано связывание полученных антител с оргопоксвирусами. выявлены антитела, обеспечивающие различное связывание вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии, отобрано групноспецифическое антитело, узнающее шитоп, который отсутствует на поверхности вируса эктромелии

3. Впервые обнаружены антитела, обеспечивающие различное связывание штаммов вируса нагуралыюй оспы Varrola major (штаммы Ind-3a, Oon-9, K.uw-5) и varrola minor (штаммы Butler, Bra/ill31).

4. Впервые выявлены одноцепочечные антитела человека, способные подавлять инфскционность вирусов осповакцины, оспы корон и эктромелии и показано, чго эти антитела связывают белок оргопоксвирусов с молекулярным весом приблизительно 34 кДа.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. NV.Tikunova, V V Moro-/ova. Т.А Batanova, E.RBelanov. N I Bormotov, А.Л Ilyichev. Phage antibodies from combinatorial library neutralize vaccinia virus./'Human antibodies and Hybridomas,- 2002 - V. 10 - P 95-99

2. H.B Гикунова, Е.Ф Бечанов, В В.Морозова, Т А Батанова, Н И.Бормотов, Ч.Г.Овечкииа А.А Ильичев, академик JI С.Сапдахчиев. Фаговые антитела способны нейтрализовать вирус осповакципы //Доклады Академии паук -2002-т 382, №1, С. 124-126

Ч В В Морозова, Н В Гикукова, Г А.Батанова, Т О Юн, Ь.И Бовшик, Е В Жираковская, В.В.Воропина, Д.И.Бобко, Е Ф Беланов, А А Ильичев. Л С Сандахчиев Мини-ачтитета человека против оргопоксвирусов /'Вестник-РАМН - 2004 - № 8 С. 22-27

4. ¡1 В.Тикуиова, РИБовшиь, Т.Э.Юн, Е.В.Жираковская, В.В Морозова, 1 А.Батанова, А A I уськов, Е.Б.Сокунова, А.А.Ильичев, JI.C Сандахчиев. Рекомбинантные антитела человека против вируса натуральной оспы.//Вопросы вирусологии. - 2005 - N>6 С. 20-25

5. Воронина В.В., Тикунова Н.В., Морозова ВВ., Бормотав НИ , Ламан А.Г., Улизин А.Б., Бровко ФА., Ьеланов Е Ф.. Ильичев А.А. Комбинаторная фаговая библиотека одноцепочечных антиген человека, обогащенная антитечами против вируса остювакцины, рекомбинантнаа фа! чиднаи ДНК pHEN-ЗАЮ, содержащая уникальный гея одноцепочечного антитела человека, способною нейтрализовать ортопоксвирусы, и искусственное одноцепочечное атитело человека ЗА10, способное нейтрализовать ортопоксвирусы.// Заявка на патент РФ Справка о приоритет № 2005125994 от 15.08.05

6. Morozova V.V., Belanov E.F, Batanova 1.A.. 1'ikimova N V. "Selection of single-chain antibodies to vaccinia virus from combinatorial libraries" 5th John Humphrey Advanced Siiinjner Programme in Immunology, 2000. Puschino, Russia

7. V.V Moro/ova, E.r.Belariov, T.A Batanova, NV.'likunova Selection of single-chain antibodies to vaccinia virus from combinatorial phage library//Human Antibodies and Hybridomas, 2001, Conference, Prague, Czech Republic. Human Antibodies, 2001, V. i 0, №1, P.27-28.

8. liyichev AA, Morozova VV, Batanova 1 A, Iikunova NV Human

18

miniantibodies. against orthopoxviruses. //Human antibodies and Hybridomas, Conference, 2.002, Berne. Switzerland. Human antibodies, 2002, V.J1, № 1-2 1'.23.

9. Ilyichev A.A., Morozova V.V., Tikunova N V., Belanov E.F., Batanova T.A. Characterization of orthopoxvirus, antigenic profile using combinatorial phage antibodies.ХП International Congress of Virology, 2002, Paris, France Book of abstracts, P.460.

10. 15й1 International conference on antiviral research Prague, Czech Republic. 2002. Antiviral research - 2002 - V.53, P. A64 Морозова B.B., Базанова T.A., Беланов Е.Ф, Бормстов Н.И., Ильичев А А., Тикунова Н.В. Иммунохимические и биологические свойства рекомбинантных моноклональямх антител че швека против вируса осповакцины. II Научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнею Севера». 2002. Новосибирск. С.253.

12. Бовшик КИ., 1икунова Н.В, Гуськов А. А. Морозова В.В., Юн ТЭ, Жираковская Е.В., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Получение рекомбинантных антител человека против вируса натуральной оспы. Международная конференция «Проблемы инфекционной паюлогии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» 2002, Новосибирск. С 253.

13 Морозова В.В , Батакова Т.А., Беланов Е.Ф., Бормотов Н.И , Ильичев А.А., Тикунова Н.В Иммунохимические и биоло! ическье свойства рекомбинантных моноклональных антител человека против вируса осповакцины. Международная научно-практическая школа-конференция "I(шокины. Воспаление.Иммунитет'' Санкт-Лстербург, Россия - 2002

14. Bovshik F,.l., Yun Г.Ь, Morozova V.V., Guskov A.A., /Jiirakovskaya E.V., Ilyichev A.A., Tikunova N. V Development of combinatorial human antibodies to variola virus. 6th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, 2002, Puschino. Russia.

15. N V,Tikunova, V V.Moro/ova, E.I.Bovshik, E F Belanov, A A.Guskov, T E Yun, A. A.Ilyichev, I.R.Sandakb^hiev Combinatorial antibodies against jrthopoxviruses. 16th International conference on antiviral research Savannah, C-a, USA 2003 Antiviral research. 2003 - V 57. P. A73

16 R l.Bov^hik, T.EYun, E.V.Zhirakovskaya, V V. Murozova, A.A.Guskov, TA.Batanova, AA.Ilyichev, N.V.Tikunova. Combinatorial Antibodies against Orthopoxviruses. 17^ International conference on antiviral research. Tucson, USA 2004. Antiviral research. 2004 V 62. P. A62.

i 7. V.V.Morozova, V V.Voronina, M V.Shveigert, E F.Belanov, A.A.Ilyichev, N.V.Tikunova. Group-spccific and neutrali?ing human scFv to Orthopoxviruses from a combinatorial phage library. 18th International conference on antiviral research. Barcelona, Spain. 2005. Antiviral research. 2005 - V.65. P A83.

ir

Подписано к печати 21 ноября 2005г. Тираж 100 экз. Заказ № 1696. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

№2506$

РНБ Русский фонд

2006^4 29968

í-

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Морозова, Вера Витальевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Краткая классификация семейства поксвирусов.

1.2.Структура и морфогенез ортопоксвирусов.

1.3.Краткая характеристика генома ортопоксвирусов.

1.4.Механизмы распространения вируса.

1.5.0сновные методы исследования ортопоксвирусных белков.

1.6. Белки вириона.

1.6.1 .Основные белки сердцевины вириона.

1.6.2.Мембранные белки зрелой вирусной частицы.

1.6.3.Белки дополнительных мембран вириона.

1.7.Использование иммуноглобулинов, направленных против ортопоксвирусов.

1.8. Фаговый дисплей.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1.Реактивы и материалы.

2.2.Метод ы.

Глава 3. Результаты.

3.1.Получение препаратов ортопоксвирусов.

3.2.Аффинная селекция антител против вируса осповакцины из иммунной

§г библиотеки.

3.3. Аффинная селекция антител против вируса осповакцины из синтетической библиотеки.

3.4. Аффинная селекция фаговых антител против вируса натуральной оспы из синтетической библиотеки.

3.5.Отбор фаговых антител против вируса эктромелии.

З.б.Определение аминокислотных последовательностей отобранных одноцепочечных антител.

3.7.Исследование связывания отобранных фаговых антител с различными ортопоксвирусами.

3.8.Исследование связывания фаговых антител, отобранных из синтетической библиотеки с различными штаммами вируса натуральной оспы.

• 3.9.Исследование антигенной специфичности отобранных антител.

3.10.Исследование вируснейтрализующих свойств антител.

Глава 4. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и характеризация рекомбинантных антител человека против ортопоксвирусов"

Род Orthopoxvirus является наиболее известным в семействе Poxviridae, включающем в себя сложные ДНК-содержащие вирусы, реплицирующиеся в цитоплазме клеток позвоночных и беспозвоночных. Для человека на протяжении всей его истории наиболее важным из ортопоксвирусов был вирус натуральной оспы, который более двух тысяч лет являлся причиной эпидемий опасного генерализованного заболевания. Естественная трансмиссия натуральной оспы была прервана в 1977 году, менее чем через два столетия после начала применения профилактических прививок вирусом оспы коров и вирусом осповакцины. Возобновление интереса к ортопоксвирусам у исследователей можно объяснить распространением оспы обезьян в Африке и других странах, а также сохраняющейся возможностью использования вируса натуральной оспы для биотерроризма. Причем стихийному или преднамеренному распространению оспы обезьян или натуральной оспы может способствовать то, что в настоящее время большая часть населения иммунитета к оспе не имеет.

В настоящее время в мире имеется только две официальные коллекции вируса натуральной оспы, одна из которых находится в Векторе. Поэтому по рекомендациям ВОЗ в нашей стране была разработана Программа комплексных исследований вируса натуральной оспы, включавшая фундаментальные исследования ортопоксвирусов и получение иммунобиологических препаратов. Данная работа была выполнена в рамках этой программы.

Следует отметить, что большая часть информации о гуморальном иммунитете к ортопоксвирусам получена при изучении моноклональных антител грызунов против вируса осповакцины и вируса оспы обезьян, а имеющиеся данные о молекулярных механизмах патогенеза вируса натуральной оспы получены на модельных инфекциях лабораторных животных. Поэтому панели человеческих антител против ортопоксвирусов, включая вирус натуральной оспы, кроме их несомненной ценности в качестве источника для разработки иммунопрофилактических и иммунотерапевтических средств, могут быть полезны как инструмент для изучения особенностей иммунологического профиля ортопоксвирусов и молекулярных основ их вирулентности, а также для исследований особенностей иммунного ответа организма.

Одним из современных способов получения антител человека является их селекция из комбинаторных библиотек мини-антител (Fab, scFv), экспонированных на поверхности нитчатых бактериофагов. Такие комбинаторные фаговые библиотеки содержат 106-109 фаговых частиц, на поверхности каждой из которых экспонировано уникальное мини-антитело. Процедура биопэннинга (biopanning) - специфического обогащения библиотеки путем повторяющихся раундов связывания антител с антигеном - позволяет отбирать молекулы с предопределенными свойствами.

Ранее в США из комбинаторной фаговой библиотеки, сконструированной на основе мРНК лимфоцитов периферической крови иммунного донора, была получена коллекция Fab-фрагментов человека, специфических к вирусу осповакцины. Несколько Fab-фрагментов из этой библиотеки продемонстрировали вируснейтрализующие свойства в отношении вируса осповакцины.

Целью данной работы являлось получение методами фагового дисплея одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов, включая вирус натуральной оспы, поиск группоспецифических или, в случае антител против вируса натуральной оспы, штаммо-специфических антител и отбор антител, обладающих вируснейтрализующими свойствами. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- отобрать из иммунной и синтетической комбинаторных библиотек одноцепочечные антитела человека против ортопоксвирусов, включая вирус натуральной оспы, штамм Butler;

- определить аминокислотные последовательности полученных одноцепочечных антител;

- исследовать отобранные антитела в реакции кроссреактивного связывания с различными ортопоксвирусами;

- исследовать связывание отобранных антител с различными штаммами вируса натуральной оспы;

- провести поиск вируснейтрализующих антител в полученной коллекции.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые получены одноцепочечные антитела человека против вируса натуральной оспы, штамм Butler, против вируса осповакцины и вируса эктромелии. Определены аминокислотные последовательности полученных антител. Исследовано связывание антител с различными ортопоксвирусами, выявлены группоспецифические антитела. Проведенные исследования способности отобранных антител к кросс-реактивному связыванию позволили высказать предположение о вкладе в иммунологические профили ортопоксвирусов эпитопов, конформации которых могут несколько различаться у различных видов (штаммов одного вида) ортопоксвирусов.

Впервые исследовано связывание антител с различными штаммами вируса натуральной оспы. Впервые обнаружены антитела, обеспечивающие различное связывание штаммов вируса натуральной оспы, обладающих разной вирулентностью (variola major и variola alastrim).

В ходе данной работы впервые были отобраны одноцепочечные антитела человека, способные подавлять инфекционность вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии. На основе данных антител в дальнейшем могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека. Такие полноразмерные антитела человека, после проверки их противовирусных свойств в модельных экспериментах на животных, могли бы представлять интерес для создания на их основе иммунопрофилактических средств, а также терапевтических препаратов предупреждения поствакцинальных осложнений и, возможно, лечения ортопоксвирусных инфекций.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 11 Международных конференциях: 5th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Пущино, Россия, 2000), "Human antibodies and hybridomas" (Прага, Чехия, 2001; Берн, Швейцария, 2002); 15-ой Международной конференции «Antiviral research» (Прага, Чехия, 2002); на XIII Международном вирусологическом конгрессе (Париж, 2002); Научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002); Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет. (Санкт-Петербург, Россия, 2002); 6th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, (Пущино, Россия, 2002), 16-ой Международной конференции «Antiviral research» (Саванна, США, 2003), 17-ой Международной конференции «Antiviral research» (Туксон, США, 2004), 18-ой Международной конференции "Antiviral research" (Барселона, Испания, 2005).

Вклад автора. В исследованиях, проводимых с использованием жизнеспособного вируса натуральной оспы в условиях специальной лаборатории с уровнем защиты BSL 3-4, вместе с автором участвовали А.А.Гуськов, Е.Б.Сокунова, Т.Э.Юн, Е.В.Жираковская, Е.И.Бовшик, к.б.н, Н.В.Тикунова. Тестирование антител на наличие вируснейтрализующей активности проводилось в лаборатории общих вирусов, руководитель к.м.н. Е.Ф.Беланов, в тестировании антител принимали участие вместе с автором Н.И.Бормотов и З.Ф.Киселева. Все остальные эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Морозова, Вера Витальевна

Выводы

Впервые получены фаговые одноцепочечные антитела человека против вируса натуральной оспы, вируса осповакцины и вируса эктромелии. Определены аминокислотные последовательности полученных антител и показано, что V-сегменты тяжелых цепей полученных антител относятся к семействам Vhl и Vh3 иммуноглобулинов человека, а V-сегменты легких цепей - к к1- и13-подтипам.

Исследовано связывание полученных антител с ортопоксвирусами, выявлены антитела, обеспечивающие различное связывание вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии, отобрано группоспецифическое антитело, узнающее эпитоп, который отсутствует на поверхности вируса эктромелии.

Впервые обнаружены антитела, обеспечивающие различное связывание штаммов вируса натуральной оспы variola major (штаммы Ind-3a, Con-9, Kuw-5) и variola alastrim (штаммы Butler, Brazil 131).

Впервые выявлены одноцепочечные антитела человека, способные подавлять инфекционность. вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии и показано, что эти антитела связывают белок ортопоксвирусов с молекулярным весом около 34 кДа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Морозова, Вера Витальевна, Кольцово

1. Берзовски Д., Берковер Д. Взаимодействие антиген-антитело. Иммунология (подред. У .Пол). Мир, Москва.- 1989. ТомЗ. С. 5-89.

2. Воробьев А.А., Подкуйко В.Н., Максимов В.А. Пероральная вакцинация против оспы (к вопросу о возврате оспопрививания).// Вестн. РАМН. 2003. - Вып. 1. -С. 5-9.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва. 1984. - С. 477.

4. Маренникова С.С., Мацевич Г.Р. и др. Повышение специфичности иммуноферментного анализа за счет использования коньюгата на основе моноклональных антител.//Вопр. Вирусологии. 1986 - Вып.6 - С. 689 - 690.

5. Маренникова С.С., Мальцева Н.Н. Использование реакции микропреципитации на стекле для лабораторной диагностики натуральной оспы.//Вопросы вирусологии. 1961а- Вып.2. - С.204-206.

6. Маренникова С.С., Еремян А.В., Огородникова З.И. Применение противооспенного гамма-глобулина для серопрофилактики и серотерапии оспы. // Натуральная оспа (под ред. Маренниковой). М. 1961b - С.141-148.

7. Маренникова С.С., Мацевич Г.Р., Свет-Молдавская И.А. Об эффективности гамма-глобулина с повышенным содержанием противооспенных антител при лечении поствакцинальных энцефалитов//Вопр.вирусол„ 1968 - Вып.1.- С. .9 -13.

8. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. КМК Scient.Press. Москва 1998 - С. 386.

9. Ройт. А. Основы иммунологии. М.:Мир 1991 — С. 327.

10. Смородинцев А. Реакция нейтрализации. В кн. «Иммунологическая диагностикавирусных инфекций». М.Медицина- 1985 С.21-46.

11. Baek S. et al. Lipase activities of p37, the major envelope protein of vaccinia virus.//J. Biol.Chem. 1997 - V.272. - P.32042 - 32049.

12. Barbas C.F., Bain J.D., Hoekstra DM. and Lerner R.A. Semisynthetic combinatorial Ab libraries: a chemical solution to the diversity problem. Proc.Natl.Acad. Sci. USA. -1992.-V. 89.-P. 4445-4457.

13. Barbas CF. Ill, Kang A.S., Lerner R.A., Bencovich SJ. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface: The gene III site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -88.- 1991.- P. 7978-7982.

14. Barbas III C.F., Lerner R.A. Combinatorial immunoglobulin library on the surface of phage (Phabs):rapid selection of an antigen specific Fabs. A companion to Meth. In Enzimology. 2. -1991. - P. 119-124.

15. Bayliss, C. D., and G. L. Smith. Vaccinia virion protein VP8, the 25 kDa product of the L4R gene, binds single-stranded DNA and RNA with similar affinity.// Nucleic Acids Res. 1997. - V.25. - P. 3984-3990.

16. Bednarek S., Orci., Schekman R. Traffic COPS and the formation of vesicle coats.//Trends in Cell Bioligy. 1996 - V.6. - P.468-473.

17. Betakova T, Wolffe EJ, Moss B. Regulation of vaccinia virus morphogenesis: phosphorylation of the A14L and A17L membrane proteins and C-terminal truncation of the A17L protein are dependent on the F10L kinase.// J Virol. 1999a - V.73. - P. 3534-3543.

18. Betakova Т., Wollfe E., Moss В. Membrane topology of the vaccinia virus A17L envelope protein.//Virology. 1999b - V.261. - P.347-356.

19. Beyersdorf N, Hanke T, Kerkau T, Hunig T.Superagonistic anti-CD28 antibodies: potent activators of regulatory T cells for the therapy of autoimmune diseases. // Ann Rheum Dis. 2005 - V.64.Suppl. 4 - 91-95.

20. Birnboim H. and Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.//Nucl.Acids Res. 1979 - V.7 - 1513.

21. Blasco R., Moss B. Extracellular vaccinia virus formation and cell-to-cell transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37 000 -Dalton outer envelope protein.//! Virol. 1991 - V.65. - P.5910 - 5920.

22. Bond Ch., Marsters J.C., Sidhu S. Contributions of CDR3 to VHH Domain Stability and Design of Monobody Scaffolds for Naive Antibody Libraries.// J. Mol. Biol.- 2003- V.332, P.643-655.

23. Boulter E., Appleyard G. Differences between extracellular and intracellular forms of poxviruses and their implications.//Prog.Med.Virol. 1973. - V.16. - P.86-108.

24. Bray M. Pathogenesis and potential antiviral therapy of complications of smallpox vaccination. Antiviral Research. 2003 - V.58. - P.101-114.

25. Byrnes A., Griffin D. Binding of Sindbis virus to cell surface heparan sulfate.//J.Virol.- 1998 V.72. - P.7349 - 7356.

26. Сагг С., Kim P. A spring-loaded mechanism for the conformational change of influenza hemagglutinin.//Cell. 1993,- V.73. - P.823-832.

27. Chan D.,Fass J., Berger J., Kim P.Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein// Cell. 1997 - V.89. - P.263-273.

28. Chang W., Hsiao J., Chung C., Bair C. Isolation of a monoclonal antibody which blocks Vaccinia virus infection.// J. Virol. 1995 - V.69. P.517-522.

29. Clackson Т. et al. Making antibody fragments using phage display libraries.// Nature. -1991. V. 352. - P. 624-628.

30. Cudmore S., Blasco R., Vincentelli R., Esteban M., Sodeik В., Griffiths G., Krijnse Locker. A vaccinia core protein, p39, is membrane associated.// J.Virol., 1996. V. 70. -P.6909-6921.

31. Czerny P., Mahnel H. Structural an functional analysis of orthopoxvirus epitops with neutralizing monoclonal antibodies.// J.Gen.Virology.,-1990.-V.71.- P.2341-2352

32. Czerny P., Wagner K., Gessler K., Mayr A., Kaaden O. Amonoclonal blocking-ELISA for detection of orthopoxvirus antibodies in feline sera. Veterinary Microbiology. -1996 V.52. - P.185-200.

33. Dales S., Mosbach E. Vaccinia as a model for membrane biogenesis.//Virology. -1968. V.35. - P.564-583.

34. Demkovicz W., Maa J., Esteban M. Identification and characterization of Vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans.// J. Virol. 1992 - V.66. - P.386-398.

35. Derrien M. et al. Tyrosine phosphorilation of A17L during vaccinia virus infection: involvment of the HI phosphatase and the F10 kinase.// J.Virol. 1999. - V.73. - P. 7287 -7296.

36. Dotto G.P., Horiuchi K., Zinder N.P. The functional origin of bacteriophage fl DNA replication. Its signals and domains.//J. Mol Biol. 1984 - V. 172 - P. 507-521.

37. Dubochet J., Adrian M., Richter K., Garces J., Wittek R. Structure of intracellular mature vaccinia virus observed by cryoelectron microscopy.// J. Virol. 1994. - V.68. - P.1935-1941.

38. Durrani O.M., Reuser T.M., Murray P.I. .Infliximab: A Novel Treatment for Sight-Threatening Thyroid Associated Ophthalmopathy.//Orbit- 2005 V.24 - P.l 17-119.

39. Emery S., Harris W. Strategies for humanizing antibodies. In Antibody Engineering. Oxford University Press. New York. 1995 - P. 159-183.

40. Engelstad M., Smith G. The vaccinia virus 42 kDa envelope protein is required for the envelopment and egress of extracellular virus and virus virulence.// Virology. 1993 -V.194. -P.627-637.

41. Eroshkin A.M. et al. Design of four-helix bundle protein as a candidate for HIVvaccine.// Protein Eng. 1995 V. 8 P. 167-173.

42. Essani, K., Dales S. Biogenesis of vaccinia: evidence for more than 100 polypeptides in the virion.//Virology . 1979 - V.95. - P.385-394.

43. Ewert S., Huber Т., Honegger A., PlUckthun А/ Biophysical properties of human antibody variable domains.// J.Mol.Biol. 2003 - V.325. - P. 531-553.

44. Fenner F.,Wittek R., Dumbell K. The Orthopoxviruses. Acad.Press., USA.-1989.- P. 432.

45. Franke C., Reynolds P., Hruby D. Fatty acilation of vaccinia virus proteins.// J.Virol. -1989.-V.63.-P.4285-4291.

46. Frischknecht F. et al. Actin-base motility of vaccinia virus mimics receptor tyrosine kinase signaling.// Nature 1999 - V.401. - P.926 - 929.

47. Galmiche M., Goenaga J.,Wittek R., Rindisbacher L. Neutralizing and protective antibodies directed against Vaccinia virus envelope antigens.// Virology. 1999 -V.254. -P.71-80.

48. Gordon J., Mohandas A., Wilton S., Dales S. A prominent antigenic surface polypeptide involved in the biogenesis and function of the vaccinia virus envelope.//Virology. 1991- V.81 - P. 671-686.

49. Grillo-Lopez A.J. et al. Overview of the clinical development of rituximab: first monoclonal antibody approved for the treatment of limphoma.// Semin.Oncol. 1999. -V. 26. - P.66-73.

50. Griffiths G. et al. Structure and assembly of intracellular mature vaccinia virus:isolated-particle analysis.//J.Virol. -2001. V.75. -P.l 1056-11055.

51. Griffiths et al. Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires.// EMBO J. 1994 -V. 13. P.3245-3260.

52. Grosenbach D., Ulaeto D., Hruby D. Palmitylation of the Vaccinia virus 37-kDa major envelope antigen. Identification of a conserved acceptor motif and biological relevance.//.!. Biol.Chem. 1997 - V.272. - P.l956-1964.

53. Herrera E., Lorenzo M., Blasco R., Isaacs S. Functional Analysis of Vaccinia virus B5R protein: essential role in virus envelopment is independent of a large portion of the extracellular domain.// J.Virol. 1998 - V.72. - P.294-302.

54. He X, Li G, Zhu J. Construction and selection of human anti-idiotypic antibody single chain variable fragments or CDR3 fragments of nasopharyngeal carcinoma.// J Exp Clin Cancer Res. 2004 - V. 23. - P. 607-615.

55. Hollinshead M., Vanderplasschen A., Smith G., Vaux D. Vaccinia virus intracellular mature virions contain only one lipid membrane.//J.Virol. 1999. - V.73. - P. 15031517.

56. Hollinshead M. et al. Vaccinia virus utilises microtubules for movement to the cell surface.// J.Cell.Biol. 2001. - V.154. - P.389-402.

57. Hoogenboom H., Winter G. By-passing immunization. Human Antibodies from Synthetic Repertoires of Germline Vh Gene Segments Rearranged in v//ro.//J.Mol.Biol. 1992 - V. 227. - P.381-388.

58. Hsiao J., Chung C., Vhang W. Cell surface proteoglycans are necessary for A27L protein-mediated cell fusion: identification of the N-terminal region of A27L protein as the glycosaminoglycan-binding protein.//J.Virol. 1998. - V.72. - P. 8374 - 8379.

59. Hsiao J-C, Chung C-S, Chang W. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the adsorption of intracellular mature virionsto cells.// J Virol. 1999 - V.73 - P. 8750-8761.

60. Husain M., Moss B. Evidence against an essential role of COPII-mediated cargo transport to the endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment in the formation of the primary membrane of Vaccinia virus.//J.Virol. 2003.- V.77. -P.l 1754-11766.

61. Huston J. Medical applications of single-chain antibodies. //Int. Rev.Immunol. 1993 - V.10. - P.195-217.

62. Ichihashi Y., Oie M. Adsorption and penetration of the trypsinized vaccinia virion.// Virology 1980-V.101. - P.50-60.

63. Ichihashi Y., Tsuruhara Т., Oie M. The effect of proteolytic enzymes on the infectivity of vaccinia virus.// Virology 1982 - V. 122 - P. 279-289.

64. Ichihashi Y., Oie M., Tsuruhara T. Location of DNA-binding proteins and disulfide-linked proteins in Vaccinia virus structural elements.//J. Virol. 1984 - V.50. - P.929-938.

65. Jensen O.N. et al. Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis.//!. Virol. 1996 - V.70 - P.7485-7497.

66. Johnston J., McFadden G. Poxvirus immunomodulatory strategies: current perspectives.// J.Virol. 2003 - V.77. - P.6093-6100.

67. Kajioka R., Siminovitch L., Dales S. The cycle of multiplication of vaccinia virus in Earle's strain L cells. II. Initiation of DNA synthesis and morphogenesis.//Virology.-1964.- V.24. -P.295-309.

68. Kao S., Bauer W. Biosynthesis and phosphorylation of vaccinia virus structural protein VP 11 .//Virology. 1987 - V. 159. - P.399-407.

69. Katz, E., and В. Moss. Vaccinia virus structural polypeptide derived from a high-molecular-weight precursor: formation and integration into virus particles.// J. Virol. -1970.- V.6.-P.717- 726.

70. Kay B.K., Winter G., McCafferty J. Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual. Academic press. 1996. - P.306.

71. Keane J.T., James K„ Blankenship M.L., Pearson R.W. // Arch.Dermatol. 1983. -Vol. 119.- P. 404-408.

72. Kim S J., Myeong H.J., Stapleton J.T., Yoon S.O., Kim K., Jeon E., Hong L. Neutralizing human monoclonal antibodies to hepatitis A virus recovered by phage display.// Virology. 2004. - V. 318. - P. 598-607.

73. Kipriynov S.M., Le Gall F. Generation and production of engineered antibodies.// Mol Biotechnol. 2004- V. 26. - P. 39-60.

74. K6hler G., Milstein G. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.// Nature, 1975 V. 2.56. - P.52-53.

75. Koefoed K. et al. Molecular characterization of the circulating anti-HIV-1 gpl20-specific В cell repertoire using antibody phage display libraries generated from preselected HIV-1 gpl20 binding PBLs. //J. Immunol. Methods. 2005 -V. 297. P. 187201.

76. Koonin E.V. A duplicated catalytic motif un a new superfamily of phosphohydrolases and phospholipid synthases that include poxvirus envelope proteins.//Trends in Biochem. Sci. 1996 - V.21 - P.242-243.

77. Krebs B, Griffin H, Winter G, Rose-John S. Recombinant human single chain Fv antibodies recognizing human interleukin-6. Specific targeting of cytokine-secreting cells.// J Biol Chem. 1998 V.273. P. 2858-2865.

78. Krijnse-Locker J, Schleich S, Rodriguez D, Goud B, Snijder EJ, Griffiths G. The role of a 21-kDa viral membrane protein in the assembly of vaccinia virus from the intermediate compartment.//J. Biol. Chem. 1996 - V.271. - P. 14950-14958.

79. Krauss О., Hollinshead R., Hollinshead M., Smith G. An investigation of incorporation of cellular antigens into Vaccinia virus particles.//J.Gen. Virol. 2002 -V.83. - P.2347-2359.

80. Krusat Т., Streckert H.-J. Heparan-dependent attachment of respiratory syncytial virus (RSV) to host cells.//Arch.Virol. 1997 - V.142. - P.1247-1254.

81. Kyte J., Doolittle F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.//J.Mol.Biol. 1982 - V.157. - P. 105-132.

82. Laemmli U.K. Nature. 1970. - v. 227. - P. 680-685.

83. Lai CF, Gong SC, Esteban M. The 32-kilodalton envelope protein of vaccinia virus synthesized in Escherichia coli binds with specificity to cell surfaces.// J. Virol. 1991 -V.65.-P. 499-504.

84. Lartigue A, Drouot L, Jouen F, Charlionet R, Tron F, Gilbert D. Association between anti-nucleophosmin and anti-cardiolipin antibodies in (NZW x BXSB)F1 mice and human systemic lupus erythematosus.// Arthritis Res Ther. 2005 V.7 - P. R1394-403.

85. Law M., Hollinshead R., Smith G. Antibody-sensitive and antibody-resistant cell-to-cell spread by vaccinia virus:role of the A33R protein in antibody-resistant spread.//J.Gen.Virol. 2002 - V.83. - P.209 - 222.

86. Law M, Smith GL. Studying the binding and entry of the intracellular and extracellular enveloped forms of vaccinia virus.// Methods Mol. Biol. 2004 - V. 269. P. 187-204.

87. Loury L., Rosenbrou G.// J. Biol. Chem. 1951 - V.100. - P. 539-543.

88. Luzzago A., Felici F., Tramontano A., Pessi A., CorteseR. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed library of contrained peptides. Gene. 1993.-v. 128.-P. 51-57.

89. Maa J.-S., Esteban M. Structural and functional studies of a 39000-Mr immunodominant protein of vaccinia virus.//J.Virol. 1987 - V.61. - P.3910 - 3919.118

90. MacCafferty J., Griffiths A.D., Winter G. and Chiswell D.J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains.// Nature. 348. - 1990. - P. 552-554.

91. Martin K., Grosenbach D., Franke C., Hruby D. Identification and Analysis of three Myristilated Vaccinia virus late proteins.//J.Virol. 1997 - V.71. - P. 5218-5226.

92. Martin K.H., Franke C.A., Hruby D.E. Novel acylation of poxvirus A-type inclusions proteins.// Virus Res. 1999 - V.60 - P. 147-157.

93. Martinez-Pomarez L., Stern R., Moyer R. The ps/hr gene (B5R open reading frame homolog) of rabbitpox virus control pock colour, is a component of extracellular enveloped virus, and is secreted into the medium.// J. Virol. 1993 - V. 67 - P. 54505462.

94. Maruyama T. et al. Ebola virus can be effectively neutralized by antibody produced in natural human infection.// J. Virol. 1999. - V.73 - P. 6024-6030.

95. McKelvey Т., Andrews C., Miller S., Ray C., Pickup D. Identification of the Orthopoxvirus p4c Gene, Which Encodes a Structural Protein That Directs Intracellular Mature Virus Particles into A-Type Inclusions.// J. Virol. 2002 - V. 76. -P. 11216-11225.

96. Medzon E.,Bauer H. Structural features of vaccinia virus revealed by negative staining, selectioning, and freeze-etching.//Virology. 1970. - V.40. - P.860-867.

97. Meiser A., Sancho C., Krijnse Locker J. Plasma membrane budding as an alternative release mechanism of the extracellular enveloped form of vaccinia virus from HeLa cells.// J.Virol.- 2003 V.77. - P.9931-9942.

98. Mercer J, Traktman P. Investigation of structural and functional motifs within the vaccinia virus A14 phosphoprotein, an essential component of the virion membrane.// J. Virol.- 2003 V.77.-P. 8857-8871.

99. Minnencova O.O., Ilyichev A.A., Kishchenko G.P. Design of specificimmunogenes using filamentous phage at the carrier. Gene. - 1993. - V. 128. -P. 85-88.

100. Moss В., Rosenblum E. Protein cleavage and poxvirus morpogenesis: tryptic peptide analysis of core precursors accumulated by blocking assemblywith rifampicin.//J.Mol.Biol. 1973. V.81. - P.267-269.

101. Nagler F. Application of Hirst's phenomenon to the titration of vaccinia virus and vaccinia immune serum.//Medical Journ. Austral. 1942 - V.l. - P.281-283.

102. Niles E G, Seto J. Vaccinia virus gene D8 encodes a virion transmembrane protein.// J. Virol. 1988 - V. 62 - P. 3772-3778.

103. Nissim A., Hoogenboom H., Tomlinson Ian M., Flynn G., Midgley C., Lane D., Winter G. Antibody fragments from a 'single pot' library as immunochemical reagents.// EMBO J. 1994.- V.13. - P. 692-698.

104. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gels.// Acta Path.Microbiol.Scand. -1949-V.26.-P.507-515.

105. Parkinson J., Smith G. Vaccinia virus gene A36R encodes a Mr- 43-50 kDa protein on the surface of extracellular enveloped virus.//Virology 1994 - V.204. - P. 376 -390.

106. Patel D., Pickup D., Joklik W. Isolation of cowpox virus A-type inclusions and characterisationof their major protein component.// Virology. 1986 - V.149. -P. 174-189.

107. Payne L.G. Polypeptide composition of extracellular enveloped vaccinia virus.//J.Virol. 1978 - V.27. - P. 28 - 37.

108. Payne L.G. Significance of extracellular enveloped virus in the in vitro and in vivo dissemination of vaccinia virus.//J.Gen. Virol. 1980. - V.50. - P.89-100.

109. Payne L. G. Characterization of Vaccinia virus glycoproteins by Monoclonal Antibody Precipitation. //Virology. 1992- V.197. - P.251-260.

110. Pedersen K., Snijder E., Schleich S., Roos N., Griffiths G., Krijnse Locker J. Characterization of Vaccinia virus intracellular cores: implications for viral uncoating and core structure. J. Virol. 2000 - V.74. - P.3525-3536.

111. Pulford D., Meyer H., Ulaeto D. Orthologs of the vaccinia A13L and A36R virion membrane protein genes display diversity in species of the genus Orthopoxvirus.// Arch. Virol. -2002 V.l 47-P. 995-1015.

112. Ramsey-Ewing A, Moss B. Apoptosis induced by a postbinding step of vaccinia virus entry into Chinese hamster ovary cells.// Virology. 1998 - V. 242. - P. 138149.

113. Ravanello M.P., Hruby D.E.Conditional lethal expression of the vaccinia virus L1R myristylated protein reveals a role in virion assembly.// J Virol. 1994a - V.68 -P.6401-6410.

114. Ravanello M.P., Hruby D.E.Characterization of the vaccinia virus L1R myristylprotein as a component of the intracellular virion envelope.// J Gen Virol. -1994b.-V. 75- P.1479-1483.

115. Reckmann I., Higley S., Way M. The Vaccinia virus F17R protein interacts with actin. FEBS Lett. 1997 - V.409.- P.141-146.

116. Risco C. et al. Endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment membranes and vimentin filaments participate in vaccinia virus assembly.// J.Virol. 2002. -V.76. - P.1839 -1855.

117. Rodriguez J., Janesco R., Esteban M. Isolation and Characterization of Neutralizing Monoclonal Antibodies to Vaccinia Virus. J.of Virology. 1985 - V.56.- P.482-488

118. Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M. The vaccinia virus 14-kilodalton fusion protein forms a stable complex with the processed protein encoded by the vaccinia virus A17L gene.// J. Virol. 1993 - V.67 - P.3435-3440.

119. Rodriguez D, Risco C, Rodriguez JR, Carrascosa JL, Esteban M. Inducible expression of the vaccinia virus A17L gene provides a synchronized system to monitor sorting of viral proteins during morphogenesis.// J Virol. 1996. - V.70 - P.7641-7653.

120. Rodriguez JR, Risco C, Carrascosa JL, Esteban M, Rodriguez D.Vaccinia virus 15-kilodalton (A14L) protein is essential for assembly and attachment of viral crescents to virosomes.// J Virol. 1998 - V.72. - P. 1287-1296.

121. Roos N. et al.A novel immunogold ciyoelectron microscopic approach to investigate the structure of the intracellular and extracellular forms of vaccinia virus.//EMBO Journal. 1996. - V.15. - P. 2343 - 2355.

122. Ryazankina O.I., Shchelkunov C.N. Mapping of Vaccinia virus genes. Mol.Biol. -1993 V.27.- P.153-166.

123. Salmons T. et al. Vaccinia virus membrane proteins p8 and pi6 are cotranslationally inserted into the rough endoplasmic reticulum anr retained in the intermediate compartment. J. Virol. 1997 - V.71'. - P.7404-7420.

124. Sanderson C., Frischknecht F., Way M., Hollimshead M., Smith G. The vaccinia virus A27L gene is needed for the microtubule-dependent transport of intracellular mature virus particles.//J.Gen.Virol. V.81. P.47-58.

125. Sarov, I., Joklik W. Studies on the nature and location of capsid polypeptides of vaccinia virions.// Virology 1972- V.50. - P.579-592.

126. Sidhu, S.S., Lowman, H.B., Wells, J.A. Phage display for selection of novel binding peptides.//Methods Enzymol. 2000. - V. 328. - P. 333-363.

127. Sieczkarski S., Whittaker G. Dissecting virus via endocytosis. J. Gen.Virol. 2002 -V.83. - P.1535-1545.

128. Schmaljohn C., Cul Y., Kerby S., Pennock D., Spik K. Production and characterization of human monoclonal antibody Fab fragments to Vaccinia Virus from phage-display library. Virology. 1999-V. 858. - P. 189-200.

129. Shearer JD, Siemann L, Gerkovich M, House RV. Biological activity of an intravenous preparation of human vaccinia immune globulin in mouse models of vaccinia virus infection.// Antimicrob Agents Chemother. 2005 V.49 - P. 26342641.

130. Smith G.P. Filamentous fusion phage: Novel expression vectors that display cloned antigens on the surface of the virion//Science 1985 - V. 228 - P. 1315-1317.

131. Smith G.P. and Scott J. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage//Meth.Enzymol. 1993 - V. 217 - P.228 - 257.

132. Shida H., Dales S.Biogenesis of vaccinia: molecukar basis for the hemagglutinin-negative phenotype of the IHD-W strain.//Virology. 1982 - V.l 17. - P.219-237.

133. Shida H. Nucleotide sequence of the vaccinia virus hemagglutinin gene.// Virology. 1986-V.150.-P.451-462.

134. Smith G., Vanderplasschen A., Law M. The formation and function of extracellular enveloped vaccinia virus.//J. Gen.Virol. 2002 - V.83. - P. 2915 - 2931.

135. Smith G. Law M. The exit of Vaccinia virus from infected cells.//Virus Research. -2004-V. 106.-P. 189-197.

136. Sodeik В., Krijnse Locker J. Assembly of Vaccinia virus revisited: de novo synthesis or acquisition from the host.// Trends in Microbiol. 2002. - V.10. - P. 15-24.

137. Soderlind E., Strandberg L., et al. Recombining germline-derived CDR sequences for creating diverse single-framework antibody libraries.//Nature Biotechnol. 2000 -V.18.-P. 852-856.

138. Stern, W., Dales S. Biogenesis of vaccinia: isolation and characterization of a surface component that elicits antibody suppressing infectivity and cell-cell fusion.// Virology 1976a-V. 75.-P. 232-241.

139. Stern, W., Dales S. Biogenesis of vaccinia: relationship of the envelope to virus assembly.// Virology 1976b - V. 75. - P. 242-255.

140. Sung T. et al. Mutagenesis of phospholipase D defines a superfamily including a trans-Golgi viral protein required for poxvirus pathogenicity.// EMBO Journ. 1997 -V.16.-P. 4519-4530.

141. Takahashi Т., Oie M., Ichihashi Y. N-terminal amino acid sequences of vaccinia virus structural proteins.//Virology-1994. V.202. - P.844-852.

142. Thornton. The antigenicity and immunogenicity of the intracellular and extracellular forms of Vaccinia virus. I: The production of High-titre Vaccinia extracellular virus and its antigenicity after inactivation. Br.J.exp.Path.- 1980.-V.61.-P.444-450

143. Towbin H., Staehlin Т., Gorden J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350.

144. Ulaeto D., Grosenbach D., Hruby D. The vaccinia 4c and A-type inclusion proteins are specific markers for the intracellular mature virus particle.// J.Virol. 1995 - V.70.1. Р.3372-3377.

145. Van Eijl H., Hollinshead M., Smith G. The vaccinia virus A36R protein is a type lb membrane protein present on intracellular but not extracellular enveloped particles.// Virology. 2000 - V.271. - P.26-36.

146. Van Eijl H., Hollinshead M., Rodger O., Zhang W.-H., Smith G. The vaccinia virus F12L protein is associated with intracellular enveloped virus particles and is required for their egress to the cell surface. // J.Gen.Virol. 2002 - V.83 - P.l95-207.

147. Van Meir E., Wittek R. Fine structure of the vaccinia virus gene encoding the precursor of the major core protein 4a.//Arch.Virol. 1988 - V.102. - P.19-27.

148. Vanderplasshen A., Hollinshead M., Smith G. Antibodies against Vaccinia virus do not neutralize extracellular enveloped virus but prevent virus release from infected cells and comet formation. J. Gen.Virol.-1997.-V.78.- P.2041-2048.

149. Vanderplasshen A. et al. Extracellular enveloped vaccinia virus is resistant to complement because of incorporation of host complement control proteins into its envelope.// Proc.Natl.Acad.Sci. 1998. - V.95. - P. 7544 -7549.

150. Vazquez M., Esteban M. Identification of functional domains in the 14-kilodalton envelope protein (A27L) of Vaccinia virus. J.Virol.- 1999 V.73. - P.9098-9109.

151. Veiga E, De Lorenzo V, Fernandez LA. Neutralization of enteric coronaviruses with Escherichia coli cells expressing single-chain Fv-autotransporter fusions. // J Virol. 2003 V.77 - P.13396-13398.

152. Wallengren K., Risco C., Krijnse Locker J., Esteban M., Rodriguez D. The A17L gene product of Vaccinia virus is exposed on the surface of IMV.// Virol. 2001. - V. 290. - P.143-152.

153. Weissenhorn W. et al. Atomic structure of the ectodomain from HIV-1 gp41.// Nature. 1997 - V.387. - P. 426 - 430.

154. White J.M. Viral and cellular membrane fusion proteins.//Annu.Rev.Physiol. 1990. - V.52. - P.675-697.

155. White J.M. Membrane fusion.//Science. 1992 - V.258. - P. 917-924.

156. Whitehead S., Hruby D. Differential utilization of a conserved motif for the proteolytic maturation of vaccinia virus proteins.//Virology 1994. - V.200. - P. 154

157. Wilcock D., Smith GL.Vaccinia virus core protein VP8 is required for virus infectivity, but not for core protein processing or for INV and EEV formation.//Virology. 1994 - V. 202 - P. 294-304.

158. Wilcock D., Smith GL.Vaccinia virions lacking core protein VP8 are deficient in early transcription.// J. Virol. 1996 - V. 70 - P. 934- 943.

159. Williamson R.A., Burioni R., Sanna P.P., Partridge L.J., Barbas C.F., Burton D.R. 1993 . Human monoclonal antibodies against a plethora of viral pathogens from single combinatorial libraries. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.90. P. 4141-4145.

160. Wilton, S., A. R. Mohandas, and S. Dales. Organization of the vaccinia envelope and relationship to the structure of intracellular mature virions.// Virology 1995 - V. 214 - P.503-511.

161. Wolffe EJ, Vijaya S, Moss B. A myristylated membrane protein encoded by the vaccinia virus LIR open reading frame is the target of potent neutralizing monoclonal antibodies.// Virology. 1995 - V.211- P.53-63.

162. Wollfe E., Weisberg A., Moss B. The vaccinia virus A33R protein provides a chaperone function for viral membrane localization and tyrosine phosphorylation of the A36R protein.// J. Virol. 2001 - V.75. - P. 303-310.

163. WuDunn D., Spear D. Initial interaction of herpes simplex virus with cells is binding to heparan sulfate.//J.Virol. 1989 - V.63. - P.53-63.

164. Yang W., Bauer W. Purification and characterization of vaccinia virus structural protein VP8.//Virology. 1988. - V.167. - P.578-584.

165. Zinoviev V.V., Tchikaev N.A., Chertov O.Yu., Malygin E.G. Identification of the gene encoding vaccinia virus immunodominant protein p35.// Gene 1994 - V.147. -P. 209-214.

166. Zhang W.-H., Wilcock D., Smith G. The vaccinia virus F12L protein is required for actin tail formation, normal plaque size and virulence.//J. Virol. 2000 - V.74. - P. 11654- 11662.

167. Zhou Y., Takekoshi M., Maeda F., Ihara S., Esumi M. Recombinant antibody Fab against the hypervariable region 1 of hepatitis С virus blocks the virus adsorption to susceptible cells in vitro. Antiviral Research. 56. - 2002. P. 51-59.